KR102017513B1 - 백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 암세포의 성장 또는 전이 억제 활성을 갖는 펩타이드를 포함하는 약학 및 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 베타1 인테그린에서 유래한 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항-염증용 약학 조성물 또는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 펩타이드 단편을 포함하는 암 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

Description

백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 암세포의 성장 또는 전이 억제 활성을 갖는 펩타이드를 포함하는 약학 및 화장료 조성물{Pharmaceutical and cosmetic composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and growth or metastasis of cancer cells}

본 발명은 베타1 인테그린(beta1 integrin)으로부터 유래한 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물; 암의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물; 및 피부 염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 베타1 인테그린 활성 억제; 백혈구의 혈관외유출 억제; 및 혈관신생 억제 활성을 갖는다.

감염, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동(mobilization)은 감염에 대한 신속한 해결(resolution) 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 잘못되거나 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기한다. 예를 들어, 염증 질환은 뇌척수막염, 장염, 피부염, 포도막염, 뇌염, 성인성 호흡곤란 증후군 등과 같이 세균이나 바이러스에 의한 감염이나, 외상, 자가면역질환과 장기이식 거부 등과 같은 비감염 요인에 의하여 발생한다. 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류된다. 알러지나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화 및 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 이에 반하여 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화증. 만성 신장염, 간경화증 등을 비롯한 만성 염증의 주요 병리학적 특징은 염증 유발 요인이 제거가 되지 않아 염증부위로 단핵구, 호중구, 림프구, 형질세포들이 지속적으로 침윤하는 것으로, 그 결과 염증 반응이 만성화된다.

염증 반응이 일어나기 위하여서는 백혈구의 염증 부위로의 침윤이 필수적이며, 이는 여러 세포 유착 분자들(cell adhesion molecules)이 관여하는 단계를 포함한다. 즉, 염증 부위에서 분비되는 케모카인(chemokine)의 유도에 의하여 염증부위의 혈관으로 이동한 백혈구들이 이동속도를 줄이면서 혈관 내피 세포 표면에서 회전하는 단계 (Rolling stage), 백혈구들이 회전을 멈추고 내피세포벽에 견고히 부착하는 단계 (Adhesion stage), 모세혈관과 바닥막을 침윤하는 단계 (Transmigration stage)로 구분할 수 있다. 상기 마지막 단계 즉 침윤하는 단계(Transmigration stage)는 혈구누출(diapedesis)로 지칭된다.

자외선은 IL-1과 TNF-a과 같은 염증성 사이토카인의 분비를 유도한다. 이러한 염증 유도분자들은 단핵구를 비롯한 다양한 염증세포의 진피로의 유입을 촉진하며, 그 결과 MMP-1이나 MMP-9과 같은 단백질분해효소의 생성을 촉진함으로써 진피의 아교섬유 또는 탄력섬유를 분해한다. 이와 같이 자외선은 피부에서는 염증반응을 유발하며, 그 결과 표피비후, 색소침착과 진피섬유분해에 의한 주름형성이나 피부이완과 같은 노화현상이 촉진된다.

한편, 발암원(carcinogen)에 의해 변화된 암세포는 정상세포보다 빠르게 증식을 하며 종양(tumors) 덩어리를 형성하고, 주변의 조직에 침투하며 정상적인 신체 기능을 저해한다. 암세포는 혈관신생을 유도함으로써, 영양분과 산소를 공급받을 뿐 아니라, 혈관신생에 의해 암세포가 전이되게 된다. 암세포는 특정부위에서 무한 성장을 할 뿐만 아니라, 기존의 성장부위를 이탈하여 새로운 부위로 이동하여 성장을 하는데 이러한 과정을 전이(metastasis)라고 한다. 전이과정은 암세포가 이동성이 높은 중간엽성 세포로 변화하여 기존 조직에서 이탈하는 단계, 주위 결합조직과 모세혈관을 침윤하고 이동하는 단계, 혈관 내에서 이동한 후 혈관 밖으로 유출하는 단계, 결합조직 내에서의 이동 및 새로운 부위에서의 성장단계 등으로 구분할 수 있다.

본 발명자들은 베타1 인테그린으로부터 유래된 특정 서열을 갖는 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)이 백혈구의 혈관외유출 및 혈관신생을 억제함으로써 염증반응(특히, 피부 염증 반응)뿐만 아니라 암세포의 성장 및/또는 전이를 억제할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 베타1 인테그린으로부터 유래된 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암세포의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환, 바람직하게는 피부 염증(dermatitis)의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 개선용 화장료 조성물이 제공된다.

본 발명에 따른 약학 조성물 및 화장료 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드는 백혈구의 혈관외유출과 혈관신생을 억제함으로써, 피부 염증을 비롯한 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 피부 염증 개선용 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 암의 성장 및 전이 억제용 약학 조성물에도 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 사람 유방암세포주 MCF-7에 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, 파이브로넥틴에 대한 부착도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 사람 단핵구 U937에 본 발명의 폴리펩타이드를 처리하였을 때, U937세포의 혈관외 유출도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 폴리펩타이드가 사람 제대정맥 내피세포의 혈관형성에 미치는 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

본 명세서에서, "염증"이라 함은 인체내 염증 반응을 제한 없이 포함하며, 급성 및/또는 만성 염증 질환; 및 염증을 수반하는 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 골관절염 등)을 모두 포함한다. 상기 "염증"은 특히 피부 염증(즉, 피부염(dermatitis)을 포함하며, 바람직하게는 자외선에 의한 피부 염증을 포함한다.

