WO1998035983A1 - Die proliferation von zellen inhibierendes peptid und dessen verwendung - Google Patents

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Volker Ter Meulen
Sibylle Schneider-Schaulies
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Schering Aktiengesellschaft
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the invention relates to a new use of a peptide with the sequence Z-Phe-X-Gly-Y, where Z is an N-terminal protective group or hydrogen, where X is a natural amino acid and where Y is carboxyl-OH or a synthesis-related C terminal group or an oligopeptide made from natural amino acids.
  • the invention further relates to a peptide which inhibits the proliferation of cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin.
  • Natural amino acids are amino acids with naturally occurring formulas, regardless of the spatial structure.
  • amino acids whose constitution is known from nature also includes their stereochemical ones
  • a protective group is a chemical compound that protects the N-terminus of a peptide being synthesized against chemical attack by synthetic reagents. Peptides with up to about 15-20 amino acids are usually chemically synthesized, for example by means of the well-known Merrifield synthesis. Such a protective group can (must but not necessarily) but also cause a physiological effect of a peptide provided with it or increase the physiological effect of the peptide.
  • a protective group can perform a double function and in such cases the protective group is not split off even after the actual peptide synthesis has been completed.
  • a common protective group in peptide synthesis is, for example, the benzyloxycarbonyl group (C 6 H 5 -CH 2 -0-CO-), also referred to as the carbobenzoxy group.
  • the carboxyl-OH is the OH group belonging to the carboxyl group of the C-terminus.
  • a peptide with carboxyl-OH as Y has a carboxyl group at the C-terminus.
  • a C-terminal group due to synthesis cleavage is attached to the C-terminus of an amino acid and comes from the cleavage of the finished peptide from a synthesis matrix.
  • the C-terminus then has, for example, the following structures: amide (-CO-NH 2 ), hydrazide (-CO-NH-NH 2 ) or ester (-COOR).
  • the C-terminal groups due to synthesis cleavage are then -NH 2 , -NH-NH 2 or -OR.- It goes without saying that, depending on the synthesis method, other C-terminal groups due to synthesis cleavage are also possible.
  • Oligopeptides Y according to the definition determined here have 1 to approx. 10 amino acids.
  • proliferation refers to cell proliferation by division.
  • proliferation is usually induced by certain body-specific substances that act on a cell. Such substances are called mitogens.
  • proliferation in certain cell types can in principle also be induced and / or co-induced by antigens.
  • a spontaneous proliferation is a cell proliferation that takes place without mitogen induction and / or antigen induction.
  • a spontaneous proliferation is usually the result of a malfunction of the cell in question, caused for example by mutation.
  • Spontaneous proliferation is symptomatic of so-called malignant cell growth, also known as cancer, and is therefore undesirable.
  • This peptide is used in tests with cell cultures as a means of studying the inhibition of viral fusion with virus target cells. In contrast, the use of this or one of the other peptides mentioned for the production of a medicament for therapeutic treatment is not known. In the first-mentioned literature reference it was also found that CV-1 cells (adherent, non-lyphoid or non-monocytic cells) are not inhibited in their proliferation by the peptides.
  • sequence Phe-Phe-Gly is a partial sequence of a
  • SP is able to stimulate the proliferation of, for example, T cells, without the additional presence of another substance which acts as a mitogen (see, for example, Kavelaars et al., J. Neuroimm. 1993, 42, 61-70). In this respect, SP itself probably acts like a mitogen. From the subsequent literature reference IZ Siemion et al., Mol.
  • the invention is based on the technical problem of specifying a peptide which can be used in the treatment of diseases.
  • the invention is based in particular on the technical problem of specifying a peptide which inhibits the spontaneous proliferation of cells with malignant cell growth or inhibits transplant-related immune reactions.
  • the invention teaches the use of a peptide with the sequence Z-Phe-X-Gly-Y or a mixture of such peptides for the manufacture of a medicament for a therapeutic treatment of the human or animal body, where Z is an N-terminal protective group or is hydrogen, where X is a natural amino acid and where Y is carboxyl-OH or a synthesis-related C-terminal group or an oligopeptide from natural Is amino acids.
  • the invention teaches the use of this peptide or a mixture of such peptides for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases with malignant growth of cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin, in particular the T cells or the B -Cells, or a drug for the treatment of diseases with antigen-specific immune reactions of cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin.
  • the medicinal products are mostly pharmaceutical medicinal products with additives customary in medicinal products. The choice of additives can easily be carried out by a specialist from pharmaceutical practice and in coordination with the specific form of application or administration.
  • the first indication is given for the various types of cancer, leukemia.
  • the proliferation of the malignant cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin is inhibited by administration of the claimed peptide or a mixture of such peptides.
  • a spontaneous proliferation of these cells therefore no longer takes place or only to a greatly reduced extent.
  • the malignant cells deactivated in this way are not necessarily killed by the inhibition of proliferation.
  • a suitable cell-toxic substance fused to the peptide
  • suitable cell toxic substances are: methotrexates (target: DNA topoisomerase II) or polypeptides such as the diphtheria toxin.
  • the second indication is particularly given in the case of transplant-related immune reactions after an organ transplant and in autoimmune diseases.
  • the antigen-specific proliferation of the (healthy) cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin is inhibited by administration of the claimed peptide or a mixture of such peptides.
  • the healthy and natural immune response to the foreign organ is suppressed with the result that the foreign organ is not rejected.
  • the N-terminal protective group is a benzyloxycarbonyl group.
  • X is advantageously Phe or Ala, preferably Phe with a stereochemical structure on the ⁇ -carbon which differs from the N-terminal Phe.
  • the sequence of the peptide is Z- (D) Phe- (L) Phe-Gly-Y, where Z is preferably the benzyloxycarbonyl group B and / or Y is preferably carboxyl-OH.
  • Y can be an oligopeptide with a C-terminal group due to synthesis cleavage, for example -NH 2 .
  • Y can in particular be a dipeptide with the sequence Leu-Met or Val-Val, optionally with -NH 2 as a C-terminal group due to synthesis cleavage.
  • a peptide with the sequence Z-Phe-X-Gly-Y which inhibits the proliferation of cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin where Z is an N-terminal protecting group or hydrogen, where X is a natural amino acid - but not Phe, Tyr, Val or Ile; in the case of the sequence Z- (D) Phe-X-Gly-Y but not Phe - and where Y is carboxyl-OH or a C-terminal group due to synthesis cleavage or an oligopeptide from natural amino acids.
  • a further solution to the same technical problem is provided by a peptide with the sequence Z-Phe-X-Gly-Y which inhibits the proliferation of cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin, where Z is an N-terminal protective group, where X Phe with a stereochemical structure on the ⁇ -carbon which differs from the N-terminal Phe and where Y is an oligopeptide composed of natural amino acids with a maximum of 10, preferably a maximum of 3, but not -Ala-Val-Ile-Gly- . is, optionally with a synthesis-related C-terminal group, preferably -NH 2 .
  • spontaneous or antigen-specific proliferation inhibiting effect is a measure of inhibition of more than 10%, preferably more than 50%, most preferably more than 80%, measured by comparing the rate of proliferation measured in the usual way with cell culture treated with the peptide with the correspondingly measured proliferation rate in a cell culture that was not treated or was treated with an ineffective peptide. With certain cell lines an inhibition of practically 100% has been found.
