JP5249482B2 - インビボのβ−アミロイドレベルの免疫学的制御 - Google Patents
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Description
発明の背景
アルツハイマー病は、老齢人口のかなりの部分に影響を及ぼす進行性の、そして最終的には致命的な痴呆の状態である。解剖による決定的診断は、高密度の老人性斑が顕著な神経病理学的な脳の創傷の存在による。これらの細胞外沈着は、新−皮質、海馬および扁桃ならびに髄膜および大脳血管の壁に見いだされる。このような斑の主成分は39〜43残基のβ-アミロイドペプチドである。各斑が、約20フェントモル(80ピコモル)のこの4kDaペプチドを含む(Selkoe et al.,J.of Neurochemistry 46:1820(1986))。アポリポタンパク質Eおよび微小管結合タウタンパク質により形成される神経細線維のもつれがアルツハイマー病に関係することが多い。
発明の要約
本発明の1つの観点は、予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体である。1つの態様では、抗体は予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてまたELISAを使用して検出するために十分な親和性で自然なβ-アミロイドに結合する。別の観点では、抗体は予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてELISAを使用して検出するために十分な親和性で自然なβ-アミロイドには結合しない。生成される抗体は、それらが加水分解するアミド結合が特徴である。特異的抗体には、β-アミロイドの残基39と40、40と41、および41と42の間のアミロイド結合での加水分解を触媒するものを含む。
発明の詳細な記述
本発明は動物体内のβ-アミロイドのレベルを制御するための免疫学的に基づく方法に関する。本発明はβ-アミロイドに特異的な抗体が生理学的レベルのヒト血清アルブミンの存在下でβ-アミロイドに結合することができるという知見に基づく。本発明はまた、動物が血流中のβ-アミロイドを隔絶するために十分な量でβ-アミロイドに特異的な抗体の存在に耐容できるという知見に基づく。
第1章:循環中β-アミロイドの停留
β-アミロイドペプチド抗原の合成
43残基のβ-アミロイドペプチド(Aβ)のアミノ酸配列を図1に掲げる。このβ-アミロイドペプチド上のどの部位が抗体が媒介する治療に最も適するかを決定するために、Aβ43-merの3つの重要な領域(アミノ−末端、中央およびカルボキシ−末端)を選択して、エピトープに特異的なワクチンを生成した。これらの短縮化されたペプチドは、高度に特異的な抗体応答を誘導するために抗原性ペプチドとして役立てた。
ペプチドの抗原性キャリアータンパク質へのカップリング
様々なCysを含むAβペプチドを、個々にマレイミド−活性化KLHにチオエーテル結合させた。多価Aβワクチンも、3種のすべてのこのようなペプチドをマレイミド−活性化KLHに同時に連結することにより生成した。さらに完全長Aβ43-merをグルタルアルデヒドを使用してKLHに連結した。
β-アミロイドワクチンを用いて誘導された抗体
正常なBALB/cマウスは、標準的な手順により上記のKLH-連結Aβワクチンを用いて免疫感作した。マウスは採血するか、またはハイブリドーマ作成のために脾臓を摘出するために屠殺した。得られた血清およびモノクローナル抗体は、Aβに対する結合について特性決定した。
マウスは中央領域Aβ10-25ペプチド(このペプチド抗原は、以下の章IIでさらに検討するフェニルアラニンスタチン遷移状態類似体をアミド結合で有する)のKLH結合物を用いて免疫感作した。ハイブリドーマの融合を行い、そして生産されたモノクローナル抗体を分析してワクチンに対する免疫応答の特異性を特性決定した。融合で生成されたハイブリドーマ上清は、ELISAを使用してスクリーニングしてそれらのAβ1−43ペプチドに対する結合を評価した。
アルツハイマー病のヒト患者についてβ-アミロイドワクチン療法の潜在的重要性を考慮して、ヒトに適合可能なalumに基づくAβペプチドワクチン調製物を非ヒト霊長類で試験した。ヒトに適合可能な抗体生産および安全性試験は、カニクイザル(Macaca fascicularis)で実施した。この動物系はこれら霊長類の予想されるβ-アミロイドのアミノ酸配列がヒトと同一であり、そしてそれらの基本的な生理学および免疫学系が臨床的状況において遭遇する状況に極めて近いことから、ヒトへの応用と高度に関連している。カニクイザルは毎月予防接種し、そして血清中の抗-Aβレベルをモニターするために周期的に採血した。
正常なマウスにおける 125 I-Aβの分布に及ぼす抗体の影響
循環中の抗-Aβ抗体は血液脳関門を十分な程度で横断することができないので、125I-Aβ1-40が脳に到達することを防止するシンク(sink)として作用するはずである。この停留効果は、マウスに等量の125I-Aβ1-40を単独または我々の5A11抗-Aβモノクローナル抗体と注射した4時間後に、マウスの血液レベルを測定することにより証明された(表7)。末梢の循環から出た125I−Aβ1-40の通過は、特異的な抗-Aβ抗体を同時に受容した動物において大きく縮小した。その知見は、実験動物でAβに効果的に結合することができる抗体を示すことにより、5All抗体を用いて(表3)得たインビトロの結果に拡張される。この抗体で処置した動物が循環中に10倍多い125I-Aβ1-40を停留するという観察は、体内のAβの平衡分布を、血中の選択的隔絶により劇的に改変できることを示している。
