CN102232082B

CN102232082B - 具有抗肿瘤活性的九肽

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Publication number: CN102232082B
Application number: CN200980147514.7A
Authority: CN
Inventors: 邦特·艾瑞卡·浩格; 约翰·阿蒙德·艾里克森; 约翰·希谷尔德·斯万德森; 欧斯汀·瑞克德尔
Original assignee: Lytix Biopharma AS
Current assignee: Lytix Biopharma AS
Priority date: 2008-11-26
Filing date: 2009-09-11
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2029-09-11
Also published as: DK2402364T3; EP2402364B1; ES2733129T3; US20110318364A1; JP2012509914A; KR20140084355A; CN103304631A; CA2743986C; AU2009319454B2; PL2402364T3; WO2010060497A1; US20160176923A1; US9241968B2; CA2743986A1; JP2016138112A; EP2402364A2; TR201909522T4; RU2503685C2; BRPI0922832A2; GB0821616D0

Abstract

本发明涉及肽或肽样分子以及它们在治疗中的用途，尤其是作为抗肿瘤剂的用途。

Description

具有抗肿瘤活性的九肽

发明领域

本发明涉及肽或肽样分子以及它们在治疗中的用途，尤其是作为抗肿瘤剂以及作为包括肿瘤疫苗在内的疫苗的佐剂的用途。

发明背景

肽及其衍生物长期以来被认为是治疗方面受关注的分子。多种生物使用肽作为它们的宿主防御机制的一部分。已经从细菌和哺乳动物这样不同的物种中分离了抗微生物肽。通常，这些肽具有净正电荷并且在与细菌细胞膜的外部磷脂双层相互作用时倾向于形成两性的α-螺旋或β-折叠结构。在大多数情况下，抗菌作用的详细分子机制是未知的，但是被分类为L类(溶解)肽的某些肽被认为与细菌细胞膜相互作用，形成离子通道、孔或能破坏膜的稳定性的其它结构。

在一般种类的抗微生物溶解肽中，某些还表现出抗肿瘤活性。肿瘤细胞的真核细胞膜的性质与原核生物细胞膜相似，并且假定这可以提供这些溶解肽在体内对于肿瘤细胞的一定程度的选择性。具有两性特征和净正电荷的肽的一些抗肿瘤活性在WO 00/12542、WO 01/66147、WO01/19852和Yang et al.Journal of Peptide Science[2004]，10，pp 37-46(PMID：14959890)中有描述。通常，抗肿瘤活性需要的肽大于设计用于抗细菌用途的肽。在需要良好的靶细胞毒性和体内选择性之间进行的平衡在产生有用的抗肿瘤肽中造成了特殊的问题，部分原因是在肿瘤细胞和未转化的细胞的细胞膜之间仍存在高度的相似性。然而，人类和动物群体中癌症的盛行和它在死亡率中的作用意味着对能有效对抗肿瘤的新药物存在持续的需求。根除肿瘤或减小肿瘤大小或减少血液或淋巴系统中循环的癌细胞数在很多方面都是有利的：减少疼痛或不适、防止转移、便于手术介入、延长生命。

在研究肽的生物学活性期间，本发明的发明人已经鉴定出了一小组分子，其表现出特别好的对抗一系列癌症类型的活性并且对癌细胞比正常细胞具有良好的选择性。

发明描述

如下文详述，一种分子(LTX-315)是特别优选的，并且因此按照本发明的第一方面，提供了具有SEQ ID NO：23的式的化合物或该化合物的盐、酯或酰胺。

一方面，本发明提供了具有下列特征的化合物，优选为肽：

a)由线性排列的9个氨基酸组成；

b)在那9个氨基酸之中，5个是阳离子性的且4个具有亲脂性R基；

c)所述9个氨基酸中的至少一个是非遗传编码的氨基酸或遗传编码氨基酸的修饰过的衍生物；以及任选地

d)所述亲脂性和阳离子性残基的排列使得不多于两个任一类型的残基彼此相邻；以及还任选地

e)所述分子包含两对相邻的阳离子氨基酸和一对或两对相邻的亲脂性残基。

阳离子氨基酸可以相同或不同，并且优选为赖氨酸或精氨酸，但可以是组氨酸或在pH 7.0时携带正电荷的任何非遗传编码的或修饰过的氨基酸。

合适的非遗传编码的阳离子氨基酸和修饰过的阳离子氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸的类似物，例如高赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二氨基丙酸和高精氨酸以及三甲基赖氨酸和三甲基鸟氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、4-氨基-1-甲脒基哌啶-4-羧酸和4-胍基苯丙氨酸。

亲脂性氨基酸(即具有亲脂性R基的氨基酸)可以相同或不同，并且都具有R基，所述R基具有至少7个非氢原子、优选至少8个或9个、更优选至少10个非氢原子。本文将具有亲脂性R基的氨基酸称为亲脂性氨基酸。通常所述亲脂性R基具有至少一个、优选两个环状基团，所述两个环状基团可以是稠合的或连接的。

所述亲脂性R基可含有诸如O、N或S的杂原子，但通常不多于一个杂原子，优选为氮。该R基优选具有不多于2个极性R基，更优选没有或有一个极性R基，最优选没有极性R基。

色氨酸是优选的亲脂性氨基酸，所述分子优选包含1-3个，更优选包含2或3个，最优选包含3个色氨酸残基。可以并入的其它遗传编码的亲脂性氨基酸是苯丙氨酸和酪氨酸。

优选地，亲脂性氨基酸中的一个是非遗传编码的氨基酸。最优选地，所述分子由3个遗传编码的亲脂性氨基酸、5个遗传编码的阳离子氨基酸和1个非遗传编码的亲脂性氨基酸组成。在本文中，尽管严格来说D氨基酸不是遗传编码的，但是也不将其认为是“非遗传编码的氨基酸”，所述“非遗传编码的氨基酸”不应仅在立体特异性上，而应该是在结构上不同于20个遗传编码的L氨基酸。本发明的分子具有的氨基酸中的一些或全部可以以D型存在，然而优选地，所有的氨基酸都是L型。

当所述分子包含非遗传编码的亲脂性氨基酸(或氨基酸衍生物)时，该氨基酸的R基优选包含不多于35个非氢原子，更优选不多于30个非氢原子，最优选不多于25个非氢原子。

优选的非遗传编码的氨基酸包括：2-氨基-3-(联苯基-4-基)丙酸(联苯丙氨酸)、2-氨基-3，3-二苯基丙酸(二苯丙氨酸)、2-氨基-3-(蒽-9-基)丙酸、2-氨基-3-(萘-2-基)丙酸、2-氨基-3-(萘-1-基)丙酸、2-氨基-3-[1，1′:4′，1″-三联苯基-4-基]-丙酸、2-氨基-3-(2，5，7-三叔丁基-1H-吲哚-3-基)丙酸、2-氨基-3-[1，1′:3′，1″-三联苯基-4-基]-丙酸、2-氨基-3-[1，1′:2′，1″-三联苯基-4-基]-丙酸、2-氨基-3-(4-萘-2-基-苯基)-丙酸、2-氨基-3-(4′-丁基联苯基-4-基)丙酸、2-氨基-3-[1，1′:3′，1″-三联苯基-5′-基]-丙酸和2-氨基-3-(4-(2，2-二苯基乙基)苯基)丙酸。

在优选的实施方案中，本发明的化合物具有下面列出的式I-V之一，其中C代表上文所定义的阳离子氨基酸，L代表上文所定义的亲脂性氨基酸。氨基酸是共价连接的，优选通过肽键共价连接而产生真正的肽，或通过其它连接共价连接而产生拟肽物。可以修饰这些分子的自由氨基或羧基末端，优选对羧基末端进行修饰以去除负电荷，最优选将羧基端酰胺化，该酰胺基可以被取代。

CCLLCCLLC(I)(SEQ ID NO：1)

LCCLLCCLC(II)(SEQ ID NO：2)

CLLCCLLCC(III)(SEQ ID NO：3)

CCLLCLLCC(IV)(SEQ ID NO：4)

CLCCLLCCL(V)(SEQ ID NO：5)