  • the peptide is preferably designed such that the sequence is Z- (D) Phe-X-Gly-Y. Otherwise everyone can
  • the new peptide according to claim 10 or 11 the use of this new peptide for the manufacture of a medicament for a therapeutic treatment of the human or animal body, in particular for the treatment of diseases with malignant cell growth, lymphocytic and / or monocytic and / or Granulocytic origin, for example the T cells or the B cells, or for the treatment of diseases with antigen-specific immune reactions of cells of lymphocytic and / or monocytic and / or granulocytic origin.
  • the invention also includes a method for producing a peptide according to claim 10 or 11, possibly with modifications as mentioned above, the peptide being produced by means of a conventional synthesis method, for example Merrifield synthesis or solid-phase synthesis.
  • the invention also includes a medicament which has been produced in accordance with claims 1 to 9 or 13. The invention is explained in more detail below with the aid of examples.
  • the proliferation in the respective cell cultures was quantified either using the [ 3 H] thymidine method or using the Alamar blue method.
  • the spontaneous proliferation was measured, ie without the addition of a substance acting as a mitogen.
  • the peptide B- (D) Phe- (L) Phe-Gly-OH was used as the proliferation-inhibiting peptide (referred to in the tables as pepX).
  • pepX proliferation-inhibiting peptide
  • pepC B-Gly- (L) Phe- (L) Phe-OH
  • the cell lines or cell samples were introduced into 96-cluster (well) plates with a density or cell number / well of 5 ⁇ 10 4 in a volume of 100 ⁇ l / well.
  • the assays were carried out in triplicate. After the cells had been harvested, the proliferation rates or the increase in metabolism were determined by determining the incorporation into tritium by means of a ⁇ detector or by determining the staining or fluorescence. These values were then compared with values from corresponding untreated cell cultures. whereby the inhibition of spontaneous proliferation was obtained in%. In the results shown in Table 2, the inhibition in% was determined against experiments with the control peptide.
  • Table 1 shows the results of initial investigations on samples of malignant cells from patients with various types of cancer.
  • Table 2 shows further examinations on samples of malignant cells from patients with various cancers. It can first be seen in Table 1 that the inhibition of spontaneous proliferation by pepX is stronger than by the mostly practically inactive control peptide pepC. It can also be seen from Table 1 that the inhibition by pepX is highly dose-dependent, which is the inhibitory effect of the peptide itself and not one Test boundary condition proven. The inhibition of proliferation is given in%.
  • the index a denotes values obtained with [ 3 H] thymidine.
  • the index b denotes values obtained with Alamar blue. In general, it can be stated that the Alamar blue method is comparatively less sensitive compared to the [ 3 H] thymidine method.
  • CLL chronic lymphatic leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • AML acute myeloid leukemia
  • RARS refractory anemia with blasteness
  • NHL non Hodgin Ly phom
  • HD Hodgin's disease
  • ITP Immunotromopenia
  • HCL hairy cell leukemia
  • ThroPE Thro bopenia
  • MPS myeloproliferative syndrome
  • PCV Polycythemia vera
  • IC immunocytoma
  • ZIP plastocytoma
  • cb / cc centroblastic / centrocystic lymphoma
  • MEG-M Megacaryocytic myelosis.
  • the cells examined in the experiments on which Tables 1 and 2 are based were isolated by Ficoll / Paque (Pharmacia) density gradient centrifugation from heparinized blood of the patients.
  • the cells isolated in this way were also cultured in PPMI 1640 medium containing 10% FCS (fetal calf serum).
  • pepX In all cases it can also be seen here that the inhibition of proliferation by pepX is stronger than by the practically inactive or comparatively only slightly active control peptide pepC. It can also be seen that the inhibition by pepX is dose-dependent, which in this case also demonstrates the inhibitory effect of the peptide itself and not an experimental boundary condition.
  • U-937, U-937-X (U-937 subclone deficient in CD46 expression) and HL60 are monocytic cells.
  • BJAB lymphoblastoid B cells
  • Raji and Jurkat are human lymphoid cells.
  • Table 5 shows the results of tests on various Rodent (rodent) cells or cell lines.
  • the test methodology was the same as described in Example 2.
  • the rat PBL and mouse spleen cells were stimulated with ConA (Concanavalin A).
  • ConA Concanavalin A
  • EL4 thymoma line
  • YAC1 lymphoma
  • P815 mastozyme
  • FQK45.5, S107RelB, S107NFKB and TIB221 B cells, S107 ... have certain mutations in intracellular signaling pathways
  • P388D1 lymphoid macrophage
  • L929 fibroblast.
  • Cells pepX pepX pepX pepX pepC cell line (50 ⁇ g / ml) (100 ⁇ g / ml) (200 ⁇ g / ml) (200 ⁇ g / ml)
  • BJAB B cells
  • HL-60 monocytes
  • PBL's U937
  • J16 Jurkat cells, selected for maximum sensitivity to apoptosis
  • J16.6 subclone of J16, less sensitive to apoptosis
  • J17 subclone of J16
  • HL-60 PBL's and J16 control conditions were chosen which induce apoptosis (positive control).
  • BJAB stochastic fluctuations in the proportion of annexin positive / propidium iodide negative cells in the range from 2% to 16%, with both pepX and pepC, no time correlation.
  • HL-60 stochastic fluctuations in the proportion of annexin positive / propidium iodide negative cells in the range from 1% to 8%, with both pepX and pepC, no time correlation. In contrast, 70% when adding 0.2 ⁇ g / ml camptothecin.
  • PBL's stochastic fluctuations in the proportion of fluorescein-12-dUTP positive cells in the range from 4% to 15%, both with pepX and with pepC, none
  • J16 stochastic fluctuations in the proportion of annexin positive / propidium iodide negative cells in the range of
  • J16.6 stochastic fluctuations in the proportion of annexin positive / propidium iodide negative cells in the range of
  • J17.6 stochastic fluctuations in the proportion of annexin positive / propidium iodide negative cells in the range of 7% to 18%, with both pepX and pepC, no time correlation.
  • Example 8 shows that even after reversal of the inhibition of proliferation according to Example 6, a dose-dependent inhibition of proliferation can be observed again after the addition of pepX.
  • PBLs were first treated in accordance with Example 6. Then 50, 100 or 200 ⁇ g / ml pepX were added. For these amounts, inhibitions of proliferation of 30%, 55% and 92%, respectively, were found. This shows that the cells do not become resistant to pepX even after reversion of the inhibition.
  • Example 8 shows that the cells do not become resistant to pepX even after reversion of the inhibition.
  • pepX particularly impressive raw data on the inhibition of antigen-specific proliferation, caused by different antigens.
  • the cells were labeled with 3 H (0.5 ⁇ Ci / well) 48 h after stimulation for 20 h.
  • pepX or pepC in an amount of 300 ⁇ g / ml added (in addition to the respective stimulation peptide).
  • spleen cells which were taken from C3H mice infected with the measles virus were stimulated for proliferation with a peptide which contains a T cell-immunodominant epitope of the measles virus nucleocapsid protein. Costimulation was performed with autologous spleen cells inactivated by radiation, which present the peptide.
  • the peptide with the T cell immunodominant epitope of the measles virus nucleocapsid protein is a major antigen for the measles virus specific T cell response.
  • pepX a radioactivity of only 148 cpm was measured.
