CN106552259A - 一种融合蛋白及其治疗疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白及其治疗结核病的用途，该融合蛋白能够靶向特异的诱导吞噬结核菌的巨噬细胞凋亡,从而杀灭包内寄生菌,并且不会诱导细菌耐药性。所以对于结核病,尤其是耐药结核病的治疗将起重要作用。

Description

一种融合蛋白及其治疗疾病的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种融合蛋白及其治疗疾病的用途。

背景技术

结核病的病原菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，主要分为人型和牛型。人型结核杆菌感染的发病率最高。临床上所指的结核病多由上述两型引起。结核病主要经呼吸道传染，也可经消化道感染，少数经皮肤伤口感染。呼吸道传播是最常见和最重要的途径。肺结核病人(主要是空洞型肺结核)从呼吸道排出大量带菌微滴。吸入这些带菌微滴即可造成感染。直径小于5μm的微滴能到达肺泡，因此其致病性最强。

如果病人感染的结核分枝杆菌对一种或一种以上的抗结核药物产生了耐药性，即为耐药结核病。WHO 2008年报道显示，全球结核病总耐药率为20.0％，耐多药率为5.3％，估计全球耐多药结核病为50万例，其中，被WHO认定的27个耐药高负担国家占了病例总数的85％。特别是随着人口的增长、世界范围内的旅行和人口流动的增加，耐药性肺结核病例更趋上升态势，每年约增加30万新病例。耐药结核病的流行持续威胁着结核病控制工作已取得的进展，广泛耐药结核病的出现更加剧了这一威胁。由于耐药结核病的诊断复杂，治疗困难，往往疗程很长，耐多药病人一般需要18-24个月，而且医药费用是治疗一般病人的100倍左右，因此耐药结核病的治疗对个人、家庭及社会均造成巨大的经济压力。

现有结核病的化学药物治疗,容易诱导结核分枝杆菌产生耐药性,耐药性结核病的临床治疗非常困难,严重的甚至无药可用。因此，本领域技术人员一方面致力于开发能够有效抑制结核分枝杆菌的药物，另一方面也在寻求能够避免结核分枝杆菌耐药性的治疗方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种融合蛋白及其应用。

本发明的第一方面，提供了白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于：

(1)诱导巨噬细胞凋亡；和/或

(2)治疗和/或预防病原菌感染；和/或

(3)诱导分泌IFN-γ的效应T细胞的增殖；和/或

(4)诱导Vγ2Vδ2T细胞的扩增。

在另一优选例中，所述病原菌为能够在巨噬细胞中增殖的病菌。

在另一优选例中，所述巨噬细胞为吞噬有病原菌的巨噬细胞。

在另一优选例中，所述病原菌为胞内寄生病原菌。

在另一优选例中，所述病原菌包括但不限于：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、单增李斯特菌(L.monocytohenes)等胞内寄生病原菌。

在另一优选例中，所述病原菌感染包括：结核病。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所示结构：

C-B-A (Ia)，或

C-A-B (Ib)

其中，

A为包括白细胞介素-2(IL-2)的蛋白元件；

B为白喉毒素蛋白元件；

C为任选的信号肽序列；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述元件A包括选自下组的多肽：

(A)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述元件A衍生自哺乳动物(如人)的IL-2蛋白，优选地所述IL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述元件A的长度为80-153个氨基酸。

在另一优选例中，所述元件B包括选自下组的多肽：

(A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

在另一优选例中，所述元件B的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述元件B的长度为200-536个氨基酸。

在另一优选例中，所述元件B的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述元件B衍生自白喉毒素蛋白，优选地所述白喉毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-10氨基酸，较佳地为1-5个氨基酸。

在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肽元件C。

在另一优选例中，所述融合蛋白不含信号肽，并且结构式为

B-A (IIa)，或

A-B (IIb)

式中，A、B和“-”的定义如上所述。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述结核病为耐药性结核病。

本发明的第二方面，提供了一种特异性诱导巨噬细胞凋亡的方法，包括步骤：将所述巨噬细胞与白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白接触，从而特异性诱导巨噬细胞凋亡。

在另一优选例中，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所示结构：

C-B-A (Ia)，或

C-A-B (Ib)

