JP2001512449A

JP2001512449A - 細胞増殖を阻害するペプチド及びその使用

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Publication number: JP2001512449A
Application number: JP53522498A
Authority: JP
Inventors: ミューレン，フォルカーター; シュナイダー−シャウリーズ，ジビレ
Original assignee: シェリングアクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1997-02-17
Filing date: 1998-01-30
Publication date: 2001-08-21
Also published as: EP0975661A1; DE19708454A1; WO1998035983A1; AU6391598A; CA2281033A1; IL131409A0

Abstract

(57)【要約】この発明は、配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙを有するペプチド又はこのようなペプチドの混合物の、ヒト又は動物の体、とくに細胞の悪性成長を伴う疾患、又は細胞の抗原特有な免疫反応を伴う疾患を治療する医薬の製造への使用を教示し、ここでＺは、Ｎ末端保護基又は水素であり、Ｘは、天然アミノ酸であり、そしてＹは、カルボキシルＯＨ又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基又は天然アミノ酸からなるオリゴペプチドであり、同じく発期は、このような使用に供する新規なペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞増殖を阻害するペプチド及びその使用この発明は、配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙ（配列中、ＺはＮ末端保護基又は水素であり、Ｘは天然アミノ酸であり、そしてＹはカルボキシルＯＨ又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基又は天然アミノ酸オリゴペプチドである）を有するペプチドの新規な使用に関する。さらに発明は、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の増殖を阻害するペプチドに関する。この発明においては、次の定義を使用する。天然アミノ酸とは、天然に産出され、化学式に従った構造をもつアミノ酸であり、その立体構造との関係はない。この点に関して、挙げた定義の範囲からみると、天然に由来する構造が知られるが、その立体化学構造が、とくにα位の炭素に関して天然に存在しないようなアミノ酸でも、天然アミノ酸の概念の中に入る。その例として（Ｄ）フェニルアラニンがある。Pheは、アミノ酸のフェニルアラニンを、Glyは、アミノ酸のグリシンを表わす。保護基としては、合成によって得られたペプチドのＮ末端部を合成試薬の化学的攻撃から保護するような化合物が挙げられる。ほぼ１５〜２０個のアミノ酸からなるペプチドは、通常、化学的な合成により、例えば、よく知られたメリフィールド合成法によって得られる。このような保護基は、得られたペプチドに生理効果を与える原因にもなり（しかし、必須ではない）、又はペプチドの生理効果を強めることもできる。この点に関し１つの保護基に、二重の機能があり、そしてこのような場合には、本来のペプチド合成反応が終了した後でも保護基は脱離されない。ペプチド合成で、通常使用される保護基の１つとして、例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃ₆Ｈ₅−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＯ−）があり、これはカルボベンゾキシ基とも呼ばれる。カルボキシルＯＨとしては、Ｃ末端部のカルボキシル基に属するＯＨ基が挙げられる。換言すれば、ＹとしてカルボキシルＯＨを有するペプチドは、Ｃ末端部に付くカルボキシル基を表わす。合成時の脱離を条件としたＣ末端基とは、アミノ酸のＣ末端部に結合し、それ自体として完成しているペプチドの、合成マトリックスからの脱離に由来する。次にＣ末端部としては、脱離の種類によるが、例えば、次の構造が挙げられる：アミド（−ＣＯ−ＮＨ₂ ）、ヒドラジド（−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ₂）又はエステル（−ＣＯＯＲ）。これらの例で合成時の脱離を条件としたＣ末端基には、−ＮＨ₂、−ＮＨ−ＮＨ₂又は− ＯＲがある。よく知られるように合成法にもよるが、合成時の脱離を条件とした他のＣ末端基を使用することも可能である。同様に保護基の場合でも、生理効果を与え、あるいは生理効果を強める作用は、合成時の脱離を条件とした１つのＣ末端基に限定されるものではない。この発明で定めた定義によれば、オリゴペプチドＹには、１個からほぼ１０個のアミノ酸が含まれる。増殖と表現した意味は、分裂により細胞数が増すことである。健康な細胞の場合には、増殖は、規則どおりに特定の、身体に適した物質が、１つの細胞に働いて誘発される。このような物質は、マイトジェンと命名される。同様に特定な種類の細胞の場合に、増殖は、抗原によっても誘発及び／又は共誘発される。