TWI380993B - 重組型超化合物干擾素之用途 - Google Patents

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Description

重組型超化合物干擾素之用途
本申請案是2005年3月9日提申之美國申請案案號60/659,925的一個部分繼續申請案，該案之全部內容於此被併入至本申請案中以作為參考資料。
遍佈本申請案，各種公開刊物係參考的。此等公開刊物之全部揭示於此被併入至本申請案中以作為參考資料，俾以更完全地說明本發明所屬技藝之狀態。
發明領域
本發明係關於一生物工程的領域。特別地，本發明關於一種重組型超化合物干擾素(rSIFN－co )或其具有改變的空間構形、高功效與低副作用之均等物。因此，高劑量的rSIFN－co 可以被使用。本發明亦關於一種生產該超化合物干擾素(rSIFN－co) 或一含有該超化合物干擾素(rSIFN－co) 或其均等物之藥學組成物的方法，以及該干擾素或組成物供用於抗病毒和抗腫瘤療法之用途。
 發明背景
IFN－con是一種新穎的干擾素分子，其係使用基因工程的方法，以於天然的人類IFN－α亞型中存在最普遍的守恆性胺基酸(conservative amino acid)予以建構。美國專利案案號4,695,623與4,897,471已經說明它。IFN－con已經被證實具有廣效的(broad－spectrum)IFN活性以及病毒和腫瘤的抑制與自然殺手細胞(natural killer cell)活性。Amgen,Inc.的美國專利案案號5,372,808提出治療Infergen(干擾素alfacon－1)。Amgen,Inc.的中華人民共和國專利案案號97193506.8提出Infergen(干擾素alfacon－1)於C型肝炎的再治療。Shenzhen Jiusheng Bio－engineering Ltd.的中華人民共和國專利案案號98114663.5提出供用於B型肝炎和C型肝炎的重組型人類一致的干擾素－α治療。
在1997年底時，美國食品與藥物管理局(FDA)許可Amgen以大腸桿菌(E.Coli.) 生產Infergen(干擾素alfacon－1)用於臨床的C型肝炎治療。
當偵測HbsAg與HbeAg時，可以鑑定出B型肝炎病人。IFN－α被普遍地使用在診所中以治療B型肝炎。IFN－α結合表面的細胞膜受體，藉此抑制DNA與RNA(核糖核酸)複製並誘導某些酵素以防止肝炎感染的細胞內的病毒之複製。所有的IFN能抑制病毒的DNA複製，但是其等無法抑制e和s抗原的表現。
非典型肺炎的爆發，被稱為嚴重急性呼吸道徵候群(severe acute respiratory syndrome,SARS)且首次在中國廣東省(Guangdong Province,China)被鑑定出，已經散佈至數個國家。自2003年的二月至三月，在香港、越南，以及加拿大的病人偵測到相似的病例。世界衛生組織(WHO)對該疾病發出一全球的警訊。於2003年的三月中旬，在遠東地區的保健工作者與曾經照顧嚴重呼吸道疾病病人的家庭成員證實了SARS 。這些病例的許多病例經由多條傳播鏈能被追蹤到一個來自廣東省、曾經造訪過香港的保健工作者，在香港他因肺炎住院治療並且死亡。至2003年四月末，在世界上超過25個國家中，上千件SARS病例與上百件SARS相關的死亡被通報至WHO。這些病例的多數係於家庭或保健的安置經由暴露至SARS病人而發生。本發明提供一種預防及/或治療SARS的方法。
本揭示描述重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)，生產該重組型超化合物干擾素的方法及其用途。特別地，本文中被揭示的超化合物干擾素能夠抑制、預防及/或治療肝炎病毒、SARS病毒，或病毒誘發的上呼吸道疾病，流行性感冒病毒，例如鳥類流行性感冒病毒，以及伊波拉病毒(Ebola virus)。
此外，相較於其他可得的干擾素，rSIFN－co在預防及/或治療病毒疾病與腫瘤是有效且較少副作用的。
 發明概要
本發明提供一種重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)以及其具有改變的空間構形、高功效與低副作用之均等物。因此，高劑量的rSIFN－co可以被使用。
本發明提供一種包含載體的表現系統，該載體含有編碼該超化合物干擾素或其均等物的基因。本發明亦提供一宿主細胞，該宿主細胞包含該含有編碼該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)或其均等物的基因之載體。該宿主細胞可以是真核或原核的，諸如：大腸桿菌。
本發明提供一種供用於抑制、預防或治療一個體體內的病毒疾病，或是用於抑制或治療一個體體內的腫瘤的方法，其包含對該個體投藥以一有效量的該超化合物干擾素或其均等物。
本發明提供上述的方法，其中超化合物干擾素被口服投藥，經由靜脈注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻或黏膜投藥，或是經由一呼吸器藉由吸入予以投藥。
本發明提供預防或治療病毒疾病的方法，其中該病毒疾病是A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、其他型的肝炎、由下列病毒所造成的感染：愛氏頓病毒(Epstein－Barr virus)、人類免疫不全病毒(HIV)、伊波拉病毒(Ebola virus)、嚴重急性呼吸道徵候群病毒(SARS)、流行性感冒病毒、細胞巨大病毒(Cytomegalovirus)、單純疱疹病毒，或是其他類型的疱疹病毒、乳多空病毒(papovavirus)、痘病毒(poxvirus)、細小核糖核酸病毒(picornavirus)、腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、第I型人類T－細胞白血症病毒，或第II型人類T－細胞白血症病毒，或第III型人類T－細胞白血症病毒。
本發明提供預防或治療病毒疾病的方法，其中該病毒疾病是人類免疫不全病毒(HIV)與伊波拉病毒。
本發明提供一種用於抗肝炎活性的方法。其能抑制HBV－DNA的複製、HbsAg與HBeAg的產生。
本發明提供一種預防或治療上呼吸道感染疾病的方法。
