KR101842978B1 - 에즈린-유래 펩티드 및 이의 약제학적 조성물 - Google Patents

에즈린-유래 펩티드 및 이의 약제학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 의학 분야, 구체적으로, 화학 및 약제 산업 분야에 관한 것으로 에즈린-유래 펩티드, 특히 하기 화학식(1)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 관한 것이다:
[화학식 1]
X1 EKKRRETVERE X2X3
상기 식에서
각각의 X는 비-극성 아미노산 잔기이다.
상기 펩티드의 면역자극제(immunostimulatory agent)로서의 용도, 더욱 구체적으로, 항바이러스, 항균 및 항진균 감염의 치료 및 예방, 및 GI관의 질병, 특히 GI관의 궤양성 질환의 치료 용도. 본 발명은 또한 상기 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 감염 및 GI관의 궤양성 질병의 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 펩티드를 투여함을 특징으로 하는, 이들 감염 및 궤양성 질병의 치료 방법에 관한 것이다.

Description

에즈린-유래 펩티드 및 이의 약제학적 조성물{EZRIN-DERIVED PEPTIDES AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF}
본 발명은 의학 분야, 구체적으로, 화학 및 약제 산업 분야에 관한 것으로 에즈린-유래 펩티드, 특히 하기 화학식(1)의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 관한 것이다:
[화학식 1]
X1 EKKRRETVERE X2X3
상기 식에서
각각의 X는 비-극성 아미노산 잔기이다.
면역자극제(immunostimulatory agent)로서 상기 펩타이드의 용도는 더욱 구체적으로, 항바이러스, 항균 및 항진균 감염의 치료 및 예방, GI관의 질병으로 특히 GI관의 궤양성 질환의 치료 용도이다. 본 발명은 또한 상기 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 감염 및 GI관의 궤양성 질병의 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 펩티드를 투여함을 특징으로 하는, 이들 감염 및 궤양성 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
사이토빌린(cytovillin) 또는 빌린-2(villin-2)로도 알려져 있는 에즈린 단백질은 EZR 유전자에 의해 인간에서 암호화되는 단백질이다. 에즈린 단백질로부터 유래된 펩티드는 생물학적 활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있다. 본 발명의 펩티드와 가장 가까운 유사체는 14개의 아미노산 잔기를 포함하는, 약제학적 테트라데카펩티드 NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu_COOH로, 이는 HEP-1 펩티드 또는 인간 에즈린 펩티드 1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)로 알려져 있으며 HIV-감염의 치료 [R.D.Holms, AIDS prophylactics. PCT/GB95/001285, 02.06.95, WO 95/33768], 및 또한, 광범위한 세균성, 진균성, 및 바이러스성 감염의 치료용으로 개발되었다.
HEP-1 펩티드를 약 96% 포함하는, 동결건조된 약제학적 제품인 GEPON® (마케팅 권한부여 번호: PN000015/01-010911)은 러시아연방공화국에서 의학적으로 널리 제안되고 있다 [Kladova , O.V ., Kharlamova , F.S ., Shcherbakova , A.A ., Legkova , T.P , Feldfix, L.I ., Znamenskaya , A.A ., Ovchinnikova , G.S ., Uchaikin , V.F . The first experience of Hepon intranasal application in children with respiratory infections. // Pediatrics, 2002, No. 2, pp. 86-88), (Polyakova T.O., Magomedov , M.M ., Artemyev , M.E ., Surikov , E.V ., Palchun , V.T . A new approach in the treatment of chronic diseases of the pharynx // Attending Doctor, 2002, No. 4, pp. 64-65), (Novokshonov , A.A ., Uchaikin , V.F ., Sokolova, N.V ., Tikhonova , O.N ., Portnykh , O. Yu . Biocenosis -protecting therapy of intestinal infections in children. // Russian Medical Journal, special supplement "Diseases of the Digestive System", 2004, volume 6, No. 1), (Parfenov , A.I . The activator of the local immunity Hepon in the complex treatment of dysbiotic disorders of the intestine. // Experimental and Clinical Gastroenterology , 2003, 3, pp. 66-69),. (Tishchenko , A.L . A new approach in the treatment of recurrent urogenital candidiasis . // Attending Doctor, 2002, No. 3, pp. 46-47), (Telunts , A.V . Treatment of candidiasis in infants. // Questions of Gynecology, Obstetrics, and Perinatology , 2004, vol. 3, No. 4, pp. 89-90), (Ataullakhanov , R.I ., Holms , R.D ., Katlinsky , A.V ., Pichugin A.V ., Papuashvili , M.N ., Shishkova , N.M . Treatment with Hepon immunomodulator increases the efficacy of the immune control of opportunistic infections in HIV-infected patients. // Allergy, Asthma, and Clinical Immunology, 2002, No. 10, pp. 3-11), (Cherednichenko , T.V ., Uchaikin , V.F ., Chaplygina, G.V ., Kurbanova , G.M . A new efficient treatment of viral hepatitis.// Attending Doctor, 2003, No. 3, pp. 82-83), (Gorbarets , I.P ., Voronkova, N.V ., Lopatina , T.V ., Ivanovskaya , V.N ., Braginsky , D.M ., Blokhina, N.P ., Malyshev , N.A . The combined use of Hepon drug product and recombinant interferon-alpha in the patients with chronic hepatitis C increases the efficiency of antiviral treatment and reduces side effects of the therapy.// Hepatology , 2003, No. 4, pp. 23-28), (Lazebnik , L.B ., Zvenigorodskaya, L.A ., Firsakova , V. Yu ., Pichugin , A.V ., Ataullakhanov , R.I . The application of Hepon immunomodulator in the treatment of erosive ulcerous lesions of gastroduodenal zone.// Experimental and Clinical Gastroenterology , 2003, No. 3, pp. 17-20), (Malakhova , N.S ., Pichugin , A.V ., Khalif , I.L ., Ataullakhanov, R.I . The application of Hepon immunomodulator for the treatment of nonspecific ulcerative colitis.// Farmateka , 2005, No. 6 [101], pp. 105-108), Dudchenko , M.A ., Lysenko , B.F ., Chelishvili , A.L ., Katlinsky , A.V., Ataullakhanov , R.R . Complex treatment of trophic ulcers.// Attending Doctor, 2002, No. 10, pp. 72-75), (Bardychev , M.S . Treatment of local radiation injuries with the activator of local immunity.// Russian Medical Journal, 2003, volume 11, No. 11 (183), pp. 646-647). Salamov G., R.Holms, W. Bessler, R. Ataullakhanov. HIV 감염된 환자에서 C형 간염 감염을 인간 에즈린 펩티드 1(HEP 1)을 사용한 치료. Arzneimittel-Forschung (Drug Research) 2007; 57(7): 497-504].