防御レベルの抗-β-アミロイド抗体を誘導するために、ヒトに使用するための遺伝子操作したβ-アミロイド抗原が現在開発されている。β-アミロイドフラグメントは、高度に免疫原性のキャリアー部分を組込んだキメラAβワクチンに工作されて、ヒト患者の適切な免疫原性応答を上昇させる。使用に適するキャリアー部分は、ジフテリア毒素(DT)およびB型肝炎コア抗原(HBcAg)を含む。これらはβ-アミロイドペプチドの強力な送達系を表し、そしてアジュバントとしてalumを使用した時に優れた、高力価の免疫応答を誘導することが知られている。
本発明の方法
ペプチド合成。40merのAβ1-40、43merのAβ1-43および3種の小さいAβペプチドAβ1-16、Aβ10-25およびAβ35-43を、標準的な自動化Fmoc化学により合成した。新しく合成したペプチドはHPLCにより精製し、そしてそれらの組成をマススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。Aβ43merは、市販のものから得た(バッケム:Bachem、トランス、カリフォルニア州)。
β-アミロイドペプチドの免疫原生キャリアーへの連結。小さいAβペプチドを抗原性にするために、KLHキャリアータンパク質に連結した。Cys残基をこれらAβペプチドのN−およびC−末端に計画的に配置して、それらをマレイミド活性化キャリアータンパク質へのチオエーテル結合を介してカップリングするための適当な連結基を提供した。この連結は安定であり、そしてペプチドを定めた方向に結合する。この連結法により典型的には〜20ペプチド/KLHの付加が得られる。より長い、完全長のAβペプチドは、グルタルアルデヒドカップリング法を使用してキャリアータンパク質に連結した。
β-アミロイド抗原カクテル。図2〜4に示した3種のAβペプチドを、それぞれKLHに連結した。20μgのこれら各3種の結合物を次いで一緒に混合した。この混合物を完全フロイントアジュバントで乳化し、そしてマウスにi.p.注射した。続いて毎月のi.p.追加免疫注射は、不完全フロイントアジュバントで乳化した同じカクテル混合物を使用した。対照マウスは同様の免疫感作プロトコールを受けたが、Aβペプチドとは連結していないKLHを使用した。
マスの免疫感作。正常なBALB/cマウスは、上記のKLH-連結Aβワクチンを用いた標準的手法により免疫感作した。簡単に説明すると、マウスに完全フロイントアジュバントで乳化した抗原をi.p.注射し、続いて不完全フロイントアジュバントで2回目の感作を行った。マウスは採血またはモノクローナル抗体を生産するためのハイブリドーマ融合用に脾臓を取り出す3日前に、PBS中の抗原をi.v.により追加免疫感作した。
ELISA。結合した抗−ペプチド抗体の存在は、ペルオキシダーゼで標識した抗−マウスIgGプローブを使用することにより、続いて発色体基質により明らかにされた(Engvall et al.,Immunochemistry 8:871-875(1971))。
結合アッセイ。Aβ1-43およびAβ1-40の両方を125Iで放射標識した。ヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離して、本質的に定量的に特異的な活性を与えた(〜2000Ci/mmol)(Maggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:5462(1992))。125I-Aβ1-43プローブを23℃で1時間、モノクローナル抗-Aβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取ったHy培地とインキューベーションした。標準的なポリエチレングリコール分離法を使用して、抗体に結合した125I-Aβ1-43の量を検出した。
霊長類用のβ-アミロイドワクチン。使用した免疫原は、Aβタンパク質のアミノ酸1〜41を包含する合成Aβペプチドであった。このペプチドをHPLCにより精製し、そして凍結乾燥させ、そして次いで滅菌水に1.5mg/mlの濃度で再懸濁した。ワクチンは、本明細書ではalumゲルと呼ぶ7.5mlの2%水酸化アルミニウムゲルアジュバント(Alhydrogel、スパーホス バイオセクター(Superfos Biosector)、デンマーク)を、7.5mlのペプチドと混合することにより調製した。試験ではすべてのペプチドが25℃で12時間混合した後にalumゲルに吸着したことが示された。
遺伝子操作したワクチン。高度に免疫原性のキャリアー部分を使用して、キメラAβワクチンを構築する。使用した部分は、ジフテリア毒素(DT)およびB型肝炎コア抗原(HBcAg)を含む。HBcAg発現系を使用する(Schodel et al.,Infect.and.Immun.57:1347-1350);Schodel et al.,J.of Exer.Med.180:1037-1046(1994);Schodel et al.,J.of Virology 66:106-114(1992);Milich et al.,AnnalsNew York Academy of Sciences:187-201(1993))。HBcAgの触媒ドメインのアミノ末端は、Aβ融合タンパク質を培養基中に分泌させるべくシグナル配列を有する。培養基は、大きなアミコン(Amicon)超遠心デバイスを使用して濃縮し、そして濃縮物を大きなSuperdex 75カラムでカラムクロマトグラフィーにかける。溶解した細胞内から得られた組換え産物は、陰イオン交換体およびサイズ排除FPLCの組み合わせを使用して細菌タンパク質から分離する。
