CN113651870B - 一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明中公开了一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽及其应用。该小分子修饰短肽为在H2肽(GPANVET)的N端进行甲基化、乙酰化修饰、序列截短或引入两个苯丙氨酸形成自组装纳米球，获得七种不同修饰短肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2和FF‑H2肽。本发明中的小分子修饰短肽在血浆中具有较高的活性和较强的酶解稳定性，在体内酶解环境中能促进成纤维细胞和脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移，从而能够促进创伤部位组织的修复，如皮肤创伤修复和神经损伤修复等。

Description

一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽及其应用。
背景技术
许多因素会造成细胞和组织的损伤。损伤后组织部位及其附近存活的健康细胞不断进行分裂和增殖，以取代死亡细胞和修复受损组织，生物体的这种生理机能称为再生和修复。
正常情况下，人体不同器官的修复和再生能力有所不同。表皮细胞(如呼吸道、消化管和泌尿生殖器的粘膜被覆上皮)、淋巴细胞、造血细胞等属于再生力强的细胞，这些种类的细胞每时每刻都在进行衰老与新生，具有应对损伤的强大再生修复能力，因此属于再生能力较强的细胞。而其他如血管内皮细胞、骨膜细胞、各种腺体器官的细胞如肝、胰、内分泌腺、汗腺、皮脂腺及肾小管上皮细胞等则属于次一级的有较强再生力的细胞，当受到损伤时，也能表现出一定的再生能力。具体反映在局部组织当这些正常的细胞被破坏后，由残留的同类细胞分裂、补充；而如果该局部的细胞完全被破坏，细胞全部坏死，则该部位就不能被修复。另外，还有再生力微弱或无再生力的细胞，如中枢神经细胞和神经节细胞再生很弱，遭损坏后极难恢复原有功能；心肌细胞再生能力极弱，损毁后均由纤维结缔组织代替，很难恢复原有的结构和功能。
影响组织再生的因素有很多。除了组织和细胞自身的再生能力外，还有如下几种因素：(1)组织受损伤的程度和范围：范围越大则修复和再生的时间越长，因为大范围的细胞坏死后，难以有相当数量的同类细胞代替，需要健康的细胞产生新细胞，新生细胞再生成新细胞，需要的时间就要漫长一些。(2)年龄因素：儿童和青少年组织再生能力强，创伤愈合快；老年人组织再生能力弱，愈合慢。(3)营养状况：充足的蛋白质、维生素C、E和矿物质钙、锌供应能够促进损伤的修复，反之则会延缓各种损伤的修复。(4)药物影响：有些药物如肾上腺皮质激素和垂体促肾上腺皮质激素能抑制炎症，但不利于机体消除伤口感染，还能抑制肉芽组织生长和胶原合成，加速胶原分解；还有抗癌药中的细胞毒药物也可延缓愈合。(5)血液供应：组织损伤后，由于局部毛细血管也受到破坏，或者其他因素导致血管硬化等，都会导致血液供应不足而导致组织营养不良，妨碍愈合。(6)神经支配：失去神经支配的组织会丧失再生能力。
从上可知，机体的组织受到损失后，除却无法外界干预的如年龄等客观因素外，从增加受损部位的营养供给、采用药物干预其促进存活细胞增殖、促进毛细血管的新生和神经细胞的再生等，可以加快组织的修复。
以下从目前组织修复的三大应用领域：皮肤、神经和骨组织的创伤修复情况进行更为详细的介绍：
一、皮肤组织的创伤修复
皮肤是人体面积最大的且最直接与外界接触组织，同时也是最容易受到外界刺激而损伤的器官。正常创伤的愈合对维持机体稳态至关重要，而异常愈合如大面积烧烫伤造成的不愈或者迟愈、其他疾病导致的慢性创面愈合、以及不正常的愈合如病理性瘢痕的形成等等不仅影响了美观，更会造成结构和功能的障碍，往往对患者造成沉重的心理压力，严重影响着患者的身心健康。因此，如何在皮肤创伤治疗中快速达到最佳愈合效果，一直是人们研究的热点。
皮肤的愈合过程是一个复杂的、协调有序的组织修复再生过程，是多种细胞及细胞因子共同作用完成的过程。该过程大致可以分为炎症反应期、增生期和重塑期，三个期相互交叉并无严格的界线，且均有大量的细胞及细胞因子参与愈合过程。参与愈合的细胞包括角质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、单核/巨噬细胞和肥大细胞等；参与愈合的细胞因子包括成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生因子(Plateletderived growth factor，PDGF)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowth factors，IGF)和多种凝血因子等。细胞分泌细胞因子调节创伤愈合，细胞因子又反过来影响细胞的功能，其中任何一个环节的异常都可能造成皮肤愈合结果的异常，而且皮肤愈合过程受到的影响因素众多(年龄、营养状况、内分泌变化、药物、局部血液循环、感染、电离辐射和系统性疾病等)，因此，皮肤愈合的机制目前仍不完全明确。