HEP-1은 항-바이러스성 C형 간염 생물학적 활성을 갖고 있으며 C형 간염 환자의 치료용으로 사용될 수 있다 [R.D.Holms, R.I.Ataullakhanov. HCV combination therapy. PCT/GB2004/000330, 27.01.2004, WO 2004067024 A2].
HEP-1은 궤양치료성 생물학적 활성을 갖고 있으며 위장관의 궤양성 질병의 치료용으로 사용될 수 있다 [R.D.Holms, R.I.Ataullakhanov. The use of peptides in anti-ulcer therapy. PCT/GB2006/004390, 23.11.2006, WO/2007/060440].
본 발명자들은 합성적으로 제조되고 면역자극 활성이 높은 신규한 펩티드를 개발하였다. 생물학적 시험에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 펩티드 및 이의 약제학적 조성물은 GEPON® 약물 제품의 주성분인 HEP-1 펩티드의 활성을 능가하는 높은 면역자극 활성을 갖는다.
본 발명의 첫번째 양태로, 하기 화학식(1)의 아미노산 서열(서열번호: 5)을 포함하는 펩티드가 제공된다:
[화학식 1]
X1 EKKRRETVERE X2X3
상기 식에서
각각의 X1, X2 및 X3은 비-극성 아미노산 잔기이다.
비-극성 아미노산 잔기는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 메티오닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판으로 이루어진 군 및/또는 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구현양태로, X1, X2 및/또는 X3이 작은 R기를 갖는 비-극성 아미노산, 특히, 글리신, 알라닌 및/또는 발린, 및/또는 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구현양태로, 각각의 X1, X2 및 X3이 글리신, 알라닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현양태로, X1, X2 및/또는 X3이 모두 동일한 아미노산일 수 있다. 바람직한 구현양태로, X1, X2 및 X3 중 적어도 1개가 글리신이다. 더욱 바람직한 구현양태로, X1, X2 및 X3 중 적어도 2개가 글리신이다. 가장 바람직한 구현양태로, 각각의 X1, X2 및 X3이 글리신이다. 하나의 구현양태로, 상기 펩티드가 화학식(1)의 아미노산 서열을 포함한다:
[화학식 1]
X1 EKKRRETVERE X2X3
상기 식에서
각각의 X1, X2 및 X3은 비-극성이고, 추가로, X1, X2 및 X3 중 적어도 1개, 또는 적어도 2개가 글리신이다.
바람직한 구현양태로, 상기 펩티드가 서열 GEKKRRETVEREGG을 갖는다.
본 발명에서, 1개의 문자 코드가 다양한 아미노산을 표시하기 위하여 사용되고 있다. 3개의 문자와 1개의 문자 코드를 사용하는 것은 다음과 같이 언급될 수도 있다: 글리신 (G 또는 Gly), 알라닌 (A 또는 Ala), 발린 (V 또는 Val), 류신 (L 또는 Leu), 이소류신 (I 또는 Ile), 프롤린 (P 또는 Pro), 페닐알라닌 (F 또는 Phe), 티로신 (Y 또는 Tyr), 트립토판 (W 또는 Trp), 라이신 (K 또는 Lys), 아르기닌 (R 또는 Arg), 히스티딘 (H 또는 His), 아스파르트산 (D 또는 Asp), 글루탐산 (E 또는 Glu), 아스파라긴 (N 또는 Asn), 글루타민 (Q 또는 Gln), 시스테인 (C 또는 Cys), 메티오닌 (M 또는 Met), 세린 (S 또는 Ser) 및 트레오닌 (T 또는 Thr). 잔기가 아스파르트산 또는 아스파라긴일 수 있는 경우, 기호 Asx 또는 B가 사용될 수 있다. 잔기가 글루탐산 또는 글루타민일 수 있는 경우, 기호 Glx 또는 Z가 사용될 수 있다. 문맥에 달리 명시되지 않는 한, 아스파르트산에 대한 언급은 아스파르테이트를 포함하며, 글루탐산은 글루타메이트를 포함한다.
용어 펩티드는 본 명세서에 개시되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 당업자에 의해 적합하거나 요구되는 것으로 간주되는 것과 같이, 펩티드가 분해되는 것으로부터 보호하기 위하여 또는 펩티드의 생체이용율 및/또는 생체적합성을 증가시키기 위하여 펩티드를 변형시킬 수 있다 (예를 들면, C 또는 N 말단에서). "본 발명의 펩티드"와 관련 있는 특징들은 상기 화학식으로 명시되는 아미노산 서열에 대등하게 적용됨을 알아야 한다.
본 발명의 펩티드는 임의의 길이일 수 있는데, 단, 상기 아미노산 서열은 화학식(1)을 포함하여야 한다:
[화학식 1]
X1 EKKRRETVERE X2X3
상기 식에서
각각의 X는 본 명세서에 기재된 바와 같은 비-극성 아미노산 잔기이다.
