CN101531703B - 用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽，以及所述多肽用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的用途。

Description

用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽

技术领域

本发明涉及多肽及其用途，更具体而言，本发明涉及一类可用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽，以及所述多肽用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆症，是一种神经退行性疾病，起病隐匿，病程呈进行性，典型的临床特征是综合认知能力损害及人格改变，表现为早期近期记忆力障碍，继而表现持续性智能衰退、失语、判断推理能力丧失和运动障碍等。这一疾病严重影响患者及其家庭成员的生活质量，也给患者家庭和社会造成沉重负担。

随着人口老龄化进程的加快，老年性疾病已成为一个明显影响人类健康的突出问题。老年性痴呆和恶性肿瘤、心脑血管意外并列为导致老年人死亡的三大疾病，被喻为21世纪人类健康的第四大敌。世界卫生组织已将AD列入21世纪五大重点疾病之一。我国于1999年进入老龄社会。2004年底，我国60岁及以上老年人口达到1.43亿，占总人口的10.97％。据预测，这一数字在2014年将达到2亿，2026年达到3亿，2037年超过4亿，2051年达到最大值，之后一直维持在3亿～4亿的规模。老龄人口的不断增多，使阿尔茨海默病的发病率相对上升。据了解，目前，欧洲、日本和美国80岁以上的人口中有20％以上的人患有此病。全世界65岁以上人口中有5000多万人患有不同种类的痴呆症。

阿尔茨海默病的病理学改变的主要特征为：神经细胞之间形成大量由β淀粉样肽(β-amyloid peptide，简写为Aβ或βA)沉积形成的老年斑(senileplaque，SP)、神经细胞内过度磷酸化的Tau蛋白所致的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangle，NT)和神经元大量丢失。众多证据表明Aβ的神经毒性是所有病因的共同交汇点。因此靶向Aβ的预防和/或治疗已成为近年来AD研究的焦点之一。

Aβ是β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)的代谢产物。正常情况下APP在α分泌酶作用下，生成可溶性的sAPPα，sAPPα具有降低细胞内钙浓度，调节突触可塑性、促进突触的生长和保护神经元的功能，这是APP加工的主要形式，这一途径不产生Aβ；另一途径是APP在β分泌酶作用下产生sAPPβ和C99，C99进一步在γ分泌酶作用下，释放Aβ肽。γ分泌酶水解C99是不均一的，酶切丙氨酸713和苏氨酸714之间位点产生Aβ_1-42；酶切缬氨酸711和异亮氨酸712之间的位点产生Aβ_1-40(Selkoe DJ.Alzheimer’s disease：genes，proteins，and therapy.Physiol Pev，2001，81(2)：741-766)。Aβ_1-42占Aβ蛋白总量的10％左右，Aβ_1-40大约占90％，但Aβ_1-42则更容易聚集，聚集的Aβ_1-42是构成老年斑的基本成分。

Aβ_1-42肽的一级结构如下所示(SEQ ID NO：4)：

Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-

 1               5                   10                  15

Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-

16              20                   25                  30

Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gty-Gly-Val-Val-Ile-Ala

31              35                   40      42

Aβ_1-42C端的10个氨基酸残基33～42及17～21位的氨基酸残基具有高度的疏水性，构成了Aβ_1-42疏水区；28-42位氨基酸残基形成β折叠构象的可能性较大，而9-21位的氨基酸残基也可能形成β折叠构象。β折叠构象有利于Aβ_1-42肽的聚集。实验结果表明，C端的Val⁴⁰Ile⁴¹Ala⁴²三个氨基酸残基对β折叠的构象起到了稳定的作用，有利于β折叠的形成。Aβ肽_1-42的N端具有亲水性，根据溶液条件的不同，能够形成α螺旋，无规螺旋或β折叠的构象。研究结果表明β折叠构象有利于Aβ肽的聚集，而Aβ肽的聚集又是由于其疏水区的相互作用。Soto等人(Soto C，Kindy MS，Baumann M，et aL.，Inhibition of Alzheimer′s amyloidosis by peptides that preventbeta-sheet conformation.Biochem.Biophys.Res.Commun.1996，226(3)：672-680)用脯氨酸取代Aβ肽疏水区附近的氨基酸，得到的小肽不仅不会形成β折叠的构象，同时还可以与Aβ肽相结合，使其维持无规螺旋的构象，抑制其聚集。研究结果发现Aβ肽的疏水区之一：Aβ_16-20五肽片段Lys-Leu-Val-Phe-Phe能与Aβ肽相结合，从而阻止其聚集。通过丙氨酸逐个取代，表明Lys¹⁶、Leu¹⁷、和Phe²⁰在其中起了关键作用。这说明了Aβ^16-20残基是Aβ肽聚集过程中与邻近Aβ肽链相结合的部位。研究显示Aβ的空间构象明显影响其聚集能力，当其二级结构以α螺旋为主时，聚集较慢；而以β折叠为主时，聚集较快。