目前，在伤口护理中提出了几种新的技术。在临床护理上，负压伤口治疗仪(NPWD)治疗急性伤口的应用比较广泛，可以稳定患者的许多复杂伤口，利于皮肤重建过程。高级敷料如各种亲水性泡沫敷料、水凝胶、藻酸盐等吸收重量最多可以达到其重量的20倍，对于严重渗出的伤口能够更快愈合。随着生物材料和组织工程技术的发展，烧伤复苏和重症监护管理技术逐渐进步，自体移植成为优先的治疗方式，但是在许多情况下，用于移植的组织数量不够，或者患者的病情妨碍了自体移植的使用，同时异体移植带来的忧患，生物工程皮肤替代品是皮肤替代品和自体皮肤的共培养产物，可以提供临时或者永久性覆盖伤口，其优点在于几乎不存在大面积细菌感染和免疫学问题，这使得生物工程皮肤替代品更受青睐。但是治疗费用较高，限制了它的应用频率。
除了临床护理技术外，创伤愈合的药物研究成为一个较热的领域。基于我国传统中医药的优势，在创伤修复领域涌现了许多单方如康复新液，复方则由少则四、五味，多则二三十味中药进行配伍制备而来，例如治疗烧烫伤的“湿润烧伤膏”、“京万红”等。现代医药开发特别是基因工程技术介入的生物医药开发后，促细胞生长的重组生长因子的生产也是创伤修复药物开发的生力军，比如已经在临床上应用于创伤、烧烫伤等的生物技术药物--外用重组碱性成纤维细胞生长因子(basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)，就是我国第二个基因工程I类新药(注：碱性成纤维细胞生长因子又称为成纤维细胞生长因子-2，FGF2)。
多肽药物相对于重组蛋白在制备上更容易通过化学合成的方式获得，容易在杂质或副产品中分离，纯度与重组蛋白更高。另外，多肽药物分子量小，在病灶处积累多，且相对于重组蛋白不易降解的特点，使得多肽药物的研发成为热点。在皮肤创伤修复领域，用于治疗创伤修复的多肽药物主要集中在伤口愈合抗菌肽、组织再生肽和基于肽的伤口敷料。
伤口愈合抗菌肽类主要包括基于抗菌肽(AMPs)的防御素和合成肽。人类防御素主要分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素。而LL-37是迄今为止在人体内发现的唯一Cathelicidins家族的抗菌肽，已经有报道证明，LL-37通过表皮生长因子受体的反式激活诱导角质形成细胞迁移，因此，在糖尿病足(DFU)愈合过程中引起更多关注。
抗菌肽在创伤初期能有效抑制创面的微生物病原体污染，有文献报道，在溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶降解基质会产生生物活性肽能够促进微血管形态的发生和体外伤口愈合。其中Col4-1和Comb1两种肽与血清相比，可将微血管内皮细胞增殖速率提高47％，将体外血管生成速率提高200％。也有文献报道Matrikines，既基于细胞外基质(ECM)的修复肽，能够促进成纤维细胞中胶原蛋白的形成。后来，有学者发明了基于模拟肝素合成的多肽PA，实验结果表示PA具有肝素促进血管生成的特性，并且把PA制成凝胶，在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠的治疗中显示能够促进重新上皮形成。此外，GHK三肽能够形成铜配合物，具有抗炎和伤口愈合特性，改善皮肤密度和紧致度，在化妆品行业的应用甚广。
基于多肽的伤口敷料，有文献报道了一种连接多肽QHREDGS的壳聚糖胶原水凝胶，能够促进健康人和糖尿病人的角质形成细胞迁移，加速伤口闭合，促进血管生成。此外，也有报道多肽ACT1包埋在羟乙基纤维素水凝胶中，加速重新上皮。基于肽的伤口敷料不仅发挥出多肽对细胞增殖迁移的功能作用，而且水凝胶或胶原蛋白在伤口愈合过程中起支架作用，有利于皮肤的重建。
二、神经损伤的创伤修复
神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统。人体各器官、系统的功能和各种生理过程在神经系统的直接或间接调节控制下，互相联系、相互影响、密切配合，从而实现和维持正常的生命活动。同时，人体的神经系统能感受到外部环境的变化，接受内外环境的变化信息，对体内各种功能不断进行迅速而完善的调整，使人体适应体内外环境的变化。
