ITMI20070999A1 - Peptide sintetico dotato di proprieta anti-infiammatorie e anti-microbiche - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo:

“Peptide sintetico dotato di proprietà anti-infiammatorie e antimicrobiche”

La presente invenzione riguarda un peptide avente una sequenza scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO. da 1 a 16 ed i suoi usi, come qui riportati di seguito.

L’ormone alfa-melanocitostimolante ( alpha-melanocyte stimulating hormone, alfa-MSH) è un tridecapeptide endogeno che esercita un effetto immunomodulante, antipiretico e anti-infiammatorio. Ricerche precliniche hanno dimostrato che il trattamento con alfa-MSH inibisce la flogosi in modelli di infiammazione acuta e cronica come ad esempio l’artrite da adiuvante e le malattie infiammatorie intestinali. Il trattamento con alfa-MSH aumenta la sopravvivenza nei topi con shock settico indotto da legatura e puntura cecale. Inoltre, inibisce la diapedesi di neutrofili nel polmone di ratti con sindrome da difficoltà respiratoria acuta (acute respiratory distress syndrome, ARDS) indotta da istillazione intratracheale di endotossine.

Inoltre, dati recenti indicano che alfa-MSH e melanocortine ad esso correlate hanno attività antimicrobica.

L’effetto concomitante anti-infiammatorio e antimicrobico è una caratteristica peculiare di alfa-MSH che non è rilevabile in altre classi di farmaci in uso. Di conseguenza, l’uso di alfa-MSH nella preparazione di medicamenti sarebbe molto utile.

Un problema connesso all’uso di alfa-MSH, nella preparazione di un medicamento, è dato dalla sua instabilità e dalla sua breve emivita. Di conseguenza, queste due limitazioni comportano che il medicamento sia di poca utilità.

Il problema da risolvere, pertanto, è di trovare un sostituto analogo di alfa-MSH che ritenga al meglio le sue proprietà terapeutiche ma che presenti, allo stesso tempo, una maggiore stabilità chimica.

La Richiedente ha sorprendentemente trovato che le sequenze peptidiche secondo SEQ ID NO. 1-16 sono in grado di risolvere il problema sopra citato, in particolare un peptide avente una sequenza scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO. da 2 a 16.

Le sequenze secondo SEQ ID NO. 1-16 sono state scelte da sequenze che comprendono due monomeri di un tripeptide Lys-Pro-Val.

I monomeri sono legati ad una molecola di D-Penicillamina (Pen).

Nel contesto della presente invenzione, la molecola D-Penicillamina è considerata un amino acido e, pertanto, le sequenze secondo l’invenzione sono state scelte da sequenze che comprendono due monomeri di tetrapeptidi Pen-Lys-Pro-Val (PenKPV).

I due monomeri di tetrapeptidi sono legati tra loro tramite un ponte disolfuro tra le due molecole Pen per formare un dimero octapeptide che è rappresentato in SEQ ID NO. 1 e nella formula I di seguito riportata:

Formula I

Le sequenze SEQ ID NOs. da 2 a 16 rappresentano varie forme di realizzazione acetilate e/o ammidate della sequenza secondo la formula I nelle sole posizioni 1, 4, 5 e 8.

La descrizione completa delle sequenze SEQ ID NOs. da 1 a 16 è riportata in allegato (1) secondo lo standard intemazionale WIPO Standard ST.25 e sviluppato con il programma Patent-In 3.3.

Tra dette sequenze secondo l’invenzione, la preferita è SEQ ID NO. 2.

Detta invenzione è ulteriormente illustrata anche con l’ausilio delle allegate figure da 1 a 5, in cui:

- la tavola 1 mostra un effetto inibitorio di SEQ ID NO. 2 e SEQ ID NO. 1 sulla produzione del fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa) da parte di cellule mononucleate del sangue periferico stimolate con endotossine. Gli istogrammi indicano la percentuale di inibizione rispetto al controllo. Gli asterischi indicano significatività statistica con valore di probabilità (p) <0.05.