在一定条件下，富含β折叠的结构疏水区暴露，会促使Aβ聚集，形成低聚物，最终成为不可溶性物质在神经元间隙沉积，产生神经毒性并引起脑内胶质细胞活性增高，产生炎性介质和补体，共同形成淀粉样斑块。

分子的疏水性电荷数增多是Aβ聚集的主要原因之一。与Aβ_1-40相比Aβ_1-42延长的两个氨基酸不仅增加了Aβ的疏水性，使其更易聚集，而且提高了聚集物的稳定性，早期即可选择性地在淀粉样斑块中沉积。Aβ_1-42可能是可溶性Aβ形成寡聚物、纤维和斑块的始动因素(Younkin，S.G.1995.Evidencethat A beta 42 is the real culprit in Alzheimer’s disease.Ann.Neurol.37：287-288.；Matsuok Y，Saito M，Lafrancois T，et al.Noval therapeuticapproach for the treatment of Alzheimer’s disease by peripheraladministration of agents with an affinity to β-amyloid[J].J Neurosci，2003，23(1)：1-5)。

Jarrett等提出：Aβ_1-42是作为“种子”首先聚集启动了Aβ的沉积；其他单体逐渐聚集到核的周围，延长(elongation)肽链形成纤维进一步聚集并传播，最后形成斑块(Jarrett JT，Lansbury PT Jr.Seeding“one-dimensionalcrystallization”of amyloid：a pathogenic mechanism in Alzheimer’sdisease and scrapie？Cell.1993，(6)：1055-1058)。

从Aβ聚集、沉淀再到老年斑的形成及其伴随的神经元损害被认为是阿尔茨海默病的病理机制的中心环节。因此，若能够抑制Aβ肽的聚集，加速Aβ肽的降解与清除，便能够从根本上达到预防和/或治疗AD的目的。

目前国际上针对Aβ的药物的研究目标是减少Aβ的生成，增加Aβ清除、预防或逆转Aβ聚集和抑制Aβ的毒性等。美国华盛顿大学医学院的研究人员发现，在清除阿尔茨海默病小鼠脑内的淀粉蛋白斑块后，小鼠的脑细胞开始奇迹般地恢复功能。表明针对Aβ的药物有着令人鼓舞的前景。在各种针对Aβ的药物中，β片层阻断剂越来越为人关注。

当前国际上属于β片层阻断剂的药物主要有以下两种：

(1)加拿大Neurochem公司根据低相对分子质量氨基糖蛋白(gly-cosaminoglycan，GAGs)在β淀粉样蛋白斑块中起稳定斑块作用并阻碍斑块降解这一发现，设计并合成了该GAG的衍生化合物。动物体内实验表明，该类低相对分子质量GAG类似物可以显著降低β淀粉样蛋白在血浆和脑内水平，抑制Aβ聚集，用于治疗AD。目前小分子化合物Alzhemed处于III期临床试验阶段。

(2)Chacón等(Chacón MA，Barría MI，Soto C，et aL.，Beta-sheetbreaker peptide prevents beta-induced spatial memory impairments withpartial reduction of amyloid deposits.Mol.Psychiatry.2004，9(10)：953-61)通过腹腔注射纤维化Aβ使大鼠发生行为障碍，然后检验由5个氨基酸残基组成的β片层阻断肽(fiye-amino-acid beta-sheet breaker peptide，iAbeta5p)对神经元的保护作用，结果显示iAbeta5p不仅能阻止Aβ纤维的形成，而且对Aβ纤维具有分解能力，目前该药处于III期临床试验阶段。

本领域目前需要能够与β淀粉样蛋白单体(Aβ_1-42)特异结合，稳定其正常空间结构，抑制其形成β片层，阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成的新的活性药剂。所述药剂应能够抑制Aβ肽的聚集，加速Aβ肽的降解与清除，从而可用于AD的预防和/或治疗。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能与β淀粉样蛋白单体(Aβ_1-42)特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成β片层、阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成、且对Aβ纤维具有分解作用的多肽，所述多肽可以被称为β片层阻断肽。

本发明的发明人意外地发现，包括如下氨基酸序列的多肽能够实现上述目的：

His-X1-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp

其中：X1可以为赖氨酸残基(Lys，K)或者谷氨酰胺残基(Gln，Q)；

X2可以为赖氨酸残基(Lys，K)或者谷氨酰胺残基(Gln，Q)；

X3可以为缬氨酸残基(Val，V)或者脯氨酸残基(Pro，P)；

X4可以为丙氨酸残基(Ala，A)或者谷氨酸残基(Glu，G)。

因此，在本发明的第一方面，提供了包括上述氨基酸序列的多肽。

由于上述的多肽能与β淀粉样蛋白单体(Aβ_1-42)特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成β片层、阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成、且对Aβ纤维具有分解作用，因此可以用于阿尔茨海默病的预防和/或治疗。