神经系统由中枢部分及其外周部分所组成。中枢部分包括脑和脊髓，分别位于颅腔和椎管内，两者在结构和功能上紧密联系，组成中枢神经系统。外周部分包括12对脑神经和31对脊神经，它们组成外周神经系统。外周神经分布于全身，把脑和脊髓与全身其他器官联系起来，使中枢神经系统既能感受内外环境的变化(通过传入神经传输感觉信息)，又能调节体内各种功能(通过传出神经传达调节指令)，以保证人体的完整统一及其对环境的适应。
人类大脑和脊髓组成的中枢神经系统缺乏自我再生和修复能力，因其损伤导致的细胞死亡，组织破坏及神经功能永久性缺失，目前尚无有效的治疗手段。
外周神经损伤分开放性损伤和非开放性损伤。前者一般伴发于软组织的开放性损伤，引起神经的部分截断或全截断；后者并发于软组织的钝性非开放性损伤，引起神经干的挫伤、压迫或牵张，在神经内发生小的溢血和水肿，髓鞘水肿和变性。外周神经损伤的结果在临床上主要表现为神经麻痹，受该神经支配的区域出现感觉障碍，运动障碍和肌肉萎缩等。
在临床上一般神经损伤的药物有：一、神经生长因子增强剂：1、普立宁钾，是一种认知增强剂，用于治疗轻、中度阿尔茨海默病(AD)，通过提高受损或退化神经元的神经营养生长因子水平来增强神经细胞功能，刺激轴突生长，改善记忆能力，是首个进入Ⅲ期临床试验用于增强神经再生的药物。2、乙酰L-肉碱：是一种胆碱能激动药，能主动通过血脑屏障，在神经退行性及衰老模型中可保护中枢及周围神经突触，提高神经生长因子水平，改善老年大鼠认知缺陷，目前正在美国进行Ⅲ期临床试验。二、神经营养类药物有；1、神经节苷脂(GM1)，促进神经重构(包括神经细胞生存、轴突延长和突触生长)，在细胞分化、发育、神经组织修复、神经元可塑性等方面起重要作用。2、脑蛋白水解物，为一种改善脑代谢的新药，易透过血脑屏障进入大脑神经细胞，影响其蛋白质合成及呼吸链，增强脑细胞抗氧化能力，保护神经系统免受有毒物质侵害，延缓脑细胞死亡，促进其存活。3、三磷酸胞苷二钠注射液，这是一种核苷酸类药物，不仅可促进蛋白质合成，还可调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，能对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤，从而具有支持存活、增强活性、延缓死亡，提高细胞抗损伤和修复能力，促进神经轴突再生长，并改善支配血管的神经功能，起到抗血管硬化作用。4、奥拉西坦，它是一类能促进学习记忆能力的新型中枢神经系统药物，能选择性地作用于大脑皮层和海马，激活、保护或促进神经细胞的功能恢复。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽。
本发明的另一目的在于提供所述促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽，是一种由4～9个氨基酸残基组成的小分子短肽，该种短肽是基于H2序列(GPANVET)而衍生的修饰短肽，该修饰短肽序列的获得是通过在基础序列GPANVET的N端进行甲基化、乙酰化修饰或序列截短，以及引入两个苯丙氨酸形成自组装纳米球等，经过不同方式的修饰，得到的不同修饰短肽；所述的小分子修饰短肽含有GPANVET核心序列的连续4个或5个(总共4～9个氨基酸残基组成)氨基酸长度的线性肽，具体为AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2和FF-H2肽中的至少一种；其氨基酸序列如下所示：
AcH2肽的序列为GPANVET；其中，G的N端乙酰化；
H2A3M肽的序列为GPANVET；其中，A的N端甲基化；
d1AcH2肽的序列为PANVET；其中，P的N端乙酰化；
d2AcH2肽的序列为ANVET；其中，A的N端乙酰化；
d2H2肽的序列为ANVET；
d3H2肽的序列为NVET；
FF-H2肽的序列为FFGPANVET(FF-H2肽在序列中G的N端连接两个具疏水性的苯丙氨酸，自组装成纳米球颗粒)。
所述的小分子修饰短肽优选为AcH2、H2A3M、d1AcH2(乙酰化六肽)和d2AcH2肽(乙酰化五肽)中的至少一种；更优选为d1AcH2和d2AcH2肽中的至少一种；其中，d2AcH2活性高，而d1AcH2的稳定性强，本领域技术人员可根据实际需要选择所需的小分子修饰短肽。
所述的促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽既能在体内酶解环境中稳定存在，又能发挥更好的生物活性，其可以采用化学合成的方法获得。
