CN1548149A - 重组α干扰素在防治呼吸系统感染制药中的应用 - Google Patents

Abstract

α干扰素现主要用于慢性病毒性感染。本发明利用冠状病毒或鼻病毒感染的人宫颈癌细胞(HELA)作为评价模型，观察不同α干扰素对引起呼吸系统感染的常见病毒的抑制效果，表明α干扰素可用于防治由冠状病毒和鼻病毒引起的疾病，包括严重的急性呼吸道综合症(SARS)，其中集成干扰素及其突变体和干扰素α1b对新型SARS病毒有更好的抑制作用。

Description

重组α干扰素在防治呼吸系统感染制药中的应用

一、技术领域

本发明属生物制药领域，主要涉及重组α干扰素(recombinant αInterferon)在制备用于防治由冠状病毒、鼻病毒等引发的疾病中的应用

二、背景技术

干扰素具有广泛的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能，其作用机理是通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内复制，增强NK细胞活性及其他免疫调节作用，有效地遏制病毒侵袭和感染的发生，并有抑制肿瘤细胞生长、清除早期病变细胞等多方面的作用。由于干扰素具有上述重要作用，因此人们对它的研究也在不断深入，并有新的干扰素分子被不断发现，目前已知的干扰素分子主要有一下9种：干扰素-α：属I型干扰素，约有23个变种，较详细研究的有约13种亚型。分子量为19-26kDa，由156-166个氨基酸残基组成，在115-151之间为保守序列；干扰素-β：属I型干扰素，主要由成纤维细胞所产生，由166个氨基酸残基组成，其中Cys31/141之间的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的。它在DNA水平上与干扰素α有30％的同源性；干扰素-γ：属II型干扰素，由T细胞和NK细胞刺激所产生。由143个氨基酸残基组成，与干扰素α和β无明显的同源性；干扰素-ω：属I型干扰素，是人白细胞干扰素的自然成分，与干扰素-α高度同源。干扰素ω结合于与干扰素-α和β同样的细胞受体；干扰素-τ：属I型干扰素，由172个氨基酸残基组成。它在反刍动物识别母体和建立孕体上起有重要作用；干扰素-δ：属I型干扰素，由149个氨基酸残基组成；干扰素-λ(1-3)：包括干扰素-λ-1、2和3，它们通过同一组受体系统进行信号传递；干扰素-κ：属I型干扰素，207个氨基酸，N端27个氨基酸是信号肽，与I型干扰素的其它成员有约30％的同源性；干扰素-ε：属I型干扰素，由189个氨基酸残基组成，N端21个氨基酸为信号肽，有一个分子内二硫键和一个游离的半胱氨酸残基。

在上述干扰素分子中，临床应用最广泛的为α家族干扰素，主要用于治疗慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、慢性粒细胞白血病、慢性宫颈炎、毛细胞白血病等近40种疾病。除了早期开发成功的干扰素α1b、α2a、α2b之外，目前在临床上使用的还有集成干扰素(IFN-con)。集成干扰素并不是自然界中存在的天然分子，它是通过比较十几种α亚型的干扰素分子，并选取其中的保守序列人工组合而成的一种分子。我单位对集成干扰素进行了系列突变体的筛选，并已申报专利(新型α干扰素突变体及其制备方法，申请号：02159950.5)。

尽管α干扰素已用于多种疾病的治疗，但主要适应症为病毒引发的慢性疾病，还没有文献报道可用于由病毒引发的急性疾病，例如SARS(severe acute respiratory syndrome)等。

SARS译为严重性急性呼吸道综合症，在我国又称为“非典型性肺炎”。2002年11月起在我国广东省发现病例，在2003年2月底，在香港发生流行，并很快传播到北美、欧洲和其它亚洲国家。经过全球科学家的共同努力，认为SARS疾病是由一种(+)链有膜的RNA病毒引起，经过形态鉴定和遗传信息分析，认为该病毒属新型冠状病毒，接近第2组。

本发明的目的在于研究用α干扰素预防和治疗包括SARS在内的由冠状病毒和鼻病毒等引发的呼吸系统疾病。

三、发明内容

由于本发明使用的干扰素的纯化方法在文献上均有详细描述，在此不予重复。另外，本发明使用的药物制剂为干扰素与可作为药物的载体、佐剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂一起组成的药物制剂。其中稀释剂包括各种具有一定的pH值和离子强度范围的稀释剂；载体为人血白蛋白等；增溶剂包括吐温、聚乙二醇等；防腐剂包括硫汞撒、间甲苯酚、苯甲醇等。由于上述内容均为本领域技术人员所公知，在此亦不予详述。

