CN1478545A - 复合干扰素在治疗sars疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了SEQ ID NO：1所示的复合干扰素在制备治疗SARS疾病的药物中的应用。本发明还提供了一种用于治疗SARS疾病的药物组合物，它含有治疗有效量的SEQ ID NO：1所示的复合干扰素和药物载体。

Description

复合干扰素在治疗SARS疾病中的用途

技术领域

本发明涉及复合干扰素的用途，和一种用于治疗SARS(重症急性呼吸系统综合症)疾病的药物组合物。

背景技术：

干扰素是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生物活性的细胞素的总称，被广泛应用于临床治疗肝炎，炎症与癌症。哺乳动物的干扰素有α、β、γ三种型别，其中的α-干扰素又分为多种亚型。

八十年代初，科学家比较了当时已查明的13种α-干扰素的氨基酸序列及其相关功能之后，发现它们具有很多相同之处，说明它们的相似的生物活性与功能；同时它们又具有各自特异之处，这就决定了它们各自的作用专一性。综合这些相同与相异之处，美国安进(Amgen)公司设计出一种综合各种天然干扰素优点的全人工干扰素-复合干扰素(consensus interferon)(US00/5541293A，1996年7月15日，SEQ IDNO：1)。复合干扰素具有天然干扰素无法匹配的优点：A.复合干扰素集中了各种天然干扰素的优点，故而具有更强、更广谱的抗病毒作用。例如，在治疗丙型肝炎方面，干扰素α-2b的有效率略大于50％，但其中近三分之二的病人停药后病情复发，因而其净治愈率只有15-20％。与之呈鲜明对照的是，复合干扰素的总治愈率高达40％。B.对天然干扰素α-2b无法治疗的病人，复合干扰素的治愈率达17％左右；而对干扰素α-2b治疗后复发的病人，复合干扰素的治愈率高达50％。

安进公司开发的复合干扰素于1997年获美国FDA批准上市，商品名Infergen，临床上用于治疗对干扰素α-2b治疗无效的丙型肝炎。

中国四川省生物工程研究中心于2001年申请了“重组高效复合干扰素用作乙型肝炎表面抗原和e抗原抑制剂”的国际专利保护，并于2002年获得批准(WO 02/80958 A1)。

迄今为止的复合干扰素抗病毒活性的研究主要集中在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒方面，而对抗其他病毒的活性评估未见文献报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种SEQ ID NO：1所示的复合干扰素的用途。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗SARS的药物组合物。

我们在前期工作中，建立了一套复合干扰素高效表达、纯化系统，能够大量产生高纯度、高活性的复合干扰素。

本发明研究了SEQ ID NO：1所示的复合干扰素抑制引起重症急性呼吸系统综合症(又称非典型性肺炎)的冠状病毒SARS-CoV病毒感染宿主的能力，为利用复合干扰素制备用于治疗SARS-CoV病毒引起的非典型性肺炎提供一种新的方法。本发明分析了SEQ ID NO：1所示的复合干扰素在细胞培养系统中抗SARS-CoV病毒的活性，发现SEQ ID NO：1所示的复合干扰素能有效抑制SARS-CoV病毒的感染和复制。本发明发现SEQ IDNO：1所示的复合干扰素能够非常有效地抑制引起重症急性呼吸系统综合症的冠状病毒SARS-CoV病毒感染宿主细胞，抑制活性比干扰素α-2b高10倍以上。

本发明提供了一种SEQ ID NO：1所示的复合干扰素在制备治疗SARS疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗SARS疾病的药物组合物，它包括治疗有效量的SEQ ID NO：1所示的复合干扰素和药物载体。

附图说明：

图1是SEQ ID NO：1所示的复合干扰素抗SARS病毒感染活性测定图。用不同浓度SEQ ID NO：1所示的复合干扰素或干扰素α-2b(IFNα-2b)处理的细胞用SARS-CoV病毒感染，72小时后用MTT方法测定活细胞数。图1A中SARS-CoV的病毒滴度为10^-2，图1B中SARS-CoV的病毒滴度为10^-5。