通常，拟肽物的特征在于保留其肽等同物的极性、三维大小和功能性(生物活性)，但是其中肽键已经被替换，通常被更稳定的连接所替换。“稳定”表示对水解酶的酶降解的抗性更强。通常，代替酰胺键的键(酰胺键代替物)保留了酰胺键的许多性质，例如构象、空间体、静电特征、形成氢键的可能性等。″Drug Design and Development(药物设计与开发)″，Krogsgaard，Larsen，Liljefors and Madsen(Eds)1996，Horwood Acad.Pub的第14章提供了设计和合成拟肽物技术的一般性讨论。在本发明的情况下，当分子是与膜而不是酶的特异性活性位点发生反应时，所述的确切模拟亲和力和效力或底物功能的某些问题就不相关了，并且可以基于给定的肽结构或所需官能团的基序容易地制备拟肽物。合适的酰胺键替代物包括以下基团：N-烷基化(Schmidt，R.et al.，Int.J.Peptide Protein Res.，1995，46，47)，逆反(retro-inverse)酰胺(Chorev，M and Goodman，M.，Acc.Chem.Res，1993，26，266)，硫代酰胺(Sherman D.B.and Spatola，A.F.J.Am.Chem.Soc.，1990，112，433)，硫酯、膦酸酯、酮亚甲基(Hoffman，R.V.and Kim，H.O.J.Org.Chem.，1995，60，5107)、羟基亚甲基、氟代乙烯基(Allmendinger，T.et al.，Tetrahydron Lett.，1990，31，7297)，乙烯基、亚甲基氨基(Sasaki，Y andAbe，J.Chem.Pharm.Bull.1997 45，13)，亚甲基硫代(Spatola，A.F.，MethodsNeurosci，1993，13，19)、烷(Lavielle，S.et.al.，Int.J.Peptide Protein Res.，1993，42，270)以及亚磺酰氨基(Luisi，G.et al.Tetrahedron Lett.1993，34，2391)。

本发明的拟肽化合物可具有9个可识别的亚基，所述亚基与9个阳离子氨基酸和亲脂性氨基酸在大小和功能上大致相同。因此，术语“氨基酸”在本文中方便地用于表示拟肽化合物的等同亚基。而且，拟肽物可以具有与氨基酸的R基等同的基团，并且本文中关于合适的R基以及N和C末端修饰基团的讨论可以加以变通应用于拟肽化合物。

正如″Drug Design and Development(药物设计和开发)″，Krogsgaard etal.，1996以及酰胺键的代替中所讨论的，拟肽物可以涉及用二拟肽结构或三拟肽结构代替较大的结构部分，并在这种情况下，涉及肽键的模拟部分，例如唑衍生的模拟物，可以用作二肽代替。然而，如上文所讨论的，仅酰胺键被代替的拟肽物以及拟肽主链是优选的。

合适的拟肽物包括还原的肽，其中通过用诸如硼烷的还原剂或诸如氢化锂铝的氢化物试剂进行处理使酰胺键还原成亚甲基胺。所述还原在增加分子的整体阳离子性中具有增加的优势。

其它拟肽物包括，例如通过酰胺官能化的聚甘氨酸的逐步合成而形成的类肽。某些拟肽主链可以容易地从它们的肽前体获得，例如全甲基化的肽，合适的方法描述于Ostresh，J.M.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91，11138-11142。强碱性条件有助于N-甲基化超过O-甲基化，并导致肽键的某些或全部氮原子和N末端氮的甲基化。

优选的拟肽骨架包括聚酯、聚胺及它们的衍生物以及取代的烷和烯。拟肽物优选具有可以按照本文所讨论进行修饰的N和C末端。

术语“氨基酸”包括β和γ氨基酸以及α氨基酸，还包括N取代的甘氨酸。本发明的化合物包括β肽和酯肽。

如上文所讨论的，本发明的化合物包含至少一个，且优选一个非遗传编码氨基酸。当该残基指定为L′时，优选的化合物由以下式表示：

CCL′LCCLLC(I′)(SEQ ID NO：6)

CCLLCCLL′C(I″)(SEQ ID NO：7)

CCLL′CCLLC(I″′)(SEQ ID NO：8)

LCCLL′CCLC(II′)(SEQ ID NO：9)

特别优选的是式I和II的肽，并且在这些之中，尤其优选式I″的肽。

优选地，所述肽不是LTX-302(SEQ ID NO：11)(下文)。

如表1中所示的以下肽(除了LTX-302之外)是最优选的。

表1

其中：

·标准单字母代码用于遗传编码氨基酸

·小写字母表示D氨基酸

·Dip是二苯丙氨酸

·Bip是联苯丙氨酸

·Orn是鸟氨酸

·Dap是2，3-二氨基丙酸

·Dab是2，4-二氨基丁酸

·1-Nal是1-萘基丙氨酸

·2-Nal是2-萘基丙氨酸

·Ath是2-氨基-3-(蒽-9-基)丙酸

·Phe(4，4′Bip)是2-氨基-3-[1，1′:4′，1″-三联苯基-4-基]丙酸

本文描述的所有分子都可以为盐、酯或酰胺形式。

因此，本发明还提供了选自以下的化合物：LTX-301、LTX-303-LTX-310、LTX-312-LTX-321、LTX-323-LTX-327、LTX-329、LTX-331-LTX-336和LTX-338，或以上化合物的盐、酯或酰胺。因此，本发明提供了具有选自以下的式的化合物：SEQ ID NO：10和12-42，或它们的盐、酯或酰胺。

所述分子优选是肽，且优选具有修饰过的C末端，尤其是酰胺化的C末端。酰胺化的肽本身可以为盐形式，且优选醋酸盐形式。合适的生理学上可接受的盐是本领域公知的，包括无机酸或有机酸的盐，且包括三氟醋酸盐以及醋酸盐和与HCl形成的盐。

本文描述的分子本质上是两性的，它们的二级结构可趋向或可不趋向于形成α-螺旋，并且在生理条件下提供了两性分子。

本发明另一方面提供了用于治疗的，特别是用作抗肿瘤剂或抗癌剂的化合物，具体而言是式I-V的化合物，特别是表1的肽。本文所用的术语抗肿瘤剂或抗癌剂是同义的。

所述化合物表现出抗肿瘤活性；具体而言，它们通过直接影响膜的机制发挥细胞毒性效应。这些分子使细胞膜溶解、破坏细胞膜的稳定性或甚至使细胞膜穿孔。这提供了超过作用于靶细胞的蛋白组分或与靶细胞的蛋白组分相互作用的试剂的明显的治疗优势，所述蛋白组分例如细胞表面受体。突变可以产生靶蛋白的新形式，这导致对于化学治疗的抗性，但是脂膜不大可能发生根本改变而阻止细胞毒性效应。

因此，本发明另一方面提供了用于破坏肿瘤细胞膜的稳定性和/或透化肿瘤细胞膜的化合物。“破坏稳定性”表示干扰正常的脂双层三维构型，包括但不限于使膜变薄、增加膜对水、离子或代谢物等的透过性(通常不涉及通道)。

本发明提供通过给予本文所述各种化合物来治疗肿瘤的方法，包括治疗实体瘤和非实体瘤。给予的量应当能够有效杀死全部或部分的靶细胞或有效防止或降低它们的增殖率，或者有效抑制转移或减轻肿瘤对患者的有害作用。临床医生或患者应当观察到一种或多种肿瘤相关参数或症状的改善。给药也可以是预防性的。患者通常是人类患者，但是也可以治疗诸如驯养动物或家畜的非人动物。

与多数具有蛋白靶标的试剂不同，本发明的分子能靶向于多种癌症，如本文实施例中所示。优选的癌症靶标包括淋巴瘤、白血病、神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤(例如来自脑)、癌和腺癌(特别是来自乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、前列腺和皮肤)和黑素瘤。乳腺癌是特别优选的靶标。

可以通过任何方便的方法来合成本发明的肽。通常，在整个合成期间，存在的反应性基团(例如氨基、巯基和/或羧基)会被保护起来。因此，合成的最终步骤是使本发明的受保护的衍生物脱保护。