自然増殖とは、マイトジェン誘発及び／又は抗原誘発を伴わない細胞の増殖をいう。自然増殖は、多くの場合、該当する細胞の欠陥機能による結果であり、例えば、突然変異によって引き起こされる。自然増殖は、いわゆる悪性の細胞成長に対する症候性を示し、癌とも呼ばれ、結果的に望ましいものではない。そしてまた望ましくない、とくに免疫系細胞の増殖は、別の理由によっても発生することがある。ヒト又は動物に、例えば、器官が移植されると、受容組織体の免疫反応が生じる。これは実質的に移植された器官の「異細胞」に対する一種独特な拒絶反応であって、器官被移植体の免疫系によって起こり、このときリンパ球は、器官の１つ又は幾つかの抗原に刺激されて増殖を起こす。マイトジェン誘発は、この種の増殖に対しては基本的に必要とされるものではない。それゆえに重要なことは、抗原特有な（すなわち、「異」誘発性の）増殖である。そしてまた抗原特有な望ましくない増殖は、例えば、自己免疫疾患のような移植医学として他の医学分野との関係ができるようになる。発明の理解には、次の技術水準が重要である。文献：Ch．D．Richardson et a l.，Virology，1980，105，205−222及びCh．D.Richardson et al.，Virology， 1983，131，518−532からは、とくにＢ−Phe−Phe−Gly−Ala−Val−Ile−Gly− ＯＨ（Ｂ＝ベンジルオキシカルボニル基、Ala＝アラニン、Val＝バリン、Ile＝イソロイシン）、Ｂ−Phe−Phe−Gly−ＯＨ、Ｈ−Phe−Phe−Gly−Ala−Val−Il e−Gly−ＯＨ及びＨ−Phe−Phe−Gly−ＯＨの配列をもつペプチドが知られる。これらのペプチドは、人体細胞に種々のウイルスが融合する機構を解明するために製造された。その背景をなすものに、例えば、センダイウイルス又ははしかウイルスのような種々のウイルスが、Ｆ１膜融合タンパク質の融合ドメインにおいて、部分配列−Phe−Phe−Gly−又は共通配列をなしていることがある。この研究における発見に、前記のペプチド（ウイルス標的細胞の並べられた受容体への競合的結合によると推定される）が、ウイルスとウイルス標的細胞との融合を阻害することがある。融合は、配列Ｂ−Phe−Phe−Gly−ＯＨを有するペプチドによっても阻止されたが、その効果は比較的弱かった。このペプチドは、細胞培養を伴う試験において、ウイルスとウイルス標的細胞の融合阻害を研究するための試薬として使用された。これに対して、このペプチド又は他に述べたペプチドの１つを、治療用の医薬を製造するために利用することは、まだ知られていない。初めに挙げた文献の箇所においても確認されているが、ＣＶ−１−細胞（非リンパ球又は非単球の付着細胞）は、ペプチドによって増殖が阻害されない。冒頭で述べた構成で一般的な配列の中に入れられる特別な配列は、基本的に別な関係に由来する部分配列としても知られる。従って配列Phe−Phe−Glyは、配列Ｈ−Arg−Pro−Lys−Pro−Gln−Gln−Phe−Phe−Gly−Leu−Met−ＮＨ₂（Arg ＝アルギニン、Pro＝プロリン、Lys＝リシン、Gln＝グルタミン、Leu＝ロイシン、Met＝メチオニン）をもつタキキニンの部分配列であり、これは神経伝達物質／神経修飾物質として、又は免疫系細胞（リンパ球）の産出を調整する作用を有する。ここにおいて、知られている限りの配列で、アミノ酸は、常に（Ｌ）−構造をしていることが分かる。このタキキニンは、ＳＰ（物質Ｐ）とも表わされる。このときＳＰは、例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するような状態にあり、しかもマイトジェンとして作用するほかの物質を追加して加える必要がない（例えば、 Kavelaars et al.，J.Neuroimm．1993，42，61−70を参照のこと）。この限りにおいて、ＳＰ自身は、マイトジェンと同じような働きをするものと思われる。次に挙げる文献：I.Z.Siemion et al.，Mol.Immunol.，27，887−890の相当箇所から知られるように、細胞培養実験から再び確認されたが、ＳＰのＣ末端と配列が一致する配列Ｈ−Phe−Phe−Gly−Leu−Met＝ＮＨ₂を有するペプチドは、（Ｌ） −構造だけが存在するフェニルアラニンに関しても一致するが、前記の文献による結果とは反対に、マイトジェン活性を示さないＢ細胞（リンパ球の下位グループ）の免疫グロブリン合成を低下させるように働くことがある。しかしながら、増殖の挙動に対する作用については、前記の文献からは知られていない。文献：I.Z.Siemion et al.，Archivum Immun o-logiae et Therapiae Experimentalis，1994，42，201-203から知られるように、配列Ｈ−Phe−Tyr−Gly−Leu−Met−ＮＨ₂（Tyr＝チロシン）、Ｈ−Phe−Va l−Gly−Leu−Met−ＮＨ₂及びＨ−Phe−Ile−Gly−Leu−Met−ＮＨ₂を有するペプチドには、同様な作用があり、このときも常に（Ｌ）−アミノ酸が使用されるが、増殖に関する効果には触れられていない。この発明の出発点となった文献に、Y．Yanagi et al.，Virology，1992，187 ， 280−289があり、細胞培養実験を行って、はしかウイルスが、Ｔ細胞（リンパ球の下位グループ）の増殖に及ぼす効果について調べられた。