KR101838286B1 - 피부 각질 줄기세포 증식 및 활성화 활성을 갖는 다이펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

피부 각질 줄기세포 증식 및 활성화 활성을 갖는 다이펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트레오닌-류신(T-L)으로 이루어진 피부 각질 줄기세포 증식용 다이펩타이드 또는 이의 변이체, 이들을 유효성분으로 포함하는 피부 각질 줄기세포의 증식촉진제, 상기 증식촉진제를 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물 및 피부 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 다이펩타이드는 피부 각질 줄기세포의 증식 및 세포생장인자 분비 활성을 유도하여, 피부 재생력 향상 또는 피부탄력 개선 효과를 나타내며, 이를 통해 화장품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용 가능하다.

Description

피부 각질 줄기세포 증식 및 활성화 활성을 갖는 다이펩타이드 및 이의 용도 {Dipeptide with activities of growth and activation of skin keratinocyte stem cell and use thereof}
본 발명은 인간 피부 각질 줄기세포 증식 효능이 있는 다이펩타이드(T-L) 및 이를 포함하는 피부 재생 또는 피부 탄력 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체를 구성하는 가장 큰 기관으로, 우리 몸 부피의 약 18%를 차지하며, 표피, 진피 및 피하지방층으로 구성되어 있다. 이러한 피부는 외부 환경과 직접 접하고 있으면서 인체 유해 미생물과 같은 다양한 유해인자들과 자외선 등과 같은 외부 자극으로부터 인체를 보호하는 중요한 보호막 역할을 담당하는 동시에 전신의 대사에 필요한 생화학적 기능을 영위하는 생명유지에 필수 불가결한 기관이다. 피부는 구조적으로 크게 표피(epidermis) 및 진피(dermis)를 포함하며, 표피는 납작한 육각형 모양의 죽은 세포로 구성된 각질층(Stratum Corneum)과 살아있는 표피로 나눌 수 있다.
살아있는 표피는 기저층(Stratum Spinosum), 가시층(유극층, spinous layer), 과립층(Stratum Granulosum), 및 투명층(stratum Iucidum)의 4 개의 층을 포함한다. 이 중에서 재생능력을 보이는 것으로 알려진 것은, 기저층에 존재하는 피부의 각질 줄기세포(Keratinocyte stem cell, KSC)이다. 각질 줄기세포가 지속적으로 분열하여 크게 두 가지 세포를 생성하는데, 하나는 자기 복제(self-renewal)를 하여 만드는 똑같은 줄기세포이고, 다른 하나는 전이-증폭 세포(Transit Amplifying Cells, TA cells)를 만들게 된다. 이 세포들은 수차례의 분열을 하며, 피부 발생학적으로 중/후반부에 해당되는 피부 장벽기능에 중추역할을 하는 각질 세포(Keratinocyte cells)를 형성한다. 각질 세포는 분화(differentiation)를 진행하여, 피부 발생학적으로 마지막 단계인, 피부 표면으로 밀려 올라가게 된다. 이 과정에서 각질 세포의 분화와 각화(Keratinization)가 일어나면서 각질층을 만들게 되며, 결국에는 각질 세포는 각질층에서 떨어져 나간다.
상기 각질 줄기세포 및 전이-증폭 세포는 보통 기저층 세포들의 약 4 내지 7% 정도로 극히 낮은 수로 분포되며, 사람이 나이가 들어가게 됨에 따라, 피부 각질 줄기세포와 전이-증폭 세포를 증식하는 능력이 저하된다. 각질세포를 만드는 능력이 저하되면, 결국에는 피부재생 능력이 감퇴되면서 피부탄력 저하 등의 노화 현상이 심화된다. 그래서 피부 각질 줄기세포의 증식능력을 보이는 조성물의 개발이 필요하다.
이러한 문제점을 해소하기 위한 본 발명의 하나의 목적은 피부에 자극이 없으면서 피부 각질 줄기세포를 증식시켜 피부 재생 또는 피부탄력 개선에 탁월한 효과를 나타내는 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 피부 재생 또는 피부탄력 개선용 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 피부 재생 또는 피부탄력 개선용 화장료 및 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 각질 줄기세포 증식용 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 증식촉진제에 포함되는 다이펩타이드는 트레오닌-류신(T-L)의 아미노산으로 구성되는 펩타이드로서, 상기 다이펩타이드 또는 이의 변이체는 피부 각질 줄기세포의 증식을 통해, 피부를 재생시키고, 피부탄력을 개선시킨다.