在构建肽时，原则上能够从C末端或N末端开始，但是优选从C末端开始。

肽合成的方法是本领域公知的，但对于本发明，在固相载体上进行合成是特别方便的，这样的载体是本领域公知的。

氨基酸的保护基的多种选择是已知的，合适的胺保护基可以包括苄氧羰基(也被指定为Z)、叔丁氧基羰基(也被指定为Boc)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr)和9-芴基甲氧基-羰基(也被指定为Fmoc)。应当理解，当从C末端构建肽时，胺保护基会存在于每个新添加的残基的α-氨基上并需要在接下来的偶联步骤之前被选择性地除去。

例如，可以使用的羧基保护基包括易于裂解的酯基，例如苄基(Bzl)、对硝基苄基(ONb)、或叔丁基(OtBu)以及固体载体上的偶联基团，例如与聚苯乙烯连接的Rink酰胺。

巯基保护基包括对甲氧基苄基(Mob)、三苯甲基(Trt)和乙酰氨甲基(Acm)。

可以使用Lys、Orn、Dab和Dap的胺侧链的叔丁氧基羰基(Boc)保护基以及色氨酸残基的吲哚氮的保护来方便地制备本发明优选的肽。Fmoc可用于保护α-氨基。对于含有Arg的肽，2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基可用于保护胍侧链。

有多种除去胺保护基和羧基保护基的方法。然而，这些方法必须与所用的合成策略相一致。在接下来的偶联步骤之前，侧链保护基在用于除去临时α-氨基保护基的条件下必须是稳定的。

通过用酸处理，例如用三氟乙酸处理，可以将诸如Boc的胺保护基和诸如tBu的羧基保护基同时除去。使用诸如碘的氧化剂可以选择性地除去诸如Trt的巯基保护基。

用于合成本发明的拟肽化合物和其它生物活性分子的参考文献和技术在本文中进行了描述并因此是本领域公知的。

包含本发明的一种或多种化合物与合适的稀释剂、载体或赋形剂的混合物的制剂构成本发明的另一方面。这样的制剂可尤其用于制药(包括兽药)用途。合适的稀释剂、赋形剂和载体是本领域技术人员已知的。

尽管本发明的化合物(或化合物的盐、酯或酰胺)可以作为纯化合物给予，但是优选将它们提供为药物制剂。因此，本发明的制剂优选包含至少一种化合物或上文所述的盐、酯或酰胺、以及至少一种其它的治疗成分。因此，本发明扩展至合并了本发明的化合物(或化合物的盐、酯或酰胺)和至少一种其它的治疗成分的组合产品。

本发明的另一方面是治疗肿瘤的方法，所述方法包括向人类患者或患病动物给予本文定义的一种或多种化合物。

例如，本发明的组合物可以提供为适合于口服给药、局部给药、鼻腔给药、肠胃外给药、静脉内给药、肿瘤内给药、直肠给药或区域给药(例如隔离肢体灌注)的形式。通常通过肠胃外途径给药，优选通过皮下注射、肌内注射、囊内注射、脊柱内注射、肿瘤内注射或静脉内注射。

本文定义的活性化合物可以提供为给药的常规药物形式，例如片剂、包衣片剂、鼻喷雾剂、溶液、乳液、脂质体、粉剂、胶囊剂或缓释形式。常规药物赋形剂以及常规的制备方法可以用于制备这些形式。

还可以使用器官特异性载体系统。

可以按照常规的方式来制备注射液，例如通过添加诸如对羟基苯甲酸酯的防腐剂或诸如EDTA的稳定剂。随后将溶液装入注射小瓶或安瓿。

优选的制剂是肽溶解于盐水中的那些制剂。这类制剂适用于给药的优选方法中，尤其是部位给药，即肿瘤内给药，例如通过注射或对优选隔离的(包括部分隔离)肢体、身体区域或器官进行灌注/输注。

优选地，包含活性分子的剂量单元包含0.1-10mg的抗肿瘤剂，例如1-5mg。药物组合物可以另外包含其它活性成分，包括其它细胞毒性剂，例如其它抗肿瘤肽。其它活性成分可以包括不同类型的细胞因子，例如IFN-γ、TNF、CSF和生长因子、免疫调节剂、诸如顺铂的化疗剂或抗体或癌疫苗。

在系统性使用这样的组合物时，活性分子的量能使生物活性分子的血清水平达到至少约5μg/ml。通常，血清水平不需要超过500μg/ml。优选血清水平为约100μg/ml。可以通过将生物活性分子以1mg/kg至约10mg/kg的剂量合并到将进行系统性给药的组合物中来达到这样的血清水平。通常，给予分子的剂量不需要超过100mg/kg。

本发明还提供了本发明的化合物、盐、酯或酰胺与至少一种疫苗的组合。

如下文详述，实验表明用LTX-315溶解的肿瘤细胞进行预防性疫苗接种导致肿瘤生长抑制，表明本发明的化合物作为疫苗佐剂是高效的，并且因此，本发明扩展至化合物(或化合物的盐、酯或酰胺)与至少一种疫苗的组合用途。优选的疫苗包括但不限于：含有至少一种蛋白和/或肽的抗癌疫苗，所述蛋白和/或肽的氨基酸序列对应于来自肿瘤关联抗原(TAA)的免疫原性序列，所述TAA优选为但不限于端粒酶、存活素、致癌p21ras、abl、gip、gsp、ret、terk；和含有至少一种蛋白和/或肽的抗病毒疫苗，所述蛋白和/或肽的氨基酸序列对应于来自病毒蛋白的免疫原性序列。此外，可以使用肿瘤溶解物。优选疫苗的实例包括WO 92/14756、WO 00/66153(NO 309798)、WO 00/02581、WO 02/051994、WO 02/070679、WO02/094312、WO 99/58552和WO 99/58564所教导的疫苗、肽、肽片段和免疫原。

本发明还提供了本发明的化合物、盐、酯或酰胺或组合在制备药物，尤其在制备用于治疗癌症的药物和/或在制备疫苗中的用途。

优选地，所述药物用于治疗多抗药性(MDR)肿瘤。

本发明还提供了药物包装，包括：

(i)至少一种疫苗；和

(ii)本发明的化合物、盐、酯或酰胺。

对于药物包装，所述至少一种疫苗和所述化合物、盐、酯或酰胺可以分别给药(例如，时间延迟为约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、45、60、90或120分钟，至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、45、60、90或120分钟，或不多于1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、45、60、90或120分钟)。所述药物包装还可以包括给药说明书。

本发明还提供了治疗肿瘤的方法，包括给予有需要的患者药学上有效量的本发明的化合物、盐、酯或酰胺或组合的步骤。

本发明还提供了疫苗接种方法，包括给予患者药学上有效量的本发明的化合物、盐、酯或酰胺或组合的步骤。

本发明还提供了制备药物的方法，包括将具有SEQ ID NO：23的式的化合物(LTX-315)或该化合物的盐、酯或酰胺与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。

本发明还提供了制备药物的方法，包括将具有SEQ ID NO：23的式的化合物(LTX-315)或该化合物的盐、酯或酰胺与肿瘤细胞混合。

附图说明

现通过下面的实施例并参照附图进一步描述本发明，其中

图1显示了在测试不同浓度的肽LTX-315的一系列实验中红细胞死亡的百分比。X轴表示肽浓度(μg/ml)。Y轴表示％细胞死亡。

图2显示了用鼠A20B细胞淋巴瘤细胞再接种的小鼠中的肿瘤生长与来自最初研究的对照动物中的生长的比较。菱形表示来自最初研究中的对照。实心方形表示再接种的小鼠。

图3显示了用鼠A20B细胞淋巴瘤细胞再接种的个体小鼠中的肿瘤生长，所述淋巴瘤细胞最初用LTX-315进行了处理。方形表示小鼠1。三角形(底在下)表示小鼠2。三角形(底在上)表示小鼠3。菱形表示小鼠4。