일부 구현양태로, 상기 펩티드는 길이가 14 내지 25개의 잔기, 예를 들면, 길이가 14 내지 20개의 잔기, 또는 길이가 14 내지 18개의 잔기이고 화학식(1)의 아미노산 서열 (또는 이의 추가의 정의된 구현양태)을 포함한다. 일부 구현양태로, 상기 펩티드는 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 잔기이고 화학식(1)의 아미노산 서열 (또는 이의 추가의 정의된 구현양태)을 포함한다. 추가의 구현양태로, 상기 펩티드는 길이가 14 내지 25개의 잔기, 예를 들면, 길이가 14 내지 20개의 잔기, 또는 길이가 14 내지 18개의 잔기이고 서열번호: 1 (GEKKRRETVEREGG)의 서열을 포함한다. 일부 구현양태로, 상기 펩티드는 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 잔기이고 서열번호: 1 (GEKKRRETVEREGG)의 서열을 포함한다. 하나의 구현양태로, 상기 펩티드는 길이가 14개와 18개 사이의 잔기이고 화학식(1)의 아미노산 서열을 포함한다:
X1 EKKRRETVERE X2X3
상기 식에서
각각의 X1, X2 및 X3은 비-극성이고, 추가로, X1, X2 및 X3 중 적어도 2개가 글리신이다.
바람직한 구현양태로, 본 발명의 펩티드는 길이가 아미노산 적어도 14개이고 서열번호: 1 (GEKKRRETVEREGG)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 펩티드는 길이가 14개의 아미노산 잔기이다. 본 발명의 가장 바람직한 구현양태로, 펩티드가 NH2_Gly-Glu-Lys-Lys-Arg-Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Gly-Gly_COOH의 서열 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG) (본 명세서에서 HP-V2로 언급됨)을 갖는다.
본 발명의 목표는 면역자극 활성이 향상된 펩티드 화합물의 범위를 확장시키는 것이다. 또한, 본 발명의 목표는 특허청구되어 있는 펩티드 및 공지의 에즈린 펩티드를 기준으로 면역자극 활성이 최고이고 작용 범위가 넓은 약제학적 조성물의 제조이다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 2를 포함하거나 이들로 이루어진 펩티드와 비교할 때 더 높은 면역자극 프로파일 및/또는 더 높은 항바이러스 활성을 갖는다. 면역자극 및 항바이러스 활성은 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 상기 펩티드의 면역학적 활성을 J-96 세포 (예를 들어, IFN-α, IL-1β 및 IL-6)에서 사이토킨 mRNA의 합성에 대한 효과에 따라서 평가할 수 있다. 항바이러스 활성은 뇌심근염 바이러스(ECM)에 대한 세포독성 효과에 따라서 및/또는 EMC 바이러스 복제를 억제하는데 있어서 상기 펩티드에 대한 IC50에 따라서 측정할 수 있다. 기타 방법들이 당업자에게 자명할 것이다.
목적하는 목표는 화학식(1)의 서열을 포함하는, 제안된 신규 펩티드, 및 본 명세서에서 논의되는 바와 같은 이의 유도체, 더욱 특히 서열번호 1: GEKKRRETVEREGG에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 이들 펩티드는 합성으로 제조되며 높은 면역자극 활성을 갖는다. 데이타베이스 http://research.bioinformatics.udel.edu/peptidematch/index.jsp에서 상기 펩티드의 조사와 데이타베이스 http://www.uniprot.org/blast/에서 상기 단백질 서열의 조사로 14개의 아미노산 잔기 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)를 포함하는, 상기 펩티드 (HP-V2)의 신규성이 확인되었다.
생물학적 시험에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 펩티드와 이의 약제학적 조성물은 GEPON® 약물 제품의 주성분인 HEP-1 펩티드의 활성을 능가하는, 높은 면역자극 활성을 갖는다.
공지의 에즈린 펩티드 HEP-1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE), 및 2종의 더 작은 펩티드: 이후 HP1-5로 정의되는 화학식 NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg_COOH의 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR), 및 이후 HP6-14로 정의되는 화학식 NH2_Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu_COOH의 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)가 본 발명의 펩티드와 함께 약제학적 조성물의 제조용으로 사용되었다. 상기에서 후술한 2종의 펩티드는 HEP1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)의 절단 산물이며 이전에 기재된 것들과 동일한 서열을 갖는다 [R.D.Holms. Regulatory/unfolding peptides of ezrin. PCT/GB00/03566, 15.09.2000, WO 01/025275]. HP1-5 펩티드와 HP6-14 펩티드는 2종의 세틀라이트 펩티드(satellite peptide)로, 이들은 GEPON® 약물 제품에서 불순물로 확인되었다.
일부 구현양태로, 본 발명의 펩티드를 HEP-1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE), 또는 이후 HP1-5로 정의되는 화학식 NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg_COOH의 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR), 또는 이후 HP6-14로 정의되는 화학식 NH2_Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu_COOH의 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)와 조합할 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 본 명세서에 기재되는 바와 같은 펩티드 조합물은 의학분야에서, 예를 들어, 바이러스, 세균 및 진균 감염의 치료 및 예방용뿐만 아니라 점막 및 연부조직의 궤양 질병의 치료용으로 유용할 수 있다.
본 발명의 두번째 양태로, 본 발명의 펩티드 (예로서, 화학식(1)의 펩티드), 특히 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드가 의학적 용도로 제공된다. 특정의 의학적 용도에는 감염의 치료 또는 예방이 포함된다. 상기 감염은 바이러스, 세균 또는 진균성 감염일 수 있다. 본 발명의 추가의 구현양태로 소화관 점막의 궤양화, 예로서 위, 대장, 십이지장 또는 소장의 궤양의 치료 또는 예방, 및 위, 대장, 십이지장 또는 소장의 궤양과 관련한 질병 및/또는 질환, 및 과민성 대장 증후군(IBS)을 포함한 염증성 장질환의 치료 또는 예방을 포함한다. 본 발명의 펩티드는 또한 궤양성 대장염 및 크론씨병(Crohn's disease)의 치료 또는 예방용으로 제공된다. 바람직한 구현양태로, 본 발명의 펩티드가 하부 소화관 염증 및/또는 궤양화의 치료 또는 예방용으로 제공된다.