第II章:遷移状態抗原を用いたモノローナル抗体の誘導
遷移状態ペプチド抗原
異なる型の遷移状態ペプチド抗原を合成して、予め定めたアミド結合位置でAβの遷移状態を優先的に認識(加水分解)する抗体の生成に使用した。
遷移状態ペプチド抗原を用いた免疫感作
マウスの免疫感作前に、ペプチド抗原を免疫原性キャリアーKLHにカップリングした。標準的なプロトコールを使用して、BALB/cマウスは前記の章に記載したKLHを連結したAβペプチドで免疫感作した。簡単に説明すると、この手順はフロイントアジュバントで乳化した種々の抗原のi.p.注射、続いて2回目は不完全アジュバントで乳化して使用した。ハイブリドーマ融合の3日前に、BALB/cマウスをi.v.でPBS中の抗原を用いて追加免疫感作した。
抗-Aβおよび抗-遷移状態Aβモノクローナル抗体が、隔絶または開裂されるように設計された天然のAβ1-43ペプチドに結合することを示すことは大変重要であった。このために、Aβ1-40およびAβ1-43を125Iで標識し、そしてヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離した。プローブを精製した抗-Aβ抗体または抗-Aβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取った培地のいずれかとインキューベーションした。抗体に結合した125I-Aβ1-43の量は、ポリエチレングリコール分離法を使用して決定した。実験結果を表3に与える。
固相およびTLCのAβタンパク質溶解アッセイ
固相125I-標識Aβアッセイを開発して、特異的タンパク質溶解活性について抗−遷移状態抗体ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。Aβのアミノ酸14〜25を包含するペプチドCys−His−Gln−Lys−Leu−Val−Phe−Phe−Ala−Glu−Asp−Val−Gly−Tyr−アミド(配列番号5)を放射標識し、そしてチオール−反応性、ヨードアセチル-Sepharoseゲルにカップリングして、無関係な連結を作成した。生成物は抗-遷移状態抗体とインキューベーションし、そして固相マトリックスからの可溶性125I-ペプチドの進行的放出をアッセイした。125I-Aβ-Sepharoseからの放射活性の放出は、触媒活性を確認するために使用した(図15)。このアッセイは、このSepharoseを連結したAβ基質を迅速に加水分解するために、数種の異なるプロテアーゼの能力により確認した。インキューベーション時間に伴い上昇する可溶性125I-ペプチドの放出により明らかにされるように、ペプチドは容易にタンパク質溶解的に開裂されることが可能であった。
モノクローナル抗体によるβ-アミロイドの分解(disaggregation)
合成Aβペプチドの自己−集合は、脳内でアミロイド斑に似た顕微鏡構造を導くと既に示され(Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4109-12(1997);Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:452-5(1996))、これがチオフラビンTに暴露すると同じ明るい緑色の蛍光を現す。これらの凝集物は大変安定であり、そして通常は溶解するために苛酷な界面活性剤または強酸が必要である。しかし特定の抗-Aβモノクローナル抗体の結合がこのペプチドの初期の凝集を効果的に阻害し、そしてまた形成されたAβ複合体を分解できることが証明された(Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4109-12(1997);Solomon et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:452-5(1996))。
抗-Aβ抗体は、抗-Aβ抗体を脳に送達するためのベクターとして役立つ抗−トランスフェリンレセプター抗体(抗-TfR)に連結した。7D3マウスモノクローナル抗体を構築物の抗-TfR部分として使用した。7D3はヒトレセプターに特異的であり、そして正常なヒトの脳組織中の皮質毛細管を選択的に免疫染色する(Recht et al.,J.Neurosurg. 72:941-945(1990))。レセプターへの抗体のアタッチメントは、過剰なヒトのトランスフェリンにより遮断されない。この抗体により認識されるエピトープは、したがってレセプター−リガンド結合部位からは離れている。この7D3抗体および抗-Aβ抗体を用いて構築された二重特異性抗体は、アルツハイマー病の患者の治療に有用となると予想される。
新規なベクター化された二重特異性構築物の脳への侵入(entry)をモニターすることができるように、ラットモノクローナル抗-マウストランスフェリンレセプター抗体を、マウスモノクローナル抗体(アメリカン タイプ カルチャー コレクション(ATCC TIB 219)から得た。R17 217.1.3とも呼ばれる(Cell.Immunol.83:14-25(1984))にカップリングした。二重特異性抗体を125Iで標識し、そして正常なマウスにi.v.注射した。異なる時間の後、マウスを屠殺し、そして血液−脳バリアーを横断し、そして脳に入った125I-二重特異性抗体の量を、マウス毛細管消費法(mouse capillary depletion method)(Friden et al.,J.Pharrm.Exper.Ther.278:1491-1498(1996);Triguero et al.,J.Neurochem.54:1882-1888(1990))により測定した。