因此，在本发明的第二方面，提供了本发明的多肽在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括一种或多种本发明的多肽和可药用的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的本发明的多肽。

附图说明

图1显示了制备本发明多肽的一种示例性方法的步骤和所制备产品的检测结果。图1A显示了用于合成和纯化本发明多肽H101的一种示例性方法的主要步骤；图1B显示了H101的色谱分析结果；图1C显示了H101的质谱检测结果。

图2显示了Aβ_1-42肽聚集和纤维形成的硫磺素T荧光分析结果，表明本发明多肽对Aβ聚集的荧光强度的影响。将给定浓度的Aβ_1-42肽与本发明的多肽H101、H102或H103或维生素E(VE)或L5在37℃孵育24小时，然后测量ThT荧光强度。n＝5，*表示与Aβ_1-42组相比P＜0.05。

图3显示了H102和维生素E抑制Aβ_1-42纤维形成的剂量依赖性曲线，将浓度为10μmol/L、20μmol/L、44.30μmol/L、100μmol/L的H102和维生素E与11.07μmol/L的Aβ_1-42在37℃共孵育24小时，然后测量ThT荧光强度。n＝5。

图4显示了H102和维生素E抑制Aβ_1-42纤维形成的时间依赖性曲线，将浓度为44.30μmol/L的H102和维生素E与11.07μmol/L的Aβ_1-42在37℃共孵育，分别在12小时，1天、3天、5天和7天时测量ThT荧光强度。n＝5。

图5显示了用浓度为44.30μmol/L的各种多肽与11.07μmol/L的Aβ_1-42在37℃一起孵育5天后，Aβ_1-42多肽纤维形成的电镜观察结果。其中：图5A为将Aβ_1-42单独孵育5天的电镜结果，放大倍数35000倍；图5B为将Aβ_1-42单独孵育5天的电镜结果，放倍数50000倍；图5C为将多肽L5与Aβ_1-42一起孵育5天的电镜结果，放倍数35000倍；图5D为将多肽H101与Aβ_1-42一起孵育5天的电镜结果，放倍数35000倍；图5E为将多肽H102与Aβ_1-42一起孵育5天的电镜结果，放大倍数35000倍；图5F为将多肽H103与Aβ_1-42一起孵育5天的电镜结果，放倍数35000倍；

图6显示了不同浓度(10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L)的各种多肽对于与5μmol/L的A β_1-42一起培养72小时的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的存活率的影响。n＝12，*表示与Aβ_1-42组相比P＜0.05。

图7显示了用APPN末端抗体和Aβ抗体对各组小鼠的海马CA1区神经元切片进行免疫组化染色的结果，放大倍数为400倍。图7A：对照组的APP N末端抗体免疫组化染色结果；图7B：对照组的Aβ抗体免疫组化染色结果；图7C：模型组的APP N末端抗体免疫组化染色结果；图7D：模型组的Aβ抗体免疫组化染色结果；图7E：多肽注射组的APP N末端抗体免疫组化染色结果；图7F：多肽注射组的Aβ抗体免疫组化染色结果。

图8显示了用刚果红对各组动物的大脑颞叶皮层和海马进行染色的结果，放大倍数为400倍。图8A：对照组的大脑颞叶皮层的刚果红染色结果；图8B：对照组的海马的刚果红染色结果；图8C：模型组的大脑颞叶皮层的刚果红染色结果；图8D：模型组的海马的刚果红染色结果；图8E：多肽注射组的大脑颞叶皮层的刚果红染色结果；图8F：多肽注射组的海马的刚果红染色结果。

具体实施方式

在本文中公开了一系列多肽的氨基酸序列，本领域技术人员能够理解的是，在以单字母或三字母的氨基酸残基表示某一序列时，该序列从左至右表示的是该多肽从N端(氨基端)至C端(羧基端)的序列。例如当使用“His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp”或“HQKLVFFAED”表示某一多肽的序列时，意为该多肽的序列为“N端-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-C端”，即“N端-HQKLVFFAED-C端”。

在本发明的第一方面，提供了包括下述氨基酸序列的多肽：

His-X1-X2-Leu-X3-Phe-Phe-X4-Glu-Asp

其中：X1可以为赖氨酸残基(Lys，K)或者谷氨酰胺残基(Gln，Q)；

X2可以为赖氨酸残基(Lys，K)或者谷氨酰胺残基(Gln，Q)；

X3可以为缬氨酸残基(Val，V)或者脯氨酸残基(Pro，P)；

X4可以为丙氨酸残基(Ala，A)或者谷氨酸残基(Glu，G)。

本发明的多肽可以包括上述氨基酸序列、基本上由上述氨基酸序列组成或者由上述氨基酸序列组成。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种具有如下序列的多肽，所述多肽在本发明中被命名为H101：