其中，

A为包括白细胞介素-2(IL-2)的蛋白元件；

B为白喉毒素蛋白元件；

C为任选的信号肽序列；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述巨噬细胞为吞噬结核分枝杆菌的巨噬细胞。

在另一优选例中，所述方法为非治疗目的的。

在另一优选例中，所述方法为治疗目的的。

在另一优选例中，所述方法为体外的。

本发明的第三方面，提供了一种治疗结核病的方法，包括步骤：给需要的对象施用治疗有效量的白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白。

在另一优选例中，所述所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所示结构：

C-B-A (Ia)，或

C-A-B (Ib)

其中，

A为包括白细胞介素-2(IL-2)的蛋白元件；

B为白喉毒素蛋白元件；

C为任选的信号肽序列；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述的融合蛋白以单体和/或二聚体形式施用。

在另一优选例中，所述的对象是人。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白和抗结核药物(优选为化合物)。

在另一优选例中，所述抗结核药物选自下组中的一种或多种：

雷米封(INH)、利副平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰氨(PZA)、和硫酸链霉素(SM)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1中A实验时间安排表。分别在结核菌攻毒的前5天和攻毒后第14天进行给药本发明融合蛋白治疗。实验在攻毒后65天结束。B在实验结束时，实验动物肺部病理结果。其中对照组动物肺(左一、左二图)结核感染病灶非常明显，而药物治疗组(右一、右二图)结核菌病灶不明显。C显示了综合病理打分结果和肺叶菌落计数结果。

图2显示了激光共聚焦结果，表明药物诱导吞噬结核菌的巨噬细胞凋亡从而消灭结核菌。左上图，细胞表面标志凋亡的分子caspass-3的荧光染色。上中，细胞表面CD25分子的荧光染色。右上图，结核病Mtb的荧光染色。左下图，单核细胞标志CD14分子的荧光染色。中下图，可见光下的细胞。右下图，染色图像的叠加图。

图3显示了药物处理能够减少Treg细胞的产生。A在不同处理条件下，Treg细胞(CD25+Foxp3+细胞)的比例；左一图白介素2(IL-2)处理后，同时表达Foxp3和CD25双阳性细胞占CD4T细胞的比例；左二图IL-2和本发明融合蛋白联合处理后，同时表达Foxp3和CD25双阳性细胞占CD4T细胞的比例；左三图HMBPP、IL-2和融合蛋白联合处理后，同时表达Foxp3和CD25双阳性细胞占CD4T细胞的比例；右二图HMBPP、IL-2和融合蛋白联合处理后，Vγ2和Vδ2双阳性T细胞占CD3T细胞的比例；右一图HMBPP和IL-2联合处理后，Vγ2和Vδ2双阳性T细胞占CD3T细胞的比例。B在结核菌感染后，产生IFN-γ的效应T细胞的比例变化。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白能够靶向特异的诱导吞噬结核菌的巨噬细胞凋亡,从而杀灭包内寄生菌,并且不会诱导细菌耐药性。所以对于结核病,尤其是耐药结核病的治疗将起重要作用，在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

本发明证明了白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白单独使用能够用于治疗结核病。

具体地，本发明中,采用灵长类动物模型进行试验。在高剂量500cfu结核菌右下肺叶导入攻毒的第-5天和第14天采用了两次白细胞介素2与白喉毒素融合蛋白单独进行治疗,65天后进行病理解剖分析。结果发现在实验组12只灵长类动物的肺部没有发现肉眼可见的结核病灶，而对照组动物肺部已经发生非常严重的病理变化；肺部组织菌落计数结果表明,实验组几乎没有细菌，对照组肺组织中细菌数目非常多。进一步的实验发现，白细胞介素2与白喉毒素的融合蛋白能够诱导巨噬细胞杀灭胞内寄生的结核菌。

白细胞介素-2

白细胞介素-2是趋化因子家族的一种细胞因子。它是由多细胞来源(主要由活化T细胞产生)，又具有多向性作用的细胞因子(主要促进淋巴细胞生长、增殖、分化)；对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用，能刺激已被特异性抗原或致丝裂因数启动的T细胞增殖；能活化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK细胞产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；激活巨噬细胞等。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述白细胞介素-2的氨基酸序列如下：