图4显示了用鼠CT26WT结肠癌细胞再接种的小鼠中的肿瘤生长与对照动物中的生长的比较。菱形表示来自最初研究的对照。实心方形表示再接种的小鼠。

图5显示了用鼠CT26WT结肠癌细胞再接种的个体小鼠中的肿瘤生长，所述结肠癌细胞最初用LTX-315进行了处理。小方形表示小鼠1。小三角形(底在下)表示小鼠2。小三角形(底在上)表示小鼠3。小菱形表示小鼠4。圆形表示小鼠5。大方形表示小鼠6。大三角形(底在下)表示小鼠7。大三角形(底在上)表示小鼠小鼠8。大菱形表示小鼠9。

图6显示了接受了在LTX-315治疗后表现出完全肿瘤退缩的供体小鼠的脾细胞的照射后小鼠中(组1)或接受了空白对照供体小鼠的脾细胞的对照小鼠(组2)中A20B细胞淋巴瘤的生长。方形表示组1(接受了表现出完全退缩的供体的脾细胞的小鼠)。菱形表示组2(接受了空白对照供体的脾细胞的小鼠)。

图7显示了与未治疗对照(组3)相比，两种不同治疗方案对鼠A20实体瘤(组1和2)的抗癌效果。反向实心三角形(底在上)表示组1(治疗)。空心方形表示组2(治疗+佐剂)。空心三角形(底在下)表示组3(对照)。在第21天时，肿瘤大小(mm²)的顺序是(最大至最小)：组3、组1、组2。

实施例

总之，下文的实施例证实了：

实施例1：在对37种人癌细胞系的体外细胞毒性活性研究中，LTX-315是5种受试化合物中最有效的。

实施例2：在对10种淋巴瘤细胞系的体外细胞毒性活性研究中，，LTX-315是5种受试化合物中最有效的。

实施例3：LTX 315对于人红细胞的平均EC₅₀值大于1200μg/ml(833μM)。

实施例4：在研究不同剂量水平的LTX-315对小鼠中的鼠A20B细胞淋巴瘤的效应中，发现在接受最佳剂量的组(组1)中，LTX-315的抗肿瘤活性导致7只治疗小鼠中的3只发生完全的肿瘤反应。

实施例5：四种不同的LTX-315治疗方案表现出对鼠CT26WT(多抗药性)肿瘤的强抗肿瘤效应。

实施例6：LTX-315具有对各种多抗药性癌细胞系的广谱活性，并且特别是对正常人细胞具有非常弱的细胞毒性效应。

实施例7：用LTX-315对鼠实体瘤进行最初治疗后的完全肿瘤退缩导致了在再接种后对相同肿瘤生长的内源性长期保护作用的形成。

实施例8：LTX-315治疗可以通过诱发免疫应答而赋予对具体肿瘤的长期保护。

实施例9：通过注射LTX-315和溶解的A20细胞的混合物诱导了抗A20细胞的免疫应答。

实施例1：5种受试化合物对37种人癌细胞系的体外细胞毒性活性研究

1.研究目的

为了测定5种新化合物对37种人癌细胞系产生50％增殖抑制(IC₅₀)的浓度。

2.材料和方法

2.1.受试物

2.1.1.受试物

受试物：LTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320和LTX-329(参见表1)，以粉末形式提供受试物。

2.1.2.阳性对照

将曲拉通X-100作为阳性对照，其由Sigma(Saint Quentin Fallavier，France)的Oncodesign(Dij on，France)提供。

2.1.3.药物介质和贮存条件

化合物贮存于4℃。首先将粉末溶解在无血清的培养基(RPMI 1640，Lonza，Verviers，Belgium)中，并进一步用无血清的培养基进行稀释，以达到合适的稀释度。母液不进行贮存而是在实验当天新鲜制备。

通过用培养基进行稀释获得1％(终浓度)的曲拉通X-100。

2.2.肿瘤细胞系和培养条件

2.2.1.肿瘤细胞系

购买和由Oncodesign提供癌细胞系和培养基。

a-Pharmacell，Paris

b-ATCC，Manassas，Virginia，USA

2.2.2.培养条件

肿瘤细胞于37℃下潮湿环境中(5％CO₂，95％空气)生长为贴壁的单层或悬液。培养基是含有2mM L-谷氨酰胺(Lonza，Belgium)并补充了10％胎牛血清(FBS，Lonza)的RPMI 1640。为了实验使用，用胰酶-维尔烯(Lonza)处理5分钟，使贴壁细胞从培养瓶脱离，将细胞稀释于无钙或镁的Hanks培养基(Lonza)中，并通过添加完全培养基进行中和。在血细胞计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％的台盼蓝排除实验评价它们的活力。

使用MycoAlert(RTM)支原体检测试剂盒(Lonza)，按照制造商的说明书进行支原体检测。发现所有受试细胞对于支原体污染都是阴性的。

3.实验设计和处理

3.1.细胞系扩增和接种

将肿瘤细胞接种于96孔平底微量滴定板(Nunc，Dutscher，Brumath，France)中，在进行处理之前，细胞在190μl无药物培养基中于37℃孵育24小时，该无药物培养基根据贴壁生长细胞系或悬浮生长细胞系分别补充或未补充10％FBS。

每种细胞系的种植密度总结在下面的表2中：

表2

细胞系	种植密度(细胞/孔)	细胞系	种植密度(细胞/孔)
				CCRF-CEM	25,000	HUV-EC-C	20,000
CCRF-CEM/VLB	25,000	786-O	15,000
				HL-60	20,000	A-498	15,000
HL-60/ADR	20,000	Hep G2	15,000
				K-562	20,000	SK-HEP-1	15,000
K-562/IMR	20,000	A549	15,000
				RPMI 8226	20,000	Calu-6	15,000
SH-SY5Y	20,000	NCI-H460	15,000
				SK-N-AS	15,000	IGROV-1	15,000
U-87MG	15,000	IGROV-1/CDDP	15,000
				MCF-7	20,000	NIH:OVCAR-3	15,000
MCF7/mdr	20,000	SK-OV-3	15,000
				MDA-MB-231	15,000	BxPV-3	15,000
MDA-MB-435S	20,000	PANC-1	15,000
				T-47D	15,000	DU 145	15,000
COLO 205	15,000	PC-3	15,000
				HCT 116	15,000	A-431	15,000
HCT-15	15,000	Malme-3M	15,000
				HT-29	20,000	SK-MEL-2	15,000

3.2.IC₅₀测定

处理之前，用200μl无FBS的培养基洗涤贴壁细胞系。将肿瘤细胞与10个浓度的化合物孵育4小时，化合物按照1/4的稀释步骤，最高剂量为400μM(范围为4×10^-4-4×10^-10M)，以1％(终浓度)曲拉通X-100作为阳性对照，以无FBS的培养基作为阴性对照。细胞(190μl)在终体积200μl的含有受试物的无FBS的培养基中、在37℃、5％CO₂下进行孵育。

进行3次独立的实验，测试的每个浓度有4个平行样。仅用介质处理对照细胞。在处理结束时，通过MTS测定评估细胞毒性活性(参见§3.3.)。

用Sciclone ALH 3000液体处理系统(Caliper Life Sciences S.A.)进行受试化合物的稀释以及向含有细胞的平板的分布。按照自动化使用，无论测试哪种细胞系，都测试单一的浓度范围。所述范围不会对于每种细胞系进行改动。

3.3.MTS测定

通过用新的四唑化合物(MTS，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)和称为PMS(吩嗪硫酸甲酯)的电子耦合试剂的MTS测定(BALTROP J.A.et al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1991，1：611-614)来反映受试物的体外细胞毒性活性。同MTT类似，细胞将MTS生物还原为甲臜产物，该甲臜产物可直接溶于培养基中，而无需处理，这与MTT不同。

在细胞处理结束时，将40μl 0.22μm新鲜过滤的配制在Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Ref 17-513Q，Batch 6MB0152，Cambrex)中的MTS(2mg/ml，20ml，Ref G1111，Batch 235897，Exp 03/2009，Promega，Charbonnières，France)和PMS(0.92mg/ml，1ml，Ref P9625，Batch065K0961，Sigma)的组合溶液添加至每孔。将培养板于37℃孵育2小时。用VICTOR^3TM1420酶标仪(Wallac，PerkinElmer，Courtaboeuf，France)在490nm处测量每孔中的吸光度(OD)。