本發明提供一種預防或治療腫瘤或癌症的方法，其中該腫瘤是皮膚癌、基底細胞癌和惡性黑色素瘤、腎細胞癌、肝癌、胸腺癌、鼻咽癌、固態癌、攝護腺癌、胃/腹癌、食道癌、直腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌，以及淺膀胱癌、血管瘤、表皮癌(epidermoid carcinoma)、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神經膠質瘤、白血病(leucocythemia)、急性白血病和慢性白血病、慢性骨髓性白血病、毛樣細胞白血病(Hairy cell Leukemia)、淋巴腺瘤、多發性骨髓瘤、真性紅血球過多症(polycythemia vera)，或是卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)。
本發明提供一種用於預防或治療於一個體體內的病毒誘發的疾病的方法，其包含對該個體投藥以一有效量的重組型超化合物干擾素或是其之一種功能性均等物。
該超化合物干擾素(rSIFN－co)可以被口服投藥，經由靜脈注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻或黏膜投藥，或是經由一呼吸器藉由吸入予以投藥。
本發明提供一種用於抑制病毒誘發的疾病之致病劑的方法，其包含接觸該致病劑與一有效量的超化合物干擾素或其均等物。
本發明亦提供一種用於抑制病毒誘發的疾病之方法，其包含接觸一有效量的該超化合物干擾素與該病毒或細胞。此接觸能是直接或間接的。
本發明提供一種組成物，其含有能夠抑制、預防或治療病毒誘發的疾病之一有效量的該超化合物干擾素，以及一合適的載劑。
本發明提供一藥學組成物，其含有能夠抑制、預防或治療一個體體內的病毒誘發的疾病之一有效量的該重組型超化合物干擾素，以及一藥學上可接受的載劑。
本發明提供一種用於預防或治療一個體體內的腫瘤的方法，其含有對該個體投藥以一有效量的重組型超化合物干擾素或是其之一種功能性均等物。
本發明提供一種用於抑制腫瘤的方法，其包含接觸該致病劑與一有效量的超化合物干擾素或其均等物。
本發明也提供一種用於抑制腫瘤的方法，其包含接觸一有效量的該超化合物干擾素與該病毒或細胞。此接觸能是直接或間接的。
本發明提供一種組成物，其含有能夠抑制、預防或治療腫瘤之一有效量的該超化合物干擾素，以及一合適的載劑。
本發明提供一藥學組成物，其含有能夠抑制、預防或治療一個體體內的腫瘤之一有效量的該重組型超化合物干擾素，以及一藥學上可接受的載劑。
圖式簡單說明
第1圖：依據大腸桿菌密碼子的使用所設計的rSIFN－co cDNA序列以及所推論的rSIFN－co胺基酸序列。
第2A－B圖：另一個超化合物干擾素的序列。
第3圖：rSIFN－co的野生型HIV之抑制作用的圖。
使用EXCEL且以螢光素酶(Luciferase)作Y軸以及rSIFN－co的濃度作X軸。清楚的逆向劑量依賴反應已經顯示。
第4圖：rSIFN－co的抗藥性HIV之抑制作用的圖，使用EXCEL且以螢光素酶作Y軸與rSIFN－co的濃度作X軸。清楚的逆向劑量依賴反應已經顯示。
第5圖：流行性感冒病毒的rSIFN－co抑制作用：於左方，控制井係顯示以添加流行性感冒病毒而不添加干擾素，該等細胞具有明顯的CPE，諸如：細胞的圓形化、細胞壞死、反射光的減少以及脫落。於右方，實驗井係顯示包括流行性感冒病毒以及10奈克/毫升(ng/ml)濃度的rSIFN－co具有相當於正常細胞的型態。
 較佳實施例之詳細說明 重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)
本發明提供一種重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 或是其之一種具有改變的空間構形之均等物。本發明顯示帶有相同的一級序列之蛋白質具有不同的生物物活性。如本申請案所說明的，具有完全相同的胺基酸序列之蛋白質可以能具有不同的活性。此等蛋白質的效力有時候可以被改進，有時候，具有改變的空間構形之蛋白質將顯示出新的功能。Wei(2005；公開案案號WO 2005/02177 A2；國際申請案案號PCT/US2004/028068)提供一套用於調整蛋白質空間構形的方法。
如本文中所定義的，均等物是在功能上相似於該化合物干擾素的分子。一種均等物可以是原始序列的一刪失、取代，或代替性突變體。任擇地，本發明的意圖亦涵蓋該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)的仿效物。仿效物可以是一胜肽、多肽或一個小的化學實體。
本文中所描述的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)包括，但不限於：干擾素α、β、γ或ω。於一實施例中，其為IFN－1α、IFN－2β或其他的突變體。
於其他的實施例中，所揭示的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)比α、β、γ、ω或其等之一組合，以及當相較於揭示於美國專利案案號4,695,623與4,897,471之干擾素時，具有更高的功效。此重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)據信具有獨特的二級或三級結構，其中3維的變化是其生產方法中變化的結果。Wei(2004；US 2004/0202641 A1；美國申請案案號10/650,365)也描述此重組型超化合物。
本文中所描述的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)具有由其生產方法的改變所導致的空間結構的變化。
較低的副作用
當與其他的干擾素相比較時，該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)擁有較低的副作用。此等較低的副作用允許較高的劑量被使用在需要干擾素治療的病人上。此等較低的副作用開啟了使用rSIFN－co用於其他疾病的預防及/或治療之機會。因此，本發明提供當被投藥至一個體時，具有較少副作用的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)。