生きているマウスにおける二重特異性抗体の脳分布のモニタリング
生きてマウスにおける脳内のベクター化された二重特異性抗体の侵入および蓄積を追跡する能力は、斑を持つマウスの脳内処置の開発で大いに援助されるだろう。そのような開発はタイム−コース実験を可能とし、そしてマウス間の変異性の問題を大きく減らすだろう。125I-標識二重特異性抗体を用いた予備実験は、イムノシンチグラフィーがこの系で利用できるかどうかを決定するために行った。第1段階として、放射性標識したベクター化二重特異性抗体(125I-R17/5A11)または非−ベクター化対照二重特異性抗体を別個のマウスに投与した。連続的な脳の画像は、125I-標識二重特異性抗体プローブをi.v.投与してから1、6、24および48時間後に累積した。この技法はどのくらい多くのシグナルが脳を通って循環している血管−骨放射活性レベルによるものであるかを決定するには難点があるが、マウストランスフェリンレセプター反応性二重特異性抗体で処置したマウス 対 対照の二重特異性抗体を受容したマウスの脳で、有意な識別が記録された。ベクター化された作用物質を使用した時、脳のレベルは1から6時間の間に上昇し、そして次いで24から48時間の間に大変低いレベルに低下した。対照で処置したマウスは1から6時間の間に上昇を示さなかった。脳のレベルが24時間以降で低下した理由はわからないが、二重特異性抗体プローブの脱ハロゲン化により遊離の125Iが放出されたのかもしれない。ヨウ素の使用が技術的な問題を与える場合には、ベクター化された二重特異性抗体に結合した111In(Sheldon et al.,Nucl.Med.Biol.18:519-526(1991))または99mTc(Texic et al.,Nucl.Med.Biol.22:451-457(1995))のような放射性標識を利用する別の方法を、さらなる実験で利用することができる。この造影法は、異なる物理的特性および改変された生物分布を持つより小さいベクター化された二重特異性抗体(例えばF(ab')2)が脳により効率的に浸透すかどうかを決定するために有用となるだろう。
ベクターが媒介する脳への輸送のためのF(ab') 2 ヘテロ二量体
全抗体を脳に導入することは、それらが補体を結合し、そして補体が媒介する神経細胞の溶解を促進するならば、有害となるだろう。より小さいベクター化F(ab')2二重特異性試薬の開発は、この問題を回避するものと期待される。凝集したAβ自体が任意の抗体の不存在下で補体を結合し、そして生じた炎症がアルツハイマー病の病状の原因となることが示された。類似の効果を有する脳内抗体の可能性は、抗体のFc領域を排除することにより大きく減少するだろう。さらにFab'の半分のカップリングには本来のヒンジ領域を利用するので、外来の置換連結基を加える必要はない。
発明の方法
抗原の合成。スタチンおよびフェニルアラニンスタチン遷移状態ペプチドは、自動化Fmoc化学を使用して合成した。Fmoc−スタチン(Sta)、[N-Fmoc-(3S,4S)-4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチル-ヘプタン酸]およびFmoc-“フェニルアラニンスタチン"(PhSta)、[N-Fmoc-(3S,4S)-4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸]は市販されているものを購入した。各ペプチドは純度をHPLCにより検査し、そしてその組成をマススペクトルおよびアミノ酸分析により確認した。
抗原のキャリアーへのカップリング。免疫応答を誘導するために、天然および遷移状態Aβペプチドを、マレイミド-活性化KLHに標準的手法でカップリングした(Partis et al.,J.Pro.Chem.2:263-277(1983))。Cys残基を計画的にペプチドのN−またはC−末端に配置して、それらをチオエーテル結合を介してマレイミド活性化キャリアータンパク質にカップリングさせるための適当な連結基を提供した。この安定な連結は、定めた方向にペプチドを付ける。〜20ペプチド/KLHの付加が、この加水分解された結合物のアミノ酸分析により決定されたように、遷移状態アミノ酸含量に基づき得られた(Taso et al.,Anal.Biochem.197:137-142(1991))。
マウスの免疫感作。標準的なプルトコールを使用して、マウスを前記の章に記載したKLH-連結Aβペプチドで免疫感作した。簡単に説明すると、この手法は完全フロイントアジュバントで、続いて2回目からは不完全フロイントアジュバント乳化した様々な抗原のi.v.注射を使用した。ハイブリドーマ融合の3日前、BALB/cマウスをPBS中の抗原で追加免疫感作した。
ハイブリドーマの作成I。ハイブリドーマ融合は、フェニルアラニンスタチン遷移状態Aβ-KLH抗原で免疫感作したマウスの脾臓を使用して行った。マウスから最高力価を持つ脾臓細胞をマウスミエローマNS-1細胞と融合して、標準的な手法に従いハイブリドーマを樹立した(Koehler et al.,Nature 256:495(1975);R.H.Kennett、融合プロトコール。モノクローナル抗体(Fusion Protocol.Monoclonal Antibodies)、R.H.Kennett、T.J.McKearnおよびK.B.Bechtol編集。プレナム出版、ニューヨーク。365-367頁。(1980))。