또한, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 용도로, 본 발명의 펩티드 (예로서, 화학식(1)의 펩티드, 특히 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)가 제공된다. 본 발명의 일부 구현양태로, 상기 펩티드가 개체에서 인터페론의 내인성 생산을 자극하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 또한 MAPK/ERK 시그널화 경로의 활성화를 자극하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현양태로, 본 발명의 펩티드를 HEP-1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE), 또는 이후 HP1-5로 정의되는 화학식 NH2_Thr-Glu-Lys-Lys-Arg_COOH의 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR), 또는 이후 HP6-14로 정의되는 화학식 NH2_Arg-Glu-Thr-Val-Glu-Arg-Glu-Lys-Glu_COOH의 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)와 조합할 수 있다. 예를 들어, 화학식(1)의 펩티드, 특히 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 서열번호: 2, 3 또는 4 중 1종 이상과 조합할 수 있다. 그러한 조합물은 감염의 치료 또는 예방을 포함한, 본 발명의 의학적 양태에 있어서 유용하다. 상기 감염은 바이러스, 세균 또는 진균성 감염일 수 있다. 본 발명의 펩티드의 조합물은 또한 소화관 점막의 궤양화, 예로서 위, 대장, 십이지장 또는 소장의 궤양의 치료 또는 예방, 및 위, 대장, 십이지장 또는 소장의 궤양과 관련한 질병 및/또는 질환, 및 과민성 대장 증후군(IBS)을 포함한 염증성 장질환의 치료 또는 예방에 유용하다. 본 발명의 펩티드는 또한 궤양성 대장염 및 크론씨병의 치료 또는 예방용으로 제공된다. 바람직한 구현양태로, 본 발명의 펩티드 조합물이 하부 소화관 염증 및/또는 궤양화의 치료 또는 예방용으로 제공된다.
본 발명의 구현양태는 또한 본 발명의 펩티드 (예로서, 화학식(1)의 펩티드, 특히 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 특징으로 하는, 감염, 위, 대장, 십이지장 또는 소장의 궤양, 위, 대장, 십이지장 또는 소장의 궤양과 관련한 질병 및/또는 질환, 과민성 대장 증후군(IBS), 궤양성 대장염 및 크론씨병의 치료 또는 예방법으로 확장된다. 상기 감염은 바이러스, 세균 또는 진균성 감염일 수 있다. 본 발명의 펩티드는 치료적으로 유효한 양으로 투여하며 1종 이상의 다른 약제학적 활성 화합물과 함께 투여할 수 있다. 특히, 본 발명의 펩티드는 서열번호: 2, 3 및/또는 4의 펩티드 1종 이상과 조합하여 투여할 수 있다.
따라서, 본 발명의 펩티드 (예로서, 화학식(1)의 펩티드, 특히 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)와 서열번호: 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 조합물이 의학적 용도로 제공된다. 그러한 의학적 용도에는 감염 (예로서, 바이러스, 세균 또는 진균성 감염), 소화관 점막의 궤양화 (예로서, 위궤양, 대장 궤양, 십이지장 궤양 및 소장 궤양), 또는 염증성 장질환 또는 염증성 장질환과 관련한 질병 또는 질환 (예로서 IBS, 궤양성 대장염 또는 크론씨병)의 치료 또는 예방이 포함된다. 바람직한 구현양태로, 본 발명의 펩티드가 하부 소화관 염증 및/또는 궤양화의 치료 또는 예방용으로 제공된다. 그러한 의학적 용도에는 개체에서의 면역 반응의 자극이 또한 포함된다.
바람직한 구현양태로, 본 발명의 펩티드가 HEP-1, HP1-5 또는 HP6-14와 함께 사용될 경우, 추가의 펩티드는 서열번호: 2, 3, 또는 4의 아미노산 서열로 이루어져 있다.
또한, 치료적으로 유효한 양의 본 발명의 펩티드 (예로서, 화학식(1)의 펩티드, 특히, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드)를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 특징으로 하는, 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다.
본 발명의 세번째 양태로, 본 발명의 펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명의 일부 구현양태로, 상기 약제학적 조성물이 추가의 약제학적 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 상기 약제학적 조성물이 HEP-1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE), HP1-5 (서열번호 3: TEKKR), 또는 HP6-14 (서열번호 4: RETVEREKE)를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 하나의 구현양태로, 본 발명은 길이가 14 내지 18개의 잔기인 펩티드 [상기 펩티드는 서열 X1 EKKRRETVERE X2X3 (여기에서, 각각의 X1, X2 및 X3은 비-극성이고, 추가로, X1, X2 및 X3 중 적어도 2개가 글리신이다)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다], 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 다른 약제학적 활성 물질, 예로서 항-바이러스제, 항-세균제, 항-진균제, 진통제 및/또는 염증치료제를 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 임의의 통상적인 애주번트(adjuvant) 및/또는 생리학적으로 허용되는 희석제를 사용하여 제형화할 수 있다.
약물 운반 당업자가 통상적으로 사용하는 필러, 담체, 방부제, 및 안정화제가 상기 제공되는 약제학적 조성물의 제조를 위하여 허용되는 담체 또는 필러로 사용될 수 있다. 주사제의 경우, 증류수 또는 생리식염수가 우선적으로 사용된다.
상기 약제학적 조성물은 적합한 경로를 통하여, 예를 들면, 경구적으로 (구강 또는 설하적(sublingual) 경로 포함), 직장, 코, 국소 (구강, 설하 또는 경피적 경로 포함), 질 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 또는 피내) 경로를 통한 투여용으로 채택될 수 있다. 그러한 조성물은 제약 분야에 공지되어 있는 임의의 방법으로, 예를 들면, 활성 성분을 담체(들) 또는 부형제(들)과 멸균 조건하에서 혼합함으로써 제조될 수 있다. 특정의 구현양태로, 본 발명의 펩티드를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물이 글루코오스 정제와 같은, 경구 투여용 정제의 형태로 존재한다. 일부 구현양태로, 상기 정제가 불용성이다.
경구 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물은 캡슐제 또는 정제와 같은 별개의 유니트로서; 분말제 또는 과립제로서; 용액제, 시럽제 또는 현탁제로서 (수성 또는 비-수성 액제로; 또는 식용성 포움제 또는 휘핑으로서; 또는 유액제로서) 제공될 수 있다. 바람직한 구현양태로, 본 발명의 펩티드를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물이 경구 투여용 정제의 형태로, 예로서 글루코오스 정제의 형태로 존재한다. 일부 구현양태로, 상기 정제가 불용성이다.