本發明提供相較於所有現在可得的干擾素，具有較少副作用的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)。
本發明進一步提供一種用於治療或預防於一個體體內的病毒疾病或腫瘤的方法，其包含對該個體投藥以一有效量的相較於所有現在可得的干擾素，具有較少副作用的rSIFN－co。因此，高劑量的rSIFN－co可以被使用。於一實施例中，該有效量的重組型超化合物干擾素係於奈克位準。
生產rSIFN－co的方法 人造基因
本發明亦提供編碼該超化合物干擾素或其均等物之人造基因。設計一人造基因是在通常技藝範圍內的。許多用於產生核苷酸序列的方法與其他的分子生物技術先前已經被描述。參見，例如，Joseph Sambrook and David W.Russell,Molecular Cloning：A laboratory Manual,December 2000，由Cold Spring Harbor Laboratory Press所發行。
該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)也可以依據大腸桿菌的密碼子偏好(codon preference)，以它的基因而被生產為帶有自野生型之序列的調整之人工合成的cDNA。該密碼子的使用(偏好)之廣泛的討論可以於美國專利案案號4,695,623中找到。參見，例如，第6欄，第41行－第7欄，第35行。
載體
本發明提供一包含編碼該超化合物干擾素或其均等物的基因之載體。
本發明提供一種包含載體的表現系統，該載體含有編碼該超化合物干擾素或其均等物的基因。該等細胞包括，但不限於：原核或真核細胞。本發明亦提供一宿主細胞，該宿主細胞包含該含有編碼該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)或其均等物的基因之載體。
本發明提供一種用於生產一具有改變的空間構形與提高的抗病毒活性之重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 的方法，其含有下列步驟：(a)導入編碼有偏好的用於表現之密碼子的干擾素的核酸分子至一適合的宿主內；以及(b)將該經導入的宿主置於允許該干擾素表現的條件下。
本發明提供用於生產重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)的方法，其進一步包含該經表現的干擾素之回收。
表現系統
上述的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 可以以一高效率的表現系統予以生產，其使用一特定的啟動子、增強子或其他的調節元素。於一實施例中，啟動子是可誘導的。該可誘導的啟動子包括，但不限於：PB A D 、熱休克啟動子或重金屬可誘導的啟動子。熱休克啟動子係藉由物理手段，然而其他的啟動子係藉由化學手段，例如IPTG或四環素(Tetracyclin)，而被活化。IPTG係被添加至細胞以活化下游的基因或被移除以去活化該基因。四環素是被使用以誘導啟動子或調控啟動子的強度。參見，http：//www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/plasmid inducible.html 。
於一實施例中，啟動子是PBAD。自九十年代早期，PBAD藉由AraC的表現與抑制之機制的性質已經被廣泛地研究，以及其等之相互作用已經於分子位準被仔細分析。參見，Schleif,R.S.1992 DNA looping.Annu.Rev.Biochem.61：199－223。AraC蛋白質是一種正向與負向調控子，當存在時，其開啟來自PBAD啟動子的轉錄，當不存在時，轉錄以非常低的速率發生。參見，Guzman,L.M.et al.(1995)J.Bact.177：4121－4130。PBAD啟動子的功效與機制是其他的熟悉此藝者所熟知的且是商業上可得的。參見，http：//www.invitrogen.com/content/sfs/hrochures/710 01619 pBAD bro.pdf 。
商業上可得的Invitrogen表現套組包括pBAD載體的，被設計以提供表現位準之精確的控制。araBAD啟動子係起始基因的表現。其被araC基因的產物正向與負向地調控，一種與L－阿拉伯糖形成一複合物之轉錄調控子。缺少阿拉伯糖，AraC二聚物接觸araBAD操縱子的半側，形成一210 bp DNA套環。為了最大轉錄活化作用，二件事是需要的：第一，阿拉伯糖結合至AraC。蛋白質釋放O2位置且結合I2位置，其係相鄰I1位置。此釋放DNA套環以及允許轉錄開始。第二，cAMP活化子蛋白質(CAP)－cAMP複合物結合至DNA以及刺激AraC結合至I1與I2。基礎表現位準能藉由導入葡萄糖至生長培養基而被抑制。葡萄糖作用為降低cAMP位準，其依次減少CAP的結合。當cAMP位準被降低，轉錄活化作用被降低。Invitrogen 的pBAD載體特別地為了最大表現與容易使用而被設計。
9種pBAD載體是現時可得的：pBAD102/D－TOPO,pBAD202/D－TOPO,pBAD－TOPO,pBAD/Thio－TOPO,pBAD/His,pBAD/Myc －His,pBAD－DEST49,pBAD/gIII與pBAD/Thio－E。所有的pBAD載體均具有下列特徵：1.用於劑量依賴調控的araBAD 啟動子2.用於araBAD 啟動子之嚴密控制的ara C基因3.0於增加的轉譯效率之最佳化的核糖體結合位置4.用於有效的轉錄之rrn B轉錄終止區域該等可誘導的啟動子包括，但不限於：熱休克啟動子或重金屬可誘導的啟動子。
本發明提供一種用於重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)的生產之方法，其包含導入一具有經選擇的密碼子偏好之人造基因至一適合的宿主內，於一適合於該化合物干擾素的表現之條件下培養該經導入的宿主，以及收穫該經表現的化合物干擾素。
該方法可以包含超重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)自發酵肉湯(broth)的萃取，包涵體的收集、被收穫的蛋白質之變性與復性(renaturation)。