ここで、はしかウイルスが、増殖を阻害することが証明された。さらに証明されたことに、Ｚが、ベンジルオキシカルボニル基Ｂであり、配列Ｚ−Phe−Phe−Gly−ＯＨを有するペプチドは、このはしかウイルスが誘発するＴ細胞増殖の阻害を、再び相殺することがあり、つまりマイトジェンで誘発される増殖は、再び事実上正常に進行するようになる。実験結果から得られた知識をまとめると、知られている限りペプチドは、一方では、はしかウイルスがもつ増殖阻害効果を相殺するが、他方では、自身でさえ（マイトジェンに誘発される）Ｔ細胞増殖に対する（顕著な）阻害効果を示さなかったが、いずれにしても、これは試験した濃度範囲内における結果である。この発明は、疾患の治療に使用し得るペプチドを提供する技術的問題の基礎をなすものである。この発明は、とくに悪性の細胞成長を伴う細胞の自然増殖を阻害して、又は移植に条件を付ける免疫反応を阻害するようなペプチドを提供する技術的問題の基礎をなしている。この技術的問題を解決するために発明がする教示は、配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly− Ｙを有するペプチド又はこのようなペプチドの混合物を使用して、ヒト又は動物の体を治療する医薬を製造することにあり、ここでＺは、Ｎ末端保護基又は水素であり；Ｘは、天然アミノ酸であり；そしてＹは、カルボキシルＯＨ又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基又は天然アミノ酸からなるオリゴペプチドである。とくに技術的問題を解決するために発明がする教示は、このペプチド又はこのようなペプチドの混合物を使用して、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞、とくにＴ細胞もしくはＢ細胞の悪性成長を伴う疾患を治療する医薬を製造することにあり、又はリンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の抗原特有な免疫反応を伴う疾患を治療する医薬の製造にある。この医薬は、多くの場合に慣用されている添加剤を含むガレノス(galenisch)医薬であることが理解される。添加剤の選択は、専門家が、ガレノス(galenisch)の実用形式、そして具体的な投与乃至は薬剤提供の形態に合わせて難なく定めることができる。種々の癌疾患の中で最初に挙げられるのが白血病である。特許請求されたペプチド又はこのようなペプチドの混合物を投与することによって、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する悪性細胞の増殖が阻害される。従って、このような細胞の自然増殖は、もはや見出されないか、又は非常に減少された範囲にしか存在しない。活性を失った悪性細胞に関する限り、増殖阻害により、強制しなくて確かに悪性細胞を殺せる。次に推奨されるのは、適切な（ペプチドに融合される）細胞毒物質（毒素融合）の追加投与である。細胞毒物質の適切な例として、メトトレキセート（標的：ＤＮＡトポイソメラーゼII型）又はジフテリア毒素のようなポリペプチドが挙げられる。２番目に指摘されることは、とくに器官移植後に、移植に条件を付ける免疫反応、そして自己免疫疾患に関するものである。特許請求されたペプチド又はこのようなペプチド混合物の投与によって、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する（健康な）細胞の抗原特有な増殖が阻害される。従って、異器官に対する、それ自体が健康な自然免疫応答が抑圧され、その結果、異器官が拒絶されることがなくなる。発明を使用するには、Ｎ末端保護基がベンジルオキシカルボニル基であることが好ましい。ＸがPhe又はAlaであるのが有利であり、Ｘはα位の炭素において、Ｎ末端Pheによって種々の立体化学構造をとるPheであることが好ましい。個々の場合について好ましいのは、ペプチドの配列が、Ｚ−（Ｄ）Phe−（Ｌ）Phe−Gl y−Ｙであり、ここでＺはベンジルオキシカルボニル基Ｂであることが好ましく、そして／又はＹがカルボキシルＯＨであることが好ましい。さらにＹは、合成時の脱離を条件とした、例えば、−ＮＨ₂のようなＣ末端基をもつオリゴペプチドであることができる。Ｙは、とくに配列Leu−Met又はVal−Valを含み、必要な場合には、合成時の脱離を条件としたＣ末端基として−ＮＨ₂を有するジペプチドであってもよい。とくに配列Ｂ−（Ｄ）Phe−（Ｌ）Phe−Gly−ＯＨを有する本発明のペプチドは、驚くべきことには、自然増殖又は免疫特異的増殖を、強力に阻害する作用がある。この認識は、全く驚くべきことであり、なぜなら文献：Y．Yanagi et al. ，Virology，1992，187 ，280−289に記載されるように、知られる限りのペプチドは、一方では、はしかウイルスの増殖阻害効果を相殺し、他方においては、試験した濃度範囲において、Ｔ細胞増殖（ここではマイトジェン誘発）に対する阻害効果さえも全く示さなかったからである。従って文献の該当箇所は、むしろ逆方向の記載をなすものである。もちろん基本的には、請求項１〜９に記載される他の修飾体についても、ペプチドが、自然増殖又は免疫特異的増殖に対して阻害効果を有する限り、発明のために使用される。適切な修飾が、簡単な方法を用いて通常の合成によって施され、同じく簡単にその阻害効果に関する試験が行なわれる。