본 발명의 일부 구현양태로, 상기 펩티드가 동결건조된 분말 또는 과립의 형태로 제공된다.
정제 또는 경질 젤라틴 캡슐제용으로 적합한 부형제로는 락토오스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염이 있다. 연질 젤라틴 캡슐제와 함께 사용하기에 적합한 부형제의 예로는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고체, 또는 액체 폴리올 등이 있다.
용액제 및 시럽제의 제조용으로 사용될 수 있는 부형제의 예로는 물, 폴리올 및 당류(sugars)가 있다. 현탁제 제조용 오일 (예, 식물성 오일)을 사용하여 수중유(oil-in-water) 또는 유중수(water-in-oil) 현탁제를 제공할 수 있다.
경피 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물은 연장된 기간 동안 수용체의 표피와의 친밀한 접촉을 유지시키기 위하여 별개의 패치로 제공될 수 있다. 예를 들어, 활성 성분이 문헌: Pharmaceutical Research, 3 (6), page 318 (1986)에 일반적으로 기재된 바와 같이 이온영동법(iontophoresis)에 의해 패치로부터 운반될 수 있다.
국소 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물은 연고, 크림제, 현탁제, 로션, 분말제, 용액제, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로 제형화될 수 있다. 눈 또는 기타 외부 조직, 예를 들어 입 및 피부의 감염의 경우, 상기 조성물을 국소용 연고 또는 크림으로 적합하게 도포한다. 연고로 제형화할 경우, 활성 성분을 파라핀계 또는 수-혼화성 연고 기재와 함께 사용할 수 있다. 달리, 활성 성분을 수중유 크림 기재 또는 유중수 기재와 함께 크림으로 제형화할 수 있다. 눈으로의 국소 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물은 활성 성분이 적합한 담체, 특히 수성 용매에 용해되어 있거나 현탁되어 있는 점안제를 포함한다. 입으로의 국소 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물로는 로젠지(lozenge), 파스틸(pastille) 및 마우스 워시(mouth wash)가 있다.
직장 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물은 좌제 또는 관장제로 제공될 수 있다.
담체가 고체인, 코 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물로는 입자 크기가 예를 들어 20 내지 500 마이크론(microns) 범위인 조분말(coarse powder)이 있다. 담체가 액체인, 코 스프레이 또는 코 점적액으로 적합한 조성물로는 활성 성분의 수성 또는 오일 용액제가 있다.
흡입에 의한 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물로는 다양한 타입의 정량식 가압 에어로졸, 네뷸라이저 또는 취분기(insufflator)에 의해 생성될 수 있는 미립자 더스트(dust) 또는 미스트(mist)가 있다.
질내 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물은 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제형으로 제공될 수 있다.
비경구적 투여용으로 채택되는 약제학적 조성물로는 수성 및 비-수성 멸균 주사액(이는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제 및 제형이 의도된 수용체의 혈액과 실질적으로 등장성이 되도록 만드는 용질을 함유할 수 있다); 및 현탁화제 및 농후제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제가 있다. 주사용 용액제용으로 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들면, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 있다. 상기 조성물은 단위-용량 또는 다중 용량 용기, 예를 들면, 밀봉 앰풀 및 바이알로 제공될 수 있으며, 사용 직전, 탑재된 멸균 액체, 예를 들어, 주사용 물을 첨가하는 것만을 요구하는 냉동-건조(동결건조) 조건하에 보관될 수 있다. 즉석 주사 용액제 및 현탁제를 멸균 분말제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 색소, 방향제, 염 (본 발명의 물질 자체가 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다), 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 물질 외에 치료적 활성 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 치료하고자 하는 질병 또는 질환, 치료하고자 하는 개인의 연령 및 조건 등에 따라서 넓은 제한범위 사이에서 변화될 수 있으며, 궁극적으로는 의사가 사용할 적절한 투여량을 결정하게 될 것이다.
그러한 조성물은 인간 또는 수의학용으로 제형화될 수 있다. 문맥에 명백하게 달리 암시되지 않는 한, 본 발명은 인간 뿐만 아니라 동물에도 대등하게 적용되는 것으로 이해되어야 한다.
하나의 구현양태로, 본 발명은 길이가 14 내지 18개 사이의 잔기인 펩티드 [상기 펩티드는 서열 X1 EKKRRETVERE X2X3 (여기에서, 각각의 X1, X2 및 X3은 비-극성이고, 추가로, X1, X2 및 X3 중 적어도 2개가 글리신이다)을 갖는 아미노산 서열을 포함한다], 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러를 포함하는, 경구 투여용 정제, 특히 글루코오스 정제의 형태의 약제학적 조성물을 제공한다. 더욱 바람직한 구현양태로, 상기 펩티드가 서열 GEKKRRETVEREGG을 갖는다.
본 발명은 적합한 약제학적 조성물의 제조뿐만 아니라 본 명세서에 명시된 용도 중 임의의 것으로 사용하기 위한, 의학적 용도의 의약 제조에 있어서 본 발명의 펩티드의 용도로 확장된다.
본 발명의 추가의 양태로, 본 발명의 펩티드, 특히 화학식(1)의 펩티드, 예로서 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 제공된다.