H101：His-Lys-Gln-Leu-Val-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(HKQLVFFEED)(SEQID NO：1)。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种具有如下序列的多肽，所述多肽在本发明中被命名为H102：

H102：His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(HKQLPFFEED)(SEQID NO：2)。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种具有如下序列的多肽，所述多肽在本发明中被命名为H103：

H103：His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp(HQKLVFFAED)(SEQID NO：3)。

在本文中公开了多种多肽的氨基酸序列。显而易见的是，可以对本发明的多肽进行各种修饰。所述的修饰包括但不限于：脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的o-氨基基团的甲基化，N端氨基的乙酰化以及在某些情况下C端羧基的酰胺化。应该理解的是，在获知本发明多肽的氨基酸序列之后，上述各种修饰形式对于本领域技术人员是显而易见的，并且含有这些修饰的包括所公开氨基酸序列的多肽也在本发明的范围之内。

上述的本发明多肽能够作为β片层阻断肽，它们能够与β淀粉样蛋白单体(Aβ_1-42)特异结合、稳定其正常空间结构、抑制其形成β片层、阻止可溶性β淀粉样蛋白寡聚体和β淀粉样蛋白斑块形成、且对Aβ纤维具有分解作用，因此可以用作预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物。

所以，在本发明的另一方面，提供了本发明的多肽在制备预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

本文中所使用的“预防”指的是减少受试者患上疾病的风险或者延迟患者患病或症状出现的时间。本文中所使用的“治疗”并不是指完全治愈。它是指减轻了潜在疾病的症状和/或减少了导致症状的一种或多种潜在的细胞、生理或生物化学病因或机理。应理解本文所使用的被减轻是相对于疾病状况而言的，包括疾病的分子状况，而不仅仅是疾病的生理状况。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括一种或多种本发明的多肽和可药用的载体。

“可药用的载体”是指在生物学上或其他方面不会具有不良作用的物质，即可以将所述物质与本发明的多肽一同给予受试者，同时不会引起任何不良的生物学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。显然应当选择可使活性成分的任何降解降到最低并且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体，这是本领域技术人员所熟知的。

本发明的药物组合物通常包括至少一种本发明的多肽和一种或多种可药用的载体。合适的载体包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、载体、冲淡剂、赋形剂和/或药用佐剂。例如，合适的载体可为生理盐水溶液、柠檬酸盐缓冲液或人工CSF，以及可能添加常用于肠胃外给药组合物的其他物质。中性缓冲盐溶液或与血清清蛋白混合的盐溶液也是示例性的载体。本领域技术人员可以容易地确定可用于本发明组合物和剂型的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于可药用的弱酸、弱碱或它们的混合。优选地，缓冲组分为水溶性物质，例如磷酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、谷氨酸，以及它们的盐。

载体中的基本溶剂在性质上可以为水性的或非水性的。另外载体可以含有用于改善或维持制剂pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、无菌度、稳定性、溶出速度或气味的其他可药用赋形剂。本发明的药物组合物还可以含有其他可药用的用于改善或维持本发明多肽的释放速率的载体。这类载体为配制缓释制剂的技术人员已知的物质。

当本发明的药物组合物被配制成以后，可在无菌管中以溶液、悬液、凝胶、乳剂、固体或者脱水或冻干粉末的形式储存。这些制剂也可以以即用形式、以用前需要重配的冻干粉形式或以用前需要稀释的液体形式储存。优选地，本发明的药物组合物以单次使用的无菌管装形式提供，并在用前一直在2-8℃储存。在即将给药前，可将本发明的药物组合物用合适的无菌的例如任何上述的柠檬酸盐缓冲液恰当地稀释。

本发明还提供了一种预防和/或治疗受试者的阿尔茨海默病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的本发明的多肽。

术语“有效量”意为所使用的化合物的量足以防止疾病的发病或症状的出现，或者改善疾病或病症的一种或多种病因或症状。所述改善只需减轻或改变而并不必须消除。对于本发明多肽而言，其预防和/或治疗有效量应根据所针对的个体以及所用的多肽而变化。所用的多肽的预防和/或治疗有效量也应根据个体的年龄、身材、体重、状况等而变化。针对具体受试者，确定本发明多肽的预防和/或治疗有效量是在本领域技术人员的能力范围之内的。

