CN114106097B

CN114106097B - 用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用

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Publication number: CN114106097B
Application number: CN202111403239.XA
Authority: CN
Inventors: 叶昕; 李勇; 童晓梅; 祁丹丹
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2021-11-24
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2041-11-24
Also published as: CN114106097A

Abstract

本发明公开了用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用。本发明保护的多肽：(a1)序列表的序列3所示的多肽(DCN‑P#3多肽)；(a2)序列表的序列4所示的多肽(DCN‑P#4多肽)；(a3)序列表的序列5所示的多肽(DCN‑P#5多肽)；(a4)序列表的序列1所示的多肽(DCN‑P#1多肽)；(a5)序列表的序列2所示的多肽(DCN‑P#2多肽)。本发明还保护以上任一所述多肽在制备抑制肝癌细胞的药物中的应用。本发明还保护以上任一所述多肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明提供的多肽，对于肝癌细胞增殖具有显著的抑制作用，并且在动物试验中可以有效抑制肿瘤增长。本发明对于肝癌治疗具有重大的应用推广价值。

Description

用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是由肝炎病毒感染引起的消化系统常见恶性肿瘤之一，它在全球范围内普遍存在，严重威胁着人类健康和社会经济发展。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是导致HCC的关键因素，其持续性感染还会引起肝硬化、肝功能衰竭等一系列疾病。在2015年，全球大约有2.57亿人感染慢性乙型肝炎病毒，导致近100万人死亡。

Decorin(DCN)是具有多种生物活性的细胞外基质重要组分之一，目前已有大量研究证明DCN在肿瘤发生发展中具有重要作用。DCN能够与多种细胞因子及细胞膜受体发生相互作用，在肿瘤的发生及转移中扮演着重要角色。

MET是肝细胞生长因子(HGF)的受体酪氨酸激酶，MET与HGF结合可以激活参与肿瘤发生和转移的RAS-MAPK和PI3K-AKT信号传导途径。

发明内容

本发明的目的是提供用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用。

本发明保护的多肽，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：

(a1)序列表的序列3所示的多肽(DCN-P#3多肽)；

(a2)序列表的序列4所示的多肽(DCN-P#4多肽)；

(a3)序列表的序列5所示的多肽(DCN-P#5多肽)；

(a4)序列表的序列1所示的多肽(DCN-P#1多肽)；

(a5)序列表的序列2所示的多肽(DCN-P#2多肽)。

本发明还保护以上任一所述多肽在制备抑制肝癌细胞的药物中的应用。

本发明还保护以上任一所述多肽在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

本发明还保护以上任一所述多肽在制备抑制肝癌肿瘤增长的药物中的应用。

本发明还保护以上任一所述多肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。

本发明还保护一种抑制肝癌细胞的药物，其活性成分为以上任一所述多肽。

本发明还保护一种抑制肝癌细胞增殖的药物，其活性成分为以上任一所述多肽。

本发明还保护一种抑制肝癌肿瘤增长的药物，其活性成分为以上任一所述多肽。

本发明还保护一种治疗肝癌的药物，其活性成分为以上任一所述多肽。

具体的，以上任一所述肝癌为肝细胞癌。

本发明提供的多肽，对于肝癌细胞增殖具有显著的抑制作用，并且在动物试验中可以有效抑制肿瘤增长。本发明对于肝癌治疗具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为5条多肽片段的结构式意图。

图2为5条多肽片段的空间结合示意图。

图3为实施例3中的吸光度结果和细胞增殖抑制率结果。

图4为实施例4的结果(DCN-P#3多肽对移植瘤裸鼠肿瘤生长的抑制效果)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。HepG2细胞：人肝癌细胞。

如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、基于机器学习模型及分子对接筛选抗肿瘤多肽

基于DCN蛋白序列构建虚拟肽库(虚拟肽库包括14983条多肽片段，多肽片段由5-50个氨基酸残基组成)，采用CancerGram模型进行对该虚拟肽库进行初步筛选，获得具有潜在抗肿瘤活性的多肽片段(47条)。