  • PepC a radioactivity of 17363 cpm was measured.
  • the resulting inhibition of proliferation by pepX compared to pepC is 99.992%.
  • T cell cultures (CD8 +) were created from spleen cells which were taken from C3H mice infected with the measles virus. These were alternately stimulated with IL2 or with the immunodominant peptide (see 1st approach). After several cycles, T cell lines were established that proliferate either by stimulation with IL2 or by stimulation with the immunodominant peptide (antigen). After adding pepX, a radioactivity of only 67 cpm was measured. In contrast, after the addition of PepC, a radioactivity of 74524 cpm was measured. The resulting inhibition of proliferation by pepX compared to pepC is 99.999%.
  • T-cell cultures (CD8 +) were created from spleen cells which were taken from C3H mice infected with the influenza virus. These were alternately stimulated with IL2 or with an immunodominant peptide from the influenza virus. After several cycles, T cell lines were established that proliferate either by stimulation with IL2 or by stimulation with the immunodominant peptide (antigen). After adding pepX, a radioactivity of only 90 cpm was measured. In contrast, after the addition of PepC, a radioactivity of 57053 cpm was measured. The resulting inhibition of proliferation by pepX is 99.998%.
  • the cell lines / cells mentioned in all of the above Examples 1 to 9 were always cultivated in detail in RPMI 1640 medium (available from GIBCO / BRL) containing 10% FCS (fetal calf serum).

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Abstract

Die Erfindung lehrt die Verwendung eines Peptides mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y oder eines Gemisches solcher Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere bei Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zellen oder Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y Carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist, sowie neue Peptide für solche Verwendungen.

Description

Die Proliferation von Zellen inhibierendes Peptid und dessen Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft eine neue Verwendung eines Peptides mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y carboxyl-OH oder eine synthe- seabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oli- gopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein die Proliferation von Zellen lym- phocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo- cytischer Herkunft inhibierendes Peptid.
Hierbei sind folgende Definitionen anzuwenden. Als natürliche Aminosäuren sind Aminosäuren mit in der Natur vorkommenden formelmäßigen Konstitutionen, unabhängig von der räumlichen Struktur, bezeichnet. Insofern fallen im Rahmen der hiermit gegebenen Definitionen auch solche Aminosäuren unter den Begriff der natürlichen Aminosäuren, deren Konstitution aus der Natur bekannt ist, deren stereochemische
Struktur, insbesondere am α-Kohlenstoff, jedoch nicht in der Natur vorkommt. Ein Beispiel hierfür ist (D)Phenyl- alanin. Phe steht für die Aminosäure Phenylalanin und Gly für die Aminosäure Glycin. Als Schutzgruppe ist eine chemische Verbindung bezeichnet, die den N-Terminus eines in der Synthese befindlichen Peptids gegen chemischen An- griff von Synthesereagentien schützt. Peptide mit bis zu ca. 15-20 Aminosäuren werden üblicherweise chemisch synthetisiert, beispielsweise mittels der gut bekannten Merrifield-Synthese. Eine solche Schutzgruppe kann (muß jedoch nicht zwingend) aber auch eine physiologische Wirkung eines damit ausgestatteten Peptids verursachen oder die physiologische Wirkung des Peptides verstärken. Insofern kann eine Schutzgruppe eine Doppelfunktion ausüben und in solchen Fällen wird die Schutzgruppe auch nach Abschluß der eigentlichen Peptidsynthese nicht abgespalten. Eine in der Peptidsynthese übliche Schutzgruppe ist beispielsweise die Benzyloxycarbonyl-Gruppe (C6H5-CH2-0-CO-) , auch als Carbobenzoxy-Gruppe bezeichnet. Als carboxyl-OH ist die zur Carboxylgruppe des C-Terminus gehörende OH-Gruppe bezeichnet. Mit anderen Worten ausgedrückt, weist ein Peptid mit carboxyl-OH als Y eine Carboxylgruppe am C-Terminus auf. Eine syntheseabspaltungs- bedingte C-terminale Gruppe ist an den C-Terminus einer Aminosäure gebunden und stammt aus der Abspaltung des an sich fertigen Peptides von einer Synthesematrix. Der C- Terminus weist dann, je nach Art der Abspaltung beispielsweise folgende Strukturen auf: Amid (-CO-NH2) , Hydrazid (-CO-NH-NH2) oder Ester (-COOR) . In diesen Beispielen sind die syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppen dann -NH2, -NH-NH2 oder -OR.- Es versteht sich, daß abhängig vom Syntheseverfahren auch noch andere syntheseabspaltungs- bedingte C-terminale Gruppen möglich sind. Ebenso wie im Fall der Schutzgruppen kann eine physiologische Wirkung bzw. eine Verstärkung einer physiologischen Wirkung durch eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe nicht ausgeschlossen werden. Oligopeptide Y gemäß der hiermit bestimmten Definition weisen 1 bis ca. 10 Aminosäuren auf.
Der Ausdruck Proliferation bezeichnet die Zellvermehrung durch Teilung. Bei gesunden Zellen wird die Proliferation in aller Regel durch bestimmte, auf eine Zelle wirkende körpereigene Substanzen induziert. Solche Substanzen werden als Mitogene bezeichnet. Ebenso kann eine Proliferation bei bestimmten Zellarten grundsätzlich auch durch Antigene induziert und/oder coinduziert werden. Eine spontane Proliferation ist eine ZeilVermehrung, die ohne Mito- geninduktion und/oder Antigeninduktion stattfindet. Eine spontane Proliferation ist meist das Ergebnis einer Fehlfunktion der betreffenden Zelle, hervorgerufen beispielsweise durch Mutation. Spontane Proliferation ist symptomatisch für sogenanntes malignes Zellwachstum, auch Krebs genannt und folglich unerwünscht.
Eine unerwünschte Proliferation von Zellen insbesondere des Immunsystems kann aber auch aus anderen Gründen erfolgen. Wird einem Menschen oder einem Tier beispielsweise ein Organ transplantiert, so tritt eine Immunreaktion des EmpfängerOrganismus auf. Dies ist eine im wesentlichen spezifische Abstoßungsreaktion gegen "Fremd"-Zellen des implantierten Organs durch das Immunsystem des Organempfängers, wobei dessen Ly phozyten durch ein oder mehrere Antigene des Organs zur Proliferation angeregt werden. Eine Mitogeninduktion ist für diese Art der Proliferation grundsätzlich nicht erforderlich. Es handelt sich also um eine antigenspezifische (d.h. "Fremd"-induzierte) Proliferation. Unerwünschte antigenspezifische Proliferation kann aber auch in anderen medizinischen Zusammenhängen als der Transplantationsmedizin erfolgen, z.B. bei Autoimmunerkrankungen .
