KR101772048B1

KR101772048B1 - 섬유모세포성장인자 유래의 펩타이드 단편을 포함하는 상처 치료 또는 피부 주름형성 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101772048B1
Application number: KR1020140086831A
Authority: KR
Inventors: 한장희; 고인영; 김민서
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2017-08-28
Also published as: KR20160006995A

Abstract

본 발명은 섬유모세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF)로부터 유래된 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)을 포함하는 상처 치료용 조성물; 및 피부노화 또는 피부주름 형성 억제용 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드는 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화하여 콜라겐 합성을 유도하고, 피부 각질세포 증식 및 혈관신생을 촉진하는 활성을 갖는다. 따라서, 상기 펩타이드는 상처 치료; 및 피부노화 또는 피부주름 형성 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

섬유모세포성장인자 유래의 펩타이드 단편을 포함하는 상처 치료 또는 피부 주름형성 억제용 조성물{COMPOSITION FOR WOUND-HEALING OR INHIBITING WRINKLE FORMATION ON SKIN COMPRISING PEPTIDE FRAGMENTS DERIVED FORM FIBROBLAST GROWTH FACTOR}

본 발명은 섬유모세포성장인자(fibroblast growth factor, FGF)로부터 유래된 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)을 포함하는 상처 치료용 조성물; 및 피부노화 또는 피부주름 형성 억제용 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화하여 콜라겐 합성을 유도하고, 또한 피부 각질세포 증식 및 혈관신생을 촉진하는 활성을 갖는다.

상처는 창상이라고 칭해지기도 하며, 그 따른 증세로는 통증, 출혈, 기능장애 등이 있다. 상처는 주변 세포, 혈액 유래 세포 및 감각 뉴우런으로부터 분비되는 성장인자, 사이토카인, 신경호르몬, 및 세포 외 기질로 이루어지는 특이한 미세환경(microenvironment)을 창출한다. 상처 미세환경의 일부 인자는 충분히 오랜 기간 지속하여 말초혈액으로 확산된 후, 골수의 줄기세포에 영향을 미쳐 골수 세포의 말초혈액으로의 이동, 상처 부위로의 공급, 및 상처 치유에의 참여를 유발하는 것으로 알려져 있다.

피부의 결합조직이 파괴되지 않고 온전히 그 탄성과 강도를 유지하기 위해서는, 피부에 존재하는 콜라겐 I, III (Type I, III collagens), 엘라스틴(elastin), 파이브로넥틴(fibronectin)과 같은 세포외 기질(ECM: Extracellular matrix) 단백질이 중요하다. 자연 노화 또는 자외선에 대한 만성적인 노출은 ECM 단백질의 손실과 피부조직의 탄성과 강도를 감소시키며, 이러한 현상들은 주름형성과 같은 특징적인 피부 노화와 강하게 연관되어 있다. 기저막 단백질 분해 효소(MMPs: matrix metalloproteinases)는 진피 ECM을 분해하는데 있어서 중요한 효소로 작용한다. 자외선 조사 등과 같은 스트레스 조건하에서 각질형성세포(keratinocytes) 및 진피 섬유모세포에서의 MMPs의 과발현은 ECM 단백질을 분해하는데 기여함으로써, 피부에 주름을 형성하게 된다.

한편, 섬유모세포 성장인자는 섬유모세포를 위시한 다양한 세포의 증식, 이동, 분화 및 생존을 조절하는 성장인자 중 하나로서, 23종으로 구성된 일군의 단백질로 구성되어 있다. FGF는 각질세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 민무늬근세포, 연골세포와 비만세포 등에서 생성되며, 다양한 세포에서 발현되는 4종의 섬유모세포성장인자 수용체(FGF Receptor)를 활성화함으로써 상술한 기능을 나타낸다. 특히, 피부재생에는 FGF-2, FGF-7과 FGF-10이 중요한 기능을 담당하는 것으로 알려져 있다(Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko M, Brem H, Vinay Tomic-Canic M. 2008. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Rep Reg . 16:585). FGF-2는 급성 상처시 발현이 증가하여 표피의 재상피화의 기능을 수행하며, 진피층의 섬유모세포에 작용하여 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 통한 육아조직 형성과 조직재형성을 유도한다. 또한, 피부장벽구성요소의 발현과 털의 성장도 촉진하는 것으로 알려져 있다. FGF-7과 FGF-10은 각질세포의 증식을 촉진하여 재상피과정에 관여하며, 활성산소의 해독작용을 통해 각질세포를 유지하는 역할도 한다. FGF-7은 VEGF와 HGF와 같은 성장인자의 생성도 유도하여 섬유모세포와 각질세포의 성장을 촉진한다.