白喉毒素

白喉毒素(diphtheria toxin，DT)是感染了beta噬菌体的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的外毒素，存在于临床使用的百白破疫苗成份中。安全性得到多年临床使用的验证，罕见严重不良反应，目前尚无由白喉成份引起过敏反应的报道。

白喉毒素分子由535个氨基酸残基构成，空间上相对独立的催化结构域(1-193AAs)、跨膜结构域(205-378AAs)和受体结合域(386-535AAs)组成；跨膜结构域和受体结合域本身无毒性，其功能是通过细胞表面受体结合，将催化结构域转导进入细胞内。

在本发明优选地实施方式中，白喉毒素氨基酸序列如下所示：

融合蛋白及其制备

在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，即含有包括IL-2的蛋白元件和白喉毒素蛋白元件的融合蛋白。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体)。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的融合蛋白”是指融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明融合蛋白或其元件(如IL-2)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明的一个优选地实施方式中，IL-2蛋白元件的氨基酸序列如下：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT；SEQ ID NO.3

在本发明的一个优选地实施方式中，白喉毒素蛋白元件的氨基酸序列如下：

MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKT；(SEQ ID No.:4)

优选地，本发明的IL-2-白喉毒素融合蛋白的氨基酸序列如下：

其中，直线下划线部分为白喉毒素蛋白元件，波浪线下划线部分为IL-2蛋白元件。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述IL-2-白喉毒素融合蛋白为地尼白介素2(ONTAK)。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO：5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)抗原肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式Ia或式Ib的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO:5所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽(融合蛋白)还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。

肽接头

本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。

连接肽的长度一般为0-10个氨基酸，较佳地1-5个氨基酸。

药物组合物及施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的融合蛋白或可编码本发明的融合蛋白的多核苷酸，以及(ii)药学上上可接受的载体、或赋形剂。

在其它的实施方式中，所述组合物还包括抗结核药物(优选为化合物)。

在本发明的较佳的实施方式中，所述抗结核药物选自下组中的一种或多种：

雷米封(INH)、利副平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰氨(PZA)、和硫酸链霉素(SM)。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物。

本发明的药物组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001-99wt％；较佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针对结核病患者，通常，当本发明的融合蛋白每天以约0.5mg-5mg/kg动物体重(较佳的2mg-4mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示了IL-2-白喉毒素融合蛋白具有治疗结核病的作用；

(2)使用本发明的IL-2-白喉毒素融合蛋白治疗结核病能够有效避免结核分枝杆菌的耐药性。

(3)首次揭示了IL-2-白喉毒素融合蛋白具有诱导巨噬细胞凋亡的功能。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1

在本实施例中，本发明人制备了根据本发明的白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白(以下简称融合蛋白)。本发明的融合蛋白的表达载体构建及融合蛋白的表达纯化等问题，参照论文(Structure/Function Analysis of theTransmembrane Domain of DAB389-Interleukin-2,an Interleukin-2Receptor-targeted Fusion Toxin,The journal of biological chemistry,Vol.268,No.16,pp.12077-12062,1993)。