Zum Verständnis der Erfindung ist folgender Stand der Technik wichtig. Aus den Literaturstellen Ch.D. Richardson et al., Virology, 1980, 105, 205-222, und Ch.D. Richardson et al., Virology, 1983, 131, 518-532, sind u.a. Peptide bekannt, deren Sequenzen lauten: B-Phe-Phe-Gly-Ala-Val- Ile-Gly-OH (B = Benzyloxycarbonyl-Gruppe, Ala = Alanin, Val = Valin, Ile = Isoleucin) , B-Phe-Phe-Gly-OH, H-Phe-Phe-Gly-Ala-Val-Ile-Gly-OH und H-Phe-Phe-Gly-OH. Diese Peptide sind hergestellt worden, um die Mechanismen der Fusion von verschiedenen Viren mit Körperzellen zu untersuchen. Hintergrund ist, daß verschiedene Viren, so z.B. Sendai-Viren oder Masern Viren, die Teilsequenz -Phe- Phe-Gly- oder Consensus-Sequenzen dazu in einer Fusionsdomäne ihres Fl-Me branfusionsproteins aufweisen. Bei die- sen Untersuchungen wurde gefunden, daß die genannten Peptide (vermutlich aufgrund konkurrierender Bindung an zugeordneten Rezeptoren der Virus-Zielzellen) die Fusion des Virus mit den Virus-Zielzellen inhibieren. Die Fusion wurde auch durch das Peptid mit der Sequenz B-Phe-Phe-Gly- OH unterbunden, jedoch mit vergleichsweise schwacher
Wirkung. Dieses Peptid wird in Tests mit Zellkulturen als Mittel zur Untersuchung der Inhibierung der viralen Fusion mit Virus-Zielzellen verwendet. Eine Anwendung dieses oder eines der anderen genannten Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Behandlung ist demgegenüber nicht bekannt. In der erstgenannten Literaturstelle ist auch festgestellt worden, daß CV-1-Zellen (adhärente, nicht-ly phoide oder nicht-monozytäre Zellen) durch die Peptide nicht in ihrer Proliferation gehemmt werden.
Unter die allgemeine Sequenz des eingangs genannten Aufbaus fallende spezifische Sequenzen sind grundsätzlich auch als Teilsequenzen aus anderen Zusammenhängen bekannt. So ist die Sequenz Phe-Phe-Gly eine Teilsequenz eines
Tachykinins mit der Sequenz H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe- Phe-Gly-Leu-Met-NH2 (Arg = Arginin, Pro = Prolin, Lys = Lysin, Gin = Glutamin, Leu = Leucin, Met = Methionin) , welches als Neurσtransmitter/Neuromodulator oder als Regulativ der Produktion von Zellen des Immunsystems (Lym- phozyten) wirkt. Dabei versteht sich, daß bei den insofern bekannten Sequenzen die Aminosäuren stets mit (L) -Struktur vorliegen. Dieses Tachykinin wird auch als SP (substance P) bezeichnet. SP ist dabei in der Lage, die Proliferation von z.B. T-Zellen anzuregen, und zwar ohne die zusätzliche Anwesenheit einer anderen, als Mitogen wirkenden Substanz (siehe z.B. Kavelaars et al., J. Neuroimm. 1993, 42, 61-70) . Insofern wirkt SP selbst vermutlich ähnlich einem Mitogen. Aus der hieran anschließenden Literaturstelle I.Z. Siemion et al., Mol. Immunol., 2_7, 887-890, ist es aus Zellkultur Experimenten wiederum bekannt, daß ein Peptid mit der Sequenz H-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2/ dessen Se- quenz mit der C-terminalen Sequenz von SP identisch - auch hinsichtlich des ausschließlich in (L) -Struktur vorliegenden Phenylalanins identisch - ist, gegenüber dem Ergebnis der zuvor genannten Literaturstelle zu einer Erniedrigung der Immunglobulin-Synthese nicht mitogen- aktivierter B-Zellen (eine Untergruppe der Lymphozyten) führt. Auswirkungen auf das Proliferationsverhalten sind aus dieser Literaturstelle jedoch nicht bekannt. Aus der Literaturstelle I.Z. Siemion et al., Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1994, 42, 201-203, ist es bekannt, daß Peptide mit den Sequenzen H-Phe-Tyr-Gly-Leu- Met-NH2 (Tyr = Tyrosin) , H-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2 und H-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH2 entsprechendes bewirken, wobei auch hier stets mit (L) -Aminosäuren gearbeitet -wurde und keine Angaben zum Proliferationsverhalten gemacht sind.
In der Literaturstelle Y. Yanagi et al, Virology, 1992, 187, 280-289, wovon die Erfindung ausgeht, ist die Auswirkung des Masern-Virus auf die Proliferation von T- Zellen (eine Untergruppe der Lymphozyten) in Zellkultur Experimenten untersucht worden. Hierbei wurde festgestellt, daß das Masern-Virus die Proliferation inhibiert. Weiterhin wurde festgestellt, daß ein Peptid der Sequenz Z-Phe-Phe-Gly-OH, wobei Z die Benzyloxycarbonyl- Gruppe B ist, diese Masern-Virus-induzierte Inhibierung der T-Zell-Proliferation wieder aufhebt, d.h. daß die mi- togeninduzierte Proliferation wieder praktisch normal vonstatten geht. Die Erkenntnis aus den Ergebnissen war folglich, daß das insofern bekannte Peptid einerseits den die Proliferation inhibierenden Effekt des Masern-Virus aufhebt, aber andererseits auch selbst keinen (nennenswerten) inhibierenden Einfluß auf die (mitogen-induzierte) Proliferation der T-Zellen ausübt, jedenfalls innerhalb der getesteten Konzentrationen.
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Peptid anzugeben, das Verwendung in der Behandlung von Erkrankungen finden kann. Der Erfindung liegt insbesondere das technische Problem zugrunde, ein Peptid anzugeben, das die spontane Proliferation von Zellen mit malignem Zellwachstum inhibiert oder transplantationsbedingte Immunreaktionen inhibiert.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung die Verwendung eines Peptides mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y oder eines Gemisches solcher Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y Carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C- terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist. Insbesondere lehrt die Erfindung die Verwendung dieses Peptides oder eines Gemisches solcher Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zel- len lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granu- locytischer Herkunft, insbesondere der T-Zellen oder der B-Zellen, oder eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft. - Es versteht sich, daß die Arzneimittel dabei meist galenische Arzneimittel mit arzneimittelüblichen Zusatzstoffen sind. Die Wahl der Zusatzstoffe ist für einen Fachmann ohne weiteres aus der galenischen Praxis und in Abstimmung auf die konkrete An- wendungs- bzw. Darreichungsform durchführbar.
Die erstgenannte Indikation ist bei den verschiedenen Arten der Krebserkrankung Leukämie gegeben. Durch eine Gabe des beanspruchten Peptides oder einer Mischung sol- eher Peptide wird die Proliferation der malignen Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibiert. Eine spontane Proliferation dieser Zellen findet also nicht mehr oder nur noch in stark reduziertem Umfang statt. Die insofern deaktivierten malignen Zellen sind durch die Hemmung der Proliferation allerdings nicht zwangsläufig abgetötet. Dann empfiehlt sich die zusätzliche Gabe einer geeigneten (an das Peptid fusionierten) zelltoxischen Substanz (Toxinfusion) . Beispiele für geeignete zelltoxische Substanzen sind: Methotrexate (target: DNA topoisomerase II) oder Polypep- tide wie das Diphtherie-Toxin. Die zweitgenannte Indikation ist insbesondere bei transplantationsbedingten Immunreaktionen nach einer Organtransplantation und bei Autoimmunerkrankungen gegeben. Durch eine Gabe des beanspruchten Peptides oder einer Mischung solcher Peptide wird die antigenspezifische Proliferation der (gesunden) Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibiert. Es wird also die an sich gesunde und natürliche Immunantwort auf das fremde Organ unterdrückt mit der Folge daß das fremde Organ nicht abgestoßen wird.