該方法可以維持高功效，即使當該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)是與一製劑一起被使用以及在一特定的濃度下。該方法也包含該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)之分離與純化。該方法進一步包含該經純化的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)之冷凍乾燥。該方法包含重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)之液體注射液的產生。
於一實施例中，重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)以重組技術予以生產。在固定的胺基酸序列的情況下，IFN DNA依據大腸桿菌而被重新設計。密碼子的使用且繼之rSIFN－co基因被人工合成。rSIFN－co cDNA藉由DNA重組技術被選殖至大腸桿菌的高－表現載體，以及rSIFN－co的高表現係藉由使用L－阿拉伯糖的誘導/活化－機制而得到以活化PBAD啟動子的轉錄。
與基因工程一般的熱誘導、pH誘導與IPTG誘導系統相比之下，阿拉伯糖誘導/活化系統具有幾個優點：(1)一般的系統係藉由創造一個“去抑制(derepression)”態樣而解除啟動子功能。啟動子接而誘導下游的基因表現。溫度和pH的變化以及IPTG的添加無法直接地活化e啟動子。於本文所揭示的系統中，L－阿拉伯糖不只是去活化與抑制，而且也活化PBAD啟動子的轉錄，其誘導rSIFN－co的高表現。因此，阿拉伯糖誘導/活化系統是一更有效率的表現系統。(2)介於外源性的與L－阿拉伯糖劑量的關係是線性的。此意指阿拉伯糖的濃度能被改變以調整外源性基因的表現位準。因此，比起改變溫度和pH值而言，藉由阿拉伯糖是較容易地去控制大腸桿菌內之外源性的基因表現位準。此特性對於包涵體的形成是重要的。(3)L－阿拉伯糖是資源豐富、便宜又安全的，該等的相反是其他的誘導劑，諸如：IPTG，的缺點。
此實施例創造一個有效且抗性的具有一L－阿拉伯糖誘導/活化系統之rSIFN－共表現大腸桿菌工程株。此菌株係於合適的條件下被培養與發酵以收穫細菌體。包涵體在細菌被毀壞之後繼之被純化並重複地清洗。最終的成果，供用於本發明與臨床治療之高純度、空間構形改變的rSIFN－co蛋白質團塊係自包涵體的變性與復性以及一系列的純化步驟而被得到。該純化將不影響該經純化的蛋白質之生物活性。
上述的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)擁有抗病毒或抗腫瘤活性，以及；因此，在抑制、預防和治療病毒疾病，抑制或治療腫瘤，或癌症上是有用的。
病毒疾病
本發明提供一種用於治療或預防一個體體內的病毒疾病或腫瘤的方法，其包含對該個體投藥以一有效量的該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)或其均等物。Wei(2005；國際公開案案號WO 2005/034853 A2)提供一種用於預防或治療一個體體內的嚴重急性呼吸道徵候群的方法。
當被使用本文中，病毒疾病包括，但不限於：A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、其他型的肝炎，由下列病毒所造成的感染：愛氏頓病毒、人類免疫不全病毒(HIV)、伊波拉病毒、嚴重急性呼吸道徵候群病毒(SARS)、流行性感冒病毒、細胞巨大病毒、單純疱疹病毒，或是其他類型的疱疹病毒、乳多空病毒(papovavirus)、痘病毒(poxvirus)、細小核糖核酸病毒(picornavirus)、腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、第I型人類T－細胞白血症病毒，或第II型人類T－細胞白血症病毒，或第III型人類T－細胞白血症病毒。
於一實施例中，有效量係於奈克位準。於其他的實施例中，病毒是人類免疫不全病毒以及有效量是如4奈克/毫升一般低。於其他的實施例中，病毒是流行性感冒以及有效量是如10奈克/毫升一般低。
B型肝炎病毒的DNA的複製與HbsAg和HBeAg的分泌之抑制
該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 抑制B型肝炎病毒的DNA的複製與HbsAg和HBeAg的分泌。
嚴重急性呼吸道徵候群病毒(SARS)
本發明提供一種用於預防或治療一個體的嚴重急性呼吸道徵候群，或是病毒誘發的上呼吸道疾病之方法，其包含對該個體投藥以一有效量的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)或是其之一種功能性均等物。於上述方法的一實施例中，干擾素是α、β、γ、ω或其等之一組合。
該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)可以被口服投藥，經由靜脈注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻或黏膜投藥，或是經由一噴霧或是一呼吸機藉由吸入予以投藥。於一實施例中，rSIFN－co係以一高於或等於10百萬國際單位/平方米的表面積之劑量被皮下地或肌肉內地投藥。於其他的實施例中，rSIFN－co係以一高於或等於20百萬國際單位/平方米的表面積之劑量被皮下地或肌肉內地投藥。於一實施例中，該干擾素以一噴霧設備遞送。於一特定的實施例中，該設備是如第11圖中所描述的。於該等實施例的其中一個，該干擾素被冷凍乾燥。
本發明提供一種用於抑制嚴重急性呼吸道徵候群，或病毒誘發的上呼吸道疾病之致病劑的方法，其包含接觸該劑與一有效量的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)或其均等物。
