KR101233073B1

KR101233073B1 - 백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 암세포의 전이 억제 활성을 갖는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101233073B1
Application number: KR1020110003663A
Authority: KR
Inventors: 한장희; 김민서
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2013-02-14
Also published as: KR20120082269A

Abstract

본 발명은 막횡단 단백질의 일종인 CD300LG에서 유래한 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물; 및 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

Description

백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 암세포의 전이 억제 활성을 갖는 펩타이드를 포함하는 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and metastasis of cancer cells}

본 발명은 CD300LG(nepmucin)에서 유래한 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물; 및 암전이(cancer metastasis) 억제용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 펩타이드는 백혈구의 혈관외유출 억제 활성 및 암세포의 전이 억제 활성을 갖는다.

감염, 외상 등에 의해 손상된 조직의 구조와 기능을 복원하기 위한 생체의 방어 반응을 통칭하여 염증 반응이라 한다. 염증 부위로의 백혈구 세포의 이동(mobilization)은 감염에 대한 신속한 해결(resolution) 및 다양한 외상으로부터 발생하는 조직 손상을 복구하는데 중요하다. 그러나, 잘못되거나 지속적인 염증 반응은 인체 조직의 손상과 질환을 야기한다. 예를 들어, 염증 질환은 뇌척수막염, 장염, 피부염, 포도막염, 뇌염, 성인성 호흡곤란 증후군 등과 같이 세균이나 바이러스에 의한 감염이나, 외상, 자가면역질환과 장기이식 거부 등과 같은 비감염 요인에 의하여 발생한다. 염증 질환은 증상이나 병리학적 특징이 구분되는 급성 및 만성 염증 질환으로 분류된다. 알레르기나 세균과 바이러스의 감염과 같은 급성 염증의 국소적 증상은 혈류 및 혈관 크기의 변화, 혈관 투과성의 변화 및 백혈구의 침윤 등으로 나타난다. 이에 반하여 류마티스 관절염, 죽상 동맥경화증. 만성 신장염, 간경화증 등을 비롯한 만성 염증의 주요 병리학적 특징은 염증 유발 요인이 제거가 되지 않아 염증부위로 단핵구, 호중구, 림프구, 형질세포들이 지속적으로 침윤하는 것으로, 그 결과 염증 반응이 만성화된다.

염증 반응이 일어나기 위하여서는 백혈구의 염증 부위로의 침윤이 필수적이며, 이는 여러 세포 유착 분자들(cell adhesion molecules)이 관여하는 단계를 포함한다. 즉, 염증 부위에서 분비되는 케모카인(chemokine)의 유도에 의하여 염증부위의 혈관으로 이동한 백혈구들이 이동속도를 줄이면서 혈관 내피 세포 표면에서 회전하는 단계 (Rolling stage), 백혈구들이 회전을 멈추고 내피세포벽에 견고히 부착하는 단계 (Adhesion stage), 모세혈관과 바닥막을 침윤하는 단계 (Transmigration stage)로 구분할 수 있다. 상기 마지막 단계 즉 침윤하는 단계(Transmigration stage)는 혈구누출(diapedesis)로 지칭된다.

발암원(carcinogen)에 의해 변화된 암세포는 정상세포보다 빠르게 증식을 하며 종양(tumors) 덩어리를 형성하고, 주변의 조직에 침투하며 정상적인 신체 기능을 저해한다. 암세포는 혈관신생을 유도함으로써, 영양분과 산소를 공급받을 뿐 아니라, 혈관신생에 의해 암세포가 전이되게 된다. 암세포는 특정부위에서 무한 성장을 할 뿐만 아니라, 기존의 성장부위를 이탈하여 새로운 부위로 이동하여 성장을 하는데 이러한 과정을 전이(metastasis)라고 한다. 전이과정은 암세포가 이동성이 높은 중간엽성 세포로 변화하여 기존 조직에서 이탈하는 단계, 주위 결합조직과 모세혈관을 침윤하고 이동하는 단계, 혈관 내에서 이동한 후 혈관 밖으로 유출하는 단계, 결합조직 내에서의 이동 및 새로운 부위에서의 성장단계 등으로 구분할 수 있다.