125 I-Aβ結合アッセイ。Aβ1-40およびAβ1-43を125Iで放射性標識し、そして次いでヨウ素化ペプチドを非標識材料からHPLCにより分離して、定量的な特異的活性を与えた(〜2000Ci/ミリモル)(Maggio et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.89:5462-5466(1992))。このプローブを23℃で1時間、精製した抗-Aβ抗体または抗-Aβ抗体を生産しているハイブリドーマクローンから取った培地とインキューベーションした。ポリエチレングリコール分離法を使用して、抗体に結合した125I-Aβ1-43の量を検出した。連続希釈を使用することにより、このアッセイは異なるハイブリドーマ上清または精製抗体に関する相対的な結合親和性を提供することができる。
固相Aβタンパク質溶解アッセイ。固相125I-標識Aβアッセイは、抗-遷移状態抗体ハイブリドーマ上清を特異的なタンパク質溶解活性についてスクリーニングするために開発した。Aβのアミノ酸14〜25を包含するCys−His−Gln−Lys−Leu−Val−Phe−Phe−Ala−Glu−Asp−Val−Gly−Tyr−アミド ペプチド(配列番号5)を125Iで放射性標識し、そしてヨウ素化したペプチドを次いで非標識材料からHPLCにより分離した。高度に放射性のAβペプチドをチオール−反応性のヨードアセチルSepharoseゲルにカップリングして、無関係な連結を形成した。抗体を標識したAβに加え、これを次いでpH7、25℃で固相マトリックスから可溶性125I-ペプチドの進行的放出についてアッセイした。このアッセイは、このSepharoseを連結したAβ基質を迅速に加水分解するために、数種の異なるプロテアーゼの能力により確認した。可溶性125I-ペプチドの放出はインキューベーション時間に伴い上昇した。
TLCによるAβタンパク質溶解アッセイ。薄層クロマトグラフィーに基づくオートラジオグラフィーアッセイを使用して、Aβの抗体が媒介する開裂に関するより明白な証拠を得た。選択した抗-フェニルアラニンスタチンAβ遷移状態クローンを拡張し、そして腹水生産を誘導した。異なるモノクローナル抗体は、プロテインA-Sepharoseを使用して単離した。開裂アッセイは125I-Aβ1-40およびAβのアミノ酸9-25を包含する125I-標識した17-merを使用した。2つの125I-標識ペプチドの精製したモノクローナル抗体5A11および6E2への結合は、PEG沈殿アッセイまたは同時(co)-電気泳動法によるいずれかを使用することにより調査した。ペプチド開裂は抗体を125I-ペプチドに加え、インキューベートし、そして反応混合物をポリアミド薄層シートにスポット添加することにより試験した。クロマトグラフを異なる溶媒中(例えば0.5N HCl、0.5N NaOH、またはpH7のリン酸バッファー)で展開し、125I-生成物の移動はシートを定量的なホスホイメジャー(Phosphoimager)システムを使用して暴露することにより追跡した。
選択した抗-Aβ抗体のスクリーニングおよび単離。ELISAを使用して最初に抗-Aβおよび抗-遷移状態Aβペプチドモノクローナル抗体をスクリーニングした。遷移状態ペプチドおよび対応する自然なAβペプチドの両方が別々のマイクロタイタープレートに吸着した。ハイブリドーマ上清は、天然および遷移状態Aβペプチドの両方への相対的結合が定量できるように、2つのアッセイを使用してスクリーニングした。拡張およびさらなる実験のために、遷移状態を優先的に認識したか、または高い親和性でAβに結合したモノクローナル抗体を生産しているクローンを選択した。
モノクローナル抗体の増殖および精製。抗-Aβ抗体を生産している選択したクローンおよび抗-レセプター抗体を生産しているクローンを、別個のプリスタン−適用マウスに注射した。腹水を集め、そして特異的モノクローナル抗体を単離した。腹水からの抗体の精製は、プロテインAカラムを使用して行うか、あるいは抗体は(NH4)2SO4沈殿、そしてS-300カラムを通して150kDaの免疫グロブリン面分を得ることにより腹水から単離した。一価のFabフラグメントを調製し、そして確立された方法により単離した。それらの純度は還元および非還元条件下でSDS-PAGEにより評価した。50〜100mgの精製されたモノクローナル抗体が、各々の腹水を有するマウスから日常的に得られた。
Aβ基質に対する触媒活性のさらなる特性決定。単離された抗-遷移状態抗体の加水分解特性を完全に明確にするために、幾つかの大変重要な制御を行うことができる。第1に、適当な遷移状態ペプチドを用いて触媒抗体活性を完全に遮断する能力を確認した。この非開裂性「インヒビター」は、抗体結合部位により一層強く結合し、これにより基質が結合または開裂することを妨げるはずである。基質特異性は、異なるアミノ酸配列を有する偽ペプチドの開裂がないことを示すことによりさらに確立することができる。加水分解の生成物もHPLC、アミノ酸およびマススペクトル分析により完全に特性決定できる。遷移状態Aβには向けられていない対照抗体を試験し、そして触媒作用を生じないことを確認することができる。最後に触媒活性は、抗-遷移状態抗体の精製されたFabフラグメントに存在することを示すことができる。