このような試験は、通常、〔³Ｈ〕−チミジン又はアルマルブリュー（Almar-Blau）を使用して行なわれる。〔³Ｈ〕−チミジンを使用して培養中に新しく形成した細胞の数を測定する（放射能測定）。アルマルブリュー（BIOSOURCE Int.社の製品、アメリカ）を使用して、細胞内の代謝性変換を測定する（比色測定又は蛍光測定）。代謝性変換量が多いことは、多くの場合、その前の細胞分裂との相関を示している。それぞれの量は、比較として同じ細胞を培養したときの量と、それも阻害剤なしか、又は阻害効果をもたないペプチドを添加したときの値と比べて示される。簡単な方法による比較図を書き、増殖阻害を％で表示して定量化する。この際、よく知られた標準試験法が重要である。次に示すペプチド修飾も、上述の技術水準からは知られていないが、自然増殖又は免疫特異的増殖を阻害する効果を有するので、発明に基づく技術的問題も、配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙを有し、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の増殖を阻害するペプチドによって解決されるが、ここでＸは、天然アミノ酸であるが、Phe、Tyr、Val又はIleではなく、配列がＺ−（Ｄ）Phe− Ｘ−Gly−Ｙの場合には、ＸはPheではなく、そしてＹはカルボキシルＯＨ又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基又は天然アミノ酸からなるオリゴペプチドである。技術的問題を、さらに解決するための方法として、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の増殖を阻害するために、配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙを有するペプチドを使用し、ここでＺはＮ末端保護基であり、Ｘはα位の炭素において、Ｎ末端Pheによって種々の立体化学構造をとるPheであり、Ｙは、最大で１０個、好ましくは最大３個のアミノ酸を含む天然アミノ酸からなるオリゴペプチドであり、Ala−Val−Ile−Gly−ではなく、必要な場合には、合成時の脱離を条件としたＣ末端基として−ＮＨ₂を含むのが好ましい。このような新規なペプチドについて具体例を挙げると、Ｂ−（Ｄ）Phe −（Ｌ）Phe−Gly−Phe−Gly−Ｒ及びＢ−（Ｄ）Phe−（Ｌ）Phe−Gly−Phe−Gl y−Phe−Gly−Ｒがあり、ここでＲは、ＯＨ又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基であることができ、そして立体化学的に特徴づけないPheは、（Ｌ）−構造であるのが好ましい。最初の研究において示されたように、前記の具体的構造を有するペプチドは、免疫系細胞の増殖に対しておそらくより強力な阻害効果を有している。さらに改良された生物学的活性については、オリゴペプチドＹの核配列に付くアミノ酸によるペプチドの安定化が起因するものと考えられる。このような新規な修飾化合物については、すでに前に説明したように簡単な方法で合成し、簡単な方法で自然増殖又は免疫特異的増殖を阻害する効果に関する試験ができる。自然増殖又は免疫特異的増殖を阻害する効果の程度は、１０％を超える阻害、好ましくは５０％を超える阻害、非常に好ましくは８０％を超える阻害に分けた尺度として表わされ、その測定は、ペプチドで処理した細胞培養について通常の方法で測られた増殖速度を、ペプチドを使用しないか、又は不活性なペプチドを使用して、同じ細胞培養において得られた増殖速度と比較して行なった。特定の細胞系については、事実上１００％の阻害効果さえも見出されている。ペプチドは、好ましくは配列Ｚ−（Ｄ）Phe−Ｘ−Gly−Ｙを含むように作られる。その他の場合においも、発明を使用するために前述の説明によるあらゆる修飾及び／又は請求項２〜９に相当する修飾に基づいた処理を行なうことができるが、ここで、Ｘは、Phe、Tyr、Val又はIleではなく、又は配列Ｚ−（Ｄ）Phe− Ｘ−Gly−Ｙの場合には、Ｘは、Pheではなく、又はオリゴペプチドＹは、−Ala −Val−Ile−Gly−でないことを条件とする。請求項１０又は１１に記載した新規なペプチドと並んで、この新規なペプチドを、ヒト又は動物の体を治療するための医薬の製造、とくにリンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞の悪性成長を伴う疾患を治療するための医薬の製造、又はリンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の抗原特有な免疫反応を伴う疾患を治療するための医薬の製造に使用することも本発明の対象である。さらにこの発明に属するが、請求項１０又は１１記載のペプチドを、必要な場合には、上に説明した修飾を入れて製造する方法があり、このときペプチドは、通常の合成法、例えば、メリフィールド合成法乃至は固相合成法によって製造される。最終的に発明は、請求項１〜９又は１３によって製造された医薬をも包含する。次に発明を、実施例を用いて詳しく説明する。実施例１．すべて次に示す結果は、〔³Ｈ〕チミジン法又はアラマルブリュー法により、そのつど細胞培養において得られた増殖を定量化したものである。この場合に、自然増殖の測定は、マイトジェンとして作用する物質を添加しないで行なった。