将本发明的多肽或本发明的预防和/或治疗方法应用于阿尔茨海默病受试者时，具有显著抑制受试者脑组织内Aβ聚集，减少淀粉样斑块的数量和面积，改善阿尔茨海默病症状的效果。例如可以提高活动力和注意力并减少反应时间，可以改善发音、面部表情、体态、嗅觉、性欲、性功能和情绪状况并使精神状态愉快。在本发明的另一个实施方案中，可以适当地对例如阿尔茨海默病患者给予本发明的多肽作为认知增进剂，从而提高特别是被痴呆损害的学习能力或者抑制认知衰退和/或痴呆。

本发明的多肽的制备

本发明的多肽可以通过本领域技术人员已知的任何制备多肽的方法来制备。

可以使用化学合成法合成本发明的多肽。多肽的合成可以在溶液中进行，也可以使用固相合成法。多肽的固相合成方法包括Fmoc固相合成法和tBoc固相合成法。人工合成多肽的方法一般从C端(羧基端)向N端（氨基端)合成。

在本发明的一个实施方案中，采用Fmoc固相合成法合成本发明的多肽，并通过HPLC进行纯化。图1以示例性的方式显示了在这个实施方案中合成和纯化本发明的一种多肽H101的主要步骤和所制备多肽的检测结果。在这个实施方案中，使用多肽固态合成仪在合成柱上合成多肽，从而大大减轻了产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，合成柱和添加氨基酸的侧链是被保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。本发明的多肽在采用Fmoc法合成和采用制备高效液相(HPLC)柱纯化后，可以使用质谱(MS)分析来鉴定。应当理解的是，所有本发明的多肽均可用与上述实施方案类似的合成方法来制备、纯化和鉴定。

也可以通过重组基因工程的方法生产本发明的多肽。简而言之，可以合成编码本发明多肽的多核苷酸，然后将其用本领域已知的方法转化至合适的宿主细胞中并使其被表达，对表达产物进行纯化或处理即可得到本发明的多肽。

实施例

下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例是为了使本领域普通技术人员能够更好地理解本发明，这仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明，份数为重量份数，温度以℃为单位或者为环境温度，压力接近或等于大气压。

实施例1：本发明的多肽的制备

在本实施例中，首先使用Fmoc/tBu固相多肽合成法合成了本发明的一种多肽H101，所述多肽的序列为：

His-Lys-Gln-Leu-Val-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQ ID NO：1)。

本实施例的多肽合成方法中所用原料为：Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin(0.37mmol/g)、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His(trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH和Fmoc-Phe-OH。

本实施例中应用的多肽合成和纯化方法的主要步骤如图1A所示。

图1A所示的实验方案中所用的TFA试剂的配方为：[TFA∶H₂O∶乙二硫醇∶苯酚，以体积比为92.5∶2.5∶2.5∶2.5混合]。

将制备得到的肽粗产品通过HPLC纯化，使最后获得的肽的纯度大于95％，HPLC的结果示于图1B。

将通过上述方法制备和纯化的多肽H101使用质谱(MS)分析鉴定并测序，质谱分析的结果示于图1C。鉴定和测序的结果显示，用上述方法制备的多肽序列和分子量与预期相符。

用与本实施例中类似的方法，随后还制备了以下几种本发明的多肽：

H102：His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQ ID NO：2)；

H103：His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp(SEQ ID NO：3)。

对以上几种合成多肽的测序和鉴定结果表明，本实施例所述的合成和纯化方法适用于本发明的各种多肽。用所述方法制备的各种多肽的序列和分子量均与预期相符。并且用上述纯化方法可以得到纯度大于95％的多肽产物。

实施例2：本发明多肽对β淀粉样蛋白的影响

材料与方法

1.药品与试剂：Aβ_1-42(纯度＞98％)、维生素E、硫磺素T(Thioflayin T，ThT)、噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，均购自美国Sigma公司；MEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(trypsin)均购自美国Gibco-BRL公司；本发明的几种多肽H101、H102和H103采用实施例1所述的方法制备；同时还用与实施例1所述方法类似的方法合成了一种五肽Leu-Pro-Phe-Phe-Asp，该五肽与Soto-Jara等人发明的β片层阻断肽iAbeta5的序列相同，并且在本发明中被命名为L5，在本实施例和其后的实施例中将使用L5肽作为对照。以上几种多肽均由上海吉尔生物公司合成，并通过高效液相色谱法(High performance LiquidChromatography，HPLC)纯化，经质谱仪(MS)分析鉴定纯度均＞95％。