精製した抗-Aβ抗体は形成されたAβ凝集物を溶解する。(Walker et al.,Soc.Neurosci.Abstr.21:257(1995),Zlokovic,B.V.,Life Science 59:1483-1497(1996))。Aβ沈殿を形成し、そしてインビトロで測定した(Yankner et al.,Science 250:279-282(1990)、Kowall et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.88:7247-7251(1991))。放射性アッセイを使用して生成された様々なモノクローナル抗体について、形成されたAβ凝集物を溶解する能力を迅速にスクリーニングした。125I-Aβを非標識の可溶性ペプチドに加えた後、凝集物はpH5の溶液に入れるか、またはPBS中で一晩撹拌することにより形成された。標識した凝集物のアリコートをPBS、5A11抗-Aβ抗体、または等量の無関係なマウス抗体(7D3、抗-ヒトトランスフェリンレセプター)のいずれかと1時間、インキューベーションした。遠心後、沈殿中の放射活性のレベルを測定した。
ベクター化された抗-Aβ/抗-レセプター二重特異性抗体の作成。抗-Aβ抗体を化学的に抗−ヒトトランスフェリンレセプターおよび抗-マウストランスフェリンレセプター抗体に、異なる方法によりカップリングさせた(Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27623-27628(1997);Raso et al.,トキシンに共有的または非共有的に結合した細胞標的キャリアーとしてのモノクローナル抗体。薬剤のレセプターが媒介するターゲッティング(Receptor mediated targeting of drugs)、第82巻で。G.Gregoriadis,G.Post,J.Senior and A.Trouet,編集。NATOアドバンスト スタディズ研究所(Advanced Studies Inst.)、ニューヨーク、119-138(1984))。迅速なチオエーテル連結法を使用して、Traut's試薬およびヘテロ二官能性SMBP試薬を使用した厳密に二重特異性ハイブリッドを形成した。1成分をゆるやかにチオール基(SH)に置換した。これらは以下の反応に従い、マレイミド-置換された(M)第2成分と混合すると容易に反応してチオエーテル連結を形成する:
AbA-SH + AbB-M → AbA-S-AbB
反応混合物のS-300カラムでのゲル濾過により、300kDaで、そしてAβを結合する2つの部位に加えて脳毛細管内皮細胞上のトランスフェリンレセプターに付くための2つの部位を有する精製された二量体を得た。非-標的対照ハイブリッドは、非特異的MOPC抗体を抗-Aβ抗体に連結することにより形成した。このハイブリッド抗体はAβに結合するが、トランスフェリンレセプターとは反応性ではなく、血液−脳バリアーを横断しないはずである。
Fab'A-SH + Fab'B-SS-E → Fab'A-SS-Fab'B + E-SH
に従い、排他的に二重特異性F(ab')2ハイブリッドを形成することができる。
S-200カラムでの精製により、Aβに結合するための1つの部位および脳の毛細管内皮細胞上の標的エピトープと相互反応するための1つの部位を有するハイブリッドを単離する。
FvA-SH + FvB-SS-E → FvA-SS-FvB + E-SH
全抗体とFab'またはFvに基づく二重特異性試薬のいずれかとの間の平行比較では、後者がトランスフェリンレセプターが媒介する経路を介した細胞の取り込みについて、分子基準でより穏やかに効果的であることが示された(Raso et al.,J.Biol.Chem.272:27623-27628(1997))。このようなより小さい構築物は細胞表面エピトープに対して一価であるので、このような知見は2つの表面レセプターの架橋結合が細胞の免疫複合体の取り込みには必要であるという懸念をめぐいさる。
二重特異性抗体の二重結合活性の機能的アッセイ。125I-Aβに結合するハイブリッド試薬の能力を、元の抗-Aβ抗体と標準的なPEG結合アッセイにより比較した(結合アッセイについては表10を参照にされたい)。
125 I-Aβを用いたAβ結合の測定およびポリエチレングリコール分離。二重特異性を確実とするために、ハイブリッド試薬の125I-Aβのレセプターを持つ細胞への付着を媒介する能力を試験した。トランスフェリンレセプター陽性細胞を、ハイブリッド試験を用いて処理し、非結合材料を洗浄し、そして次いでこれらの細胞を125I-Aβ1-40に暴露した。細胞を洗浄し、そして細胞に結合した放射活性の量を、二重特異性抗体での前処理を除き、同一に調製した対照細胞と比較した。
毛細管消費。二重特異性抗体を125Iで標識し、そして正常マウスにi.v.注射した。異なる時間の後、マウスを屠殺し、そして血液−脳バリアーを横断し、そして脳に入った125I-二重特異性抗体の量を、マウス毛細管消費法(Friden et al.,J.Pharm.Exper.Ther.278:1491-1498(1996);Triguero et al.,J.Neurochem.54:1882-1888(1990))により測定した。脳の実質または脳の毛細管画分に見いだされたベクター化二重特異性抗体の量は、脳のホモジネートの分別密度遠心後に測定した。値をi.v.注射後の時間の関数としてプロットした。毛細管から実質への進行的通過は、血液−脳バリアーをわたった能動的な細胞輸送を示す。