본 명세서에 정의된 용어 "피부 재생"은 전반적인 피부 노화 및 피부 표피 등에 유발된 상처 등에 대응하여 새로운 각질세포를 생성하는 능력을 포함하는 광의의 개념으로, 구체적으로, 피부 표피의 기저층에 존재하는 각질 줄기세포의 분열에 의해 생성된 전이-증폭 세포들이 더욱 증폭하고, 초기 분화하여 각질 세포가 되고, 피부 표면으로 밀려 올라가 분화(Differentiation)와 각화(Keratinazation)를 일으키면서 각질층을 이루게 되는 모든 과정을 의미한다. 그 중에서 피부 재생의 핵심 과정은 기저층에 존재하는 각질 줄기세포와 이 세포의 딸 세포인 전이-증폭 세포의 증식에 있다. 피부 외부의 물리적, 화학적 환경에 의해 일어나는 피부 손상이 일어났을 때, 이를 빠른 시간에 회복하기 위해서는 피부 기저층에 존재하며 피부 재생을 담당하고 있는 각질 줄기세포와 전이-증폭세포들의 활발한 증식이 필요하다. 보통 어릴 때는 피부 손상이 일어나더라도 흉터가 남지 않는 반면, 나이가 들어 피부 손상이 일어나게 되면 흉터가 남는 이유도 피부 재생에 필요한 각질 줄기세포와 전이-증폭 세포의 증식의 수준 정도가 나이 정도에 따라 현저하게 낮아지기 때문이다. 즉, 노화가 진행하게 되면, 이러한 세포들의 증식 정도가 낮아지게 되며, 이는 피부 재생 능력이 감퇴하는 것으로, 상처 등의 회복이 지연되거나, 피부 탄력 감소가 심화될 수 있다. 따라서, 피부 각질 줄기세포(Keratinocyte Stem Cells, KSC)의 증식을 통해 피부를 재생시키거나 피부노화를 방지할 수 있다.
나아가, 본 발명에서 용어, "피부 탄력"이란, 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는 것으로, "피부 탄력 증진"이란 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유와 교원섬유인 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지되는 것을 말한다.
본 발명의 펩타이드의 합성은 예를 들어 기기를 이용하거나 유전공학 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 기기를 이용하여 합성하는 경우, 자동 펩타이드 합성기(PeptrEX-R48, Peptron, Daejeon, Korea)에서 원하는 펩타이드를 Fmoc 고체상(Fmoc solid-phase) 방법으로 합성한다. 수지(resin)에서 합성 펩타이드를 분리한 후, 시세이도 캡셀 팩 C18 분석 RP 칼럼(Shiseideo capcell pak C18 analytical RP column)을 이용한 역상 HPLC(reverse-phase HPLC, Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan)에 의해 펩타이드를 순수분리 및 분석한다. 최종 펩타이드는 질량분광계(mass spectrometer, HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA)를 사용하여 동정한다. 유전공학적 기법을 이용하는 경우, 원하는 펩타이드의 해당 염기 서열을 단백질 발현 벡터(vector)에 도입한 후, BL21(λDE3)와 BL21(λDE3)pLys와 같은 단백질 분해효소(protease)가 결핍된 박테리아(bacteria)에서 IPTG를 이용하여 발현을 유도하고 순수 분리한다.
본 발명에 따른 일 실시예에서, 본 발명의 증식촉진제에 포함되는 다이펩타이드는 세포 독성을 거의 나타내지 않으면서도, 음성대조군(무처치군) 및 양성대조군(Rutin 처치군)에 비해 인간 피부 각질 줄기세포에 대한 탁월한 세포 증식률을 나타내고, 다양한 세포성장인자, 특히 GM-CSF, NT-3, SCF, TGF-beta 및 VEGF의 분비를 효과적으로 증가시켰다.