すべての実施例において、ペプチドＢ− （Ｄ）Phe−（Ｌ）Phe−Gly−ＯＨを、増殖阻害型ペプチドとして使用した（表中にｐｅｐＸと記した）。実験では多くの場合、自ら合成したペプチドを使用した。しかし、このようなペプチドは、購入することもできる（例えば、Sigma社又はBachem社）。比較用のペプチドとして、Ｂ−Gly−（Ｌ）Phe−（Ｌ）Phe− ＯＨを使用した（表中にｐｅｐＣと記した）。個々には細胞系乃至は細胞試料は、９６クラスター（容器）プレートとして提供されるが、その密度すなわち細胞数／容器は、容積100μl/容器について5×10⁴個である。次にペプチドを、表に挙げた量だけ加えてから７２時間インキュベートした。ここで〔³Ｈ〕チミジン( 0.5μCi/ml;1Ci=37GBq)又はアラマルブリューによる１６時間の標識化を行なった。アッセイは３回行なった。細胞を採集した後に増殖速度乃至は物質代謝上昇度を測定したが、これは内蔵されたトリチウムのβ線検出器による定量から、又は色濃度乃至は蛍光の測定から求めた。次に得られた値を、対応する未処理の細胞培養の値と比較すると、自然増殖を阻害する効果が％として得られた。表２に示した結果は、％で表わした阻害効果を、比較試料のペプチドを用いた実験に対して求めたものである。表１に示す結果は、種々の癌疾患をもつ患者の悪性細胞試料についての最初の実験によるものである。表２において、種々の癌疾患をもつ患者の悪性細胞試料について更に行なった実験結果を示す。まず表１から、ｐｅｐＸによる自然増殖の阻害は、比較として多くの場合に実用されるペプチドｐｅｐＣによる阻害に較べて強力なことが分かる。さらに表１から、ｐｅｐＸによる阻害は、高い確率をもって投与量に関係することが分り、これはペプチド自体がもつ阻害効果であって、試験の周辺条件に支配されるものではない。増殖の阻害は、％表示によって示される。表示ａを付けた値は、〔³Ｈ〕チミジンを使用して得られた。表示ｂを付けた値は、アラマルブリューを使用して得られた。アラマルブリュー法は、〔³Ｈ〕チミジン法と比較して感度が低いことが一般的に確かめられた。表１患者／診断ｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＣ (50μg/ml) (200μg/ml) (200μg/ml) １／？ 35^b 44^b 17^b ２／？ 17^b 39^b ８^b ３／ＣＬＬ 24^a 40^a ０^a ４／ＲＡＲＳ 24^a 46^a ６^a ５／ＣＬＬ 26^a 38^a 18^a ６／ＣＬＬ 34^a 42^a ２^a ７／ＣＭＬ 64^a 88^a 18^a ８／核細胞気管支癌 38^a 50^a 14^a ９／ＡＭＬ 45^a/50^b 80^a/85^b 15^a/4^b ９／ＡＭＬ 23^a/15^b 39^a/40^b 19^a/2^b ９／ＡＭＬ 42^a/36^b 58^a/56^b ６^a/6^b 表２診断患者数 200μｇ患者数 200μｇ pepX/pepC pepX/pepC ＣＬＬ 11 53^a±24 ５ 42^b±５ＮＨＬ４ 83^a±12 ４ 60^b±６ＨＣＬ１ 24^b ｃｂ／ｃｃ２９^a/95^a 急性白血病１ 70^b ＰＬＺ１ 64^b ＣＭＬ５ 78^a±16 ４ 56^b±８ＡＭＬ４ 60^a±17 ４ 63^b±20 ＭＰＳ１ 42^a ２ 37^b±７骨髄芽球１ 80^a ＰＣＶ１ 30^a １ 12^b ＩＴＰ３ 44^b±６ＩＣ１ 58^b ThroＰＥ１ 55^a ２ 37^b±16 ＲＡＲＳ１ 46^a ＭＡＧ−ＣＡ１ 29^a 咽頭再発１８^a 気管支癌１ 50^a 悪性ヒストザイム１ 14^a 使用した診断の略字は、次の所見によるものである：ＣＬＬ：慢性リンパ性白血病；ＣＭＬ：慢性骨髄白血病；ＡＭＬ：急性骨髄白血病；ＲＡＲＳ：芽球過多の不応貧血症；ＮＨＬ：非ホジキンリンパ腫；ＨＤ：ホジキン症；ＩＴＰ：免疫性血小板減少症；ＨＣＬ：ヘアリーセル白血病；ThroＰＥ：血小板減少症；ＭＰＳ：骨髄増殖性症候群；ＰＣＶ：真性赤血球増加症；ＩＣ：免疫細胞；ＰＬＺ：血小板増加；ｃｂ／ｃｃ：中心芽球／中心球性リンパ腫；ＭＡＧ−ＣＡ：胃癌腫；ＭＥＧ−Ｍ：巨核芽球骨髄症。表１及び２が基にした実験で用いた細胞は、密度勾配遠心装置Ficoll/Paque（ Pharmacia製）を用いて患者のヘパリン化した血液から分離した。このように分離された細胞を、同様に１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むPPMI 1640媒質の中で培養した。実施例２. 表３に挙げたヒトの細胞増殖を阻害するデータは、前記の表１と同じようにして得られたものである。実験は、自己ＰＢＬ（ＰＢＬ：末梢血液リンパ球）、同種ＰＢＬ（抗原特有な、ＵＶ不活性な「異」ＰＢＬにより誘発される増殖の阻害）、そして種々の自然増殖型細胞系（自然増殖の阻害）を用いて行なわれた。自己ＰＢＬの場合には、ＰＨＡ（ＰＨＡ：フィトヘマグルチニン、Ｔ細胞及びＢ細胞を活性化する）の存在下において測定された。表中で指数ｂの表示がない場合は、すべて〔³Ｈ〕−チミジンによる処理を行った。同種ＰＢＬの場合においては、阻害の計算を、ｐｅｐＣを用いた試料に対して行った。