본 발명자들은 베타1 인테그린으로부터 다양한 길이의 단편을 제조하여, 그 활성을 검색하였다. 놀랍게도, 베타1 인테그린으로부터 유래한 펩타이드로서, 3개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 특정 펩타이드 단편들이 베타1 인테그린활성 및 백혈구의 혈관외유출과 혈관신생을 억제함으로써, 염증 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있음을 발견하였다. 특히, 피부 염증은 혈관신생을 동반하는 것으로 알려져 있으므로, 상기 펩타이드는 피부 염증의 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 암 성장 및 전이 억제용 약학 조성물, 즉, 항암제에도 유용하게 적용될 수 있음을 발견하였다. 상기 펩타이드 단편들은 다음 표 1과 같다.

펩타이드 명칭	폴리펩타이드	아미노산 서열
SE104A	서열번호 1	Lys-Leu-Leu
SE104B	서열번호 2	Glu-Phe-Ala
SE104C	서열번호 3	Asp-Thr-Gln
SE104D	서열번호 4	Ile-Tyr-Lys
SE104E	서열번호 5	Asn-Tyr-Gly

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 염증 질환은 바람직하게는 피부 염증(dermatitis)을 포함한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 다양한 염증을 앓고 있는 환자; 또는 유방암, 위암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암을 비롯한 다양한 고형암 또는 골수성 백혈병(lymphoma) 등을 앓고 있는 환자에게 1일 약 1 내지 2000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다.

본 발명은 또한 상기한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 포함한다. 즉, 본 발명은 서열번호 1 내지 5의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 개선용 화장료 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 유효성분은 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드를 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로오숀 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 펩타이드의 함량은 피부 염증 개선 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 폴리펩타이드의 합성

서열번호 1 내지 5의 펩타이드(상기 표 1 참조)는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.

실시예 2. 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 제조

서열번호 1 내지 5의 펩타이드를 인산완충식염수(PBS)에 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 PBS로 희석하여 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 피브로넥틴 부착 시험

10 ㎍/ml의 피브로넥틴 200 ㎕를 24-웰 플레이트에 미리 부착시키고, 여기에 웰당 실시예 2에서 제조한 서열번호 1 내지 5의 펩타이드 용액으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 사람 유방암 세포주 MCF-7(ATCC사, 미국) 3X10⁵ cells을 넣은 뒤 37℃에서 배양하였다. 2시간이 지난 뒤 붙지 않은 세포를 PBS로 씻어내고 붙어있는 세포는 트립신-EDTA를 처리하여 떼어낸 후, 세포수를 세어 피브로넥틴에 대한 유착도를 계산하였다. 결과는 도 1과 같다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 경우, 피브로넥틴에 부착한 MCF-7 세포의 갯수가 대조군에 비해서 유의성 있게(약 25∼50% 수준) 감소되었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 베타1 인테그린의 활성을 효과적으로 억제하는 활성을 가짐을 확인할 수 있다.

시험예 2. 단핵구의 시험관 내( in vitro ) 혈관외유출 억제 시험

인간 제정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)를 보이덴 챔버 (Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 1의 펩타이드 용액(0.1 내지 100 nM)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 사람 단핵구(U937; Human monocyte)를 각 처리구에 5 x 10⁵ 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청 배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 단핵구의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 3회 반복하였으며, 결과는 도 2와 같다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 경우, 혈관 외로 유출된 단핵세포의 갯수가 대조군에 비해서 유의성 있게(약 40∼60% 수준) 감소되었다. 백혈구가 혈관을 따라 이동하다가 염증 부위로 이동하기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 염증반응 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.

시험예 3. 시험관 내( in vitro ) 혈관신생 억제능 시험

본 발명에 따른 펩타이드가 혈관신생에 미치는 영향을 하기와 같이 평가하였다.

일반적으로, 혈관의 바닥막 성분과 혈관내피 세포의 상호작용은 신생혈관의 형성과 유지에 중요한 요소이며, 바닥막 성분의 복합체인 매트리겔(Matrigel)을 24-웰 플레이트에 넣으면 중합반응을 일으켜 플러그(plug)를 형성하게 된다. HUVECs를 8 x 10⁴ cells/well의 밀도로 매트리겔이 도포된 24 well 세포배양판에 접종한 후, 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF, 10 ng/ml)와 실시예 2로부터 제조된 서열번호 1의 펩타이드 용액(0.1, 1, 및 10 nM)을 각각 첨가하고, 24시간 배양하였다. 그 후 도립현미경하에서 x50 배율로 확대하여 신생혈관 형성여부를 관찰하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 함유한 용액으로 처리한 경우, 혈관신생이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 암세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되며, 또한 피부 염증의 예방 및 치료에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical and cosmetic composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and growth or metastasis of cancer cells <130> PN0631 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 1 Lys Leu Leu 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 2 Glu Phe Ala 1 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 3 Asp Thr Gln 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 4 Ile Tyr Lys 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment <400> 5 Asn Tyr Gly 1

Claims (6)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 염증 질환이 피부 염증(dermatitis)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암의 성장 또는 전이 억제용 약학 조성물.
4. 삭제
5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 피부 염증 개선용 화장료 조성물.
6. 삭제

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