종양세포의 전이과정에서 세포유착분자의 세포표면 발현과 활성화 조절은 매우 중요한 역할을 한다 (Zetter, B. R. (1993). Adhesion molecules in tumor metastasis. Semin Cancer Biol. 4: 219). 종양세포의 전이 과정은 세포유착물질의 세포면 발현 형태나 활성도의 조절을 통하여 이루어지며, 전이현상의 온전한 이해를 위해서는 세포 유착 분자들뿐만 아니라 이들의 발현과 기능을 조절하는 물질에 대한 이해가 필수적이다. (Bailly, M., Yan, L., Whitesides, G. M., Condeelis, J. S., and Segall, J. E. (1998). regulation of Protusion Shape and Adhesion to the sustratum during chemoacic esponses of mammalian carcinoma cells. Exp Cell Res. 241: 285; Frisch, S. M., Vuori, K., Ruoslahti, E., and Chan-Hui., P. (1996). Control of adhesion-dependent cell survival by focal adhesion kinase. J Cell Biol 134: 793; 및 Hannigan, G. E., Leung-Hagesteijn, C. , Fitz-Gibbon, L., Coppolino, M. G., Radeva, G., Filmus, J., Bell, J. C., and Dedhar, S. (1996). Regulation of cell adhesion and anchorage-dependent growth by a new β1-integrin-linked protein kinase. Nature 379: 91).

한편, CD300LG는 Ig 영역이 포함된 동종 유착분자로서. 특히 혈관내피세포 접경부위의 소포에 발현되어 림프구의 혈관외유출에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Jin S, Umemoto E, Tanaka T, Shimomura Y, Tohya K, Kunizawa K, Yang BG, Jang MH, Hirata T, Miyasaka M. 2008. Nepmucin/CLM-9, an Ig domain-containing sialomucin in vascular endothelial cells, promotes lymphocyte transendothelial migration in vitro. FEBS Lett. 582:3018).

본 발명자들은 CD300LG로부터 유래된 특정 서열을 갖는 펩타이드 단편(peptide fragment 또는 small peptide)이 백혈구의 혈관외 유출을 억제함으로써 염증 반응을 억제할 수 있으며, 또한 암세포의 혈관외유출을 억제함으로써 암세포의 전이를 억제할 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 CD300LG로부터 유래된 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 CD300LG로부터 유래된 특정 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암전이(cancer metastasis) 억제용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암전이(cancer metastasis) 억제용 약학 조성물이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물에 유효성분으로 함유되는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드이다.

본 발명의 펩타이드, 즉 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드는 백혈구의 혈관외유출을 억제함으로써, 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 암세포의 혈관외유출을 억제함으로써, 암세포의 전이 억제 즉, 암전이 억제용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 생쥐 단핵구 세포주 WEHI293에 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, WEHI247.1 세포의 혈관외 유출도를 측정한 결과이다.
도 2는 생쥐 루이스 폐암종 세포주 LLC-1에 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때, LLC-1 세포의 혈관외 유출도를 측정한 결과이다.