Hinsichtlich der erfindungsgemäßen Verwendungen ist es bevorzugt, wenn die N-terminale Schutzgruppe eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe ist. Vorteilhafterweise ist X Phe oder Ala, vorzugsweise Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereochemischen Struktur am α-Kohlenstoff. Im einzelnen ist es bevorzugt, wenn die Sequenz des Peptides Z- (D) Phe- (L) Phe-Gly-Y ist, wobei Z vorzugsweise die Benzyloxycarbonyl-Gruppe B und/oder Y vorzugsweise carboxyl-OH ist. Weiterhin kann Y ein Oligopeptid mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe, beispielsweise -NH2, sein. Y kann insbesondere ein Dipeptid mit der Sequenz Leu-Met oder Val-Val sein, ggf. mit -NH2 als syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe.
Die erfindungsgemäße Verwendung insbesondere des Peptids mit der Sequenz B- (D) Phe- (L) Phe-Gly-OH beruht .auf der überraschenden Erkenntnis, daß dieses Peptid eine die spontane oder antigenspezifische Proliferation stark in- hibierende Wirkung ausübt. Diese Erkenntnis ist überraschend, weil gemäß der nächstliegenden Literturstelle Y. Yanagi et al, Virology, 1992, 187, 280-289, das insofern bekannte Peptid einerseits den die Proliferation inhibierenden Effekt des Masern-Virus aufhebt, aber andererseits bei den getesten Konzentrationen auch selbst keinen inhibierenden Einfluß auf die (dort mitogeninduzierte) Proliferation der T-Zellen ausübt. Somit weist diese Literaturstelle eher in die entgegengesetzte Richtung.
Grundsätzlich fallen natürlich auch die sonstigen Modifikationen gemäß der Patentansprüche 1-9 unter die er- findungsgemäße Verwendung, sofern diese Peptide eine inhibierende Wirkung auf die spontane oder antigenspezifische Proliferation ausüben. Geeignete Modifikationen lassen sich auf einfache Weise durch übliche Syntheseverfahren herstellen und auf ebenso einfache Weise hinsichtlich Ihrer inhibierenden Wirkung testen. Solche Tests werden üblicherweise mittels [3H] -Thymidin oder mittels Alamar-Blau durchgeführt. Mittels [3H] -Thymidin wird die Menge an neu gebildeten Zellen in einer Kultur bestimmt (Messung der Radioaktivität) . Mittels Alamar-Blau (ein Produkt der Firma BIOSOÜRCE Int., USA) wird der me- tabolische Umsatz in einer Zelle gemessen (colorimetrische oder Fluoreszenz Messung) . Hoher metabolischer Umsatz ist meist mit einer bevorstehenden Zellteilung korreliert. Diese jeweiligen Größen werden mit den entsprechenden Größen in einer Kontrollkultur gleicher Zellen, jedoch ohne Zugabe eines Inhibitors oder mit Zugabe eines nicht inhibierenden Peptids verglichen. Durch Verhältnisbildung wird auf einfache Weise die Inhibierung der Proliferation in % quantifiziert. Es handelt sich dabei um wohlbekannte Standardtests.
Da auch folgende Peptid-Modifikationen, die im o.g. Stand der Technik nicht bekannt sind, eine die spontane und/oder antigen-spezifische Proliferation inhibierende Wirkung ausüben, wird das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem auch durch ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo- cytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y gelöst, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure - nicht jedoch Phe, Tyr, Val oder Ile; im Falle der Sequenz Z- (D) Phe-X-Gly-Y nicht jedoch Phe - ist und wobei Y carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist. Eine weitere Lösung desselben technischen Problems ist gegeben durch ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz Z-Phe-X-Gly-Y, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe ist, wobei X Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereochemischen Struktur am α-Kohlenstoff ist und wobei Y ein Oligopeptid aus natürli- chen Aminosäuren mit maximal 10, vorzugsweise maximal 3, Aminosäuren, nicht jedoch -Ala-Val-Ile-Gly-, . ist, ggf. mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe, vorzugsweise -NH2. Konkrete Beispiele für solche neue Peptide sind: B- (D) Phe- (L) Phe-Gly-Phe-Gly-R und B-(D)Phe- (L) Phe-Gly-Phe-Gly-Phe-Gly-R, wobei R OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe sein kann und das stereochemisch nicht gekennzeichnete Phe vorzugsweise in (L) -Struktur vorliegt. In ersten Versuchen hat .sich gezeigt, daß Peptide der genannten konkreten Struktur ver- mutlich eine noch stärker inhibierende Wirkung auf die Proliferation von Zellen des Immunsystems haben. Die insofern nochmals verbesserte biologische Aktivität beruht möglicherweise auf einer Stabilisierung des Peptides durch die der Kernsequenz angehängten Aminosäuren des Oligopep- tides Y.
Solche neuen Modifikationen lassen sich, wie bereits vor- stehend erläutert, auf einfache Weise synthetisieren und auf ihre die spontane und/oder die antigen-spezifische Proliferation inhibierende Wirkung testen. Als die spontane oder die antigen-spezifische Proliferation inhibierende Wirkung ist bezeichnet ein Maß der Inhibierung von mehr als 10%, vorzugsweise mehr als 50%, höchstvorzugs- weise von mehr als 80%, gemessen durch Vergleich der auf übliche Weise gemessenen Proliferationsrate in einer mit dem Peptid behandelten Zellkultur mit der entsprechend gemessenen Proliferationsrate in einer Zellkultur, die nicht oder mit einem unwirksamen Peptid behandelt wurde. Mit bestimmten Zellinien ist eine Inhibierung von sogar praktisch 100% gefunden worden.
Vorzugsweise ist das Peptid so ausgebildet, daß die Se- quenz Z- (D) Phe-X-Gly-Y ist. Ansonsten können auch alle
Modifikationen gemäß der vorstehenden Erläuterungen zu der erfindungsgemäßen Verwendung und/oder der Patentansprüche 2 bis 9 entsprechend eingerichtet sein, solange X nicht Phe, Tyr, Val oder Ile oder im Falle der Sequenz Z-(D)Phe- X-Gly-Y nicht Phe ist oder das Oligopeptid Y nicht -Ala- Val-Ile-Gly- ist.