이와 같이, 본 발명에 따른 다이펩타이드를 포함하는 증식촉진제는 탁월한 피부 재생력 향상 및 피부 탄력 증가 효과를 나타내는 특징을 가지고 있어, 화장료 또는 약물로서의 유용성이 크다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는, 피부 상태 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 바람직한 하나의 양태에서, 상기 "피부 상태 개선"은 피부 재생력 향상, 피부 보습력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선 또는 피부 노화 개선을 의미한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 유효성분으로 포함하는, 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진에 의한 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 "피부 각질 줄기세포의 증식 촉진에 의한 피부질환"은 주름(wrinkle), 기미(melisma), 주근깨(Freckle), 튼살(striae distensae), 또는 상처(wound)를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 본 발명에 따른 조성물의 경우 유효 성분인 다이펩타이드는 피부외용 제제 형태인 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 또는 약학적 조성물은 피부 재생 또는 피부 탄력 개선 기능을 갖는 물질을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다. 또한 바람직한 양태에서, 상기 화장료 또는 약학적 조성물에는 이에 제한되는 것은 아니나 상기 증식촉진제가 전체 조성물에 대해 10 내지 4,000ppm의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 트레오닌-류신(T-L) 다이펩타이드는 피부 각질 줄기세포의 증식을 유도하고, 각종 세포 증식인자의 분비를 촉진시킴으로써, 피부 재생 및/또는 피부탄력 개선효과를 나타내며, 이를 통해 화장품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용 가능하다.
이하, 실시예 및 시험예 등을 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1] 다이펩타이드(T-L)의 인간 피부 각질 줄기세포 증식효과 분석
1-1: 펩타이드 합성
본 실시예에서는 다양한 세포투과 펩타이드 유도체를 합성하기 위하여, 일반적인 펩타이드 고상 합성법(Wang C. Chan, Perter D. White, "Fmoc Solid phase peptide synthesis", Oxford)에 따라서 진행하였다. 보다 구체적으로, 자동합성기(ASP48S, Peptron,Inc.)를 사용하여 Fmoc-SPPS(9-Fluorenyl methyl oxycarbonyl solid phase peptide synthesis) 방법을 이용하여 C-말단부터 하나씩 커플링(coupling)하였다. 펩타이드 유도체 합성에 사용한 모든 단량체 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호되고, 잔기는 트리틸(Trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), t-부틸(t-Bu) 등으로 보호된 아미노산을 사용하였다. 커플링제(Coupling reagent)로는 HBTU(2-(1H-Benzotirazloe-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophophate / HOBt(Hydroxybenzo triazloe) / NMM(N- methylmorpholine)을 사용하였다.
(1) 보호된 아미노산(8당량)과 커플링제 HBTU(8당량) / NMM(16당량)을 DMF(Dimethyl formamide)에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 반응시켰다.
(2) Fmoc 제거는 20%(v/v) Piperidine / DMF를 가하여 상온에서 5분간 2회 반응하였다.
상기 (1)과 (2)의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 유도체를 만들었다.
Resin에서의 펩타이드 분리는 TFA(Trifluoroacetic acid) / EDT(1,2-ethanedithiol) / Thioanisole / TIS (Triisopropylsilane) / H2O (혼합비(중량기준)= 90 / 2.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5)을 사용하여 분리하였다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리함으로써 침전물을 생성시킨다. 얻어진 침전물을 원심분리시켜 완전히 침전시키고, 과량의 트리플루오로아세트산, 티아니졸 및 에탄디티올 등을 일차로 제거한 후, 동일한 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.
얻은 침전물을 C18 column(250mm × 22 mm, 10μm, Vydac Everest, USA)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피 기기(Shimadzu Prominence HPLC, Japan)를 이용하여 0.1%(v/v) Trifluoroacetic acid를 포함하는 water - acetonitrile liner gradient(Acetonitrile 농도: 10~75%(v/v)) 방법으로 분리하였다. 정제된 펩타이드 유도체의 분자량은 LC/MS(Agilient HP 1100 series)를 사용하여 확인하였고, 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형태의 TFA(Trifluoroacetic acid)염으로서 하기의 펩타이드를 얻었다.
구체적으로, 합성된 펩타이드 유도체들의 서열과 분자량을 하기에 나타냈다.
다이펩타이드: TL : Rt= 2.825 분(0.01%(v/v) TFA를 함유하는 5%(v/v) 내지 100%(v/v)의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI) 232.14 m/e, [M+H]+= 233
1-2: 인간 피부 각질 줄기세포의 배양
인간 피부 각질 줄기세포를 CO2 배양기(CO2 Incubator)에서 37°C, 5% CO2 조건하에서 배양을 하였다. 인간 피부 각질 줄기세포는 셀앤텍(CellnTec, Inc.,USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 배양액은 셀앤텍(CellnTec, Inc.)의 지침서에 따라, 500 ㎖의 기본배양액(CnT-BM)에 첨가물(CnT-57)을 넣어 세포배양에 사용하였다.