以“MET”为关键词搜索PDB数据库，并根据筛选规则获得晶体结构，PDB编号为1SHY，分辨率为根据Anchor识别的HGF与MET结合关键氨基酸(ASP127，ARG191,ARG218)定义活性位点，半径为/>位点的三维坐标位置为-3.98,21.35,26.88。将上述获得的47条具有潜在抗肿瘤活性的多肽片段进行对接(利用DS 2.5中的LibDock方法)，筛选获得5条具有结合MET能力的多肽片段，作为进一步筛选得到的具有潜在抗肿瘤活性的多肽片段。

5条多肽片段的评分表见表1。

5条多肽片段的结构式意图见图1，空间结合示意图见图2。

表1

	分子对接打分	ACP
			DCN-P#1	158.232	0.941
DCN-P#2	141.981	0.986
			DCN-P#3	130.966	0.998
DCN-P#4	166.854	0.851
			DCN-P#5	133.694	0.978

实施例2、制备5种多肽

人工合成5种多肽。

五种多肽以及相应的氨基酸序列如下：

DCN-P#1多肽(序列表的序列1)：AQVSWAGPF；

DCN-P#2多肽(序列表的序列2)：KISKVSP；

DCN-P#3多肽(序列表的序列3)：NLAKLGL；

DCN-P#4多肽(序列表的序列4)：QRGLFDF；

DCN-P#5多肽(序列表的序列5)：LLLLAQ。

实施例3、MTT法检测多肽对HepG2细胞活力的影响

供试药物分别为：实施例2制备的DCN-P#1多肽、DCN-P#2多肽、DCN-P#3多肽、DCN-P#4多肽或DCN-P#5多肽。

细胞培养在5％CO₂、37℃培养箱中进行。

1、将对数生长期的HepG2细胞接种至96孔板(1600个细胞/孔)，采用含10％FBS的高糖DMEM培养液(100μL/孔)培养24h。此时，在显微镜下可以观察到细胞贴壁并且生长良好。

2、分组培养

低剂量试验组：完成步骤1后，弃除上清，每孔加入150μL含10μg/ml供试药物和10％FBS的高糖DMEM培养液，然后培养。

中剂量试验组：完成步骤1后，弃除上清，每孔加入150μL含100μg/ml供试药物和10％FBS的高糖DMEM培养液，然后培养。

高剂量试验组：完成步骤1后，弃除上清，每孔加入150μL含200μg/ml供试药物和10％FBS的高糖DMEM培养液，然后培养。

空白对照组(Control组)：完成步骤1后，弃除上清，每孔加入150μL含10％FBS的高糖DMEM培养液，然后培养。

阳性对照组(Crizotinib)：完成步骤1后，弃除上清，每孔加入150μL含100nM克唑替尼和10％FBS的高糖DMEM培养液，然后培养。

试验组和阳性对照组统称为药物组。

3、完成步骤2后，弃除上清，每孔加入100μL 5mg/ml MTT溶液，孵育4h，然后弃除上清，然后每孔加入150μL DMSO并震荡以溶解蓝紫色结晶，然后采用酶标仪492nm检测溶液的吸光度(A)。