4.数据表示

4.1.IC₅₀测定

按照以下表示剂量反应增殖抑制(IC)：

OD值是4个实验测量值的平均值。

IC₅₀：获得50％细胞增殖抑制的药物浓度。

用XLFit 3(IDBS，United Kingdom)绘制剂量反应曲线。用XLFit 3软件从半对数曲线计算IC₅₀测定值。生成单个IC₅₀测定值以及平均值和SD值。

4.2.抗性指数(RI)

用下面的公式计算抗性指数：

计算每种化合物对于每一对敏感细胞系和抗性细胞系的抗性指数。当在相同的实验中测定了敏感细胞系和相应的抗性细胞系的IC₅₀值时，计算单个抗性指数。此外，抗性指数也计算为三次独立的实验中获得的平均IC₅₀值的比值。

5.结果

5.1.LTX-302

所有37种受试人肿瘤细胞系对LTX-302化合物都是敏感的，IC₅₀值为4.83±0.96μM(T-47D细胞系)至20.09±4.07μM(Hep G2细胞系)。

在37种肿瘤细胞系上获得的LTX-302化合物的平均IC₅₀值是12.05±4.27μM，中位值为11.70μM。在正常细胞系(HUV-EC-C)上获得的平均IC₅₀值高于所述肿瘤细胞系中的任何一种。

血液学癌细胞系和肺癌细胞系对LTX-302化合物是最敏感的(血液学癌细胞系的中位IC₅₀值为7.96μM(n＝7)，肺癌细胞系的中位IC₅₀值为9.02μM(n＝3))，而肝癌细胞系的抗性最强(中位IC₅₀值为17.84μM，n＝2)。

正如HL-60/ADR和MCF-7/mdr细胞系的RI值(HL-60/ADR细胞系为1.31，MCF-7/mdr细胞系为1.23)所表现的，对阿霉素的获得性抗性似乎稍微降低了LTX-302化合物的活性。相反，正如IGROV-1/CDDP细胞系的0.33的RI值所表现的，对顺铂的获得性抗性似乎增加了LTX-302化合物的活性。

5.2.LTX-313

所有37种受试人肿瘤细胞系对LTX-313化合物都是敏感的，IC₅₀值为4.01±0.39μM(RPMI 8226细胞系)至18.49±4.86μM(U-87MG细胞系)。

在37种肿瘤细胞系上获得的LTX-313化合物的平均IC₅₀值是9.60±3.73μM，中位值为8.83μM。在正常细胞系(HUV-EC-C)上获得的平均IC₅₀值高于所述肿瘤细胞系中的任何一种。

血液学癌细胞系对LTX-313化合物是最敏感的(中位IC₅₀值为7.04μM，n＝7)，而肝癌细胞系的抗性最强(中位IC₅₀值为13.71μM，n＝2)。

正如CCRF-CEM/VLB、HL-60/ADR和MCF-7/mdr细胞系的RI值(CCRF-CEM/VLB细胞系为0.76、HL-60/ADR细胞系为1.16、MCF-7/mdr细胞系为1.24)所表现的，LTX-313化合物的活性似乎不受对阿霉素的获得性抗性的影响。相反，正如IGROV-1/CDDP细胞系的0.49的RI值所表现的，对顺铂的获得性抗性似乎增加了LTX-313化合物的活性。

5.3.LTX-315

所有37种受试人肿瘤细胞系对LTX-315化合物都是敏感的，IC₅₀值的为1.18±0.25μM(T-47D细胞系)至7.16±0.99μM(SK-OV-3细胞系)。

在37种肿瘤细胞系上获得的LTX-315化合物的平均IC₅₀值是3.63±1.45μM，中位值为3.27μM。在正常细胞系(HUV-EC-C)上获得的平均IC₅₀值高于所述肿瘤细胞系中的任何一种。

乳腺癌细胞系、血液学癌细胞系和肺癌细胞系对LTX-315化合物是最敏感的(乳腺癌细胞系的中位IC₅₀值为2.45μM(n＝5)、血液学癌细胞系的中位IC₅₀值为2.60μM(n＝7)、肺癌细胞系的中位IC₅₀值为2.83μM(n＝3))，而肝癌细胞系的抗性最强(中位IC₅₀值为5.86μM，n＝2)。

正如HL-60/ADR和MCF-7/mdr细胞系的RI值(HL-60/ADR细胞系为1.45、MCF-7/mdr细胞系为1.12)所表现的，对阿霉素的获得性抗性似乎稍微降低了LTX-315化合物的活性。相反，正如IGROV-1/CDDP细胞系的0.50的RI值所表现的，对顺铂的获得性抗性似乎增加了LTX-315化合物的活性。

5.4.LTX-320

所有37种受试人肿瘤细胞系对LTX-320化合物都是敏感的，IC₅₀值为3.46±0.22μM(T-47D细胞系)至16.64±3.15μM(Hep G2细胞系)。

在37种肿瘤细胞系上获得的LTX-320化合物的平均IC₅₀值是7.58±2.79μM，中位值为6.92μM。在正常细胞系(HUV-EC-C)上获得的平均IC₅₀值高于所述肿瘤细胞系中的任何一种。

血液学癌细胞系、乳腺癌细胞系、肾脏癌细胞系和脑癌细胞系对LTX-320化合物是最敏感的(血液学癌细胞系的中位IC₅₀值为6.04μM(n＝7)、乳腺癌细胞系的中位IC₅₀值为6.60μM(n＝5)、肾脏癌细胞系的中位IC₅₀值为6.60μM(n＝2)、脑癌细胞系的中位IC₅₀值为6.92μM(n＝3))，而肝癌细胞系的抗性最强(中位IC₅₀值为11.46μM，n＝2)。

正如HL-60/ADR和MCF-7/mdr细胞系的RI值(HL-60/ADR细胞系为0.90、MCF-7/mdr细胞系为1.19)所表现的，LTX-320化合物的活性似乎不受对阿霉素的获得性抗性的影响。相反，正如IGROV-1/CDDP细胞系的0.49的RI值所表现的，对顺铂的获得性抗性似乎增加了LTX-320化合物的活性。

5.5.LTX-329

所有37种受试人肿瘤细胞系对LTX-329化合物都是敏感的，IC₅₀值为2.43±0.34μM(T-47D细胞系)至16.90±1.18μM(U-87MG细胞系)。

在37种肿瘤细胞系上获得的LTX-329化合物的平均IC₅₀值是8.17±3.20μM，中位值为7.89μM。在正常细胞系(HUV-EC-C)上获得的平均IC₅₀值高于所述肿瘤细胞系中的任何一种。

乳腺癌细胞系和血液学癌细胞系对LTX-329化合物是最敏感的(乳腺癌细胞系的中位IC₅₀值为4.92μM(n＝5)、血液学癌细胞系的中位IC₅₀值为5.26μM(n＝7))，而卵巢癌细胞系的抗性最强(中位IC₅₀值为13.37μM，n＝4)。

正如CCRF-CEM/VLB、HL-60/ADR和MCF-7/mdr细胞系的RI值(CCRF-CEM/VLB细胞系为0.76、HL-60/ADR细胞系为0.80、MCF-7/mdr细胞系为1.07)所表现的，LTX-329化合物的活性似乎不受对阿霉素的获得性抗性的影响。相反，正如IGROV-1/CDDP细胞系的0.46的RI值所表现的，对顺铂的获得性抗性似乎增加了LTX-329化合物的活性。

5.6.一般注释

对于所有受试LTX化合物，T-47D乳腺癌细胞系都是最敏感的细胞系。

对于所有五种受试化合物，血液学癌细胞系都是最敏感的组织学类型，肝癌细胞系和卵巢癌细胞系是抗性最强的细胞系。

所有五种受试化合物表现出对IGROV-1/CDDP细胞系(对顺铂具有抗性)的活性都高于对母体IGROV-1卵巢癌细胞系的抗性。阿霉素抗性似乎稍微降低了LTX化合物的活性。