- La tavola 2 mostra un effetto inibitorio di SEQ ID NO. 2 sui livelli plasmatici di TNF-alfa stimolati da endotossine nel ratto. Gli asterischi indicano una significatività statistica con valore di probabilità (p) <0.01.

- La tavola 3 mostra un effetto inibitorio di SEQ ID NO. 2 sulla proliferazione di fibroblasti umani in coltura primaria. Gli asterischi indicano una significatività statistica verso il controllo con valore di probabilità (p) <0.01.

- La tavola 4 mostra un effetto inibitorio di SEQ ID NO. 2 sulla chemiotassi dei neutrofili indotta da interi euchina 8.

- La tavola 5 mostra un effetto candidacida del peptide SEQ ID NO. 2 valutato mediante il conteggio delle colonie in piastre agar.

In una realizzazione dell’invenzione, le sequenze peptidiche secondo l’invenzione sono presenti in una composizione. La composizione può inoltre comprendere eccipienti selezionati tra: tamponanti, lubrificanti, disperdenti, aromatizzanti, edulcoranti, stabilizzanti, conservanti, antiossidanti, comunemente noti e/o usati nella tecnica formulativa farmaceutica.

In un’altra realizzazione preferita dell’invenzione, le sequenze peptidiche secondo l’invenzione possono essere incorporati in agenti veicolanti.

Nel contesto della presente invenzione, per agenti veicolanti si intende preferenzialmente liposomi o nanoparticelle.

Le sequenze peptidiche secondo l’invenzione possono essere incorporate o associate o fuse con i liposomi o le nanoparticelle secondo metodi noti nell’arte. Preferibilmente, detti agenti veicolanti sono opportunamente funzionalizzati per raggiungere i tessuti specifici secondo metodi noti nell’arte.

Ancora più preferibilmente, gli agenti veicolanti contengono plurime sequenze secondo l’invenzione e, opzionalmente, anche alcuni eccipienti.

Le sequenze peptidiche secondo l’invenzione possono essere prodotte usando tutti i modi noti nell’arte per produrre sequenze peptidiche che riescono ad incorporare nelle sequenze prodotte gruppi acetati o ammidati in posizioni specifiche nella sequenza.

Un metodo preferito è sintetizzare due monomeri tetrapeptidici, come sopradescritti, con un metodo in fase solida noto al tecnico del settore e poi ossidare i tetrapeptidi per formare le sequenze peptidiche secondo l’invenzione mediante la formazione di un ponte disolfuro che lega le due unità tetrameriche. Una realizzazione preferita di detta sintesi dei monomeri in fase solida prevede l’uso della chimica N<alfa>-Fmoc e una resina poliammidica.

In una realizzazione ancora più preferita, i tetrapeptidi risultanti sono ossidati con il metodo di pompa siringa. La pompa siringa è un metodo noto nell’arte ed è semplicemente un sistema di infusione capillare utilizzato in una fase della sintesi in cui i tetrameri Pen-Lys-Pro-Val vengono ossidati. I due gruppi Pen, appartenenti a due unità diverse, si legano mediante un ponte disolfuro.

In un’altra realizzazione, le sequenze peptidiche possono essere sintetizzate in fase liquida con metodi noti nell’arte per la produzione di sequenze peptidiche su larga scala.

In una realizzazione ancora più preferita, le sequenze peptidiche secondo l’invenzione sono purificate, dopo essere state sintetizzate, preferibilmente con RP-HPLC su una colonna semipreparativa di silice utilizzando un gradiente di CH3CN in 0.1% di TFA.

In un altro aspetto dell’invenzione, le sequenze peptidiche secondo l’invenzione, le composizioni e/o gli agenti veicolanti che le comprendono sono usate come medicamento. Detti medicamenti vengono prodotti utilizzando tecniche di formulazione farmaceutica note nel settore. I medicamenti sono preferibilmente somministrati enteralmente o parenteralmente o topicamente. Le somministrazioni enterali possono essere orali, ad esempio, incorporate in capsule a rilascio gastrointestinale. Le somministrazioni parenterali possono essere iniettabili per via endovenosa, intramuscolare o intradermica. Le somministrazioni topiche comprendono medicamenti preparati secondo metodi noti nell’arte per la somministrazione locale di medicamenti, ad esempio, una pomata comprendente i peptidi secondo l’invenzione per somministrazione sulla cute o per inalazione, con un dispositivo a base di aerosol, se si vuole trattare le aree bronco-polmonari.