已經被確定SARS的致病劑是一病毒。參見，例如Rota et al(2003),Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome.Science 1085952www.sciencexpress.org 和Marra,et al.(2003),The Genome Sequence of the SARS－Associated Coronavirus.Science 1085853 www.sciencexpress.org。
本發明也提供一種用於抑制嚴重急性呼吸道徵候群病毒或嚴重急性呼吸道徵候群病毒感染的細胞，或是病毒誘發的上呼吸道疾病，或感染能夠誘導上呼吸道疾病的病毒的細胞之方法，其包含接觸一有效量的該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)與該病毒或細胞。此接觸能是直接或間接的。
本發明提供一種組成物，其含有一有效量的能夠抑制嚴重急性呼吸道徵候群病毒或嚴重急性呼吸道徵候群病毒感染的細胞，或是病毒誘發的上呼吸道疾病，或感染能夠誘導上呼吸道疾病的病毒的細胞之重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)，以及一合適的載劑。
本發明提供一種組成物，其含有一有效量的能夠預防或治療一個體的嚴重急性呼吸道徵候群，或是病毒誘發的上呼吸道疾病之超化合物干擾素，以及一合適的載劑。
本發明提供一藥學組成物，其含有一有效量的能夠抑制嚴重急性呼吸道徵候群病毒或嚴重急性呼吸道徵候群病毒感染的細胞，或是病毒誘發的上呼吸道疾病之重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)，以及一藥學上可接受的載劑。
本發明提供一藥學組成物，其含有一有效量的能夠預防或治療一個體體內的嚴重急性呼吸道徵候群，或是病毒誘發的上呼吸道疾病之重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)，以及一藥學上可接受的載劑。
本發明提供一設備以遞送該上述的藥學組成物。
於一較佳的實施例中，該個體是一人類。能很容易明瞭的，該超化合物干擾素能被使用於其他的動物或哺乳動物。
本發明提供一種用於預防人類體內的嚴重急性呼吸道徵候群或病毒誘發的上呼吸道疾病的方法，其包含經由一噴霧器施用該超化合物干擾素一天三次，其於3毫升中包括20微克的干擾素，等同於一千萬單位的活性。
病毒上呼吸道感染(VURI)
病毒上呼吸道感染，任擇地名為感冒(common cold)、傷風(colds)。此為一種上呼吸(respiratory )道的接觸性傳染的病毒感染，其特徵在於黏膜發炎、打噴嚏(sneezing )，以及喉嚨痛(sore throat )。其通常是由超過200種不同的病毒所造成，已知為鼻病毒。傷風不是由造成流行性感冒(Influenza )相同的病毒所造成。傷風是經由其他有傷風的人咳嗽(coughing )或打噴嚏的小滴或是藉由手的接觸被某個有傷風的人所污染的物品而散佈的。傷風的發生率在小孩是最高的，以及發生率隨著年齡而下降，因為對造成傷風的病毒之免疫力(immunity )在疾病後產生。逐漸地，對造成傷風的廣泛種類病毒的免疫力於成人體內發展。孩童可能一年有10次傷風，而成人可能一年有3次傷風。
設若一病人呈現一病毒性URI，攝生法的範圍是廣泛的。因為多數此等感染是自限的(self－limiting)，臨床醫生通常建議休息與多喝水，但是其他的治療包括環境與營養療法，不用處方箋與處方箋的去充血藥與抗組織胺產物、新的抗組織胺與抗膽鹼的鼻配方，以及抗生素。
參見，http：//www.physsportsmed.com/issues/1998/02feb/swain.htm (2005)。
感染上呼吸道感染(URI)的預防與治療
差不多70~80%的URI是由病毒所造成的，諸如：呼吸道合胞病毒(respiratory Syncytical virus)、腺病毒(adenovirus)、鼻病毒(rhinovirous)、柯薩奇病毒(cox－sackie virus)、冠狀病毒(corona virus)及其變異株、流行性感冒A型病毒及其變異株、流行性感冒B型病毒及其變異株、副流行性感冒病毒及其變異株，或是腸病毒(enterovirus)及其變異株。成人URI的一個主要成因是來自鼻病毒。關於孩童，呼吸道合胞病毒與副流行性感冒病毒是URI的二個主要成因。
重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 在對抗造成URI的病毒上扮演一重要的角色。超化合物干擾素主要經由二個機制得到其抗病毒的作用：1.附著至感受性細胞的表面並誘導它們生產抗病毒蛋白質，接而封阻活體內病毒的複製與生殖。
2.重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 能調節免疫反應，包括T－細胞免疫反應、NK細胞的活動、單核細胞(monokaryon)的吞噬功能，以及一些抗體活體內的形成。
於URI的治療上，重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 能經由一噴霧器或一呼吸而直接地被施用至罹病的區域。此治療方法允許該干擾素直接地到達標的細胞。結果，以一噴霧器售出用品，而不是經由口腔或注射，會更安全且更有效地投藥該干擾素。
SARS的預防與治療
在四川(中國境內的一省)SARS 預防與控制事務委員會(Sichuan working group on SARS prevention and control) 的同意下，重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 的分布於2003年5月開始。超化合物干擾素噴霧器被分派給醫院內的醫生與護士，具有SARS高風險的居住地區，以及SARS 預防與控制國家研究小組(National research group on prevention and control of SARS )。在2003年12月的3000個使用者中，沒有任何與該噴霧器相關的副作用被報告。而且，沒有任何一個已經使用該超化合物干擾素噴霧器醫生與護士，四川省的人民，或是其他的機構的人已經被SARS感染。
因此，本發明提供一種用於抑制、預防或治療病毒的複製或病毒感染的細胞的方法，其係藉由接觸該病毒或感染的細胞與一有效量的該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 或其均等物。