在五种受试化合物中，LTX-315化合物是最有效的化合物。

6.结论

所有五种受试化合物(即LTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320和LTX-329)都表现出对37种受试人癌细胞的细胞溶解活性，IC₅₀值为μM至10μM。

LTX-315化合物是最有效的受试化合物，对所有37种受试人癌细胞系的IC₅₀值为1-5μM。

实施例2：5种受试化合物对10种淋巴瘤细胞系的体外细胞毒性活性研究

1.研究目的

为了测定5种新化合物对10种淋巴瘤细胞系产生50％增殖抑制(IC₅₀)的浓度。

2.材料和方法

2.1.受试物

2.1.1.受试物

2.1.2.阳性对照

将曲拉通X-100作为阳性对照，其由Sigma(Saint Quentin Fallavier，France)的Oncodesign(Dijon，France)提供。

2.1.3.药物介质和贮存条件

通过用培养基进行稀释获得1％(终浓度)的曲拉通X-100。

2.2.肿瘤细胞系和培养条件

2.2.1.肿瘤细胞系

购买和由Oncodesign提供癌细胞系和培养基

^aAmerican Type Culture Collection(美国模式培养物保藏所)，Manassas，Virginia，USA

^bDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuturen Gmbh(德国微生物和培养物保藏公司)，Braunschweig，Germany

2.2.2.培养条件

肿瘤细胞于37℃潮湿环境中(5％CO₂，95％空气)生长为悬液。每种细胞系的培养基在下面的表3中描述。为了实验使用，在血细胞计数器中对细胞进行计数，并通过0.25％的台盼蓝排除实验评价它们的活力。

表3

3.实验设计和处理

3.1.细胞系扩增和接种

将肿瘤细胞接种于96孔平底微量滴定板(Nunc，Dutscher，Brumath，France)中，进行处理之前，细胞在190μl无药物且无FBS的培养基中于37℃孵育24小时。

每种细胞系的种植密度总结在下面的表4中：

表4

3.2.IC₅₀测定

将肿瘤细胞与10个浓度的化合物孵育4小时，化合物按照1/4的稀释步骤，最高剂量为400μM(范围为4×10^-4-4×10^-10M)，以1％(终浓度)曲拉通X-100作为阳性对照，以无FBS的培养基作为阴性对照。细胞(190μl)在终体积200μl的含有受试物的无FBS的培养基中、在37℃、5％CO₂下进行孵育。

3.3.MTS测定

通过用新的四唑化合物(MTS，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑)和称为PMS(吩嗪硫酸甲酯)的电子耦合试剂的MTS测定(Baltorp et al)来反映受试物的体外细胞毒性活性。同MTT类似，细胞将MTS生物还原为甲臜产物，该甲臜产物可直接溶于培养基中，而无需处理，这与MTT不同。

在细胞处理结束时，将40μl 0.22μm新鲜过滤的配制在Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Ref 17-513Q，Batch 6MB0152，Cambrex)中的MTS(2mg/ml，20ml，Ref G1111，Batch 235897，Exp 03/2009，Promega，Charbonnières，France)和PMS(0.92mg/ml，1ml，Ref P9625，Batch065K0961，Sigma)的组合溶液添加至每孔。将培养板于37℃孵育2小时。用VICTOR^3TM 1420酶标仪(Wallac，PerkinElmer，Courtaboeuf，France)在490nm处测量每孔中的吸光度(OD)。

4.数据表示

4.1.按照实施例1测定IC₅₀数据

5.结果

5.1.LTX-302

所有10种受试人淋巴瘤细胞系对LTX-302化合物都是敏感的，IC₅₀值为5.30±2.02μM(U-937细胞系)至12.54±3.52μM(Raji细胞系)。

在10种敏感的细胞系上获得的LTX-302化合物的平均IC₅₀值是8.11±2.44μM，中位值为7.53μM。

5.2.LTX-313

所有10种受试人淋巴瘤细胞系对LTX-313化合物都是敏感的，IC₅₀值为3.21±2.81μM(Ramos细胞系)至16.08±4.86μM(Raji细胞系)。

在10种敏感的细胞系上获得的LTX-313化合物的平均IC₅₀值是7.05±3.91μM，中位值为5.89μM。

5.3.LTX-315

所有10种受试人淋巴瘤细胞系对LTX-315化合物都是敏感的，IC₅₀值为1.15±0.42μM(U-937细胞系)至4.93±1.03μM(Raji细胞系)。

在10种敏感的细胞系上获得的LTX-315化合物的平均IC₅₀值是3.01±1.36μM，中位值为2.93μM。

5.4.LTX-320

所有10种受试人淋巴瘤细胞系对LTX-320化合物都是敏感的，IC₅₀值为2.22±NAμM(Hs 445细胞系)至11.26±3.42μM(Raji细胞系)。

在10种敏感的细胞系上获得的LTX-320化合物的平均IC₅₀值是5.03±2.82μM，中位值为4.84μM。

5.5.LTX-329

所有10种受试人淋巴瘤细胞系对LTX-329化合物都是敏感的，IC₅₀值为2.46±NAμM(Hs 445细胞)至8.70±1.70μM(Raji细胞系)。

在10种敏感的细胞系上获得的LTX-329化合物的平均IC₅₀值是5.76±2.27μM，中位值为5.72μM。

5.6.一般注释

对于所有受试LTX化合物，KARPAS-299和Raji细胞系都是抗性最强的细胞系。

对于所有受试LTX化合物，Hs 445、Ramos和U-937细胞系都是最敏感的细胞系。

在五种受试化合物中，LTX-315化合物是最有效的化合物。

6.结论

所有五种受试化合物(即LTX-302、LTX-313、LTX-315、LTX-320和LTX-329)都表现出对10种受试人淋巴瘤细胞系的细胞溶解活性，IC₅₀值在μM范围内。

LTX-315化合物是最有效的受试化合物，对于所有10种受试人淋巴瘤细胞系，IC₅₀值为1-5μM。

实施例3：体外溶血活性

测试原理

检测肽LTX-315对人红细胞的溶血活性。

材料和方法

为了分离红细胞，将新鲜收集的人血于1500rpm离心10分钟。使用PBS[含有150mM NaCl的35mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4]、通过于1500rpm离心10分钟将红细胞(RBC)洗涤三次，并用PBS调整至10％血细胞比容。添加LTX-315溶液，以产生1200μg/ml-1μg/ml的肽终浓度范围和1％的RBC浓度。得到的悬液随着搅动于37℃孵育1小时。孵育之后，将悬液于4000rpm离心5分钟，并通过测量上清在405nm处的吸光度来监测释放的血红蛋白。PBS用作阴性对照，且假定不引起溶血。0.1％曲拉通用作阳性对照，且假定引起完全的溶血。

受试物：LTX-315

参照物：PBS(阴性对照)和曲拉通X-100(阳性对照)

反应混合物的组分：LTX-315、10％曲拉通X-100、PBS和RBC(10％血细胞比容)

浓度	PBS(μl)	RBC(μl)	LTX-315/曲拉通X-100(μl)
				阴性对照	630	70	-
阳性对照	623	70	7
				1200	150	50	300(2mg/ml母液)
1000	200	50	250(2mg/ml母液)
				500	325	50	125(2mg/ml母液)
100	595	70	35(2mg/ml母液)
				50	612.5	70	17.5(2mg/ml母液)
10	560	70	70(0.1mg/ml母液)
				1	623	70	7(0.1mg/ml母液)

评估方法

通过测量上清在405nm处的吸光度来监测释放的血红蛋白，并通过以下公式计算溶血百分比：

％溶血＝[(A₄₀₅LTX-315-A₄₀₅PBS)/(A₄₀₅0.1％曲拉通X-100-A₄₀₅PBS)]×100

从剂量反应曲线确定对应于50％溶血(EC₅₀)的LTX-315的浓度。

结果

下面提供了五个不同实验的平均值和标准差。图1中也展示了数据。

图1表明LTX-315的EC₅₀平均值高于1200μg/ml(833μM)。

实施例4：小鼠中对鼠A20B细胞淋巴瘤肿瘤的药效

测试原理

该研究目的是研究不同剂量水平的LTX-315对小鼠中鼠A20 B细胞淋巴瘤的效应。

材料和方法

通过肿瘤内注射溶于无菌盐水中的LTX-315来进行给药。

将50μl体积的5×10⁶个鼠A20细胞(ATCC，LGC Promochem AB，Middlesex，England)皮下接种至雌性小鼠腹部。将小鼠分成四组(详细参见下面的表5)。当肿瘤达到直径约5mm(最小20mm²)的所需大小时，开始肿瘤内治疗。