表３細胞ｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＣ細胞系 (50μg/ml) (100μg/ml) (200μg/ml) (200μg/ml) 自己PBL 12±３ 52±５ 84±８５±２同種PBL 15^b±２ 22^b±４ 65^b±６ 42±５ 70±３ U-937 10±４ 39±４ 74±３６±２ U-937-X 17±５ - - 70 ±２８±３ HL60 15±２ 42±４ 69±４４±１ BJAB 21±５ 28±11 79±６６±２ラージ細胞 22 30 94 16 ジャーカット８±３ 58±23 64±９５±３細胞今回も、先ずすべての場合について認められるが、ｐｅｐＸによる増殖阻害の程度は、事実上不活性なｐｅｐＣ、又は比較として用いた活性に乏しいｐｅｐＣによる阻害に較べて強力である。さらにｐｅｐＸによる阻害は、投与量に関係するが、この場合においても、ペプチド自体がもつ阻害効果により、試験の周辺条件によるものではない。Ｕ−９３７、Ｕ−９３７−Ｘ（ＣＤ４６発現において欠失されるＵ−９３７サブクローン）及びＨＬ６０は、単球細胞である。ＢＪＡＢ（リンパ芽球Ｂ細胞）、ラージ細胞及びジャーカット細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、ヒトのリンパ球様細胞である。実施例３．この実施例に表示する結果は、実施例２と比較したときに、ヒトの非リンパ性乃至は非単球性の細胞系について得られたものである。実験は、実施例２と同じ条件で行なわれた。表４細胞系ｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＣ (50μg/ml) (100μg/ml) (200μg/ml) (200μg/ml) Hela ９±５ 11 13±３６±３ Hela S3 ０ -- ２±２４±６ 293 ８±３ 11 12±４４±１ NCI H460 12±５２ 15±３４±２ U87 １＜10 1 2 非リンパ性乃至は非単球性の細胞系について試験したが、阻害効果は見られない。実施例４. 表５に、種々の齧歯動物の細胞乃至は細胞系について実験した結果を示す。試験方法は、実施例２の記載と同じにした。ラットのＰＢＬ細胞及びマウスの脾臓細胞は、ＣｏｎＡ（コンカナバリンＡ）による刺激を受けた。今回も、先ずすべての場合について認められるが、マイトジェンにより剌激された増殖の阻害、又はｐｅｐＸによる自然増殖の阻害は、事実上不活性なｐｅｐＣ、又は比較として用いた活性に乏しいｐｅｐＣによる阻害に較べて強力である。さらにｐｅｐＸによる阻害は、投与量に関係するが、この場合においても、ペプチド自体がもつ阻害効果により、試験の周辺条件によるものではない。前記の細胞系には、次のような略字を使用した。ＥＬ４：胸腺腫系；ＹＡＣ１：リンパ腫；Ｐ８１５：マスト細胞腫；ＦＱＫ 45.5、Ｓ１０７Re1B、Ｓ１０７ＮＦＫＢ及びＴＩＢ２２１：Ｂ細胞、Ｓ１０７．．．は、細胞間信号経路の特定な突然変異を示す；Ｐ３８８Ｄ１：リンパ球マクロファージ；Ｌ９２９：線維芽細胞。表５細胞ｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＸｐｅｐＣ細胞系 (50μg/ml) (100μg/ml) (200μg/ml) (200μg/ml) ラット： PBL(ルイス) 64±６ 97±２ 93±８ 12±４マウス、脾臓： Balb/c 68 88 98 ２ C3H 75 92 96 ０ C57/b16 72 96 98 ０細胞系： EL4 26±４ 57±24 87±２９±３ YAK1 50±５ 62±５ 83±16 ４±６ P815 11±２ 55±７ 81±６ 10±２ P388D 40±３ 39±３ 82±17 21±９ FQK45.5 22±２ 75±26 95±８ 19±１ S107 Re1B 50±４ 87±10 100±０５±５ S107 NFkB 60±０ 80±３ 100±０５±３ TiB 221 40 66±１ 93 11 L929 15±４ 25±８ 68±４５±１実施例５. この実施例が示した結果によると、ｐｅｐＸ又はｐｅｐＣで処置しても、ペプチドによって誘発された細胞死の信号が現れない（計画的又は外因性の刺激により誘発された細胞死）。アネキシン染色法及びチューネル染色法が使用された。アネキシン染色法の場合には、アネキシンが強くホスファチジルセリンと結合するが、このホスファチジルセリンは、通常、細胞膜内に局在化し、細胞死の初期段階の１つとして細胞表面に転座する。従って、蛍光標識アネキシンの細胞に対する結合は、非常に早期段階において細胞死の誘発を検出する。チューネル法（ＴＵＮＥＬ）とは、ターミナルウリジン−トランスフェラーゼヌクレオチドによる末端標識化法を意味する。標識化されたヌクレオチドは、遊離のＤＮＡ末端に移行するが、この末端は細胞死で誘発されたＤＮＡの鎖断片に由来する。この反応は、細胞死の後期段階において初めて観察することができる。両者の方法によって得られた結果は、時間に関係する動態であり、つまり着色度は、ペプチドと接触させてからの時間を変えて測定した。ペプチドに曝してから、そのつど６時間、１２時間、２４時間及び４８時間が経過した後で測定した。添加したペプチド量は、常に200μg/m lであった。ＢＪＡＳ（Ｂ細胞）、ＨＬ−６０（単球）、ＰＢＬ、Ｕ９３７（（単球）、Ｊ１６（ジャーカット細胞、細胞死に対する最大感度に基づいて選択）、Ｊ 16.6 （Ｊ１６のサブクローン、細胞死に対する感度は低い）及びＪ１７（Ｊ１６のサブクローン）が試験された。ＨＬ−６０、ＰＢＬ及びＪ１６については、比較として細胞死を誘発する条件が選ばれた（陽性比較）。結果を要約すると次のようになる。