腫瘤之預防與治療
此重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 在抑制、預防或治療下列的癌症或腫瘤上是有用的：
因此，本發明提供一種用於抑制腫瘤或癌細胞生長的方法，其係藉由接觸該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 或其均等物與該等腫瘤或癌細胞。
投藥的配方與途徑
本發明亦提供藉由以上方法而被生產的超化合物干擾素。
本發明提供一種組成物，其包含重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 或其均等物與一合適的載劑。
本發明提供一藥學組成物，其包含該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 或其均等物以及一藥學上可接受的載劑。
本發明提供上述的方法，其中重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 被口服投藥，經由靜脈注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射、鼻或黏膜投藥，或是經由一噴霧或是一呼吸機藉由吸入予以投藥。
本發明提供上述的方法，其中重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 被投藥遵照以下注射的程序：每二天9μg、15μg或24 μg，一周3次，歷時24周。
驚訝地發現已經改變的空間結構之重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) ，不只是抑制B型肝炎的DNA複製之製備物，也是抑制HbsAg與HbeAg於2.2.15細胞上的分泌之製備物。
本發明的一個目的是要提供一種重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 的製備物，以直接地抑制B型肝炎病毒的DNA複製與B型肝炎的HbsAg與HbeAg的分泌並降低它們至正常的位準。
配方
以下是一些rSIFN－co的製備物：口服的錠劑、膠囊、液體，貼片、注射品、噴霧、栓劑，以及溶液。注射品是推薦的。皮下地注射或靜脈注射藥品是普遍的。藥品載劑可以是任何可接受的藥品載劑，包括碳水化合物、纖維素(cellulosum)、黏合劑、崩解劑、軟化劑、填充劑、添加－溶解劑、緩衝劑(amortization)、保存劑、增稠劑、配對劑(matching)等等。
本發明也提供一種含有上述的組成物以及一藥學上可接受的載劑之藥學組成物。
為本發明之目的，“藥學上可接受的載劑”意指任何標準的藥學載劑。合適的載劑之實例是本技藝中熟知的，以及可以包括，但不限於：任何標準的藥學載劑，諸如：一磷酸緩衝鹽水溶液與各種不同的濕潤劑。其他的載劑可以包括被使用於錠劑、顆粒、膠囊等等的添加劑。典型地，此等載劑包括賦形劑，諸如：澱粉、牛奶、糖、某些種類的黏土、明膠、硬脂酸或其鹽類、硬脂酸鎂或鈣、滑石、植物油脂或油、膠、乙二醇或其他已知的賦形劑。此等載劑也可以包括調味與色彩添加劑或其他的成分。含有此等載劑之組成物係藉由熟知的慣用方法予以配方。
rSIFN－co半衰期的增加 聚乙二醇化(Pegylation)
聚乙二醇化是藉由聚乙二醇鏈被附著至蛋白質與胜肽藥物以增加藥物動力學的方法，透過遮蔽蛋白質分解酵素以保護此等蛋白質與胜肽藥物。參見，Harris and Chess,Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov.2003 Mar；2(3)：214－21。
聚乙二醇化是一種相當為大家接受的用於增加的蛋白質與脂質體藥學的循環的半衰期之方法，根據聚乙二醇之大的流體動力學體積。此等聚乙二醇遮蔽蛋白質與胜肽藥物以避免腎臟廓清，酵素的降解以及免疫系統辨識，因而其等之半衰期且使得它們為病人更可接受的。參見，Molineux,Pegylation：engineering improved pharmaceuticals for enhanced therapy. Cancer Treat Rev.2002 Apr；28 Suppl A：13－6。作者結論聚乙二醇化對於癌症病人的生命品質有有益的作用。
干擾素的聚乙二醇化增加該干擾素維持於身體內的時間的量，藉由增加該干擾素分子的大小，藉由減低吸收速率，延長半衰期與干擾素廓清的速率。因此，具有聚乙二醇化的干擾素之生物活動的持續期間被增加超越非聚乙二醇化的干擾素，因而提供一超越非聚乙二醇化的干擾素的優點，較不頻繁地投藥與可匹敵的容忍度(tolerability)。作者聲明以聚乙二醇化的干擾素之單獨療法比以非聚乙二醇化的配方之單獨療法於某些病人產生一較佳的反應。參見，Baker,Pegylated interferons. Rev Gastroenterol Disord.2001；1(2)：87－99。
持續的釋放或經控制的釋放
持續的釋放遞送基質與脂質體可能隨著rSIFN－co被使用以創造持續的釋放與經控制的釋放配方。參見，Robinson and Talmadge,Sustained Release of Growth Factors. In Vivo 2002 Nov－Dec；16(6)：535－40。作者聲明聚乙二醇化以及持續的釋放遞送基質與脂質體二者均改進重組型分子的藥物動力學與藥物動力(pharmacodynamic)性質，以及因而藉由改進臨床功效此等方針增加病人的順從性(compliance)。
本發明提供含有含有一製劑或被一製劑包封的重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) ，該製劑能夠影響該干擾素的半衰期或遞送。於一實施例中，此製劑是聚乙二醇(PEG)。
本發明進一步提供一種用於治療或預防一個體體內的病毒疾病或腫瘤的方法，其包含對該個體投藥以一有效量的該重組型超化合物干擾素(rSIFN－co) 或其均等物，其含有一製劑或是被一製劑包封，該製劑能夠影響該干擾素的半衰期或遞送。於一實施例中，此製劑是聚乙二醇(PEG)。