研究了3个剂量水平：每次注射LTX-315 1mg(组1)、0.5mg(组2)和0.25mg(组3)。所有注射的体积都是50μl。将LTX-315溶于无菌的0.9％NaCl水溶液中。该介质用作对照(组4)。所有的4组都接受3次注射。

在研究期间，通过定期地测量肿瘤并对动物称重来监测小鼠。监测小鼠，直至达到125mm²的最大肿瘤负荷或直至发生严重的不良事件(即在监测期间重复治疗而形成伤口)，然后将小鼠处死。将测径器用于测量肿瘤大小，并且称重和身体检查用作健康控制。

动物：由Harlan(England，UK)提供的6-8周龄的无特定病原体的雌性Balb/c小鼠。

动物的饲养条件：给予动物标准实验室食物和水。

下面的表5中给出平均体重、剂量、途径和治疗安排。

表5

^*第1天是治疗的第一天

结果：

在下面表6中将各种治疗的抗肿瘤效应表示为平均肿瘤大小。

表6

^*在治疗第一天开始治疗之前的肿瘤大小

不同治疗组中的肿瘤反应程度总结在下面的表7中。

表7

讨论/结论

在接受最低LTX-315剂量(0.25mg/剂量)的组3中，最初几天观察到小的抑制效应。在分别接受1.0mg/剂量和0.5mg/剂量的LTX-315剂量的组1和组2中，所有动物表现出部分的或完全的肿瘤反应。对于接受最佳剂量的组(组1)，发现抗肿瘤活性导致7只治疗小鼠中的3只中的完全肿瘤反应。

相对于其它两组，组1中观察到普遍更强的坏死和更多的伤口形成。在任一动物组中，除了伤口形成，没有观察到其它不良事件或毒性效应。

在研究的第一阶段，1mg和0.5mg的LTX-315都表现出强的和快速的抗肿瘤效应。然而，随着研究进行，组2中比组1中有更多的动物复发。

实施例5：LTX-315对小鼠中鼠CT26WT结肠癌肿瘤的效应

材料和方法

通过肿瘤内注射溶于无菌盐水(0.9％NaCl的无菌水溶液)中的LTX-315来进行给药。

将50μl体积的5×10⁶个鼠CT26WT细胞(ATCC，LGC PromochemAB，Boras，Sweden)皮下接种至共40只雌性小鼠中每一只的腹部表面。将小鼠分成5组，每组8只小鼠。当肿瘤达到20mm²的所需大小时，通过肿瘤内注射开始治疗。组1仅在第1天进行治疗，组2在第1天和第2天进行治疗，组3在第1天和第3天进行治疗，组4在第1天、第2天和第3天进行治疗。所有的每天治疗都是一次性注射溶于50μl中的1.0mg LTX-315(20mg/ml)。用50μl LTX-315的介质治疗组5。

在研究期间，通过定期地测量肿瘤(数显测径器)和对动物称重来监测小鼠。监测小鼠直至达到125mm²的最大肿瘤负荷，或直至发生严重的不良事件(即由于重复注射的伤口形成)，然后将小鼠处死。称重和身体检查用作健康控制。

动物：由Harlan(England，UK)提供6-8周龄的无特定病原体的雌性Balb/c小鼠。

动物的饲养条件：标准动物设施条件。

下面的表8中给出平均体重、剂量、途径和治疗安排。

表8

^*第1天是治疗的第一天

结果：

下面表9中将各种治疗的抗肿瘤效应表示为平均肿瘤大小。

表9

^*在治疗第一天开始治疗之前的肿瘤大小

在用LTX-315治疗的所有动物中的绝大多数中观察到完全肿瘤反应。不同治疗组中的肿瘤反应程度总结在下面的表10中。

表10

讨论/结论

当肿瘤达到最小20mm²的所需大小时开始治疗，并且当肿瘤达到125mm²的最大肿瘤负荷时，处死动物。

将研究终点定在第17天，这时处死8只对照动物(组5)中的6只。

所有LTX-315治疗方案都导致强的抗CT26WT肿瘤的效应。

观察到32只治疗动物中的共27只具有完全肿瘤反应，4只为部分反应。只有1只动物(组3中)对治疗没有反应。给出的结果显示所有4个治疗组都具有非常相似的总体肿瘤反应，数据还表明组2中的肿瘤复发程度高于组1、3和4。此外，在监测结束时，组2中观察到较少没有肿瘤的动物(图2)。

在所有治疗组中都观察到坏死和完全肿瘤反应。组1的8只动物中的4只、组2的8只动物中的2只、组3的8只动物中的5只、组4的8只动物中的5只表现出完全肿瘤反应。在该阶段，肿瘤完全坏死且在肿瘤的位置处形成伤口痂。

在所有治疗组中都观察到肿瘤部位的坏死。总的来说，组2、3和4中的动物比仅给予一次LTX-315注射的组1中的动物表现出更多的坏死、伤口和痂形成。给予3次注射的组4动物表现出最多的坏死、伤口和痂形成。组1和组4之间坏死的差异相当大，但是给予最多次治疗的动物似乎能良好适应。在任一治疗动物组中，除了局部坏死组织和伤口形成之外，没有观察到毒性或其它不良反应。

受试LTX-315的所有四个治疗方案都表现出对鼠CT26WT肿瘤的强抗肿瘤效应。

坏死、伤口和痂形成的量与给予的LTX-315治疗次数成比例。

实施例6：LTX-315对敏感的和多抗药性的癌细胞和正常人细胞的活性

细胞系	药物敏感性	来源	IC₅₀μM
				HL-60	敏感	急性早幼粒细胞性白血病	2.07
HL-60/ADR	具有抗性	急性早幼粒细胞性白血病	3.01
				MCF-7	敏感	乳腺癌	1.94
MCF-7/mdr	具有抗性	乳腺癌	1.96
				IGROV-1	敏感	卵巢癌	6.37
IGROV-1/CDDP	具有抗性	卵巢癌	3.19
				K-562	敏感	慢性骨髓性白血病	3.27
K5627/Gleevec	具有抗性	慢性骨髓性白血病	2.98
				HUV-EC-C	-	正常内皮细胞	23
RBC	-	红细胞	833

上面的数据显示出LTX-315对不同癌细胞系的广谱活性，并且特别是对正常人细胞具有非常弱的细胞毒性效应。

实施例7：在具有完全肿瘤退缩的小鼠中用鼠A20B细胞淋巴瘤和鼠CT26WT结肠癌细胞的再次激发

本研究的目的是研究之前在LTX-315治疗之后表现出完全肿瘤退缩的动物中肿瘤生长的效应。

方法：在LTX-315最初治疗后6周，分别用鼠A20B细胞淋巴瘤细胞或CT26WT结肠癌细胞(5×10⁶)对之前用LTX-315(1mg)治疗的雌性Balb-c小鼠(n＝4)或之前用LTX-315(0.5或1mg)治疗的雌性Balb-c小鼠(n＝9)进行再接种(腹部s.c.)。监测肿瘤生长直至再接种之后的36天。

相对于对照动物，研究R315-03中之前用LTX-315(1mg)治疗的所有4只小鼠中都观察到肿瘤生长的显著抑制(P＜0.006)(图2)，并且在1只动物中观察到复发，3周之后，在其它3只小鼠中观察到完全肿瘤退缩(图3)。

在之前用LTX-315(0.5或1mg)治疗的9只小鼠中，与对照动物相比，观察到肿瘤生长的抑制(P＜0.01)(图3)。第18天以后，图20中的肿瘤大小的骤降的原因是6只负荷大肿瘤的动物的死亡。在7只小鼠中观察到抑制，在2只动物中观察到完全退缩(图5)。