상기 핵산은 클로닝(cloning)에 의해 수득되거나 화학적 합성에 의해 생산되는 DNA, cDNA 또는 mRNA와 같은 RNA일 수 있다. 상기 DNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 단일가닥 DNA는 암호화 전사가닥(coding sense strand)일 수 있거나, 비-암호화 또는 비-전사가닥(non-sense strand)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로, 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태로, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포가 제공된다. 상기와 같은 핵산, 벡터 및 숙주세포를 제조하거나 수득하는 방법이 또한 본 발명에 포함되며 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 합성 화학에 의해 합성될 수 있으며, 예를 들면, 본 발명의 펩티드를 표준 공정을 사용하여 액상 합성법(Combinatorial Chemistry: A Practical Approach, ed. Hicham Fenniri, Oxford University Press (2000))에 의해 또는 고체상 합성법, 예를 들면, "Fmoc" 또는 "Bmoc" 합성법 (Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (Practical Approach S.), ed.s W. Chan &, Peter White, Oxford University Press (2000))으로 합성할 수 있다. 고체상 합성법이 이용되는 경우, 폴리스티렌 수지 또는 폴리아미드 수지, 또는 PEG 하이브리드 폴리스티렌 수지, 또는 PEG를 기재로하는 수지와 같은 고체상이 사용된다. 상기 합성 중에 상이한 보호기, 예를 들면, N-말단 보호기, t-Boc 또는 FMOC 보호기가 사용된다. 또한, 벤질옥시카르보닐(benzyloxycarbonyl, Z) 기 또는 알릴옥시카르보닐(allyoxycarbonyl, Alloc) 보호기, 또는 광제거가능한(photoremovable)(lithographic) 보호기, 또는 측면기 보호 기술이 이용될 수 있다. 펩티드 산물은 HPLC 분리법 또는 임의의 다른 정제 방법으로 정제한다. 헵티드 구조는 아미노산 분석, 질량분석법, 및 고성능 액체 크로마토그라피 데이타로 확인한다.
일부 예로, 고체상 방법을 사용하여 단편을 합성한 다음 용액에서 함께 커플링시킬 수 있다. 펩티드가 세포에서는 반대 방향으로 합성되지만, 상기 방법에서는 아미노산 사슬의 카르보닐기 측면으로부터 아미노기 측면으로 펩티드가 합성될 수 있다. 그러한 방법에서는 아미노-보호된 아미노산이 기판 비드 (즉, 수지 비드)에 결합하여, 카르보닐기와 수지 사이에서 공유결합을 형성한다. 이후, 아미노기가 탈-보호되어 다음번 아미노-보호된 아미노산의 카르보닐기와 반응하게 된다. 이런 사이클은 목적하는 펩티드 쇄를 형성시키기 위하여 요구될 때마다 자주 반복된다. 이어서 합성된 펩티드를 상기 공정 말기에 비드로부터 분리시킨다. 상기 펩티드 합성법에서 대개 사용되는 아미노기용 보호기는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기 (fluorenylmethyloxycarbonyl group, "Fmoc") 및 t-부틸옥시카르보닐(t-butyloxycarbonyl group, "Boc")이다. Fmoc기는 염기를 사용하여 아미노 말단으로부터 제거하는 반면 Boc기는 산을 사용하여 제거한다.
본 발명의 약제학적 조성물의 제조를 위하여 본 발명에서 사용되는, HEP-1 펩티드, HP1-5 펩티드, 및 HP6-14 펩티드는 허가된 제조업체인 "Immapharma", LLC(Moscow)에 의해 액체상 합성 방법으로 제조되었다.
본 발명의 추가의 양태로, 본 발명의 펩티드, 특히 화학식(1)에 따르는 펩티드, 예로서 서열번호: 1 또는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 제조 방법이 제공된다. 이 방법은 액체상 합성법 또는 고체상 합성법에 의한 펩티드 합성을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현양태로, 길이가 14개의 아미노산인 펩티드 (상기 아미노산 서열은 GEKKRRETVEREGG이다)가 제공된다. 상기 펩티드는 의학적으로, 특히 하부 소화관 염증 및/또는 궤양화를 치료하는데 유용하다. 상기 펩티드는 경구 투여용 정제, 특히 글루코오스 정제의 형태로 제공된다.
본 발명의 두번째 및 후속 양태에 대해 바람직한 특징은 첫번째 양태에 대해 적절히 변경한 것들과 같다.
도 1은 HEP-1 펩티드의 고성능 액체 크로마토그라피이다. Luna C18(2)컬럼, 4.6 x 250 mm, 5.0 ㎛ 입자. 이동상: A - 물, 5% ACN, 0.1% TFA; B - 0.1% TFA; 프로그램 20분간 5-25% ACN. 유속: 1 ml/분. X-축: 시간, Y-축: UV 흡광도 (mV, 상부 라인, 피크가 있음), 압력 (하부, 수평선).
도 2는 HEP-1 펩티드와 HP1-5 펩티드의 혼합물의 고성능 액체 크로마토그라피이다. Luna C18(2)컬럼, 4.6 x 250 mm, 5.0 ㎛ 입자. 이동상: A - 물, 5% ACN, 0.1% TFA; B - 0.1% TFA; 프로그램 20분간 5-25% ACN. 유속: 1 ml/분. X-축: 시간, Y-축: UV 흡광도 (mV, 상부 라인, 피크가 있음), 압력 (하부, 수평선).
도 3은 HEP-1 펩티드와 HP6-14 펩티드의 혼합물의 고성능 액체 크로마토그라피이다. Luna C18(2)컬럼, 4.6 x 250 mm, 5.0 ㎛ 입자. 이동상: A - 물, 5% ACN, 0.1% TFA; B - 0.1% TFA; 프로그램 20분간 5-25% ACN. 유속: 1 ml/분. X-축: 시간, Y-축: UV 흡광도 (mV, 상부 라인, 피크가 있음), 압력 (하부, 수평선).
도 4는 HEP-1 펩티드와 HP-V2 펩티드의 혼합물의 고성능 액체 크로마토그라피이다. Luna C18(2)컬럼, 4.6 x 250 mm, 5.0 ㎛ 입자. 이동상: A - 물, 5% ACN, 0.1% TFA; B - 0.1% TFA; 프로그램 20분간 5-25% ACN. 유속: 1 ml/분. X-축: 시간, Y-축: UV 흡광도 (mV, 상부 라인, 피크가 있음), 압력 (하부, 수평선).
도 5는 HP-V2 펩티드의 혼합물의 고성능 액체 크로마토그라피이다. Luna C18(2)컬럼, 4.6 x 250 mm, 5.0 ㎛ 입자. 이동상: A - 물, 5% ACN, 0.1% TFA; B - 0.1% TFA; 프로그램 20분간 5-25% ACN. 유속: 1 ml/분. X-축: 시간, Y-축: UV 흡광도 (mV, 상부 라인, 피크가 있음), 압력 (하부, 수평선).