本发明重点研究了干扰素α1b、α2a、α2b和集成干扰素在细胞模型上对SARS冠状病毒和鼻病毒的抑制作用。我们分别用病人体内分离得到的SARS病毒(新型冠状病毒)、鼻病毒攻击人宫颈癌细胞(HELA)系，同时给予不同浓度的上述干扰素，观察细胞病变的抑制情况。实验结果显示，α1b、α2a、α2b在抑制由冠状病毒、鼻病毒引起的细胞病变时，效果基本相同，但集成干扰素与三者相比，在产生相同抑制效果的情况下，用量明显偏低。另外，集成干扰素对SARS病毒有较强的抑制作用，干扰素α1b对SARS病毒的抑制效果略高于干扰素α2a和α2b。

上述结果提示，α干扰素可用于治疗由SARS病毒(冠状病毒)和鼻病毒引起的疾病，其中集成干扰素和干扰素α1b对SARS病毒有更好的抑制作用。这说明，α干扰素可用于防治由冠状病毒、鼻病毒引起的呼吸系统疾病，尤其是SARS病，而相同观点未见文献报道。

四：具体实施方式

在HELA细胞培养内，采用细胞病变抑制法(CPE)法，观察不同浓度的重组干扰素对冠状病毒和鼻病毒的抑制作用。

1.材料

1)药物：重组人干扰素α1b、重组集成干扰素α及突变体(为申请号为02159950.5中的多个分子)、干扰素α2a和α2b。

2)阳性对照药物：注射用更昔洛韦。

3)细胞：人宫颈癌细胞(HELA)。

4)病毒：冠状病毒9号(SARS病人咽拭子分离株)和鼻病毒(普通感冒病人咽拭子分离株)。

2.实验方法

1)干扰素对HELA细胞的毒性测定方法

HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO₂培养24小时，加入干扰素，干扰素倍比稀释为25mg/ml～1.0ug/ml，更昔洛韦为6000ug/ml～11.7ug/ml。每浓度接种3孔，每孔100ul，同时设正常细胞对照，37℃、5％CO₂培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD₅₀)和最大无毒浓度(TD₀)。

2)在HELA细胞培养内对冠状病毒或鼻病毒的毒力测定方法(病毒CPE法)

HELA细胞以每毫升40万浓度接种96孔板，37℃、5％CO₂培养24小时，加入病毒液，病毒稀释10^-1～10^-8，8个浓度，每浓度3孔，每孔100ul，设正常细胞对照，37℃、5％CO₂培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)：以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID₅₀。

3)干扰素在HELA细胞培养内对冠状病毒和鼻病毒的抑制实验

观察不同浓度的重组干扰素在HELA细胞培养内对冠状病毒和鼻病毒的预防作用，试验采用细胞病变抑制法，计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)，判断药效。

HELA细胞以40万/毫升浓度接种96孔板，37℃、5％CO₂培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入不同浓度的重组干扰素，药物选用对细胞最大无毒浓度(TD₀)，2倍稀释10个浓度，阳更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即375ug/ml～0.73ug/ml；每浓度3孔，置37℃、5％CO₂吸附2.5小时，加入100TCID₅₀的冠状病毒或鼻病毒，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃、5％CO₂培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++～++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)，判断疗效，试验重复三次。

3.试验结果

用最小有效浓度(MIC)来评价不同干扰素对病毒的防治效果，结果见下表：

               不同α干扰素抑制细胞病变的作用结果

病毒种类	最小有效浓度(MIC)(ug/ml)
						集成干扰素α	集成干扰素α突变体	干扰素α1b	干扰素α2a	干扰素α2b
	冠状病毒9株	2.2±0.2	1.8±0.6	7.3±0.5	9.3±0.6						9.1±0.7
鼻病毒						1.6±0.1	1.9±0.4	5.4±0.3	6.8±0.5	8.6±0.5

由上表可以看出，α干扰素可用于防治由冠状病毒、鼻病毒引起的相关疾病，其中集成干扰素及其突变体和干扰素α1b有更好的抑制作用。

Claims (5)

1.重组人α干扰素在制药中的应用，其特征在于应用于防治冠状病毒和鼻病毒等引起的呼吸系统感染性疾病。

2.如权利要求1所述，其特征在于重组α干扰素为重组人干扰素αlb。

3.如权利要求1所述，其特征在于重组α干扰素为重组集成干扰素(IFN-con)及其突变体。

4.如权利要求1所述，其特征在于病原体为冠状病毒、鼻病毒。

5.如权利要求1所述，其特征在于所指的疾病为SARS病(severeacute respiratory syndrome：严重的急性呼吸道综合症)和普通感冒。