所述的促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽在制备用于皮肤创伤(损伤)的修复和再生，烧烫伤，慢性创面愈合，糖尿病足溃疡的修复和再生，和/或神经损伤的修复和再生的产品中的应用。
所述的小分子修饰短肽通过促进成纤维细胞的增殖和迁移，促进脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，促进脐静脉内皮细胞的管腔形成和/或促进血管生成实现皮肤创伤的修复和再生，慢性创面的愈合，糖尿病足溃疡的修复和再生，以及神经损伤的修复和再生的目的。
所述的小分子修饰短肽优选为AcH2、H2A3M、d1AcH2(乙酰化六肽)和d2AcH2肽(乙酰化五肽)中的至少一种；更优选为d1AcH2和d2AcH2肽中的至少一种。
所述的皮肤创伤的修复和再生包括皮肤细胞的修复和再生。
所述的神经损伤包括中枢神经损伤和外周神经损伤。
所述的中枢神经损伤包括脑外伤、脑中风、脑水肿和/或脑缺氧等造成的中枢神经损伤。
所述的外周神经损伤包括由外周神经损伤造成的感觉障碍、运动障碍和/或营养障碍。
所述的成纤维细胞包括小鼠成纤维细胞和人成纤维细胞。
所述的脐静脉内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞。
所述的血管包括毛细血管。
所述的产品优选为医用产品、护肤品或化妆品。
所述的产品的制剂类型包括但不限于溶液、冻干剂、乳剂、霜剂、凝胶、面膜或敷料等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)由于修复七肽H2呈线性，在血浆中37℃孵育20分钟后，H2完全被降解，不利于在慢性溃疡等复杂的创面环境中发挥其促进组织修复与再生的功能，本发明提供了一种在血浆酶解中保持生物活性并且促进创伤后组织修复与再生的修饰短肽；其中，乙酰化六肽(命名为d1AcH2)表现出更强的稳定性，在血浆中孵育48小时后，仍然保留50％未被降解，在生物活性上，表现出比H2更强的促细胞增殖效果；乙酰化五肽(命名为d2AcH2)在HUVEC管腔形成实验、鸡胚尿囊膜血管再生实验中，发现其能有效促进血管再生，在db/db糖尿病小鼠皮肤创伤实验发现d2AcH2能治疗糖尿病皮肤溃疡。目前为止尚无文献报道这些短肽能用于皮肤创伤修复和神经损伤修复。
(2)本发明中的修饰短肽在血浆中具有较强的酶解稳定性，在体内酶解环境中能促进成纤维细胞和人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移，从而促进创伤部位组织修复，在皮肤损伤、神经损伤甚至糖尿病足溃疡等组织再生和修复方面的具有应用价值，特别是在皮肤创伤、烧烫伤、慢性创面愈合、皮肤细胞修复和新生，脑外伤、脑中风、脑水肿以及脑缺氧等造成的中枢神经损伤，和外周神经损伤造成的感觉障碍、运动障碍和营养障碍的神经修复和再生方面。
(3)本发明提供的乙酰化六肽和乙酰化五肽是与基础序列修复肽H2(GPANVET，7个氨基酸)相比，同样具有促进皮肤创伤修复和再生的效果，但在血浆中的稳定性更高。这是因为相对于H2，由于修饰短肽如d1AcH2和d2AcH2的分子量更小，且N端乙酰化赋予对血清氨肽酶的显著抗酶解能力。其中，d1AcH2的稳定性比基础序列修复肽H2提高了228倍，d2AcH2的稳定性则提高了144倍，两者能稳定地在生物体内稳定发挥其生物活性。而且在生物活性方面，d1AcH2在促细胞增殖方面显著比H2更强，d2AcH2则在促进血管生成方面显著比H2更强。此外，由于H2是在血浆中不稳定的线性肽，易被降解，导致在机体治疗部位的积累低，持续作用的时间相对短，故在某些程度上限制和影响了其进一步的使用，所以d1AcH2和d2AcH2是很好的替代H2的创伤修复和细胞再生和增殖产品，且本发明的实验结果证明，该类修饰肽能持续高稳定性地作用于治疗部位，因此具有技术上的先进性。
附图说明
图1是HPLC法检测修复七肽H2在血浆中稳定性及其降解肽段的质谱鉴定结果图；其中，A为H2在血浆中酶解稳定性量化图；B为根据H2在每个时间段酶解得到的峰面积进行绘制的色谱指纹图；C为H2在血浆孵育20分钟后降解的氨基酸残基的峰，并命名为A′、B′、C′峰；D为A′峰的质谱图；E为C′峰的质谱图。
图2是HPLC法检测七种修饰肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2以及FF-H2在血浆中的稳定性结果图；其中，A为七种修饰肽在血浆中不同时间点的酶解情况；B为七种修饰肽酶解50％所需的时间。