2.硫磺素T(Thioflavin T，ThT)荧光分析和电子显微镜观察：ThT荧光强度可以反映Aβ的聚集程度，所以用ThT荧光来分析该蛋白的聚集程度。据报道，维生素E(VE)可以有效抑制Aβ聚集和纤维形成，因此本实验采用维生素E作为阳性对照。将Aβ_1-42冻干粉用50mmol/L PBS(pH7.4)配制成22.15μmol/L溶液，将上述四种多肽(H101、H102、H103和L5)用同样的PBS分别配制成浓度为88.61μmol/L的溶液，维生素E用含0.2％Tween 80的PBS配制成88.61μmol/L的乳化液。实验时将Aβ_1-42溶液与各种多肽溶液等体积混合，使它们的终浓度分别为11.07μmol/L和44.30μmol/L。将Aβ_1-42和维生素E乳化液等体积混合作为阳性对照，将只含有Aβ_1-42而不含有任何上述多肽或维生素E的溶液作为阴性对照。将上述各组溶液在37℃共同孵育24h后，每组取10μl加入990μl的3.0μmol/L ThT磷酸盐缓冲液中，在激发波长453nm，发射波长478～486nm处测定ThT荧光强度。

3.本发明多肽与Aβ_1-42的量效和时效关系：选取多肽H102，用上述PBS配制成系列浓度，与11.07μmol/L Aβ_1-42溶液在37℃共同孵育24小时后取样进行ThT荧光检测，以确定本发明多肽与Aβ_1-42的量效关系。将浓度为44.30μmol/L的H102和维生素E与11.07μmol/L的Aβ_1-42在37℃共孵育，分别在孵育开始后12小时(12h)、1天(1d)、3天(3d)、5天(5d)和7天(7d)取样进行ThT荧光检测，以确定观察各种多肽与Aβ_1-42的时效关系，同时，单独孵育Aβ_1-42肽作为阴性对照。

4.电镜观察：为了进一步观察纤维的形成，用浓度为44.30μmol/L的各种多肽与11.07μmol/L的Aβ_1-42在37℃一起孵育5天后，取每组样本各5μl，滴于含碳支持膜的300目去离子铜网上，室温静置15min。2％醋酸双氧铀避光负染2min，干燥后用透射电镜观察。同时将Aβ_1-42肽单独孵育5天作为阴性对照。

5.细胞毒性实验：选择本领域常用的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为细胞毒性实验的对象，该细胞系购于首都医科大学宣武医院，在MEM培养基内按常规方法培养，其中添加10％(v/v)的胎牛血清，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每5天传代一次。将细胞生长状态稳定并处于对数生长期的SH-SY5Y细胞以密度为1.0×10⁴/ml接种于96孔板(Costar产品)，每孔培养液体积200μl，24小时后更换为无血清培养基，并加入5μmol/L Aβ_1-42溶液，分组。将前述四种多肽分别以10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L浓度加入各组细胞的培养液中。将只加入无血清培养基未加入Aβ_1-42和多肽的细胞组作为阳性对照，将培养基中只加入Aβ_1-42而未加入上述多肽的细胞组作为阴性对照。在加入多肽后72小时，向每孔中加入3-(4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)(5mg/ml)20μl，37℃孵育4小时，弃去原培养液，每孔加入DMSO 200μl，静置10min，震摇1min，使甲臜颗粒完全溶解，用全自动酶标仪测定492nm处的光密度值(Opticaldensity，OD)。

6.统计学处理：对于两组之间的数据比较，采用t检验方法；对于两组以上的数据比较，采用F检验方法。

结果

1.所测试的各种多肽对Aβ_1-42聚集和纤维形成的抑制作用

用ThT荧光法分析所测试的各种多肽和VE对Aβ_1-42聚集和纤维形成的影响，Aβ_1-42在PBS溶液中能形成非常高的荧光强度，表明Aβ_1-42能自我聚集和形成Aβ纤维。将只含有Aβ_1-42而不含任何测试多肽或维生素E的阴性对照的荧光强度计为100％。计算所测试的各种多肽对Aβ_1-42聚集和纤维形成的抑制率(％)。结果示于下表1(注：表1中各数据均已扣除仪器系统本身产生的本底荧光)。

表1：各种多肽对Aβ聚集的抑制作用(％)

所测试的多肽	L5	H101	H102	H103	维生素E
						抑制(％率)	25.74	24.79	27.84	14.91	24.85

由上表1的结果可以看出，H102对Aβ_1-42聚集的抑制率最高，向下递减依次为：L5、维生素E、H101和H103。

将上表的实验结果绘制成直方图，示于图2。

如图2所示，H102能明显抑制Aβ_1-42聚集和纤维形成；维生素E与Aβ_1-42共同孵育，也有明显抑制Aβ_1-42聚集和纤维形成的作用，但其效果比H102弱。

2.本发明多肽与Aβ_1-42的量效关系：图3示出了不同浓度的多肽H102和维生素E与11.07μmol/L Aβ_1-42溶液在37℃共同孵育24小时后，进行ThT荧光检测的结果。由图3可以看出，H102和维生素E对Aβ纤维形成的抑制具有浓度依赖效应，H102在每一浓度点的抑制率均大于维生素E。H102和维生素E的最高抑制浓度均在20μmol/L附近。