Altre forme di somministrazione non sono escluse, in funzione del tipo di paziente e di affezione affrontata.

I dosaggi dei peptidi secondo l’invenzione dipendono, in rapporti noti nell’arte, dal metodo di somministrazione usato e dall’obiettivo terapeutico che si vuole raggiungere. E’ comunque preferibile che la quantità di sequenze peptidiche secondo l’invenzione presenti nel medicamento sia compresa da 25 a 750 pg/Kg di peso corporeo del paziente, preferibilmente da 50 a 500 pg/Kg.

In una realizzazione preferita di detto uso come medicamento, le sequenze peptidiche secondo l invenzione sono usate per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento di patologie in cui sono coinvolte infiammazioni. Le infiammazioni sono definite come una reazione del sistema immunitario e/o vascolare in risposta a stimoli di vario tipo. Detti stimoli sono ad esempio irritanti chimici, bruciature, necrosi, tossine ma possono essere altri stimoli noti nell’ arte come causa di infiammazioni. Le infiammazioni secondo l’invenzione incorporano infiammazioni croniche, sistemiche o acute. Tra dette situazioni infiammatorie, le infiammazioni in cui sono coinvolti il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa) o Tinterleuchina-8 sono preferite.

In un’altra realizzazione preferita di detto uso come medicamento, le sequenze peptidiche secondo l’invenzione possono essere usate per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento di patologie fibroproliferative. La patologia fibroproliferativa può essere primaria o secondaria, ad esempio conseguente ad una reazione infiammatoria, ed è caratterizzata dall’accumulo di proteine della matrice extracellulare e/o dalla proliferazione di cellule di tipo fibroblastico e/o dalla contrazione volumetrica dell’organo interessato dal processo fibrati co. I fibroblasti sono fattori essenziali della risposta fibroproliferativa al danno tessutale nei polmoni, nel fegato e in altri tessuti parenchimatici. Fattori essenziali della risposta al danno tessutale includono la proliferazione di fibroblasti, l’aumento della produzione di matrice extracellulare e il rimodellamento della matrice extracellulare. L’aumento della matrice extracellulare è conseguenza sia dell’aumento numerico dei fibroblasti (proliferazione) sia dell’ aumentata sintesi della matrice cellulare ed extracellulare. I fibroblasti migrano nel tessuto danneggiato, in seguito all’attivazione da parte di opportune sostanze prodotte dai macrofagi, o per cause ignote nelle fibrosi primarie. Successivamente, i fibroblasti proliferano e sintetizzano collagene, la proteina più abbondante del tessuto cicatriziale.

Nel contesto della presente invenzione, oltre alla fibrosi, anche la poliposi è compresa nelle patologie fibroproliferative. Un esempio in cui la poliposi può essere considerata una fibropatologia è dato dai polipi nasali in cui la fibroproliferazione consegue ad una infiammazione da risposta allergica. I polipi nasali analogamente a quelli in altri organi sono caratterizzati istologicamente da fibroproliferazione, infiltrazione di cellule eosinofiliche ed estesa distruzione della componente connettiva.

In un altro aspetto dell’invenzione, le sequenze peptidiche secondo l’invenzione sono usate per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o trattamento di una infezione microbica. Nel contesto della presente invenzione, una infezione microbica può essere batterica (procariota) o micotica. Preferibilmente detta infezione è micotica ed ancor più preferibilmente è dovuta alla presenza di C. albicans.

In un'altra realizzazione dell’invenzione le sequenze peptidiche secondo l’invenzione sono usate per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento di una infezione microbica e per contemporaneamente ridurre e/o prevenire e/o arrestare un effetto infiammatorio.