图3是Edu法与划痕法筛选七种修饰肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2、FF-H2和bFGF对小鼠成纤维细胞L929的促细胞增殖和迁移作用的结果图；其中，A为BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性直观图(bFGF组为阳性对照，七种修饰肽与H2(100μM)孵育48小时后，用BeyoClickTMEdU-488试剂盒评价细胞的增殖)；B为增值率量化图；C为细胞划痕试验评价细胞迁移实验结果(划痕后，bFGF组为阳性对照，七种修饰肽与H2(100μM)孵育24小时后，用Image J软件对迁移的细胞数进行统计分析)；D为迁移率量化图。
图4是Edu法与划痕法检测d1AcH2和H2对人成纤维细胞(HFF)促细胞增殖和迁移作用的结果图；其中，A为BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性直观图(以H2组为阳性对照，d1AcH2按4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL孵育48小时后，用BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性)；B为增值率量化图；C为细胞划痕实验检测细胞迁移活性直观图(细胞划痕后，以H2组为阳性对照，d1AcH2按4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL孵育24小时后，用Image J软件对迁移的细胞数进行统计分析)；D为迁移率量化图。
图5是d2AcH2与H2、d2H2结构对比图；其中，A为d2AcH2在原子力显微镜下的二维图；B为d2AcH2在原子力显微镜下的三维图；C为d2AcH2平均直径；D为d2AcH2的圆二色谱图；E为H2的圆二色谱图；F为d2AcH2的质谱图；G为d2H2的质谱图；H为d2AcH2的红外光谱图；I为H2的红外光谱图。
图6是Edu法与划痕法检测d2AcH2和H2对人成纤维细胞(HFF)促细胞增殖和迁移作用的结果图；其中，A为BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性直观图(以bFGF组为阳性对照，d2AcH2按4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL孵育48小时后，用BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性)；B为增值率量化图；C为细胞划痕实验检测细胞迁移活性直观图(细胞划痕后，以H2组为阳性对照，d2AcH2按4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL孵育24小时后，用Image J软件对迁移的细胞数进行统计分析)；D为迁移率量化图。
图7是Edu法与划痕法检测d2AcH2和H2对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)促细胞增殖和迁移作用的结果图；其中，A为BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性直观图(以H2组为阳性对照，d2AcH2按4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL孵育48小时后，用BeyoClickTMEdU-488试剂盒检测细胞增殖活性)；B为细胞增值量化图；C为细胞划痕实验检测细胞迁移活性直观图(细胞划痕后，以H2组为阳性对照，d2AcH2按4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL孵育24小时后，用Image J软件对迁移的细胞数进行统计分析)；D为迁移率量化图。
图8是d2AcH2促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)管腔形成的结果图；其中，A为细胞成管对比直观图；B为成管形成分支数的量化图；C为成管数的量化图；D为支点数的量化图。
图9是d2AcH2和H2促进鸡胚尿囊膜中血管生成的结果图；其中，A为药物处理后的鸡胚尿囊血管对比直观图；B为新增血管面积量化图。
图10是d2AcH2对斑马鱼胚胎的急性毒性评价；其中，A为斑马鱼幼鱼胚胎发育代表性直观图；B为斑马鱼幼鱼胚胎发育直观总图；C为d2AcH2对斑马鱼幼鱼毒性影响统计图。