ＢＪＡＢ：細胞のアネキシン陽性部分とヨウ化プロピジウム陰性部分の推計学的ゆらぎが２％〜１６％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。ＨＬ−６０：細胞のアネキシン陽性部分とヨウ化プロピジウム陰性部分の推計学的偏差が１％〜８％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。これに対してカンプトテシン0.2μg/m lを添加すると７０％になった。ＰＢＬ：細胞のフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ陽性部分の推計学的偏差が４％〜１５％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。これに対してαＣＤ３１μg/ml＋ＩＬ２ 100U/ml＋αＦＡＳ５μg/ml（１６時間後）を添加すると５７％になった。Ｕ９３７：細胞のアネキシン陽性部分とヨウ化プロピジウム陰性部分の推計学的偏差が２％〜１５％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。Ｊ１６：細胞のアネキシン陽性部分とヨウ化プロピジウム陰性部分の推計学的偏差が１％〜１５％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。これに対してαＦＡＳ５μg/mlを添加すると４５％になった。Ｊ16.6:細胞のアネキシン陽性部分とヨウ化プロピジウム陰性部分の推計学的偏差が２％〜８％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。Ｊ17.5:細胞のアネキシン陽性部分とヨウ化プロピジウム陰性部分の推計学的偏差が７％〜１８％の範囲にあり、しかもｐｅｐＸともｐｅｐＣとも時間の相関関係はない。実施例６. この実施例で示されるように、ペプチドｐｅｐＸの効果で生じた増殖阻害は、再び逆になることがある。ＰＨＡの存在下においてＰＢＬを３日間ｐｅｐＸで処置すると増殖阻害は９５％に達した。その後、さらに６乃至は１２日の間、細胞を、ＩＬ２（インターロイキン２）によって刺激した（ｐｅｐＸ及びＰＨＡは存在しない）。増殖阻害は、総計９日後に７８％に、総計１５日後に２３％まで低下した。実施例７. この実施例で示されるように、実施例６による増殖阻害の逆転後に、新たにｐｅｐＸを投与すると、投与量に関係する増殖阻害が発生することが、新たに観察された。このときＰＢＬは、実施例６に従って扱った。引き続いて50、100又は2 00μg/mlのｐｅｐＸを加えた。ここで見出された増殖阻害は、それぞれの量に対して３０％、５５％、そして９２％であった。ここに示されたように、細胞には、阻害逆転後においても、ｐｅｐＸに対する耐性が発生しない。実施例８. この比較実施例で示されるように、物質Ｐ又は物質Ｐのフラグメント（Ｌ）Ph e−（Ｌ）Phe−Gly−Leu−Met−ＮＨ₂ は、ｐｅｐＸと比較して、ＰＢＬに対する顕著な増殖阻害効果を示さない。ここでヒトＰＢＬの５×１０⁵個を、ＰＨＡ 2.5μg/mlで刺激し、７２時間、前記２ペプチドの１つとインキュベートした。表６に結果をまとめた。表６ペプチド (100μg/ml) (250μg/ml) (250μg/ml) ＳＰ８０１９ＳＰ^7-11 ４００増殖阻害は、実際に発生していない。実施例９. 終わりにあたる実施例では、とくに種々の抗原に起因する抗原特異的増殖を、ｐｅｐＸによって阻害した印象的な粗データを紹介する。３種の試みから始めたが、このうちの２つは、抗原に関して差異がある。すべての試みにおいて、細胞に、２０時間の³Ｈ（0.5 μCi/容器）による刺激を与えてから、標識化を４８時間行なった。すべての試みにおいて、そのつど量300μg/mlのｐｅｐＸ又はｐｅｐＣを加えた（それぞれの刺激ペプチドに追加する）。先ず最初の実験として、はしかウイルスを感染させたＣ３Ｈマウスから採取した脾臓細胞に、はしかウイルスであるヌクレオカプシドプロテインのＴ細胞免疫優性エピトープを含むペプチドを加えて、脾臓細胞を刺激して増殖させた。共刺激が、照射によって不活性化し、ペプチドを代表する脾臓の自己細胞に生じた。はしかウイルスであるヌクレオカプシドプロテインのＴ細胞免疫優性エピトープをもつペプチドは、はしかウイルス特有なＴ細胞反応に対する主要抗原である。その結果、すべてエピトープを認識した細胞が増殖する。ｐｅｐＸを添加した後で放射能を測定すると148cpmに過ぎなかった。これに対してｐｅｐＣ添加後における放射能測定値は17363cpmであった。実験結果によるとｐｅｐＸの増殖阻害効果は、ｐｅｐＣに対して99.992％の値を示している。２番目の実験として、はしかウイルスを感染させたＣ３Ｈマウスから採取した脾臓細胞についてＴ細胞培養（ＣＤ８＋）を行なった。ＩＬ２と免疫優性ペプチド（最初の実験参照）を、交互に用いてこれに刺激を与えた。数周期の後にＴ細胞系が樹立され、ＩＬ２による刺激又は免疫優性ペプチド（抗原）による刺激を受けたＴ細胞系が増殖した。ｐｅｐＸ添加後に放射能を測定すると67cpmに過ぎなかった。これに対してｐｅｐＣ添加後における放射能測定値は74524cpmであった。実験結果によるとｐｅｐＸの増殖阻害効果は、ｐｅｐＣに対して99.999％の値を示している。３番目の実験として、インフルエンザウイルスを感染させたＣ３Ｈマウスから採取した脾臓細胞についてＴ細胞培養（ＣＤ８＋）を行なった。