Gli esempi sotto riportati evidenziano come le endotossine inducono una situazione di infiammazione nell’ospite. Le endotossine sono lipopolisaccaridi e frammenti delle pareti di batteri Gram negativi. La infiammazione indotta da endotossine, se non trattata, può condurre ad una fibropatologia.

Un ulteriore vantaggio dell’uso delle sequenze peptidiche secondo l’invenzione per la preparazione di un medicamento è dato dal fatto che le sequenze peptidiche secondo l’invenzione danno un doppio/triplo effetto beneficiale concomitante: l’infezione causa Γ infiammazione che in se può causare le patologie fibroproliferative e le sequenze peptidiche dimostrano un effetto profilattico e/o arrestante e/o terapeutico per tutte e tre le condizioni.

Esempio 1- Sintesi di SEP ID NO. 2

Il peptide SEQ ID NO. 2, (Ac-Pen-Lys-Pro-Val-NH2)2,è stato sintetizzato manualmente con un metodo di preparazione in fase solida utilizzando la chimica N<alfa>-Fmoc e resina Rink Amide (Advanced ChemTech, Louisville, KY) per costruire il monomero Ac-Pen-Lys-Pro-Val-NH2. Il prodotto finale è stato distaccato dalla resina usando un miscela di acido trifluoroacetico (90%), trietilsilano (5%), e acqua (5%) per due ore a temperatura ambiente. La resina è stata rimossa per filtrazione e il peptide lineare Ac-Pen-Lys-Pro-Val-NH2così isolato è stato recuperato dopo precipitazione con etiletere anidro freddo in modo da ottenere una polvere bianca. Infine, il peptide è stato ossidato per formare il dimero utilizzando una pompa siringa. Il composto finale è stato purificato mediante RP-HPLC su colonna semi -preparativa di silice Vydac CI 8 (Vydac 218TPP1010, 1.0 x 25 cm) utilizzando il gradiente di CH3CN in 0.1% di TFA (da 10 a 90% in 45 minuti) alla velocità di flusso di 1.0 mL/min. Il prodotto è stato ottenuto per liofilizzazione delle frazioni appropriate dopo rimozione del CH3CN per evaporazione rotatoria. La RP-HPLC analitica ha indicato una purezza > 98% e il peso molecolare è stato confermato mediante spettrometria di massa (FAB-MS).

Esempio 2 - Dimostrazione dell’ effetto anti-infiammatorio in vitro

L’effetto inibitorio di SEQ ID NO. 2 sull’infiammazione è dimostrato con un effetto inibitorio sulla produzione della citochina denominata fattore di necrosi tumorale alfa (tumor necrosis factor-alpha , TNF-alfa). La citochina TNF-alfa è alla base della risposta infiammatoria e la sua espressione è riscontrabile in ogni tipo di flogosi. Per valutare l’effetto anti-TNF-alfa delle sequenze secondo l’invenzione, sono state utilizzate cellule mononucleate del sangue periferico (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) stimolate con endotossina in vitro. Questo sistema è stato scelto in quanto standardizzato e impiegato in numerose ricerche sulle molecole anti-infiammatorie. Le cellule mononucleate del sangue periferico comprendono linfociti e monociti, ossia cellule di primaria importanza nella risposta flogistica.

Sangue eparinato (30 mi) è stato prelevato da sette soggetti normali. Le PBMC sono state isolate mediante centrifugazione su gradiente di densità Ficoll-Hypaque (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). Le cellule sono state lavate due volte con tampone fosfato sterile (PBS) e sospese in un terreno usato comunemente e reperibile commercialmente ossia RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK) addizionato con Hepes 10 mM (Sigma), L glutamina 2 mM (Gibco), siero bovino fetale (FCS) al 10% (Gibco), penicillina 50 U/ml (ICN Flow, Costa Mesa, CA) e streptomicina 50 pg/ml (ICN Flow). I PBMC sono stati seminati in piastre da 24 pozzetti a fondo piatto alla densità di 2.5x10<5>cellule per pozzetto ed incubati in atmosfere al 5% di C02a 37°C per 24 h in presenza di: a) terreno solo, b) terreno più SEQ ID NO. 2 in concentrazioni da IO<"9>a IO<"5>M; c) terreno più lipopolisaccaride (LPS) di Escherichia coli 055:B5 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 1 ng/ml; d) terreno più LPS 1 ng/ml più SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2,entrambi in concentrazioni da IO<"9>a IO<"5>M. Dopo una incubazione di 24 ore, i campioni sono stati centrifugati e i sovranatanti sono stati aspirati e conservati a -80°C. Gli esperimenti sono stati condotti in triplicato. TNF-alfa è stato dosato con metodo immunoenzimatico specifico utilizzando kit del commercio (Biosource International, Camarillo, CA).