图11是d2AcH2和H2在同等浓度下促进C57BSK/DB小鼠皮肤创伤愈合的实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所使用的实验材料、试剂等如无特殊说明，均为商业途径获取。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
本发明中的修复七肽H2(GPANVET)参考中国专利申请(CN110124009A-一种含有能促进神经损伤修复与再生的修复肽的药物组合物及其应用)获得。
实施例1
1.HPLC法检测修复七肽H2在血浆中稳定性及其降解肽段的质谱鉴定
1.1将健康献血者的血浆与1mg/ml的H2在37℃按9：1比例(体积比)混合，分别孵育0min，10min，20min，30min，再加入0.4倍的三氟乙酸(TFA)涡流30s，置于室温下20分钟，13000r离心15分钟，取上清液于新EP管中，13000r离心5分钟，收集上清液约200ul于上样瓶中进行液相质谱分析；其中，液相色谱仪的参数如下：紫外波长220nm，上样量20μL，流速0.5mL/min，柱温25℃。
表1
Figure BDA0003166009880000101
1.2结果如图1所示：修复七肽H2在血浆中孵育20min，完全被酶解，并在质谱分析仪中鉴定三个酶解片段，随后针对这三个酶解片段进行氨基酸的修饰(委托上海淘普生物技术有限公司合成)，修饰结果如表1所示。
表2 H2以及其修饰短肽的氨基酸序列和分子量
Figure BDA0003166009880000102
2.HPLC法检测修饰短肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2、FF-H2在血浆中的稳定性
2.1方法参考上述步骤1，将健康献血者的血浆分别与修饰短肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2、FF-H2混合，分别孵育0h，4h，8h，12h，24h，48h，最后将上清液进行液相质谱分析(条件参数同上述步骤1.1)。
2.2结果如图2所示：结果提示，d2H2、d3H2、FF-H2在血浆中酶解稳定性并无明显提高，从而也进一步验证了线肽的不稳定性，但是AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2在血浆中的稳定性大大提高，其中，d1AcH2的稳定性最高，比H2提高了228倍，d2AcH2比H2的稳定性提高了144倍。
3.Edu法初步筛选修饰短肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2、FF-H2对小鼠成纤维细胞L929的促细胞增殖作用
3.1取L929细胞(ATCC)，按每孔3000个细胞铺12孔板，贴壁后饥饿24小时后，取修复肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2、FF-H2以及Scr-H2(乱序肽，作为阴性对照)各100μM处理48小时(以未经修复肽处理的细胞为对照(Control))，之后采用Edu试剂(BeyoClickTMEdU-488试剂盒)与Hochest3342试剂处理样品，在荧光显微镜下拍照。实验选取五个不同视野，用IPP软件分别数EdU(标记增殖的细胞)和Hochest3342(标记所有细胞)。随机选取不同的五个视野求细胞增殖率。增值率＝增殖细胞数/总细胞数*100％。
3.2结果如图3A和3B所示：结果显示在各修饰肽中d2AcH2促进L929细胞增殖的能力最强，d1AcH2促细胞增殖的能力仅次于d2AcH2，两者促细胞增殖的能力均比H2强。
4.划痕法初步筛选修饰短肽AcH2、H2A3M、d1AcH2、d2AcH2、d2H2、d3H2、FF-H2对小鼠成纤维细胞L929的促细胞迁移作用
4.1在6孔板背每孔画5条平行直线，间距0.5～1cm，将消化好的L929细胞以4×104个/孔接种于六孔板中，37℃5％(v/v)CO2孵育24小时至创建汇合的单层膜。用含0.5％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基饥饿12h。将六孔板板盖垂直于所画横线，用1mL无菌枪头将单层细胞划伤。用PBS缓冲液小心晃动六孔板，吸去漂浮细胞。每孔分别加入浓度为100μM的不同修饰肽在0.5％饥饿培养基(含0.5％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基)培养24小时(以PBS处理作为空白对照)。用显微镜获取图像，用Image J软件定量细胞迁移活性，并进行迁移率的计算。每个板选取五个视野数迁移的细胞数，共重复三次。