由以下之實例，本發明將更被了解。然而，一個在本技藝中具有技藝者將容易地了解所討論之特定的方法與結果僅是如於之後的申請專利範圍所更完整地說明的本發明的例示說明。
實驗詳細說明
IFN－con是一種依據人類IFN－α亞型的守恆性胺基酸，使用基因工程的方法予以建構之新穎的干擾素分子。已經被證實IFN－con具有廣效的IFN活性，諸如：高的抗病毒與腫瘤抑制活性，特別地用於有效地治療C型肝炎。
大腸桿菌密碼子被使用來重新設計rSIFN－co cDNA，並接而自公開的Infergen(干擾素alfacon－1)DNA序列人工合成rSIFN－co的cDNA與推論的胺基酸序列(第1圖)。
為了得到純的rSIFN－co蛋白質，rSIFN－co cDNA被選殖至大腸桿菌高表現載體，以及L－阿拉伯糖，其能活化載體內強的PB A D 啟動子，被用來誘導高的rSlFN－co基因表現。
實施例1 重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)對於伊波拉病毒的作用
背景：伊波拉病毒是一種造成可怕症狀的惡名昭彰的致命性病毒，最顯著的是高燒和大量的內出血。伊波拉病毒引起90%一樣多的其感染的人的死亡。其是能夠造成出血性(流血性)發燒的病毒之一。該疾病沒有特效的治療法。目前，病人接受支持性療法。此係由下列構成：平衡病人的體液與電解質、維持他們的氧位準與血壓，以及治療他們的任何的併發感染。死亡能在症狀開始的10天之內發生。
1.材料1.1藥物：rSIFN－co，由Sichuan Biotechnology Research Center提供。
1.2病毒：伊波拉，由The Academy of Military Medical Science,Institute of Microbiology Epidemiology供應。
1.3實驗的安全位準：病毒實驗係於生物實驗安全系統位準3之下進行。
1.4動物：60隻BALB/c小鼠
2方法2.1 60隻小鼠被隨機地分成6組，各組由10隻小鼠構成。第1組於接種以伊波拉病毒的該天被治療以1 μg/的rSIFN－co。第2組在接種以伊波拉病毒的第1天(1)被治療以1 μg/的rSIFN－co。第3組在接種以伊波拉病毒的第2天(2)被治療以1 μg/的rSIFN－co。第4組在接種以伊波拉病毒的第3天(3)被治療以1 μg/的rSIFN－co。第5組在接種以伊波拉病毒的第4天(4)被治療以1 μg/的rSIFN－co。第6組不以rSIFN－co治療，並且被選定作為對照組。
2.2藥物的投藥：1 μg/的rSIFN－co一天被投藥一次持續連續的六(6)天。
3結果第6組(對照組)中所有的十(10)隻小鼠均死亡。於第1組(1)、第2組(2)以及第3組(3)中所有的小鼠均存活且沒有任何可觀察到的毒性反應。於第4組(4)以及第5組(5)中顯示一些作用。
4結論清楚地，此等結果顯示rSIFN－co對抗伊波拉病毒的有效性。
實施例2 重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)的抗HIV作用
1.材料1.1野生型HIV 1.2抗藥性HIV 1.3 293－CD4－CCR5細胞1.4 DMEM，Gibco 1.5小牛血清，Gibco 1.6 rSIFN－co，由Sichuan Biotechnology Research Center提供1.7 96－井平盤，NUNC 1.8 CO2 培養箱1.9層流通風櫥1.10螢光計1.11 UV吸收計1.12其他
2.方法2.1於指數(log)期的293－CD4－CCR5細胞被取得，以0.25%胰酶予以消化，以錐藍(Trypan blue)染料予以染色以判定細胞數目，以及以DMEM予以稀釋至每毫升2.0x105 個細胞(cel1/ml)的濃度。
2.2 96－井平盤的各井被裝入100 μl(微升)的293－CD4－CCR5－DMEM懸浮液。平盤被放到攝氏37度的5%二氧化碳培養箱內以及隔天觀察到井的基部區域的70百分比(70%)被恢復。
2.3在上澄液被移除之後，100μl(微升)的不同濃度的rSIFN－co被添加至各井中。使用二個對照：磷酸緩衝食鹽水(PBS)與生長培養基。
2.4平盤被放到攝氏37度的二氧化碳培養箱內歷時大概18至20小時。
2.5實驗井：不同濃度的野生型HIV與抗藥性HIV病毒以100 μl(微升)每個井被放到各井中。對照井：無病毒被添加，只有每個井100μl(微升)的DMEM。
2.6平盤被放到攝氏37度的二氧化碳培養箱內歷時大概24小時。
2.7進行例行的螢光素酶分析以及上澄液的蛋白質濃度被測量。螢光素酶係以RLU/mg單位予以測量。
3結果rSIFN－co以4奈克/毫升(ng/ml)的位準能抑制HIV。參見，表4與第3－4圖。當使用螢光素酶為Y軸且rSIFN－co的濃度作X軸時，使用EXCEL，清楚地在rSIFN－co>4奈克/毫升(ng/ml)的位準，螢光素酶活性的位準明顯地低於PBS與培養基對照組。清楚的逆向劑量依賴反應已經顯示。
4結論：rSIFN－co對抗二者是有效的：野生型HIV與抗藥性HIV。
實施例3 重組型超化合物干擾素(rSIFN－co)的抗流行性感冒作用
1.材料1.1. 10天大的雞胚膜細胞1.2.由Sichuan Biotechnology Research Center提供的SIFN－co 1.3.由Molecular Biology Department of Institute of microbiology and epidemiology,Academy of Military Medical Science提供的流行性感冒病毒1.4. DMEM，Gibco 1.5.新生小牛血清1.6. 96－井平盤，NUNC 1.7. CO2 培養箱1.8.層流通風櫥1.9.倒立式顯微鏡1.10.其他
2.方法2.1於指數(log)期的10天大的雞胚膜細胞被取得，以0.25%胰酶予以消化，以錐藍染料予以染色以判定細胞數目，以及以DMEM予以稀釋至每毫升2.0x105 個細胞(cell/ml)的濃度。
2.2 96－井平盤的各井被裝入100 μl(微升)的293－CD4－CCR5－DMEM懸浮液。平盤被放到攝氏37度的5%二氧化碳培養箱內。隔天細胞長成一單層。
2.3在上澄液被移除之後，100μl(微升)的不同濃度的rSIFN－co被添加至各井中。使用二個對照井：不添加rSIFN－co。