本实施例中的融合蛋白的cDNA基因序列如下，

纯化后的融合蛋白，调整浓度至150UG/ML，进行动物实验。实验包含2组，第一组为生理盐水对照组，第二组为融合蛋白治疗组。每组包含12只食蟹猴(Cynomolgus Macaque)，年龄4-6岁左右，平均体重4-5公斤，雌雄各半。在计划采用结核菌(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)攻毒的前五天，第二组实验动物采用静脉滴注方式，每只动物注射1针剂融合蛋白(每针剂药量为150UG/ML)；第一组对照组的实验动物，注射相同体积的生理盐水作为对照。五天后，进行结核菌攻毒。动物麻醉后，采用支气管镜引导下的攻毒方式，每只动物导入右肺下叶1ml(500 CFU)结核菌后H37Ra感染动物。在动物感染后的第14天，进行第二次治疗，即第一组动物注射生理盐水；第二组每只动物注射1针剂融合蛋白(每针剂药量为150UG/ML)。攻毒65天后(图1A)，实验到动物实施安乐死，解剖后进行病理分析及脏器菌落计数。实验结果显示，第一组对照组动物(图1B，对照1，对照2)肺部出现了明显的结核病变，表现出严重的干酪样坏死和粟粒状结核病变或肺的干酪化，大量合并的肉芽肿。第二组实验动物(图1B，药物1，药物2)肺部几乎没有任何明显的结核病变。综合病理打分结果(图1C，病理打分图。打分标准参照文献Plos Pathogens,2009,Vol5,Issue 4:e1000392)显示，融合蛋白治疗组的综合病理得分显著低于对照组(p<0.0001)。分别取每只实验动物的右下肺叶、右中肺叶、左下肺叶各约1/3进行匀浆，然后稀释涂7H11平板。4周后进行菌落计数，结果显示(图1C，肺叶菌落计数图)在融合蛋白治疗组(药物组)的动物结核菌的数量极少，显著低于生理盐水对照组(p<0.0001)。结果说明，本发明融合蛋白对结核菌的感染有显著的治疗作用，能够有效的减轻改善结核菌感染引起的病理变化，显著抑制动物体内结核菌的生长。

实施例2融合蛋白能够引起细胞凋亡

采用激光共聚焦技术检测发现使用融合蛋白处理能够引起吞噬了结核菌的人源肺上皮细胞A549细胞的凋亡(图2)，进一步能够杀死胞内寄生的结核菌。

实验过程中，采集采集食蟹猴外周血，分离外周淋巴细胞PBMC。体外染色实验发现，IL-2能够诱导产生大量的Treg细胞(同时表达Foxp3和CD25表明分子的CD4T细胞。图3A，左一)，当融合蛋白和IL-2联用时(图3A，左二)与单纯HMBPP抗原刺激一样(图3A，左三)没有诱导产生大量的Treg细胞。但是，融合蛋白(图3A，右二)与IL-2(图3A，右一)类似，都能够诱导Vγ2Vδ2T细胞的扩增。同时，本发明人通过细胞内染色技术发现，融合蛋白治疗组，能够在结核菌(Mtb)感染2天后，显著增加了能够分泌干扰素(IFN-γ)的CD3T细胞的比例。上述结果说明，本发明的融合蛋白能够诱导产生大量分泌IFN-γ的效应T细胞，能够显著诱导Vγ2Vδ2T细胞的扩增，而且不会显著诱导Treg细胞的扩增。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于：

(1)诱导巨噬细胞凋亡；和/或

(2)治疗和/或预防病原菌感染；和/或

(3)诱导分泌IFN-γ的效应T细胞的增殖；和/或

(4)诱导Vγ2Vδ2T细胞的扩增。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述病原菌为胞内寄生病原菌；优选地，所述病原菌为能够在巨噬细胞中增殖的病菌。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白具有式Ia或式Ib所示结构：

C-B-A (Ia)，或

C-A-B (Ib)

其中，

A为包括白细胞介素-2(IL-2)的蛋白元件；

B为白喉毒素蛋白元件；

C为任选的信号肽序列；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述元件A衍生自哺乳动物(如人)的IL-2蛋白；和/或

所述元件B衍生自白喉毒素蛋白，并且所述白喉毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述元件A包括选自下组的多肽：

(A)具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:3中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽；和/或

所述元件B包括选自下组的多肽：

(A)具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源性；更优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性)的多肽；

(C)将SEQ ID NO:4所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的衍生多肽。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白不含信号肽，并且结构式为

B-A (IIa)，或

A-B (IIb)

式中，A、B和“-”的定义如上所述。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

8.一种特异性诱导巨噬细胞凋亡的方法，其特征在于，包括步骤：将所述巨噬细胞与白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白接触，从而特异性诱导巨噬细胞凋亡。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白和抗结核药物(优选为化合物)；

优选地，所述抗结核药物选自下组中的一种或多种：

雷米封(INH)、利副平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰氨(PZA)、和硫酸链霉素(SM)。

10.一种治疗结核病的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用治疗有效量的白细胞介素-2与白喉毒素融合蛋白。