4.2结果如图3C和3D所示：结果显示在各修饰肽中d2AcH2促进L929细胞迁移的能力最强，d1AcH2也表现出促细胞迁移的能力。
5.Edu法与划痕法比较d1AcH2和H2在促进人成纤维细胞增殖与迁移的作用。
5.1方法参考上述步骤3和4，将L929细胞替换为人成纤维细胞(ATCC)，用4μg/mL、20μg/mL和100μg/mL的d1AcH2分别处理细胞，同时用H2(浓度是100μg/mL)处理细胞相同时间(Edu试剂处理48小时，划痕24小时)，以未经修复肽处理的细胞为对照。
5.2结果如图4所示：d1AcH2促进人成纤维细胞增殖的能力比H2强(图4A和4B)，d1AcH2促进人成纤维细胞迁移的能力与H2相同(图4C和4D)
6.d2AcH2与H2在结构上的区别
6.1用液相质谱、原子力显微镜、红外光谱、圆二色谱观察d2AcH2在结构上与H2的区别；其中，液相质谱的参数与上述步骤1.1相同。
6.2结果如图5所示：d2AcH2在原子力显微镜下呈纳米丝结构；从图5可以看出，质谱图、圆二色谱和红外光谱图显示五肽ANVET引入乙酰基团。
7.Edu法和划痕法进一步比较d2AcH2和H2在促进人成纤维细胞HFF和人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的作用
7.1方法参考上述步骤3和4，将L929细胞替换为人成纤维细胞HFF以及人脐静脉内皮细胞(ATCC)，用4μg/mL、20μg/mL和100μg/mL的d2AcH2分别处理细胞，同时用H2(浓度是100μg/mL)处理细胞相同时间(Edu试剂处理48小时，划痕法24小时)，以未经修复肽处理的细胞为对照。
7.2结果如图6和图7所示：图6显示，d2AcH2能促进人成纤维细胞的增殖和迁移；图7显示，d2AcH2能促进人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移。
8.乙酰化五肽促进HUVEC细胞管腔形成的检测
8.1将基质胶在4℃冰箱过夜溶解，200μL枪头和96孔板预冷。向96孔板中每孔加入60μL基质胶，全程在冰上操作。将96孔板放入37℃，5％(v/v)CO2培养箱中培养30分钟。HUVEC细胞(ATCC)传代后进行细胞计数，使得每孔80μL细胞的浓度为4×104个。每孔中加入20μL的药物(H2、d2AcH2)处理，使得药物终浓度H2为20μg/mL、d2AcH2为20μg/mL、以ECGS(内皮细胞生长因子，购于BD BIOCOAT)作为阳性对照，以未经修复肽处理的细胞为对照。4小时后于显微镜下观察，拍照。用ImageJ进行定量分析。
8.2结果如图8所示：d2AcH2能促进人脐静脉内皮细胞的管腔形成，且呈剂量依赖性。
9.鸡胚尿囊膜血管再生能力的实验评价d2AcH2和H2促进血管再生。
9.1取培养5天的受精鸡蛋，大头朝上去蛋壳，暴露鸡胚尿囊膜，放置硅胶圈于正中，将5倍增浓度的d2AcH2(终浓度为4μg/mL、20μg/mL和100μg/mL)和H2(浓度是100μg/mL)各10μL滴加于硅胶圈中，干净的滤纸封闭开口，设立PBS溶液处理组为空白对照。再培养3天，之后剥取鸡胚尿囊膜，体视镜下观察，拍照，软件Angio Tool对图像进行分析处理。
9.2结果如图9所示：加入都d2AcH2后，鸡胚尿囊膜中的毛细血管明显增多，随着剂量增加而增加，说明d2AcH2明显促进了血管的生成。
10.乙酰化五肽对斑马鱼个体发育的毒性评价
10.1采用野生型斑马鱼产卵，24小时后收集鱼卵。采用破膜剂pronase(2mg/mL)，破除卵黄膜后，取24孔板，每个孔10条。每个浓度重复3个孔。设置d2AcH2药物浓度分别为0μg/mL(作为对照)，1μg/mL，100μg/mL，200μg/mL。每隔24h记录每个孔存活的斑马鱼数量(wide type)，至72h时结束统计(图中“dpf”为受精后的天数)。
10.2结果如图10所示：乙酰化五肽d2AcH2对于斑马鱼幼体发育无毒性。
11.乙酰化五肽对促进db/db糖尿病小鼠皮肤创伤修复的应用评价
11.1取dbdb糖尿病小鼠(购于江苏集萃药康生物科技有限公司)，在1％的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下(100mg/kg)，背部脱毛并消毒，1％碘伏及75％酒精常规消毒。用镊子轻轻将小鼠脊柱皮肤捏起，将小鼠侧躺，使用无菌的6mm组织活检打孔器在小鼠背部中线水平切除两个水平的圆形全皮层切除伤口，再将d2AcH2(50μg/mL)和H2(50μg/mL)各10μL滴加于伤口处，伤口开放不覆盖棉纱，设立PBS溶液处理组为空白对照组。之后每日滴加一次，同时观察伤口愈合情况。