イムノシンチグラフィー。生きてマウスの脳内への放射性標識された二重特異性抗体の侵入の視覚化が関与する脳内送達法をモニタリングするための非侵襲的方法を使用することができる。放射性標識されたベクター化された二重特異性抗体(125I-R17/5A11)または非−ベクター化対照二重特異性抗体を別個のマウスに投与した。連続的な脳の画像は、125I-標識二重特異性抗体プローブをi.v.投与してから1、6、24および48時間後に累積した。動物は、ケタミン/キシラジン麻酔を使用した暴露中に化学的に固定した。この造影法は、循環している抗-Aβ抗体がi.v.投与した125I-Aβが脳に入ることを防止するかどうかを決定するために大変有用となり得る。デジタルシンチグラフィーデータは標準および分析ソフトウェアで提供された積分関数を使用して定量した。
Claims (32)
- 予め定められたアミド結合においてβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体であって、加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであること、かつ、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むことを特徴とする、上記の抗体。
- β-アミロイドの残基39と40の間のアミド結合の加水分解を触媒する請求項1に記載の抗体。
- β-アミロイドの残基40と41の間のアミド結合の加水分解を触媒する請求項1に記載の抗体。
- β-アミロイドの残基41と42の間のアミド結合の加水分解を触媒する請求項1に記載の抗体。
- 予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、しかもELISAを使用して検出するために十分な親和性で天然のβ-アミロイドにも結合する、請求項1に記載の抗体。
- 予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体に優先的に結合し、そしてELISAを使用して検出するために十分な親和性で天然のβ-アミロイドに結合しない、請求項1に記載の抗体。
- 血液脳関門をわたる能力および予め定められたアミド結合におけるβ-アミロイドの加水分解を触媒する能力を特徴とし、かつ、加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであること、および遷移状態類似体がスタチン類似体を含むことを特徴とする、ベクター化された抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項7に記載のべクター化された抗体。
- トランスフェリンレセプターに対する第1の特異性および加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態に対する第2の特異性を有する、請求項8に記載のベクター化された抗体。
- 残基39と40の間のβ-アミロイドアミドの加水分解を触媒する請求項9に記載のベクター化された抗体。
- 有効成分として、β-アミロイドに特異的な抗体を含んで成る動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶するための製薬学的製剤であって、該抗体が予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 動物の血流中の遊離β-アミロイドを隔絶するための製薬学的製剤であって、有効成分として、内因性β-アミロイド上に存在するエピトープを含有する抗原および予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産された抗体を含んでなり、該遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、該抗原が内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために動物を免疫感作するのに使用されるものである、ことを特徴とする上記の製薬学的製剤。
- 有効成分として、内因性のβ-アミロイドに特異的な抗体を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の循環中のβ-アミロイドの停留を増加させるために動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- β-アミロイドに特異的な抗体が、予め定められたアミド結合でβ-アミロイドの加水分解を触媒する触媒抗体である、請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 抗体がモノクローナルである請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 抗体がポリクローナルである請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 抗体がβ-アミロイド1-43のC−末端上のエピトープを特異的に認識する、請求項13に記載の製薬学的製剤。
- 有効成分として、内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含有する抗原を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗原がスタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模するものであり、かつ、該抗原が内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために非ヒト動物を免疫感作するのに使用されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 抗原が、スタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、かつ、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模するものである、請求項18に記載の製薬学的製剤。