实施例

下面通过优选实例对本发明做更详细的描述。

SEQ ID NO：1所示的复合干扰素抗SARS-CoV病毒的活性测定：

1.病毒滴度测定：

SEQ ID NO：1所示的复合干扰素通过本领域公知的基因表达方法生产。SARS-CoV病毒原液经10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释，取样感染于96孔板培养的Vero E6细胞，每孔100微升，重复8孔，吸附2小时，弃病毒液，分别加入含2.5％胎牛血清的MEM培养液，每孔100微升，平行做未感染阴性对照，37℃ 5％CO₂培养箱培养72小时后，培养板于倒置显微镜下观察并记录病毒感染后出现的细胞病变(CPE)，记录出现CPE的细胞孔数，按公知的Reed-Mcench法计算病毒滴度，以半数细胞感染剂量(TCID₅₀)表示。SARS-CoV病毒原液滴度的测定结果见表1。测试结果表明，高于50％组病变率为60，低于50％组病变率为7，高于50％组稀释度对数值为6，经计算，本实验例中所用SARS-CoV病毒的TCID₅₀为6.19。

2.SEQ ID NO：1所示的复合干扰素抗SARS-CoV病毒活性测定及与干扰素α-2b的比较：

Vero E6细胞常规传代，取生长优良的单层细胞1-2瓶，用胰酶消化、计数、调整细胞浓度至1×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养板、每孔100微升。待细胞达80-90％单层时，弃培养上清，分别用10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释的复合干扰素、干扰素α-2b处理24小时，每种浓度重复8孔。

分别弃复合干扰素、干扰素α-2b上清液，用10^-1、10^-2、10^-4、10^-5稀释的SARS-CoV病毒感染经干扰素处理后的Vero E6细胞，平行做病毒感染阳性对照组，未感染阴性对照组，于37℃ 5％CO₂培养箱培养，逐日观察并记录细胞病变情况，培养72小时后用MTT法测定干扰素抑制效率。

与阴性对照(正常Vero E6细胞组)，阳性对照(SARS-CoV病毒感染组)细胞形态变化比较，综合SARS-CoV病毒感染Vero E6细胞致细胞病变(CPE)的程度和MTT测定结果判定干扰素抑制病毒感染的IC₅₀，结果见表2；用MTT法测定培养观察72h后的各试验组细胞，定量评估干扰素对SARS-CoV病毒感染的抑制效率，结果见图1。

表2的结果显示，复合干扰素、IFNα-2b两种干扰素均能抑制SARS-CoV病毒感染宿主细胞，当病毒感染滴度为10^-1、10^-2时，其IC₅₀分别为10^-5、10^-4微克/微升，而降低病毒感染量(10^-4、10^-5)，其IC₅₀也降低，呈量剂对应关系，复合干扰素比干扰素α-2b的效率高10倍。图1A、B的测定值与表2的观察判断结果基本吻合，复合干扰素、干扰素α-2b的抑制效率相差10倍以上。可见，复合干扰素较干扰素α-2b抑制SARS-CoV病毒感染的效果更佳。

                  表1SARS-CoV病毒TCID₅₀的测定病毒稀释度   出现CPE孔  未出现CPE孔  CEP累计孔数  无CPE累计孔数  测定孔总数  CPE(％)10^-3            8          0            29             0            29        10010^-4            8          0            21             0            21        10010^-5            7          1            13             1            14        9310^-6            5          3            64             10           6010^-7            1          7            1              11           13        710^-8            0          8            0              19           19        0

        表2干扰素抑制SARS-CoV病毒感染细胞IC₅₀的测定

病毒滴度     复合干扰素IC₅₀    IFNα2bIC₅₀    阳性对照    阴性对照

               (μg/μl)         (μg/μl)

 10^-1          10^-4             10^-4           病变        正常

 10^-2          10^-5             10^-4           病变        正常

 10^-4          10^-5             10^-5           病变        正常

 10^-5          10^-5             10^-5           病变        正常

                     SEQUENCE LISTING<110>中国科学院微生物研究所<120>复合干扰素在治疗SARS疾病中的用途<130>I030473<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>167<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu1               5                   10                  15Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys

        20                  25                  30Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln

   35                 40                   45Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln50                  55                  60Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu65                 70                  75                   80Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp

           85                   90                  95Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu

       100                  105                 110Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile

    115                120                  125Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val

130                 135                 140Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln145                150                  155                 160Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu

           165

Claims (2)

1.SEQ ID NO：1所示的复合干扰素在制备治疗SARS疾病的药物中的应用。

2.一种用于治疗SARS疾病的药物组合物，它含有治疗有效量的SEQID NO：1所示的复合干扰素和药物载体。

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