La allegata tavola 1 illustra i risultati di un esperimento in cui l’effetto anti-TNF-alfa viene dimostrato sia per SEQ ID NO. 1, che per SEQ ID NO. 2. In particolare, l’attività di SEQ ID NO. 2 è risultata significativamente superiore rispetto a quella di SEQ ID NO. 1. Gli istogrammi indicano la percentuale di inibizione rispetto al controllo. Gli asterischi indicano significatività statistica con valore di probabilità (p) <0.05.

Esempio 3 - Effetto di SEQ ID NO. 2 in vivo

Ratti Wistar maschi del peso di 200-220 g (Charles River, Calco, Italy) sono stati stabulati presso lo stabilimento utilizzatore dell’Ospedale Maggiore di Milano. La cura degli animali è avvenuta in conformità a quanto riportato nei Principles of Laboratory Animai Care, della National Society of Medicai Research, e alla Guide for thè Care and Use of Laboratory Animals preparata dalla National Academy of Sciences e pubblicata dai National Institutes of Health (NIH Publication No. 86-23, revised 1985).

I ratti (in numero di 6 per gruppo) hanno ricevuto iniezioni intravenose in bolo di LPS (50 pg in 200 μΐ) associato a soluzione salina (200 μΐ) oppure associato a SEQ ID NO. 2 140 pg. I ratti sono stati sacrificati un’ora dopo i trattamenti, sotto anestesia con etere. Il sangue è stato prelevato dalla vena cava inferiore. TNF-alfa è stato dosato con metodo immunoenzimatico specifico utilizzando opportuni kit del commercio (Biosource International, Camarillo, CA).

Come illustrato nella allegata tavola 2, SEQ ID NO. 2 ha significativamente inibito i livelli plasmatici di TNF-alfa stimolati da endotossina nel ratto. Gli asterischi indicano significatività statistica con valore di probabilità (p) <0.01.

Esempio 4 - Effetto di SEQ ID NO, 2 sulla proliferazione di fibroblasti

La proliferazione dei fibroblasti è un evento dannoso che accompagna le reazioni flogistiche e che porta alla formazione di fibrosi con gravi ripercussioni funzionali irreversibili sugli organi interessati.

Fibroblasti di cute umana sono stati isolati da prepuzio e mantenuti in coltura in un mezzo di coltura usato comunemente e reperibile commercialmente, precisamente il mezzo “ Dulbecco ’s Modified Eagle Medium " (in sigla, DMEM), in presenza di 10% siero bovino fetale, 200WM glutamina e antibiotici (penicillina, 100 pg/mL streptomicina, amfotericina 0.25 pg). Le cellule sono state passate cioè sottoposte a passaging, usando 0,05% tripsina e 0,02% acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) in tampone di fosfato salino a pH 7,4 (PBS). Le cellule usate per gli esperimenti sono state utilizzate tra i 3 e i 10 passaggi. Le cellule fibroblastiche nella fase di crescita esponenziale sono state lavate due volte in tampone fosfato (PBS), risospese in terreno RPMI 1640 e contate. Le cellule sono poi state distribuite in piastre da 96 pozzetti a fondo piatto alla concentrazione di 2000 cellule/100 pi di terreno/pozzetto. Detto numero di cellule è stato selezionato sulla base di esperimenti preliminari in modo da permettere una crescita esponenziale per i 4 giorni del saggio e in modo da dare un’assorbenza di 1,5-2, 2 a 540 nm (misurata con lettore di piastre Titertek Multiskan MCC/340) a 72 ore.