- 抗原が、Aβ10-25を含んで成る、請求項18に記載の製薬学的製剤。
- 生成した抗体が、天然のβ-アミロイドよりも遷移状態類似体に対して高い親和性を有する、請求項19に記載の製薬学的製剤。
- 生成した抗体が内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する、請求項19に記載の製薬学的製剤。
- 有効成分として、内因性のβ-アミロイド上に存在するエピトープを含有する抗原を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイド斑の形成を防止するための製薬学的製剤であって、該抗原がスタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模するものであり、かつ、該抗原が内因性β-アミロイドに結合する抗体を生成するために非ヒト動物を免疫感作するのに使用されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 有効成分として、内因性のβ-アミロイドポリペプチドの予め定められたアミド結合における加水分解遷移状態の模造物であるエピトープを含有する抗原を含んで成る動物内の循環しているβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗原がスタチン類似体を含む遷移状態類似体であり、かつ、該抗原がβ-アミロイド加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために非ヒト動物を免疫感作するのに使用されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 有効成分として、内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を含んで成る動物内の循環しているβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が予め定められたアミド結合における加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 有効成分として、予め定められたアミド結合において、動物により生成されるβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の血中のβ-アミロイドレベルにおいて有意な低下を引き起こすために動物に投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 有効成分として、予め定められたアミド結合において動物のβ-アミロイドの加水分解を触媒する、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター化された二重特異性抗体を含んで成る動物の脳内のβ-アミロイドレベルを低下させるための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- ベクター化された二重特異性抗体がトランスフェリンレセプターに特異的に結合する、請求項27に記載の製薬学的製剤。
- ベクター化された二重特異性抗体が、β-アミロイドの残基39と40との間のアミド結合の加水分解を触媒する、請求項27に記載の製薬学的製剤。
- 有効成分として、予め定められたアミド結合において動物により生成されたβ-アミロイドの加水分解を触媒する、血液脳関門をわたって細胞輸送することができるベクター化された二重特異性抗体を含んで成る動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解するための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物の脳内のβ-アミロイドレベルに有意な減少を引き起こすために動物に静脈内投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- 有効成分として、予め定められたアミド結合において内因性のβ-アミロイドの加水分解を触媒する抗体を含んで成る動物の脳内に存在するアミロイド斑を分解するための製薬学的製剤であって、該抗体が加水分解中にβ-アミロイドがとる遷移状態を模する遷移状態類似体で非ヒト動物を免疫感作することを含む方法により生産されたものであり、遷移状態類似体がスタチン類似体を含むものであり、かつ、該抗体が動物に投与されるものであることを特徴とする、上記の製薬学的製剤。
- β−アミロイドの加水分解を触媒する抗体の生成方法であって、
a)ポリペプチドの予め定められたアミド結合における加水分解遷移状態の立体配置を模するスタチン類似体を有するエピトープを含有し、かつ、β−アミロイドである抗原を提供する工程、
b)該加水分解遷移状態に対する抗体を生成するために適当な条件下で、該抗原で非ヒト動物を免疫感作する工程
を含んで成る、上記の抗体の生成方法。
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