본 발명자들은 피부의 각질세포와 섬유모세포에서 발현되는 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화하는 다양한 작은 펩타이드 단편을 설계하였으며, 놀랍게도 섬유모세포성장인자로부터 유래된 특정 펩타이드 단편(peptide fragments 또는 small peptides)이 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화하고, 각질세포의 증식 및 혈관신생을 촉진함으로써 표피의 재상피화를 촉진할 수 있음을 발견하였다. 또한 진피층의 섬유모세포에 작용하여 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써 피부주름 형성을 억제할 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 섬유모세포성장인자로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 특정 펩타이드 단편을 포함하는 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 13의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 유효성분으로서 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 13의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, 유효성분으로서 서열번호 1의 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명에 따라 섬유모세포성장인자로부터 유래된 특정 펩타이드 단편이 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화하고, 각질세포의 증식 및 혈관신생을 촉진함으로써 표피의 재상피화를 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 또한 진피층의 섬유모세포에 작용하여 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써 피부주름 형성을 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기 펩타이드는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물 및 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1 및 도 2는 사람 각질세포 HaCaT에서 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 평가한 결과를 나타낸다.
도 3은 생쥐 섬유모세포 NIH3T3에서 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 ERK와 Akt의 인산화를 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드가 각질세포의 증식에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드가 섬유모세포에서 콜라겐 합성에 미치는 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드에 의한 혈관신생 촉진 활성을 평가한 결과를 나타낸다.

본 명세서에서, "상처(wound)"라 함은 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 상피조직과 결합조직의 손상을 말하며, 바람직하게는 피부의 손상일 수 있다.

또한, "피부노화(skin aging)"이라 함은 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 피부의 노화를 말하며, 바람직하게는 피부주름 형성을 동반하는 피부 광노화(photoaging)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피부주름 형성을 동반하는 자외선 자극에 의한 피부 광노화를 포함한다.

또한, "피부 주름(skin wrinkle)"이라 함은 피부상에 형성된 주름(wrinkle formation on skin)을 말한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 13의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 13의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부노화 억제 또는 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 섬유모세포성장인자로부터 다양한 길이의 단편을 제조하여, 그 활성을 검색하였다. 놀랍게도, 섬유모세포성장인자로부터 유래한 펩타이드로서, 3개 내지 5개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 특정 펩타이드 단편들이 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화하고, 각질세포의 증식 및 혈관신생을 촉진함으로써 표피의 재상피화를 촉진한다는 것을 발견하였다. 또한 진피층의 섬유모세포에 작용하여 콜라겐과 같은 세포외기질의 생성을 유도함으로써 피부주름 형성을 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 상처 치유 및 피부 재생에 대한 우수한 활성을 갖는다. 또한, 자외선과 같은 외부자극에 의해 유발되는 피부염증반응에 동반되는 피부노화의 개선 및/또는 피부주름 형성의 억제를 위한 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 상기 펩타이드 단편들은 다음 표 1과 같다. 일 구현예에서, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드일 수 있다.

펩타이드명칭	서열번호	아미노산 서열
SE204 A	서열번호 1	FLE
SE204 B	서열번호 2	FRE
SE204 C	서열번호 3	FAE
SE204 D	서열번호 4	FEE
SE204 E	서열번호 5	FTE
SE204 F	서열번호 6	FKE
SE204 G	서열번호 7	FFE
SE204 H	서열번호 8	FGE
SE204 I	서열번호 9	YNVYQ
SE204 J	서열번호 10	YNVY
SE204 K	서열번호 11	YNTY
SE204 L	서열번호 12	YVIY
SE204 M	서열번호 13	YTAL

본 발명의 약학 조성물은 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있으며, 비경구 투여 형태, 바람직하게는 피부 외용제를 포함한 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육 내, 복강 내, 피하 및 정맥 내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥 내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다. 또한, 통상의 제제학적 방법에 따라 외용액제, 에멀젼, 연고제, 패치 등의 경피투여용 제형으로 제제화 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 상처를 갖는 환자에게 1일 약 1 내지 2000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물 형태일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드를 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로오숀 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 피부노화 억제, 특히 피부주름 형성 억제 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성

서열번호 1 내지 13의 펩타이드는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.

실시예 2. 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조

서열번호 1 내지 13의 펩타이드를 PBS에 각각 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 각질세포에서 섬유모세포성장인자 수용체의 활성화 평가

본 발명의 펩타이드의 처리에 의하여 각질세포에서 섬유모세포성장인자 수용체 신호전달경로가 활성화되는지를 평가하기 위하여 사람 각질세포 HaCaT(DKFZ, Heidelberg, Germany)를 서열번호 1 내지 13의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 각각 용해시켜 얻어진 용액을 10 μM이 되도록 처리하였다. 대조군은 미처리군을 의미한다. 15분 후, 세포추출물을 대상으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 ERK와 Akt의 인산화의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 1 및 도 2와 같다. 도 1 및 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, ERK와 Akt의 인산화 정도는 서열번호 1 내지 13의 펩타이드에 의하여 유의성 있게 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 각질세포에서 발현되는 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화한다는 것을 확인할 수 있다.