도 6은 HEP-1 펩티드와 HP-V2 펩티드의 혼합물의 MALDI TOF/TOF 스펙트럼이다.
이제 본 발명은 하기 실시예를 참고하여 설명될 것이며 이들 실시예는 단지 참조를 목적으로 존재하며 본 발명에 대해 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 실시예에서는 도면의 번호를 참조한다.
실시예
본 발명의 약제학적 조성물의 제조 중 각 성분 농도를 정확하게 평가하기 위하여 고성능 액체 크로마토그라피법을 사용하였다. 본 연구의 결과로 HEP-1 펩티드와 유사한 아미노산 수를 갖는 HP-V2 펩티드를 본 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC) 조건에서 구별할 수 없는 것으로 입증되었으며, 이런 사실은 HP-V2와 HEP-1을 기본으로 하는 조성물의 정량적 함량으로의 접근을 허용하지 않는다 (실시예 4; 도 1, 도 4, 도 5). 한편, 특허청구되는 HP-V2 펩티드와 위성 펩티드 HP1-5 및 HP6-14의 정량적 조성은 이들의 양호한 분리 결과로 크로마토그램을 기준으로 용이하게 계산할 수 있다 (실시예 2, 3; 도 2, 도 3).
그러나, MALDI TOF/TOF 질량분석법은 14개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 2종의 혼합물, 특히 HP-V2로 정의되는 HP-V2 펩티드 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와 HEP-1로 정의되는 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)의 혼합물 중 각 펩티드를 명확하게 검출한다 (실시예 5; 도 6).
실시예 1. HP-V2 펩티드의 제조
HP-V2 펩티드의 합성은 알콕시벤질 폴리머를 사용하여 고체상 방법으로 수행하였다. 커플링은 1) 테트라플루오로보레이트 O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄( tetrafluoroborate O-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'- tetramethyluronium, TBTU); 또는 2) 1-히드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole, HOBT)과 N,N'-다이이소프로필카르보다이이미드(N,N'- diisopropylcarbodiimide, DIPC) 중 하나의 사용을 기본으로 하는 방법을 이용하여 수행하였다. 커플링 반응 후 미반응 아미노기가 성장중인 펩티딜-폴리머 상에서 발견되었을 때를 제외하고는, 순차적인 Fmoc-보호된 아미노산 잔기의 부착은 개별적으로 수행되었다. 펩티딜-폴리머 중 미반응 아미노기 함량에 대한 조정은 닌하이드린 테스트를 사용하여 유지하였다. 펩티드와 폴리머성 담체의 분리와 최종적인 탈차단(unblocking)을 위하여, 티오아니솔, 페놀, 에탄다이티올, 트리이소프로필실란, 및 물의 첨가와 함께 트리플루오로아세트산을 사용하였다. 목적하는 생성물의 구조와 동질성(homogeneity)은 아미노산 분석, 질량분석법, 및 고성능 액체 크로마토그라피 데이타로 확인하였다.
제공되는 HP-V2 펩티드 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)을 기본으로 하는 하기의 약제학적 조성물 뿐만 아니라 다음 펩티드와 이의 혼합물을 기본으로 하는 약제학적 조성물이 제안되었다:
HEP-1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE);
HP1-5 (서열번호 3: TEKKR);
HP6-14 (서열번호 4: RETVEREKE).
약제학적 조성물:
유효량의, 서열번호 1: GEKKRRETVEREGG에 따르는 펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러 - 그 외를 포함하는 약제학적 조성물.
유효량의, 서열번호 1: GEKKRRETVEREGG에 따르는 펩티드, 서열번호 2: TEKKRRETVEREKE에 따르는 펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러 - 그 외를 포함하는 약제학적 조성물.
유효량의, 서열번호 1: GEKKRRETVEREGG에 따르는 펩티드, 서열번호 3: TEKKR에 따르는 펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러 - 그 외를 포함하는 약제학적 조성물.
유효량의, 서열번호 1: GEKKRRETVEREGG에 따르는 펩티드, 서열번호 4: RETVEREKE에 따르는 펩티드와 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러를 포함하는 약제학적 조성물.
HP-V2 펩티드와 HEP-1, HP1-5, HP6-14 (이들은 본 발명의 약제학적 조성물의 제조용으로 사용되었다)를 포함하는 특정 혼합물이 실시예 6에서 제공된다.
HP-V2 펩티드 또는 이와 상기 언급한 펩티드의 혼합물을 0.01 mg 내지 1000 mg의 양으로 1 ml 내지 10 ml 용적의 멸균수에 용해시킨다. 투여형은 제조된 용액을 기준으로 하여 제조할 수 있으며 경구적, 항문으로, 또는 질내로, 또는 점적으로, 또는 흡입용 스프레이로 코내부에 사용할 수 있다.
HP-V2 펩티드 또는 펩티드의 조합물을 0.01 mg 내지 1000 mg의 양으로 정제 또는 캡슐제에, 또는 좌제, 또는 겔, 또는 연고 제형에 약물 운반 기술 분야에서 통상적으로 사용되는, 필러, 담체, 방부제, 및 안정화제와 함께 넣는다.
상기 언급한 약제학적 조성물 중의 HP-V2 펩티드 또는 펩티드의 조합물을 경구적, 항문으로, 또는 질 내로 사용할 수 있거나, 국소적으로 적용할 수 있는 투여형의 제조를 위하여 사용할 수 있다. 1 ml 내지 10 ml 용적의 주사용 물 또는 생리식염수에 용해된 HP-V2 펩티드 또는 펩티드 조합물을 0.01 mg 내지 1000 mg 함유하는 멸균 용액을 피하, 근육내 또는 정맥내 경로를 통한 주사로 투여한다.