본 명세서에서, "염증" 또는 "염증 질환"이라 함은 급성 및/또는 만성 염증 질환을 포함하며, 예를 들면, 류마티스성관절염(rheumatoid arthritis), 유착관절낭염(adhesive capsulitis), 윤활막염(sinovitis), 고관절염(coxarthritis), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 관절주위염(periarthritis), 다발성경화증(multiple sclerosis), 골수염(osteomyelitis), 전신홍반성낭창(systemic lupus erythematosus), 류마티스성다발근육통(polymyalgia rheumatica, PMR), 소그렌증후군(Sjogren's Syndrome), 진행성전신경화증(progressive systemic sclerosis, scleroderma), 강직척추염(ankylosing spondylitis), 다발근육염(polymyositis), 피부근육염(dermatomyositis), 천포창(pemphigus), 유사천포창(pemphigoid), 제1형 당뇨병(Type I diabetes mellitus), 중증근육무력증(myasthenia gravis), 하시모도갑상선염(Hashimoto's thyroditis), 그레이브스병(Graves' disease), 그드페스추어증후군(Goodpasture's disease), 혼합결합조직병(mixed connective tissue disease), 경화쓸개관염(sclerosing cholangitis), 크론병(Crohn's Disease)이나 궤양성대장염(ulcerative colitis)과 같은 염증성창자병(inflammatory bowel disease), 염증성피부병(inflammatory dermatoses), 간질성폐렴(usual interstitial pneumonitis, UIP), 림프성간질폐렴(lymphoid interstitial pneumonia), 거대세포간질폐렴(giant cell interstitial pneumonia), 세포성간질폐렴(cellular interstitial pneumonia), 호흡결핵박리성간질폐렴(desquamative interstitial pneumonia) 석면증(asbestosis), 규폐증(silicosis), 베림륨중독증(berylliosis), 활석증(talcosis), 진폐병(pneumoconiosis), 성인성호흡곤란증후군(Adult Respiratory Distress Syndrome), 외인성알레르기폐포염(extrinsic allergic alveolitis) 등을 비롯한 염증성호흡기도질환(inflammatory respiratory diseases), 천식(asthma), 아토피피부염(atopic dermatitis), 알레르기비염(allergic rhinitis), 음식 알레르기(food allergy)와 같은 즉시과민반응(immediate hypersensitivity reactions), 사코이드병(sarcoidosis), 베게너육아종(Wegener's granulomatosis), 다양한 혈관염(angiitis), 만성활동간염(chronic active hepatitis), 옻과민반응(poison ivy dermatitis)과 같은 지연형과민증(delayed-type hypersensitivity reactions), 건선관절염(psoriatic arthritis), 라이터증후군(Reiter's syndrome), 류마티스열(rheumatic fever), 급성 또는 만성 사구체신염(acute or chronic glomerulonephritis), 급성증오(acute exacerbations), 신우신염(pyelonephritis), 연조직염(cellulitis), 방광염(cystitis), 급성담관염(acute cholecystitis), 염증성동맥류(inflammatory aortic aneurysm), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 스틸씨병(Still's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 염증 질환을 수반하는 질환, 예를 들어 재관류손상(reperfusion injury), 자가면역질환(autoimmune diseases), 조직이식 거부반응(organ transplantation rejection or tissue allograft organ rejection) 등의 환자에게도 투여될 수 있으므로, 본 명세서에서 상기 "염증" 또는 "염증 질환"은 상기한 염증 질환을 수반하는 질환을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 펩타이드는 상기 염증 질환 중 바람직하게는 류마티스성관절염, 골다공증, 호흡기도염증, 자가면역질환, 및/또는 조직이식 거부반응에 적용될 수 있으며, 특히 바람직하게는 류마티스성관절염, 자가면역질환, 및/또는 조직이식 거부반응에 적용될 수 있다.

본 발명자들은 CD300LG로부터 다양한 길이의 단편을 제조하여, 그 활성을 검색하였다. 놀랍게도, CD300LG로부터 유래한 펩타이드로서, 3개의 아미노산으로 구성된 짧은 길이를 갖는 특정 펩타이드 단편들이 백혈구의 내피세포횡단이동을 억제함으로써 항-염증 활성을 가질 뿐만 아니라, 암세포의 혈관외유출을 억제함으로써, 암세포의 전이 억제 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 상기 펩타이드 단편들은 다음 표 1과 같다.