Dopo 24 ore di incubazione di dette cellule a 37°C, 5% C02, per consentire l’adesione cellulare, SEQ ID NO. 2 è stato aggiunto a ciascun pozzetto alle concentrazioni finali di 10<'7>M e 10<'9>M.

Le cellule di controllo hanno ricevuto solo terreno DMEM in quantità equivalente.

Le piastre contenenti le colture cellulari sono state incubate per periodi variabili da 0 a 72 ore e la proliferazione di cellule è stata valutata ogni 24 ore. Il terreno di coltura, da solo o contenente SEQ ID NO. 2, è stato aspirato da ciascun pozzetto e sostituito con nuovo terreno da solo o con terreno contenente le medesime concentrazioni di SEQ ID NO. 2 (10<‘7>M e IO<"9>M) ogni 48 ore di incubazione.

Tutti i passaggi sperimentali sono stati ripetuti in 8 pozzetti, allestititi in duplicato e tutti gli esperimenti sono stati ripetuti almeno 3 volte.

La proliferazione è stata determinata usando un metodo colorimetrico (Mosmann, J Immunol Methods, 65:55, 1983), nel quale l’intensità del colore è proporzionale al numero di cellule vitali; [3-(4,5-dimetiltiazo-2-yl)-2.5-difenil tetrazoliobromuro] (MTT) è un sale tetrazolio che viene ridotto a formazano, di colore blu, per l’azione catalitica degli enzimi delle cellule metabolicamente attive. 25μ1 di soluzione MTT sono stati aggiunti ai pozzetti di cultura. Le piastre sono state incubate a 37°C per 3 ore. Dopo incubazione, il mezzo di cultura è stato rimosso per aspirazione e sostituito con 200 μΐ di dimetil solfossido per solubilizzare il formazano. La solubilizzazione del formazano è stata completata usando un agitatore per piastre per 10 min. L’assorbanza di ogni pozzetto è stata determinata con un spettrofotometro Titertek multiscan (Flow) con filtro 540 nm.

Come illustra la tavola 3, la proliferazione di fibroblasti incubati con SEQ ID NO. 2 è stata significativamente inferiore rispetto a quella di fibroblasti incubati in terreno senza il peptide. Gli asterischi indicano significatività statistica verso il controllo con valore di probabilità (p) <0.01.

Esempio 5 - Effetto inibitorio di SEQ ID NO. 2 sulla chemiotassi dei neutrofili indotta da interleuchina 8

La infiltrazione di neutrofili è una componente essenziale delle malattie infiammatorie e in particolare della flogosi che si accompagna alle infezioni microbiche. L’inibizione della chemiotassi è un requisito fondamentale per i composti anti-infiammatori.

La chemiotassi dei neutrofili è stata valutata con un metodo standard, utilizzato nella maggior parte degli studi di questo tipo, ossia utilizzando neutrofili umani radiomarcati con cromo radioattivo (<51>Cr) e camere di chemiotassi a filtro singolo. La chemochina interleuchina 8 ricombinante (Genzyme, Boston, MA) è stata utilizzata come chemioattrattante a concentrazioni rispettivamente di 5 x IO<'11>M sopra il filtro e 5 xlO<"8>M sotto il filtro. SEQ ID NO. 2 è stato aggiunto sopra al filtro a concentrazioni da IO<"9>a IO<"5>.

Come dimostrano i dati riportati in tavola 4, l’aggiunta del peptide ha significativamente ridotto la migrazione dei neutrofili attraverso il filtro.