시험예 2. 섬유모세포에서 ERK 와 Akt 활성화 시험

본 발명의 펩타이드의 처리에 의하여 섬유모세포에서 섬유모세포성장인자 수용체 신호전달경로가 활성화되는지를 평가하기 위하여 서열번호 1의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μM의 농도로 용해시켜 얻어진 용액(1 ml)로 생쥐 섬유모세포 NIH3T3(ATCC CRL-1658, USA)를 처리하였다. 15분 후, 세포추출물을 대상으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 ERK와 Akt의 인산화의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, ERK와 Akt의 인산화 정도는 서열번호 1의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 섬유모세포에서 발현되는 섬유모세포성장인자 수용체를 활성화한다는 것을 확인할 수 있다.

시험예 3. 사람 각질세포주 HaCaT 의 증식 촉진 시험

96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 5X10³ 개의 HaCaT 세포(DKFZ, Heidelberg, Germany)를 100 μL의 DMEM 배지에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 배지를 제거하고, 서열번호 1의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 0.01, 0.1, 또는 1 μM의 농도로 용해시켜 얻어진 용액(100 μL)을 첨가하였다. 대조군은 무혈청배지 100 μL만을 첨가하였다. 이 후 24, 48, 72시간 동안 배양하고, 각 웰 당 10 μL의 CCK-8 (Dojindo Laboratories, Japan)으로 2 시간 처리하고, Spectramax plus 190 plate reader(Molecular Devices, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 경우, HaCaT 세포의 증식이 펩타이드의 처리 농도에 따라 농도 의존적으로 증가되었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드가 각질세포의 증식을 촉진한다는 것을 나타낸다.

시험예 4. 사람 진피섬유모세포에서의 제1형 프로콜라겐( Procollagen type -1) 발현 평가

아교섬유 합성의 촉진은 자외선 자극에 의한 피부노화를 억제할 수 있는 주요 수단이다. 본 발명의 펩타이드의 처리에 의하여 섬유모세포에서 콜라겐 합성이 촉진되는지를 사람 진피 섬유모세포 Detroit 551(ATCC CCL-110, USA)를 이용하여 평가하였다. 서열번호 1의 펩타이드를 무혈청 DMEM 배지에 0.05, 0.1, 0.5, 및 1 μM의 농도로 용해시켜 얻어진 용액(1 ml)로 사람 진피 섬유모세포를 처리하였다. 48시간 후, 세포추출물을 대상으로 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 제1형 프로콜라겐 발현량의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제1형 프로콜라겐의 발현량은 서열번호 1의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 증가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드는 콜라겐 소실에 의한 피부의 노화, 특히 피부 주름을 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.

시험예 5. 시험관 내( in vitro ) 혈관신생 촉진 시험

본 발명에 따른 펩타이드가 혈관신생에 미치는 영향을 하기와 같이 평가하였다. 일반적으로, 혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이며, 바닥막 성분의 복합체인 매트리겔(Matrigel)을 96-웰 플레이트에 넣으면 중합반응을 일으켜 플러그(plug)를 형성하게 된다. 인간 제정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)을 1.5 x 10⁴ cells/well의 밀도로 매트리겔이 도포된 96 well 세포배양판에 접종한 후, 서열번호 1의 펩타이드를 무혈청 M199 배지에 1, 10, 또는 100 μM의 농도로 용해시켜 얻어진 용액((100 μL)을 첨가하고 배양하였다. 대조군으로는 펩타이드 용액을 첨가하지 않은 세포배양판에 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF, 10 ng/ml)를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 사용하였다. 24시간 후 도립현미경하에서 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성여부를 관찰하고 정량화하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 함유한 용액으로 처리한 경우, 혈관신생이 현저하게 촉진되는 것을 알 수 있다.

<110> KNU-INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR WOUND-HEALING OR INHIBITING WRINKLE FORMATION ON SKIN COMPRISING PEPTIDE FRAGMENTS DERIVED FORM FIBROBLAST GROWTH FACTOR <130> PN0698 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 1 Phe Leu Glu 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 2 Phe Arg Glu 1 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 3 Phe Ala Glu 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 4 Phe Glu Glu 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 5 Phe Thr Glu 1 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 6 Phe Lys Glu 1 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 7 Phe Phe Glu 1 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 8 Phe Gly Glu 1 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 9 Tyr Asn Val Tyr Gln 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 10 Tyr Asn Val Tyr 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 11 Tyr Asn Thr Tyr 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 12 Tyr Val Ile Tyr 1 <210> 13 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 13 Tyr Thr Ala Leu 1

Claims

서열번호 1 내지 8의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상처 치료 또는 상처 치료 촉진용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
서열번호 1 내지 8의 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름형성 억제용 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 서열번호 1의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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