3.本发明多肽与Aβ_1-42的时效关系：图4示出了本发明多肽H102和维生素E与11.07μmol/L Aβ_1-42溶液在37℃共同孵育不同时间后，进行ThT荧光检测的结果。由图4可以看出，11.07μmol/L Aβ_1-42单独孵育前24h的荧光强度较低，第3天急剧增强，随后形成一平台式增长，H102组和VE组的各时间点的荧光强度均明显减弱，并且以H102处理组的效果最为显著。以曲线的半高峰出现的时间T_1/2代表曲线的变化特征，Aβ组的T_1/2在第3天。与Aβ组相比，H102和维生素E组将T_1/2延迟至第4天。

4.电镜观察结果：

图5显示了用浓度为44.30μmol/L的各种多肽与11.07μmol/L的Aβ_1-42在37℃一起孵育5天后，Aβ_1-42多肽纤维形成的电镜观察结果。从各图中可以看出，Aβ_1-42单独孵育5d，出现大量Aβ纤维，直径约8～10nm，长约0.5～5μm，呈芒刺式晶状聚集，有分枝，甚至交织成网状，其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构(图5A和5B，对照组)；L5与Aβ孵育5d，形成的Aβ纤维明显较细，并聚集成直径约4～gnm，长0.3～5μm，交织成网状，其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构(图5C)；H101与Aβ共同孵育5d，有Aβ纤维形成，直径较细，约5～8nm，长0.5～5μm，有分枝交织成网状，其间可见极少量呈聚集状态的无定形结构(图5D)；H102与Aβ共同孵育5d，Aβ纤维形成明显减少且直径变细，约3～6nm，长0.3～3μm，交织成网状，其间夹杂着极少量呈聚集状态的无定形结构(图5E)；H103与Aβ共同孵育5d，Aβ纤维形成，并聚集成直径约5～8nm，长0.5～5μm，呈芒刺式晶状聚集，交织成网状，其间夹杂着少量呈聚集状态的无定形结构(图5F)。

5.本发明多肽对SH-SY5Y细胞存活率的影响

图6显示了不同浓度(10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L)的各种多肽对于与5μmol/L的Aβ_1-42一起培养72小时的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的存活率的影响。n＝12，*表示与Aβ_1-42组相比P＜0.05。

由图6中可以看出，Aβ_1-42作用于SH-SY5Y细胞72h后，细胞存活率下降，而用不同浓度的4种多肽(10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L)分别与Aβ_1-42共同孵育细胞，细胞存活率有所改善，并呈现一定的剂量依赖关系。以上结果表明，H102对细胞存活率的提高最有效，并且以20μmol/L为最适浓度。

实施例3：H102对APP转基因小鼠脑内淀粉样蛋白(Aβ)和淀粉样蛋白前 体蛋白(APP)表达的影响

材料与方法

实验动物：9月龄APP 695转基因小鼠30只，同遗传背景同月龄C57BL/6J小鼠10只，雌雄不限，均购自中国医学科学院中国协和医科大学试验动物研究中心。

药品与试剂：Aβ_1-42抗体购自美国Chemicon公司；APP抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DBA显色试剂盒、刚果红购自武汉博士德公司；其他试剂均为国产分析纯。H102多肽采用如实施例1所述的方法制备、纯化和鉴定，在实验时用生理盐水稀释配制成40μmol/L溶液。

动物分组和模型制备：30只APP 695转基因小鼠随机分为模型组15只，多肽注射组15只；C57BL/6J 10只设为正常对照组。多肽注射组：每次向动物侧脑室注射40μmol/L的H102生理盐水溶液3μl，对照组和模型组：每次向动物侧脑室注射等体积生理盐水，每日注射一次，连续注射10天。所有动物均以相同条件饲养于天津医科大学实验动物中心SPF级清洁鼠房。

将动物用10％水合氯醛按400mg/Kg体重的剂量进行腹腔麻醉后，固定于脑立体定向仪上，剪去头部毛发，用氨尔碘消毒后，沿正中线切开头部皮肤长约1cm，剥离骨膜，显露骨性标志。调整小鼠头部平面，使Bregma和Lambda处于同一高度。参照George’s小鼠脑立体定位图谱，在颅骨上于侧脑室(P_0.58，R₁，H_-1.5)位置打一直径为1mm小孔为进针点。手术后第二天，开始注射。借助小动物脑立体定位仪通过微量注射器缓慢、匀速地向侧脑室注入3μl多肽溶液或生理盐水，注射结束后留置针1min，缓慢退针。局部压迫止血，连续注射10天。