1-3: 인간 피부 각질 줄기세포 증식효과 분석
그리고 다이펩타이드(T-L)를 20 ppm으로 피부 각질 줄기세포에 72 시간 동안 처리하여, 세포증식 정도를 CCK-8 kit(WST-8; Dojindo, Japan)을 이용하여 분석하였다. 분석방법은 효소면역분석기(ELx808; BioTek, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도 분석을 통해 수치화 하였다. 해당 인간 피부 줄기세포 증식률(%)을 표 1에 나타내었다.
음성 대조군은 무처치군이고, 양성 대조군은 Rutin(quercetin-3-O-rutinoside) 처리군이었다.
상기 세포 증식률(%)은 음성 대조군의 증식률 100을 기준으로 각 처리 시료에 따른 세포 증식률을 구한 값이다.
Figure 112015105951517-pat00001
상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다이펩타이드(T-L)에 의한 인간 피부 각질 줄기세포 증식률은 각각 음성대조군에 비해 1.64배 증가하는 것으로 관찰되었으며, 이는 양성대조군 (1.21배)에 의한 세포증식률과 비교하여 더 높은 탁월한 세포증식률을 나타내는 것으로 확인되었다.
[ 실시예 2] 다이펩타이드(T-L)의 인간 피부 각질 줄기세포 세포독성 분석
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간 피부 각질 줄기세포를 배양한 후, 다이펩타이드(T-L)의 세포독성을 파악하기 위하여 펩타이드를 100, 200, 400 ppm의 농도로 처리하였다. 이 후 MTT법(Sigma Aldrich, St Louis, USA)을 이용하여 전 처리 후 효소면역분석기(570nm; BioTek)를 이용한 흡광도 분석을 통해 세포독성의 정도를 수치화하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112015105951517-pat00002
상기 표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 다이펩타이드에 의한 인간 피부 각질 줄기세포의 사멸은 100, 200, 400 ppm의 농도범위 내에서도 나타나지 않았으며, 음성대조군에 비해 세포생존율이 같거나 높은 것으로 확인되었다. 상기 농도 수치는 인간 피부 각질 줄기세포의 탁월한 세포증식률(표 1 참조)을 보인 20 ppm의 농도보다 5배, 10배, 20배 높은 수준임에도 불구하고, 해당 농도까지 세포독성은 나타나지 않는 것으로, 이는 약리학적, 화장품학적으로 유효한 효과를 나타내는 농도에서 본 발명에 따른 다이펩타이드가 세포 독성이 없이 안전하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
[ 실시예 3] 다이펩타이드(T-L)의 인간 피부 각질 줄기세포 세포생장인자 발현 분석
실시예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간의 피부 각질 세포를 배양한 후, 다이펩타이드(T-L)에 의한 세포생장인자 발현 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 20 ppm의 농도로 처리한 후 72시간 동안 배양한 세포배양액(2ml)을 사용하였다. 음성대조군으로는 펩타이드를 처리하지 않은 배양액(vehicle), 양성대조군으로는 루틴(Rutin)을 사용하였다.
세포생장인자 anti-body(Ab) array(ab134002; Abcam, Cambridge, UK)의 사용은 공급처에서 제공하는 지침서에 따랐으며, 결과의 정량은 ImageJ software(NIH, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 각각의 세포생장인자 발현 정도를 확인하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112015105951517-pat00003
상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포배양액 내 세포생장인자의 발현 변화는 다이펩타이드(T-L)를 처리한 군에서 관찰되었으며, 그 중에서도 특히 GM-CSF, NT-3, SCF, TGF-beta 및 VEGF의 분비를 효과적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 그 밖에도 각종 세포생장인자의 분비가 음성대조군에 비하여 대부분 증가하는 것으로 확인되었다.

Claims (12)

  1. 트레오닌-류신(T-L)으로 이루어진 다이펩타이드 또는 이의 변이체를 포함하는 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체는 다이펩타이드의 C-말단의 아미드화 및 N-말단의 아세틸화로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 그룹을 포함하는 것인 증식 촉진제.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 다이펩타이드 또는 이의 변이체는 피부 각질 줄기세포의 성장인자 발현을 촉진하는 것인 증식 촉진제.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 성장인자는 TGF-beta 또는 VEGF인 것인 증식 촉진제.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서,
    상기 피부 상태 개선은 피부 재생력 향상, 피부 탄력 개선, 피부 주름 개선, 피부 기미 개선, 피부 주근깨 개선, 피부 튼살 개선 및 피부 상처 개선으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서, 화장품학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인 화장료 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 피부 각질 줄기세포의 증식 촉진제는 10 내지 4,000ppm으로 포함되는 것인 화장료 조성물.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것인, 화장료 조성물.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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