细胞增殖抑制率(％)＝(空白对照组的平均吸光度值-药物组的平均吸光度值)/空白对照组的平均吸光度值×100％。

步骤2中的培养时间分别设置为：0h、24h、48h或72h。

每个处理组的每个培养时间至少设置三个重复，结果取平均值。

吸光度结果和细胞增殖抑制率结果见图3。

高剂量试验组的细胞增殖抑制率结果见表2。

表2

根据空白对照组的吸光度可以看出，虽然各组细胞的初始细胞数有差异，但各组细胞在24-72h内均以对数增长趋势进行生长，因此判断细胞状态良好、实验结果可信。

与空白对照组相比，试验组随着多肽给药浓度的增加，肿瘤细胞增长的速率减慢，说明多肽对HepG2的生长具有抑制作用。DCN-P#3多肽的效果最佳。

实施例4、DCN-P#3多肽对HepG2细胞移植瘤裸鼠肿瘤生长的影响

试验动物为BALB/c-nunu裸鼠(维通利华BALB/c雄性裸鼠)，四周龄。

1、用PBS缓冲液悬浮HepG2细胞，得到1×10⁷个细胞/mL的细胞悬液。

2、取试验动物，背部皮下接种步骤1制备的细胞悬液(0.1mL细胞悬液/只)，正常饲养，3天后可以观察到试验动物背部发生肿瘤且肿瘤体积为10mm³以上。

3、完成步骤2后，将背部发生肿瘤且肿瘤体积为10mm³以上的试验动物分为3组，进行分组处理。

荷瘤对照组(Control组)：腹腔注射PBS缓冲液(每次每只试验动物注射0.1ml)；

克唑替尼组(Crizotinib组)：灌胃给药克唑替尼，克唑替尼的单次给药剂量为50mg药物/kg体重；

DCN-P#3多肽组(DCN-P#3组)：腹腔注射DCN-P#3多肽溶液(DCN-P#3多肽溶液是将DCN-P#3多肽溶于PBS缓冲液得到的，每次每只试验动物注射0.1ml；DCN-P#3多肽的单次给药剂量为5mg/kg体重)。

每天给药一次，连续给药21天。

克唑替尼组和DCN-P#3多肽组统称为试验组。

从分组处理开始，每2天记录试验动物体重并测量肿瘤体积。肿瘤体积变化见图4的A(横坐标为给药天数，纵坐标为各组试验动物的肿瘤体积的平均值)。试验动物的体重变化见图4的B(横坐标为给药天数，纵坐标为各组试验动物的体重的平均值)。给药6天时各组之间肿瘤生长没有显著性差异；给药8天时荷瘤对照组肿瘤体积最大，克唑替尼组与DCN-P#3多肽组肿瘤体积稍小；给药第10天时，荷瘤对照组肿瘤体积急剧增加，克唑替尼组与DCN-P#3多肽组肿瘤体积明显较小。

完成最后一次给药的当晚禁食不禁水，第二天断颈椎处死裸鼠，剥离肿瘤组织，测量肿瘤体积(用游标卡尺测量肿瘤的最长径和最短径，从而计算肿瘤体积)。肿瘤体积＝a×b²×1/2(a为最长径，b为最短径)。各组肿瘤体积比较见图4的C。抑制率＝(荷瘤对照组平均肿瘤体积-试验组平均肿瘤体积)/荷瘤对照组平均肿瘤体积×100％。与荷瘤对照组相比，克唑替尼组与DCN-P#3多肽组肿瘤体积受到显著抑制(P<0.0001)，克唑替尼对肿瘤体积的抑制率为82.13±6.364％，DCN-P#3多肽对肿瘤体积的抑制率为81.35±7.963％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 用于治疗肝细胞癌的多肽及其应用

<130> GNCYX213191

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Gln Val Ser Trp Ala Gly Pro Phe

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Ile Ser Lys Val Ser Pro

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Asn Leu Ala Lys Leu Gly Leu

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Arg Gly Leu Phe Asp Phe

1 5

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Leu Leu Leu Ala Gln

1 5

Claims

1.多肽，为序列表的序列3所示的多肽。

2.权利要求1所述多肽在制备抑制肝癌细胞的药物中的应用。

3.权利要求1所述多肽在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。

4.权利要求1所述多肽在制备抑制肝癌肿瘤增长的药物中的应用。

5.权利要求1所述多肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。

6.一种抑制肝癌细胞的药物，其活性成分为权利要求1所述多肽。

7.一种抑制肝癌细胞增殖的药物，其活性成分为权利要求1所述多肽。

8.一种抑制肝癌肿瘤增长的药物，其活性成分为权利要求1所述多肽。

9.一种治疗肝癌的药物，其活性成分为权利要求1所述多肽。

10.如权利要求2至5中任一所述的应用，其特征在于：所述肝癌为肝细胞癌。