Neben dem neuen Peptid nach Patentanspruch 10 oder 11 ist auch die Verwendung dieses neuen Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft, beispielsweise der T-Zellen oder der B-Zellen, oder für die Behandlung von Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulo- cytischer Herkunft Gegenstand der Erfindung. Zur Erfindung gehört weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Peptides nach Anspruch 10 oder 11, ggf. mit Modifikationen wie oben erwähnt, wobei das Peptid mittels eines üblichen Syntheseverfahrens, beispielsweise der Merrifield-Synthese bzw. Festphasensynthese, hergestellt wird. Die Erfindung umfaßt schließlich auch ein Arzneimittel, das entsprechend der Patentansprüche 1 bis 9 oder 13 hergestellt worden ist. Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
In allen folgend dargestellten Ergebnissen wurde die Proliferation in den jeweiligen Zellkulturen entweder mittels der [3H]Thymidin-Methode oder mittels der Alamar-Blau- Methode quantifiziert. Gemessen wurde dabei die spontane Proliferation, d.h. ohne Zugabe einer als Mitogen wirkenden Substanz. In allen Beispielen wurde das Peptid B- (D) Phe- (L) Phe-Gly-OH als die Proliferation hemmendes Peptid (in den Tabellen als pepX bezeichnet) eingesetzt. In den Versuchen wurde meist selbstsythetisiertes Peptid verwendet. Ein solches Peptid ist jedoch auch käuflich erwerbbar (z.B. von Sigma oder Bachem) . Als Kontrollpeptid wurde B-Gly- (L) Phe- (L) Phe-OH (in den Tabellen als pepC bezeichnet) verwendet. Im einzelnen wurden die Zellinien bzw. Zellproben in 96-cluster (well) Platten mit einer Dichte bzw. Zellzahl/well von 5 x 104 in einem Volumen von lOOμl/well eingebracht. Dann wurden die Peptide in den in den Tabellen angegebenen Mengen zugegeben und 72h inku- biert. Hierauf wurde mit [3H] Thymidin (0,5μCi/ml; lCi = 37GBq) oder mit Alamar-Blau für lβh gelabelt. Die Assays wurden dreifach ausgeführt. Nach dem Ernten der Zellen wurden die Proliferationsraten bzw. die Stoff ech- selerhöhung durch Bestimmung der Inkorporation "an Tritium mittels ß-Detektor oder durch Bestimmung der Färbung bzw. Fluoreszenz ermittelt. Diese Werte wurden dann mit Werten aus entsprechenden unbehandelten Zellkulturen ins Verhältnis gesetzt, wodurch die Inhibierung der spontanen Proliferation in % erhalten wurde. Bei den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen wurde die Inhibierung in % gegen Versuche mit dem Kontrollpeptid bestimmt.
In Tabelle 1 sind die Ergebnisse von ersten Untersuchungen an Proben maligner Zellen von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen dargestellt. In Tabelle 2 sind weitere Untersuchungen an Proben maligner Zellen von Patienten mit verschiedenen Krebserkrankungen dargestellt. Man erkennt in Tabelle 1 zunächst, daß die Inhibierung der spontanen Proliferation durch pepX stärker ist als durch das meist praktisch inaktive Kontrollpeptid pepC. Man erkennt aus Tabelle 1 weiterhin, daß die Inhibierung durch pepX mit hoher Wahrscheinlichkeit dosisabhängig ist, was die inhibierende Wirkung des Peptides selbst und nicht einer Versuchsrandbedingung belegt. Die Inhibierung der Proliferation ist in % angegeben. Der Index a bezeichnet Werte, die mit [3H] -Thymidin erhalten wurden. Der Index b bezeichnet Werte, die mit Alamar-Blau erhalten wurden. Generell ist festzustellen, daß die Alamar-Blau-Methode gegenüber der [3H]Thymidin-Methode vergleichsweise weniger sensitiv ist.
Tabelle 1
Patient/ pepX pepX pepC
Diagnose (50μg/ml ) (200 μg/ml ) (200 | 1/? 35 44 1 7b
2/1 17b 39b 8b
3/CLL 24a 40a 0a
4/RARS 24a 4 βa 6a
5/CLL 26a 38a 18a 6/CLL 34a 42a 2a
7/CML 64a 88a 18a
8 /keimzelliges
Bronchial- -CA 38a 50a 14a
9/AML 45a/50b 80a/85 15a/4 9/AML 23a/15b 39a/40b 19a/2b
9/AML 42a/36b 58a/5βb 6a/ β Tabelle 2
Diagnose Anzahl 200μg Anzahl 200μg
Pat. pepX/pepC Pat. pepX/pepC
CLL 11 53a + 24 5 42b + 5
NHL 4 83a + 12 4 60b ± 6
HCL 1 24° cb/cc 2 9V9 ia akute
Leukämie 1 70b
PLZ 1 64b
CML 5 78a + 16 4 56b + 8
AML 4 60a + 17 4 63b + 20 MPS 1 42a 2 37b ± 7 myelische
Blastie 1 80a
PCV 1 30a 1 12b
ITP 3 44b ± 6 IC 1 58
ThroPE 1 55a 2 37° ± lβ
RARS 1 4βa
MAG-CA 1 29a
Phaynx rezidiv 1 8a
Bronchial
Karzinom 1 50a malignes
Histozytem 1 14a
Die verwendeten Abkürzungen der Diagnosen stehen für folgende Befunde : CLL : chronisch lymphatische Leukämie ; CML : chronisch myeloische Leukämie; AML: akute myeloische Leukämie; RARS: refraktäre Anämie mit Blastenexess; NHL: non Hodgin Ly phom; HD: Hodgin's disease; ITP: Immunotrom- bopenie; HCL: hairy cell leukemia; ThroPE: Thro bopenie; MPS: myeloproliferatives Syndrom; PCV: Polycythaemia vera; IC: Immunocytom; PLZ: Plastozytom; cb/cc: centroblastisch/centrocystisches Lymphom; MAG-CA Magen- Karzinom; MEG-M: Megacaryocytäre Myelose.
Die in den den Tabellen 1 und 2 zugrundeliegenden Versuchen untersuchten Zellen wurden durch Ficoll/Paque (Pharmacia) Dichtegradientenzentrifugation aus heparinis- iertem Blut der Patienten isoliert. Die so isolierten Zellen wurden ebenfalls in PPMI 1640 Medium enthaltend 10% FCS (fetal calf serum) kultiviert.
Beispiel 2
Die in der Tabelle 3 angegebenen Daten zur Proliferations- hemmung an menschlichen Zellen wurden entsprechend der Vorgehensweise zu Tabelle 1 erhalten. Die Versuche wurden mit autologen PBL's (PBL: peripheral blood lymphocyte) , allogenen PBL's (Hemmung der antigenspezifischen, durch UV-inaktivierte "Fremd"-PBL's induzierten Proliferation) und verschiedenen spontan proliferierenden Zellinien (Hemmung der spontanen Proliferation) durchgeführt. Im Falle der autologen PBL's wurde in der Gegenwart von PHA (PHA: Phytohämagglutinin, bewirkt Aktivierung von T- und B- Zellen) gemessen. Gearbeitet wurde ausschließlich mit
[3H] -Thymidin, wenn nicht durch Index b gekennzeichnet. Im Falle der allogenen PBL's wurde die Inhibierung gegen Proben mit pepC berechnet. 17
Tabelle 3
Zellen pepX pepX pepX pepC
Zellinie (50μg/ml) (lOOμg/ml) (200 μg/ml) (200 μg/ml)
PBL's autolog 12 + 3 52 + 5 84 + 8 5 ± 2 PBL's allogen 5b + 2 22b + 4 65b + 6
42 + 5 70 + 3
U-937 10 + 4 39 + 4 74 + 3 6 + 2 U-937-X 17 + 5 — 70 + 2 8 + 3
HL60 15 + 2 42 + 4 69 + 4 4 + 1
BJAB 21 + 5 28 + 11 79 + 6 6 + 2
Raji 22 30 94 16
Jurkat 8 + 3 58 + 23 64 + 9 5 + 3
Man erkennt auch hier in allen Fällen zunächst, daß die Inhibierung der Proliferation durch pepX stärker ist als durch das praktisch inaktive oder vergleichsweise nur ger- ing aktive Kontrollpeptid pepC. Man erkennt weiterhin, daß die Inhibierung durch pepX dosisabhängig ist, was auch in diesem Fall die inhibierende Wirkung des Peptides selbst und nicht einer Versuchsrandbedingung belegt.