Esempio 6 - Effetto candidacida di SEQ ID NO. 2

L’effetto candidacida del peptide SEQ ID NO. 2 è stato valutato mediante misurazione del numero di unità formanti colonie in piastre di agar. Detto metodo è stato selezionato anziché quello standard di microdiluizione in brodo per poter individuare anche piccole modificazioni del numero di microorganismi vitali. I microrganismi selezionati sono ceppi di Candida albicans, ottenuti daH’American Type Culture Collection (ATCC) ed aventi numero di deposito No. 76615 e No. 24433. Detti ceppi sono in vendita al pubblico e fomiti a chiunque ne faccia richiesta. Le cellule di Candida albicans sono state mantenute in anse di agar Sabouraud e trasferite periodicamente in piastre di agar Sabouraud e incubate per 48 ore a 28°C. Per preparare lieviti in fase di crescita lineare, una colonia veniva prelevata dalla piastra di agar e trasferita in 5 mi di brodo Sabouraud-destrosio incubato per 48 h at 32°C. Le cellule venivano centrifugate a 1,000 x g per 10 minuti e il fondello veniva lavato due volte con acqua distillata. Le cellule venivano contate e risospese in acqua distillata in modo da ottenere una densità di IO<7>cellule di lievito/ml. La vitalità, determinata con esclusione del blu di metilene allo 0.01 %, era costantemente > 98%.

Alle provette contenenti cellule di Candida lxlO<6>in 100 μΐ di acqua distillata sono stati aggiunti concentrazioni di SEQ ID NO. 2 di IO<'7>e IO<-4>M disciolti in 100 μΐ di acqua distillata. Alle provette controllo sono stati aggiunti 100 μΐ di acqua distillata. Tutti i test sono stati condotti in triplicato. Dopo 2 ore di incubazione a 37°C, la sospensione di Candida da ciascuna provetta è stata diluita con acqua distillata in modo da ottenere all’incirca 100 organismi/ml nel controllo. Una aliquota da un mi da ciascuna provetta è stata dispensata in piastre di agar sangue incubate per 48 h at 37°C per contare il numero di unità formanti colonie (CFU). La vitalità dei lieviti è stata stimata come numero di CFU in ciascuna piastra.

I risultati, illustrati nella allegata tavola 5, indicano che SEQ ID NO. 2 riduce efficacemente la vitalità del fungo patogeno rappresentativo Candida albicans.

Claims (18)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un peptide avente una sequenza scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO. da 2 a 16.
2. 2. Il peptide secondo la rivendicazione 1, in cui la sequenza è SEQ ID NO. 2.
3. 3. Un agente veicolante comprendente sequenze peptidiche secondo la rivendicazione 1 o 2.
4. 4. Una composizione comprendente almeno un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2.
5. 5. Un agente veicolante comprendente una composizione secondo la rivendicazione 4.
6. 6. Il peptide secondo la rivendicazione 1 o 2 per uso come medicamento.
7. 7. L’agente veicolante secondo la rivendicazioni 3 per uso come medicamento.
8. 8. La composizione secondo la rivendicazione 4 per uso come medicamento.
9. 9. L’agente veicolante secondo la rivendicazione 5 per uso come medicamento.
10. 10. Uso di un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2 per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento di patologie in cui infiammazioni sono coinvolte.
11. 11. Uso di un peptide secondo la rivendicazione 1 o 2, per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento di patologie fibroproliferative.
12. 12. L’uso secondo la rivendicazione 11, in cui la patologia fibroproliferativa è la fibrosi.
13. 13. L’uso secondo la rivendicazione 11, in cui la patologia fibroproliferativa è la poliposi.
14. 14. Uso di un peptide avente la sequenza scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO. da 1 a 16 per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento delle infezioni microbiche.
15. 15. L’uso secondo la rivendicazione 14, in cui le infezioni microbiche sono batteriche.
16. 16. L’uso secondo la rivendicazione 14, in cui le infezioni microbiche sono micotiche.
17. 17. L’uso secondo la rivendicazione 16, in cui le infezioni micotiche sono dovute ad una infezione di C. albicans.
18. 18. Uso di un peptide avente la sequenza scelta dal gruppo che consiste da SEQ ID NO. da 1 a 16 per la preparazione di un medicamento per la profilassi e/o l’arresto e/o il trattamento di infezioni microbiche e che contemporaneamente è un anti-infiammatorio.