2.4平盤被放到攝氏37度的二氧化碳培養箱內歷時大概18至20小時。
2.5實驗井：不同濃度的流行性感冒病毒以100μl(微升)每個井被放到各井中。
對照井：無流行性感冒病毒被添加，只有每個井100μl(微升)的DMEM。
2.6平盤被放到攝氏37度的二氧化碳培養箱內歷時大概24小時。
2.7細胞在倒立式顯微鏡下被觀察。
3.結果3.1在倒立式顯微鏡下，於對照井中添加流行性感冒病毒且無干擾素的細胞具有明顯的CPE，諸如：細胞的圓形化、細胞壞死、反射光的減少以及脫落。
3.2含有濃度10奈克/毫升(ng/ml)的rSIFN－co之實驗井中的細胞沒有CPE且相當於正常細胞的型態。參見，第5圖。
3.3無添加流行性感冒病毒且無干擾素之對照井沒有任何CPE。
4結論濃度10奈克/毫升(ng/ml)的rSIFN－co對抗流行性感冒病毒是有效的。
實施例4 一個肺癌個體的臨床觀察
一個體於2005年10月7日被認為有非小細胞肺癌。在一個月的化療治療之後，於2005年10月22日與2005年10月25日的成像檢查中沒有觀察到改善。於2006年1月4日的檢查中也沒有進展。該個體以超化合物干擾素予以治療歷時1個月。攝生法如下：該個體每隔一天被給予注射。第一次，該個體被給予9微克的劑量。後續的注射中，劑量被加倍至18微克。於2006年2月23日的檢查顯示出快速的改進。
第1圖：依據大腸桿菌密碼子的使用所設計的rSIFN－co cDNA序列以及所推論的rSIFN－co胺基酸序列。
第2A－B圖：另一個超化合物干擾素的序列。
第3圖：rSIFN－co的野生型HIV之抑制作用的圖。
使用EXCEL且以螢光素酶(Luciferase)作Y軸以及rSIFN－co的濃度作X軸。清楚的逆向劑量依賴反應已經顯示。
第4圖：rSIFN－co的抗藥性HIV之抑制作用的圖，使用EXCEL且以螢光素酶作Y軸與rSIFN－co的濃度作X軸。清楚的逆向劑量依賴反應已經顯示。
第5圖：流行性感冒病毒的rSIFN－co抑制作用：於左方，控制井係顯示以添加流行性感冒病毒而不添加干擾素，該等細胞具有明顯的CPE，諸如：細胞的圓形化、細胞壞死、反射光的減少以及脫落。於右方，實驗井係顯示包括流行性感冒病毒以及10奈克/毫升(ng/ml)濃度的rSIFN－co具有相當於正常細胞的型態。
<110> 輝陽科技美國公司(HUIYANGTECH(USA),INC)
<120> 重組型超化合物干擾素之用途
<130> 1005-B-TW
<140> 95107930
<141> 2006-03-09
<150> 60/659,925
<151> 2005-03-09
<160> 6
<210> 1
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重組人類干擾素之序列
<400> 1
<210> 2
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<223> 編碼重組人類干擾素
<400> 2
<210> 3
<211> 504
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<223> 編碼重組人類干擾素
<400> 3
<210> 4
<211> 120
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<213> 人工序列
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<223> 重組人類干擾素之序列
<400> 4
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<223> 編碼重組人類干擾素
<400> 5
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> CDS
<223> 編碼重組人類干擾素
<400> 6

Claims (5)

  1. 一種用於製作治療嚴重急性呼吸道徵候群的醫藥組成物的重組干擾素的用途，其中該干擾素由SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列編碼而成，其中該重組干擾素與具有如SEQ ID NO.1所示相同氨基酸序列但並不是由SEQ ID NO.2所示之多核苷酸序列編碼構成的干擾素相比，重組型干擾素具有不同的空間構象和強化生物活動的能力。
  2. 一種用於製作治療人類免疫不全病毒的醫藥組成物的重組干擾素的用途，其中該干擾素由SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列編碼而成，其中該重組干擾素與具有如SEQ ID NO.1所示相同氨基酸序列但並不是由SEQ ID NO.2所示之多核苷酸序列編碼構成的干擾素相比，重組型干擾素具有不同的空間構象和強化生物活動的能力。
  3. 一種用於製作治療伊波拉病毒的醫藥組成物的重組干擾素的用途，其中該干擾素由SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列編碼而成，其中該重組干擾素與具有如SEQ ID NO.1所示相同氨基酸序列但並不是由SEQ ID NO.2所示之多核苷酸序列編碼構成的干擾素相比，重組型干擾素具有不同的空間構象和強化生物活動的能力。
  4. 一種用於製作治療流行性感冒病毒的醫藥組成物的重組干擾素的用途，其中該干擾素由SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列編碼而成，其中該重組干擾素與具有如 SEQ ID NO.1所示相同氨基酸序列但並不是由SEQ ID NO.2所示之多核苷酸序列編碼構成的干擾素相比，重組型干擾素具有不同的空間構象和強化生物活動的能力。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之用途，其特徵是該干擾素被口服投藥，經由靜脈注射、腹膜注射、皮下注射、鼻或黏膜投藥，或是經由一呼吸器藉由吸入予以投藥。
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