U-937, U-937-X (U-937 Subclon defizient in der CD46 Expression) und HL60 sind monocytische Zellen. BJAB (lym- phoblastoide B-Zellen) , Raji und Jurkat (CD4+ T-Zellen) sind menschliche lymphoide Zellen. Beispiel 3
In diesem Beispiel sind Ergebnisse an nicht lymphatischen bzw. nicht monocytären menschlichen Zellinien zum Vergleich mit Beispiel 2 dargestellt. Die Untersuchungen erfolgten unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 angegeben.
Tabelle 4
Zellinie pepX pepX pepX pepC
(50μg/ml) (lOOμg/ml) (200 μg/ml) (200 μg/ml;
HeLa 9 + 5 11 13 + 3 6 + 3
Heia S3 0 — 2 + 2 4 + 6
293 8 + 3 11 12 + 4 4 + 1 NCI H460 12 + 5 2 15 + 3 4 + 2
U87 1 <10 1 2
Man erkennt, daß die untersuchten nicht lymphatischen bzw. nicht monozytären Zellinien demgegenüber nicht gehemmt werden. Beispiel 4
In Tabelle 5 sind die Ergebnisse von Untersuchungen an verschiedenen Rodent- (Nager-) Zellen bzw. Zellinien dargestellt. Die Untersuchungsmethodik war dieselbe wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Ratten-PBL- und die Maus-Milz- Zellen wurden mit ConA (Concanavalin A) stimuliert. Man erkennt auch hier in allen Fällen zunächst, daß die Inhibierung der mitogen-stimulierten oder der spontanen Pro- liferation durch pepX stärker ist als durch das praktisch inaktive oder vergleichsweise nur gering aktive Kontrollpeptid pepC. Man erkennt weiterhin, daß die Inhibierung durch pepX dosisabhängig ist, was auch in diesem Fall die inhibierende Wirkung des Peptides selbst und nicht einer Versuchsrandbedingung belegt.
Die genannten Zellinien sind wie folgt abgekürzt. EL4 : Thymom-Linie; YAC1: Lymphom; P815: Mastozym; FQK45.5, S107RelB, S107NFKB und TIB221: B-Zellen, S107... weisen bestimmte Mutationen intrazellulärer Signalwege auf; P388D1: lymphoid macrophage; L929: Fibroblast.
Tabelle 5
Zellen pepX pepX pepX pepC Zellinie (50μg/ml) (lOOμg/ml) (200 μg/ml) (200 μg/ml)
Ratte:
PBL (Lewis) 64 + 6 97 + 2 93 + 8 12 + 4
Maus, Milz: Balb/c 68 88 98 2
C3H 75 92 96 0
C57/bl6 72 96 98 0
Zellinien: EL4 26 + 4 57 + 24 87 + 2 9 + 3
YAK1 50 + 5 62 + 5 83 + 16 4 + 6
P815 11 + 2 55 + 7 81 +_ 6 10 + 2
P388D 40 + 3 39 + 3 82 + 17 21 + 9
FQK45.5 22 + 2 75 + 26 95 + 8 19 + 1 S107 RelB 50 + 4 87 + 10 100 + 0 5 + 5
S107 NFkB 60 + 0 80 + 3 100 + 0 5 + 3
TiB 221 40 66 + 1 93 11
L929 15 + 4 25 + 8 68 + 4 5 + 1
Beispiel 5
In diesem Beispiel werden Ergebnisse präsentiert, die zeigen, daß eine Behandlung mit pepX oder pepC nicht begleitet ist von einem vom Peptid induzierten apop- totischen Signal (programmierter oder durch exogene Stimuli induzierter Zeil-Tod) . Als Methoden wurden Annexin-staining und TUNEL-staining verwendet. Beim Annexin-staining wird Annexin stark an Phosphatidyl-serin, welches normalerweise innerhalb der Zellmembran lokalisiert ist und als einer der ersten Schritte der Apoptose an die Oberfläche der Zellen tran- sloziert wird, gebunden. Die Bindung des fluoreszenzmarkierten Annexins an Zellen ist somit ein Nachweis einer sehr frühen Phase der Induktion von Apoptose. TUNEL steht für Terminal Uridin-transferase Nucleotide End Labeling. Es werden markierte Nukleotide an freie DNA-Enden, die aus Apoptose induzierten DNA Strangbrüchen herrühren, übertragen. Diese Reaktion kann erst in der Spätphase der Apoptose beobachtet werden. Die mit beiden Methoden erhaltenen Ergebnisse sind Zeitkinetiken, d.h. Färbungen, die nach unterschiedlichen Zeiten seit Kontakt mit dem Peptid durchgeführt wurden. Gemessen wurde jeweils 6h, 12h, 24h und 48h nach Exposition mit dem Peptid. Die zugegebene Menge Peptid betrug stets 200μg/ml
Getestet wurden BJAB (B-Zellen) , HL-60 (Monozyten) , PBL's, U937 (Monozyten) , J16 (Jurkat-Zellen, selektioniert auf maximale Sensitivitat gegenüber Apoptose), J16.6 (Subclon von J16, weniger sensitiv gegenüber Apoptose) und J17 (Subclon von J16) . Für HL-60, PBL's und J16 sind als Kon- trolle- Bedingungen gewählt worden, die Apoptose induzieren (positiv-Kontrolle) .
Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen.
BJAB: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 2% bis 16%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation. HL-60: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 1% bis 8%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation. Dagegen 70% bei Zugabe von 0,2μg/ml Camptothecin.
PBL's: stochastische Schwankungen des Anteils Fluorescein-12-dUTP positiver Zellen im Bereich von 4% bis 15%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine
Zeitkorrelation. Dagegen 57% bei Zugabe von lμg/ml αCD3 + 100 U/ml IL2 + (nach 16h) 5 μg/ml αFAS.
U937 : stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von
2% bis 15%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.
J16: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von
1% bis 15%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation. Dagegen 45% bei Zugabe von 5μg/ml αFAS.
J16.6: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von
2% bis 8%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.
J17.6: stochastische Schwankungen des Anteils Annexin positiver/propidium iodide negativer Zellen im Bereich von 7% bis 18%, und zwar sowohl mit pepX als auch mit pepC, keine Zeitkorrelation.