ＩＬ２とインフルエンザウイルスの免疫優性ペプチドを、交互に用いてこれに刺激を与えた。数周期の後にＴ細胞系が樹立され、ＩＬ２による刺激又はと免疫優性ペプチド（抗原）による刺激を受けたＴ細胞系が増殖した。ｐｅｐＸ添加後に放射能を測定すると90cpmに過ぎなかった。これに対してｐｅｐＣ添加後における放射能測定値は57053cpmであった。実験結果によるとｐｅｐＸによる増殖阻害効果は99.998の値を示している。すべて前記の実施例１〜９に挙げた細胞／細胞系は、個々に、常に１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むRPMI 1640媒質（GIBCO/BRLより入手可能）の中で培養した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 7/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】 1. 配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙ：（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基又は水素であり；Ｘは、天然アミノ酸であり；そしてＹは、カルボキシルＯＨ、又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基、又は天然アミノ酸からなるオリゴペプチドである）を有するペプチド又はこのようなペプチドの混合物の、ヒト又は動物の体を治療する医薬を製造するための使用。 2. リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞、とくにＴ細胞又はＢ細胞の悪性成長を伴う疾患を治療する医薬を製造するための請求項１に記載の使用。 3. リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の抗原特異的免疫反応を伴う疾患を治療する医薬を製造するための請求項１に記載の使用。 4. Ｎ末端保護基が、ベンジルオキシカルボニル基である請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。 5. Ｘが、Phe又はAlaであり、そして好ましくは、α位の炭素において、Ｎ末端Pheによって種々の立体化学構造をとるPheである請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。 6. ペプチド配列が、Ｚ−（Ｄ）Phe−（Ｌ）Phe−Gly−Ｙであり、ここでＺは、好ましくはベンジルオキシカルボニル基Ｂであり、そして／又はＹは、好ましくはカルボキシルＯＨである請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。 7. Ｙが、合成時の脱離を条件としたＣ末端基を有するオリゴペプチドである請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。 8. 合成時の脱離を条件としたＣ末端基が、−ＮＨ₂である請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。 9. Ｙが、配列Leu−Met又はVal−Valを含むジペプチドであり、必要な場合には、合成時の脱離を条件としたＣ末端基として−ＮＨ₂を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。 10．配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙ：（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基又は水素であり；Ｘは、天然アミノ酸であるが、Phe、Tyr、Val又はIleではなく；配列が、Ｚ−（Ｄ）Phe−Ｘ−Gly−Ｙの場合には、Pheではなく；そしてＹは、カルボキシルＯＨ、又は合成時の脱離を条件としたＣ末端基、又は天然アミノ酸からなるオリゴペプチドである）を有し、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の増殖を阻害するペプチド。 11．配列Ｚ−Phe−Ｘ−Gly−Ｙ：（式中、Ｚは、Ｎ末端保護基であり；Ｘは、α位の炭素において、Ｎ末端Pheによって種々の立体化学構造をとるPhe であり；そしてＹは、最大で１０個、好ましくは最大３個のアミノ酸を含む天然アミノ酸からなるオリゴペプチドであり、しかし、−Ala−Val−Ile−Gly−ではなく、必要な場合には、合成時の脱離を条件としてＣ末端基に好ましくは−ＮＨ₂を含む）を有し、リンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の増殖を阻害するペプチド。 12．配列がＺ−（Ｄ）Phe−Ｘ−Gly−Ｙである請求項１１又は１２に記載のペプチド。 13．ヒト又は動物の体を治療するための医薬、とくにリンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞、例えば、Ｔ細胞又はＢ細胞の悪性成長を伴う疾患を治療するするための医薬、あるいはリンパ球及び／又は単球及び／又は顆粒球に由来する細胞の抗原特異的免疫反応を伴う疾患を治療する医薬を製造するための請求項１０〜１２のいずれか１項記載のペプチドの使用。