11.2结果如图11所示：加入乙酰化五肽d2AcH2后，愈合速度增快。说明上述修复肽明显促进了皮肤创伤的愈合，并促进愈合部位血管的生成。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<222> (1)..(1)
<223> N端乙酰化
<220>
<223> AcH2肽
<400> 1
Gly Pro Ala Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> H2A3M肽
<220>
<222> (3)..(3)
<223> N端甲基化
<400> 2
Gly Pro Ala Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> d1AcH2肽
<220>
<222> (1)..(1)
<223> N端乙酰化
<400> 3
Pro Ala Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> d2AcH2肽
<220>
<222> (1)..(1)
<223> N端乙酰化
<400> 4
Ala Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> d2H2肽
<400> 5
Ala Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> d3H2肽
<400> 6
Asn Val Glu Thr
1
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FF-H2肽
<400> 7
Phe Phe Gly Pro Ala Asn Val Glu Thr
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Scr-H2肽
<400> 8
Thr Pro Glu Ala Val Asn Gly
1 5

Claims (8)

1.一种促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽，其特征在于：所述的小分子修饰短肽为d1AcH2和d2AcH2肽中的至少一种；其氨基酸序列如下所示：
d1AcH2肽的序列为PANVET；其中，P的N端乙酰化；
d2AcH2肽的序列为ANVET；其中，A的N端乙酰化。
2.权利要求1所述的促进创伤后组织修复与再生的小分子修饰短肽在制备用于皮肤创伤的修复和再生，烧烫伤，慢性创面愈合，糖尿病足溃疡的修复和再生，和/或神经损伤的修复和再生的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的小分子修饰短肽通过促进成纤维细胞的增殖和迁移，促进脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，促进脐静脉内皮细胞的管腔形成和/或促进血管生成实现皮肤创伤的修复和再生，慢性创面的愈合，糖尿病足溃疡的修复和再生，以及神经损伤的修复和再生的目的。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
所述的成纤维细胞为小鼠成纤维细胞或人成纤维细胞；
所述的脐静脉内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞；
所述的血管为毛细血管。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
所述的皮肤创伤的修复和再生为皮肤细胞的修复和再生；
所述的神经损伤为中枢神经损伤或外周神经损伤。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述的中枢神经损伤包括脑外伤、脑中风、脑水肿和/或脑缺氧造成的中枢神经损伤；
所述的外周神经损伤包括由外周神经损伤造成的感觉障碍、运动障碍和/或营养障碍。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的产品为医用产品、护肤品或化妆品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的产品的制剂类型为溶液、冻干剂、乳剂、霜剂、凝胶、面膜或敷料。
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