Beispiel 6
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß die mit dem Peptid pepX bewirkte Proliferationshemmung wieder reversiert werden kann. Hierzu wurden PBL's 3 Tage in Gegenwart von PHA mit pepX behandelt bis zu einer Proliferationshemmung von 95%. Danach wurden die Zellen für weitere 6 bzw. 12 Tage mit IL2 (Interleukin 2) stimuliert (in Abwesenheit von pepX und PHA) . Nach insgesamt 9 Tagen war die Proliferationshemmung auf 78% und nach insgesamt 15 Tagen auf 23% gesunken. •
Beispiel 7
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß auch nach Reversion der Proliferationshemmung nach Beispiel 6 eine dosisabhängige Proliferationshemmung erneut zu beobachten ist nach erneuter Zugabe von pepX. Hierzu wurden PBL's zunächst gemäß Beispiel 6 behandelt. Anschließend wurden 50, 100 oder 200μg/ml pepX zugegeben. Für diese Mengen wurden Proliferationshemmungen von 30%, 55% und 92%, respektive, gefunden. Dies zeigt, daß die Zellen auch nach Reversion der Hemmung nicht resistent gegen pepX werden. Beispiel 8
Mit diesem Vergleichsbeispiel wird gezeigt, daß Substance P oder das Substance P Fragment (L) Phe- (L) Phe-Gly-Leu- Met-NH2 im Gegensatz zu pepX keine nennenswerte Proliferationshemmung bei PBL's bewirken. Hierzu wurden 5x10S menschliche PBL's, stimuliert mit 2,5μg/ml PHA, für 72h mit einem der beiden genannten Peptide inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt.
Tabelle 6
Peptid ( lOOμg/ml ) (250μg/ml ) ( 500μg/ml )
SP 8 0 19
SP7"11 4 0 0
Eine Hemmung der Proliferation findet praktisch nicht statt.
Beispiel 9
In diesem abschließenden Beispiel werden besonders beeindruckende Rohdaten zur Hemmung antigenspezifischer Proliferation, verursacht durch verschiedene Antigene, mittels pepX vorgestellt. Es wurden drei Ansätze gefahren, wobei sich zwei Ansätze hinsichtlich der Antigene unterschieden. In allen Ansätzen wurden die Zellen 48h nach Stimulation für 20h mit 3H (0,5 μCi/well) markiert. In allen Ansätzen wurden jeweils pepX oder pepC in einer Menge von 300μg/ml zugegeben (zusätzlich zu dem jeweiligen Stimulations- Peptid) .
Im ersten Ansatz wurden Milzzellen, welche mit dem Masern- virus infizierten C3H-Mäusen entnommen wurden, mit einem Peptid, welches ein T-Zell-immundominantes Epitop des Masernvirus Nukleokapsidproteins enthält, zur Proliferation stimuliert. Costimulation erfolgte mit durch Bestrahlung inaktivierte autologe Milzzellen, welche das Peptid präsentieren. Das Peptid mit dem T-Zell-immundominanten Epitop des Masernvirus-Nukleokapsidproteins ist ein Hauptantigen für die Masernvirus-spezifische T-Zell-Reaktion. Im Ergebnis proliferieren jene Zellen, die das Epitop erkennen. Nach Zugabe von pepX wurde eine Radioaktivität von nur 148 cpm gemessen. Nach Zugabe von PepC wurde demgegenüber eine Radioaktivität von 17363 cpm gemessen. Die sich daraus ergebende Proliferationshemmung durch pepX gegenüber pepC liegt bei 99,992%.
Im zweiten Ansatz wurden aus Milzzellen, welche mit dem Masernvirus infizierten C3H-Mäusen entnommen wurden, T- Zell-Kulturen (CD8+) angelegt. Diese wurden alternierend mit IL2 bzw. mit dem immundominanten Peptid (siehe 1. Ansatz) stimuliert. Nach mehreren Zyklen wurden so T-Zell- Linien etabliert, die entweder durch Stimulation mit IL2 oder durch Stimulation mit dem immundominanten Peptid (An- tigen) proliferieren. Nach Zugabe von pepX wurde eine Radioaktivität von nur 67 cpm gemessen. Nach Zugabe von PepC wurde demgegenüber eine Radioaktivität von 74524 cpm ge- messen. Die sich daraus ergebende Proliferationshemmung durch pepX gegenüber pepC liegt bei 99,999%. Im dritten Ansatz wurden aus Milzzellen, welche mit dem Influenzavirus infizierten C3H-Mäusen entnommen wurden, T-Zell-Kulturen (CD8+) angelegt. Diese wurden alternierend mit IL2 bzw. mit einem immundominanten Peptid des Influen- zavirus stimuliert. Nach mehreren Zyklen wurden so T-Zell- Linien etabliert, die entweder durch Stimulation mit IL2 oder durch Stimulation mit dem immundominanten Peptid (An- tigen) proliferieren. Nach Zugabe von pepX wurde eine Radioaktivität von nur 90 cpm gemessen. Nach Zugabe von PepC wurde demgegenüber eine Radioaktivität von 57053 cpm gemessen. Die sich daraus ergebende Proliferationshemmung durch pepX liegt bei 99,998%.
Die in allen vorstehenden Beispielen 1 bis 9 genannten Zellinien/Zellen wurden im einzelnen stets in RPMI 1640 Medium (erhältlich von GIBCO/BRL) enthaltend 10% FCS (fe- tal calf serum) kultiviert.

Claims

Patentansprüche
1) Verwendung eines Peptides mit der Sequenz
Z-Phe-X-Gly-Y
oder eines Gemisches solcher Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure ist und wobei Y Carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C- terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist.
2) Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit ma- lignem Wachstum von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft, insbesondere der T-Zellen oder der B-Zellen.
3) Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft. 4) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die N-terminale Schutzgruppe eine Benzyloxycarbonyl-Gruppe ist.
5) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei X Phe oder Ala, vorzugsweise Phe mit einer vom N- terminalen Phe verschiedenen stereochemischen Struktur am α-Kohlenstoff, ist.
6) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Sequenz des Peptides
Z-(D)Phe-(L)Phe-Gly-Y
ist und wobei Z vorzugsweise die Benzyloxycarbonyl- Gruppe B und/oder Y vorzugsweise carboxyl-OH ist.
7) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Y ein Oligopeptid mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe ist.
8 ) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , wobei die syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe -NH2 ist . 9) Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei Y ein Dipeptid mit der Sequenz Leu-Met oder Val-Val ist, ggf. mit -NH2 als syntheseabspaltungsbedingte C- terminale Gruppe.
10) Ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz
Z-Phe-X-Gly-Y,
wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe oder Wasserstoff ist, wobei X eine natürliche Aminosäure - nicht jedoch Phe, Tyr, Val oder Ile; im Falle der Sequenz Z-(D)Phe- X-Gly-Y nicht jedoch Phe - ist und wobei Y carboxyl-OH oder eine syntheseabspaltungsbedingte C-terminale Gruppe oder ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren ist.
11) Ein die Proliferation von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft inhibierendes Peptid mit der Sequenz
Z-Phe-X-Gly-Y,
wobei Z eine N-terminale Schutzgruppe ist, wobei X Phe mit einer vom N-terminalen Phe verschiedenen stereo- chemischen Struktur am α-Kohlenstoff ist und wobei Y ein Oligopeptid aus natürlichen Aminosäuren mit maximal 10, vorzugsweise maximal 3, Aminosäuren, nicht jedoch -Ala-Val-Ile-Gly-, ist, ggf. mit einer syntheseabspaltungsbedingten C-terminalen Gruppe, vorzugsweise -NH2.
12) Peptid nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Sequenz
Z-(D)Phe-X-Gly-Y
ist.
13) Verwendung eines Peptides nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels für eine therapeutische Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere für die Behandlung von Erkrankungen mit malignem Wachstum von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft, beispielsweise der T-Zellen oder der B-Zellen, oder für die Behandlung von Erkrankungen mit antigenspezifischen Immunreaktionen von Zellen lymphocytischer und/oder monocytischer und/oder granulocytischer Herkunft.
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