펩타이드명칭	서열번호	아미노산 서열
CD300LG-pep1	서열번호 1	Cys-Thr-Tyr
CD300LG-pep2	서열번호 2	His-Arg-Lys
CD300LG-pep3	서열번호 3	Gln-Glu-Leu

따라서, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암전이(cancer metastasis) 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 유효성분으로 함유되는 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 락토즈, 옥수수전분 등의 부형제, 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제, 공지되어 사용가능한 유화제, 현탁제, 완충제, 등장화제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태가 될 수 있으며, 용액제의 형태로 국소적으로 환자의 근육내 혈류에 도입할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 염증 질환을 앓고 있는 환자; 혹은 유방암, 위암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암을 비롯한 다양한 고형암 또는 골수성 백혈병(lymphoma) 등을 앓고 있는 환자에게 1일 약 1 내지 2000 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 환자의 연령, 체중 및 증상에 따라 일반적으로 변경될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 펩타이드의 합성

서열번호 1 내지 3의 펩타이드(상기 표 1 참조)는 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)을 이용하여 FMOC solid-phase method로 합성하였다. 합성된 펩타이드는 C18 analytical RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.

실시예 2. 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조

서열번호 1 내지 3의 펩타이드를 인산완충식염수(PBS)에 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 PBS로 희석하여 하기 시험예에서 사용하였다.

시험예 1. 단핵구의 시험관 내( in vitro ) 혈관외유출 억제 시험

생쥐 뇌내피세포인 bEND3 (ATCC사, 미국)를 보이덴 챔버(Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 1 내지 3의 펩타이드 용액(100 μM)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 생쥐 단핵구 WEHI247.1 (ATCC사, 미국)를 각 처리구에 5 x 10⁵ 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민 C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 단핵구의 침윤을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 5회 반복하였으며, 결과는 도 1과 같다. 도 1에서 Control(대조군)은 펩타이드 용액으로 전처리하지 않은 생쥐 단핵구 WEHI247.1를 5 x 10⁵ 개 가하였다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드를 처리한 경우, 혈관 외로 유출된 단핵구의 갯수가 대조군의 약 60∼80% 수준으로 감소되었다. 백혈구가 혈관을 따라 이동하다가 염증 부위로 이동하기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 염증반응 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.

시험예 2. 암세포의 시험관 내( in vitro ) 혈관외유출 억제능 시험

생쥐 뇌내피세포인 bEND3를 보이덴 챔버(Boyden chamber)의 위칸에서 배양하였다. 배양 상층액을 제거하고, 실시예 2에서 제조한 서열번호 1 내지 3의 펩타이드 용액(100 μM)으로 1시간 동안 전처리하거나 전처리하지 않은 생쥐 루이스 폐암종 세포주 LLC-1 (ATCC사, 미국)을 각 처리구에 5 x 10⁵ 개씩 가하였다. 이때 아래칸에는 생쥐 섬유모세포인 NIH/3T3를 0.005% 비타민 C와 0.1% 소혈청알부민이 첨가된 DMEM 무혈청배지에서 16시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 상등액이 포함된 배양액을 넣어서 폐암 세포의 혈관외유출을 유도하였다. 6 시간 동안 배양하면서 아래칸으로 침윤하여 이동한 세포수를 측정하였다. 상기 시험은 3회 이상 반복하였으며, 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 Control(대조군)은 펩타이드 용액으로 전처리하지 않은 생쥐 루이스 폐암종 세포주 LLC-1를 5 x 10⁵ 개 가하였다.

도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 처리한 경우, 생쥐 폐암 세포의 혈관외 유출이 대조군의 약 85 내지 90% 수준으로 억제되었다. 혈관 내로 침윤한 암세포가 혈관을 따라 이동하다가 장기로 전이되기 위해서는 혈관 밖으로 유출되는 과정이 수반됨을 감안할 때, 본 발명의 펩타이드는 효과적인 암세포 전이 억제 활성을 가질 것으로 기대된다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition comprising peptide having inhibitory activities against transendothelial migration of leucocytes and metastasis of cancer cells <130> PN0454 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 1 Cys Thr Tyr 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 2 His Arg Lys 1 <210> 3 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 3 Gln Glu Leu 1

Claims

서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.