综上，这些数据提示：用LTX-315对鼠实体瘤(鼠A20B细胞淋巴瘤或CT26WT结肠癌)进行最初治疗之后的完全肿瘤退缩导致在再接种后对相同肿瘤生长的内源性长期保护作用的形成。与负荷CT26WT结肠肿瘤的动物相比，负荷A20B细胞淋巴瘤肿瘤的动物中肿瘤生长的抑制更显著。

实施例8：鼠A20B细胞淋巴瘤模型中LTX-315的免疫学效应-体内过继性脾细胞转移的初步研究

进行本研究是为了研究在研究R315-33中观察到的在再接种之后的动物中对于相同肿瘤生长的长期保护是否可以通过取自LTX-315治疗的供体动物的脾细胞被动转移至空白对照接受体中。

用A20细胞(5×10⁶于50μL中，s.c.)对10只雌性Balb/c小鼠(n＝32)中的每一只的腹部表面进行接种。一旦肿瘤达到20mm²，肿瘤内注射50μL体积的LTX-315(1mg)，每天一次持续3天。随后监测肿瘤大小(mm²)和体重，并且如果观察到任何肿瘤再生长，则再给予LTX-315注射。随后，处死表现出完全肿瘤退缩的小鼠，并将其用作脾细胞转移的供体，空白对照供体小鼠用作对照。从供体小鼠切除脾，并分离细胞。将空白对照接受体小鼠进行照射并分成2组。组1接受从治愈小鼠分离的脾细胞，而组2接受从空白对照小鼠分离的脾细胞。通过尾静脉注射新鲜制备的细胞(每100μl 20×10⁶)。24小时以后，如上文所述将5×10⁶鼠A20B细胞淋巴瘤细胞接种至接受体小鼠的腹部表面。监测肿瘤大小和体重，直至达到约125mm²的最大肿瘤负荷或发生严重的不良事件(即由于肿瘤组织坏死的伤口形成)，此时处死小鼠。

与接受了来自空白对照供体的脾细胞的对照动物相比，在接受了从LTX-315治疗之后表现出完全肿瘤退缩的动物分离的脾细胞的照射小鼠中观察到肿瘤生长抑制(图6)。还注意到，来自LTX-315治疗的小鼠的脾细胞的接受体中的肿瘤颜色和质地存在差异，这提示立即的炎性反应。

基于这些观察，得到的数据为接受了来自在之前的LTX-315治疗之后表现出A20-B淋巴瘤肿瘤的完全退缩的动物的脾细胞的动物中的适应性免疫应答提供了证据。该数据提示LTX-315治疗可以通过诱发免疫应答而赋予针对具体肿瘤的长期保护。

实施例9

该研究的目的是研究(i)单独用10mg/ml LTX-315溶解的A20淋巴瘤细胞进行预防性疫苗接种的抗癌效应；以及(ii)联合进行上述预防性疫苗接种和疫苗接种前在接种部位注射20mg/ml LTX-315的抗癌效应。

共使用两种不同的治疗方案

通过溶解于含有A20淋巴瘤细胞的生长培养基中的LTX-315的皮下注射进行给药。为了确保癌细胞的完全溶解，在注射之前静置细胞-LTX-315“混合物”30分钟。

将50μl的10×10⁶鼠A20细胞(ATCC，LGC Promochem AB，Boras，Sweden)与10mg/ml LTX-315的“混合物”(“A20溶解物”)皮下注射至组1(“疫苗”)小鼠的腹部。按照组1来治疗组2(“疫苗+佐剂”)小鼠，但是除此之外，在A20溶解物注射之前5分钟，在疫苗接种部位皮下给予25μl的20mg/ml LTX-315。组3(“对照”)小鼠未接受治疗。

治疗6周之后，在所有小鼠的腹部表面皮下接种50μl体积的5×10⁶活的A20B细胞淋巴瘤细胞。

在研究期间，通过定期测量肿瘤大小并对动物称重来监测小鼠。监测小鼠直至达到约130mm²的最大肿瘤负荷，此时处死小鼠。

材料和方法

动物：由Harlan实验室(England，UK；www.haRIan.com)提供的6-8周龄的无特定病原体的雌性Balb/c小鼠。

动物的饲养条件：大学的标准动物设施条件。

受试物：LTX-315(Lot 1013687)溶解的鼠A20细胞和单独的LTX-315(Lot 1013687)。

受试物制备：将10×10⁶A20细胞添加至50μl 10mg/ml LTX-315/介质(“A20溶解物”)中。混合后30分钟受试物即可使用。单独将LTX-315溶于0.9％NaCl的无菌水溶液。

介质：RPMI-1640w/2mM L-谷氨酰胺或0.9％NaCl的无菌水溶液。

参照物：未用

对照治疗：未用

评估方法：肿瘤大小测量和通过称重和检查的健康控制

关于方法的其它数据：将数显测径器用于肿瘤大小测量，称重和身体检查用作健康控制。

表11中显示了平均体重、剂量、途径和治疗安排(下面)。

表11

结果：

将不同治疗的抗癌效应表示为下面表12中的平均肿瘤大小，并在图7中提供了图形表示的数据。表12中，第1天是疫苗接种后6周，接种活的A20细胞的那天。

表12

讨论/结论：

在给予治疗之后6周，完成活的A20B细胞淋巴瘤细胞的接种(第1天)，并且当肿瘤达到最大允许的约130mm²的肿瘤负荷时，将动物处死。

结果显示，与对照组相比，两个LTX-315/A20-溶解物治疗组中肿瘤发育都更缓慢。组1的中位存活期是28天，组2是33天，对照组(组3)为25天。与对照组(组3)相比，组1的中位存活期增加12％，组2增加35％。

数据显示，与未治疗的对照组相比，治疗组具有延长的存活期。在第34天时，当处死对照组中的最后一只动物时，组2中50％的动物仍存活，组1中37.5％的动物仍存活。将研究终点定在第60天。此时，在16只治疗动物中的总共3只中，最初发展的肿瘤完全退缩并且没有了肿瘤。在研究结束时，观察到组1中25％的动物和组2中12.5％的动物没有肿瘤。

在肉眼观察中，治疗组(组1和2)与未治疗对照组(组3)相比存在形态学差异。两个治疗组中观察到的发展的肿瘤比对照组中所观察到的肿瘤更白且更硬。该发现与更慢的肿瘤生长率联合表明，LTX-315和溶解的A20细胞的混合物的疫苗接种诱导了抗A20细胞的免疫应答。

因此，LTX-315可以具有双重用途，溶解肿瘤细胞和诱导注射位点处从正常细胞的危险信号的释放。

应当理解，并非意图仅将本发明限制于上面的具体的实施方案，在未脱离附加的权利要求书的范围的情况下，很多实施方案、修改和改进对本领域技术人员都是显而易见的。

Claims

1.SEQ ID NO:23所示的化合物或该化合物的盐或酰胺，其中所述酰胺是通过SEQ ID NO:23的羧基端的酰胺化形成的。

2.抗肿瘤组合物，包含如权利要求1所述的化合物、盐或酰胺和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

3.抗肿瘤组合物，包含如权利要求1所述的化合物、盐或酰胺和至少一种其它治疗成分。

4.抗肿瘤组合物，包含如权利要求1所述的化合物、盐或酰胺和至少一种肿瘤疫苗。

5.权利要求1所述的化合物、盐或酰胺或权利要求2-4中任一项所述的抗肿瘤组合物在制备肿瘤疫苗佐剂中的用途。

6.权利要求1所述的化合物、盐或酰胺或权利要求2-4中任一项所述的抗肿瘤组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

7.权利要求1所述的化合物、盐或酰胺或权利要求2-4中任一项所述的抗肿瘤组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。

8.权利要求1所述的化合物、盐或酰胺或权利要求2-4中任一项所述的抗肿瘤组合物在制备肿瘤疫苗中的用途。

9.药物包装产品，包括：

(i)至少一种肿瘤疫苗；和

(ii)权利要求1所述的化合物、盐或酰胺。

10.药物包装产品，包括：

(i)至少一种其它治疗成分；和

(ii)权利要求1所述的化合物、盐或酰胺。