小鼠海马石蜡切片的制备：对各组动物连续进行侧脑室注射10天后，采用0.1kg/L水合氯醛按4mL/kg体重的剂量进秆腹腔注射麻醉，经左心室迅速插管，同时剪开右心房，快速灌注生理盐水；待肝脏变白后，改灌注40g/L多聚甲醛，速度先快后慢，至小鼠四肢僵硬为满意；取小鼠脑，快速放入含30％蔗糖的多聚甲醛溶液中固定2～4天。待脑组织下沉后，即可行蜡块包埋。行小鼠脑矢状面切片，待海马CA1区出现后，进行连续切片，每隔10张取1张，每只小鼠每种抗体取3张，厚度5μm。

免疫组织化学染色：按照免疫组化试剂盒说明书的步骤，分别进行Aβ、APP的免疫组化染色，第一抗体稀释度分别为1∶100和1∶200，第二抗体稀释度均为1∶100。在400倍放大倍数下观察并拍照。

小鼠脑组织切片的刚果红染色：上述石蜡包埋切片脱腊至水，浸入10％甲醛液15min后，直接浸入刚果红染色液15min，水洗4min，浸入苏木素液2min，水洗后将切片浸入0.5％盐酸乙醇分化，充分水洗泛蓝后用乙醇脱水，用二甲苯透明化，用中性树胶封固。在400倍放大倍数下观察并拍照。

结果

1.APP N末端抗体免疫组化染色和Aβ抗体免疫组化染色。

图7显示了用APP N末端抗体和Aβ抗体对各组动物的海马CA1区神经元切片进行免疫组化染色的结果。

从图7中可以看出：(1)对照组中APP N末端抗体和Aβ抗体免疫组化染色的结果(分别为图7A和图7B)显示：对照组海马CA1区神经元胞浆着色呈阴性或弱阳性；(2)模型组中APP N末端抗体和Aβ抗体免疫细化染色的结果(分别为图7C和图7D)显示：模型组与对照组相比阳性细胞增多，表达增强，胞浆着色明显加深；(3)多肽注射组中APP N末端抗体和Aβ抗体免疫组化染色的结果(分别为图7E和图7F)显示：多肽注射组APP同模型组相比阳性细胞减少，胞浆着色变淡，表达减弱。

2.刚果红染色。

用刚果红对小鼠脑组织病理切片进行染色后，对小鼠大脑颞叶皮层和海马淀粉样斑块表达情况进行观察，染色结果示于图8。

从图8中可以看出：(1)对照组小鼠的大脑颞叶皮层(图8A)和海马(图8B)中未见阳性淀粉样斑块；(2)模型组小鼠的大脑颞叶皮层(图8C)和海马(图8D)出现大小不一，淡红色着色团块状淀粉样蛋白斑块物质，多为圆形或类圆形，散在分布，分布密度不均，周围可见多少不等的神经元细胞；(3)多肽注射组小鼠的大脑颞叶皮层(图8E)和海马(图8F)也出现一些团块状淀粉样蛋白斑块物质，但是多肽注射组中的淀粉样斑块数比模型组明显减少。

结论

免疫组化染色结果显示：在模型组小鼠大脑CA1区，Aβ_1-42阳性的细胞明显高于正常对照组。而H102多肽注射组阳性的细胞较模型组明显减少。由此推测H102在体内可以抑制Aβ的聚集，降低Aβ的毒性。此外，刚果红染色发现，转基因组小鼠脑内明显出现淀粉样斑块，正常对照组小鼠脑中未见斑块，H102多肽注射组小鼠脑内的淀粉样斑块的数目和面积较转基因组有明显的减少。这也验证了H102可以抑制Aβ的聚集，减少其生成的结论。

在本申请中，引用了多种出版物。所提及的出版物通过引用的方式全文纳入本说明书中，以便更加详尽的叙述本发明所属技术领域的情况。

对于本领域技术人员显而易见的是，只要不背离本发明的范围和精神，可对本发明进行各种修改和变动。通过考虑本发明在此所公开的说明书和实例，本发明的其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。本说明书和实施例应仅看作示例性用途，本发明真正的范围和精神在所附的权利要求书中说明。

序列表

<110>天津医科大学

王威

<120>用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽

<130>CP1080054/CB

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

His Lys Gln Leu Val Phe Phe Glu Glu Asp

1                 5                     10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

His Lys Gln Leu Pro Phe Phe Glu Glu Asp

1                   5                    10

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp

1                  5                    10

<210>4

<211>42

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>4

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys

1                 5                       10                     15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

             20                      25                         30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

         35                      40

Claims (3)

1.一种由如下氨基酸序列组成的多肽：

His-Lys-Gln-Leu-Pro-Phe-Phe-Glu-Glu-Asp(SEQ ID NO：2)。

2.根据权利要求1的多肽在制备用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

3.一种药物组合物，所述药物组合物中包括根据权利要求1的多肽和可药用的载体。

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