실시예 2. HEP-1과 HP1-5 펩티드의 HPLC에 의한 분리
고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)를 사용하여 펩티드의 체류 시간을 기본으로 이들을 분리하였다. HEP-1과 HP1-5 펩티드의 스톡(stock) 용액은 1 내지 2 mg/ml의 농도로 이들을 탈이온수에 용해시킨 다음 기공 크기가 0.2 ㎛인 Millipore 필터를 통하여 멸균 여과함으로써 제조하였다. 80%의 HEP-1 펩티드와 20%의 HP1-5 펩티드를 함유하는 조성물은 상기 상응하는 스톡 용액을 적절한 용적으로 혼합하여 제조하였다.
HPLC는 크기가 4.6 x 250 mm이고, 5 ㎛ 입자로 충전된, Luna C18 (2) 컬럼에서 수행하였다. 이동상은 상 A와 B를 프로그램 혼합하여 제조하였는데, 이때 A는 물, 5% 아세토니트릴(ACN), 0.1% TFA를 함유하였으며, B는 0.1% TFA를 함유하였다. 20분간 프로그램식 구배 5 내지 25% 아세토니트릴(ACN)이 형성되었다. 샘플 용적은 20 ㎕였으며; 유속은 1 ml/분이었다. 피크(peak)는 상이한 체류 시간에서 이들의 UV-흡광도에 의해 자동적으로 기록되었다.
도 1은 체류 시간이 전형적으로 9와 1분 사이인 HEP-1 펩티드의 HPLC 피크를 설명한다. 도 2는 HPLC에 의한 2개의 피크, HEP-1 (RT=9.822분)과 HP1-5 (RT=3.666분)의 명확한 분리를 설명한다.
실시예 3. HEP-1과 HP6-14 펩티드의 HPLC에 의한 분리
HEP-1과 HP6-14 펩티드 및 이들의 혼합물의 스톡 용액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. HPLC에 의한 상기 펩티드들과 이들의 혼합물의 분석을 실시예 1에 기재된 바와 같이, 크기가 4.6 x 250 mm이고, 5 ㎛ 입자로 충전된, Luna C18 (2) 컬럼에서 수행하였다.
사용되는 HPLC 조건에서, HEP1과 HP6-14 펩티드의 혼합물은 2개의 피크로 명확하게 분리되었는데 (도 3), 이 중 하나는 HP6-14 펩티드에 대해 전형적인 체류시간 (RT=9.495분)을 가졌으며, 다른 하나는 HEP-1 펩티드에 대해 전형적인 체류시간 (RT=9.894분)을 가졌다.
실시예 4. HPLC에 의한 HEP-1과 HP-V2 펩티드의 혼합물의 분석
HEP-1과 HP-V2 펩티드뿐만 아니라 이들의 혼합물의 스톡 용액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 상기 펩티드와 혼합물의 HPLC 분석을 실시예 2에 기재된 바와 같이, 크기가 4.6 x 250 mm이고, 5 ㎛ 입자로 충전된, Luna C18 (2) 컬럼에서 수행하였다.
사용되는 HPLC 조건에서, HEP-1과 HP-V2 펩티드의 혼합물은 상기 컬럼으로부터 HEP-1 펩티드에 대해 전형적인 체류시간을 갖는 하나의 피크 (도 4)로 용출되었다. HP-V2 펩티드 용액만의 HPLC-분석은 상기 펩티드의 체류시간이 정말로 HEP-1 펩티드의 체류시간과 동일한 것으로 나타났다 (도 5). 이는 HP-V2와 HEP-1 펩티드를 상기 HPLC 조건으로 구분할 수 없음을 의미한다.
실시예 5. HEP-1과 HP-V2 펩티드의 혼합물의 질량분석법
HEP-1과 HP-V2 펩티드뿐만 아니라 이들의 혼합물의 스톡 용액을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. MALDI TOF 스펙트럼은 매트릭스로서 2,5-다이히드록시벤조산(2,5-dihydroxybenzoic acid)을 사용하는 Bruker Ultraflex TOF/TOF 질량분석기상에 기록되었다. HEP-1과 HP-V2 펩티드의 혼합물의 질량 스펙트럼 (도 6)은 이들의 분자 이온이 HEP-1의 경우 1818.0726(MW)이고 HP-V2의 경우 1630.9385(MW)인 두 펩티드를 명확하게 밝혀준다.
실시예 6 내지 8의 소개
하기 실시예 6 내지 8은 사용되는 모든 펩티드와 이들의 혼합물의 생물학적 활성을 증명한다. 이들 펩티드는 시험관 내(in vitro) 세포 배양에서 100 TCID50/ml의 용량에서 인터페론 생산을 유도하며, 세포변성 뇌심근염 바이러스( encephalomyocarditis)의 감염에 의해 유발된 사망으로부터 다양한 타입의 인간 세포를 보호한다.
14개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 (HP-V2) (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와, 이의 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE), 또는 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR), 또는 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)와의 조성물을 상이한 세포 배양에서 I 타입 인터페론의 생산으로 항바이러스 반응을 유도할 수 있는 이들의 능력에 대해 연구하였다. 본 발명자들은 면역자극, 항바이러스 약물, 및 인터페론 유도제를 선별하는데 널리 사용되는, 시험관내 컬쳐에서 상기 화합물의 항바이러스(인터페론-유도) 활성에 대한 통상적인 방법을 사용하였다.
상기 시험관내 방법에서, 본 발명자들은 상기 연구된 펩티드로 상이한 타입의 세포들을 전처리한 다음, 상기 세포들을 100 LD50 용량의 뇌심근염 바이러스로 감염시켰다. 감염시킨 지 24시간 후 상기 바이러스의 세포변성 효과를 측정하여 시험한 화합물이 세포에 대해 치명적인 바이러스에 대해 세포가 내성인 상태로 만들수 있는지에 대해 이들의 보호 활성을 평가하였다.
잘 알려져 있는 바와 같이, 대부분의 경우에 있어서 상기 화합물들의 그러한 보호 활성은 인터페론 유도에 근거한다 (상기 용어 "인터페론"은 세포에 의해 생산되며 바이러스의 복제를 방지하는 화합물을 의미한다). 상기 펩티드들과 이들의 조성물을 시험관내에서 상이한 농도로 사용함으로써 이들 화합물들의 항바이러스(인터페론-유도) 활성을 평가할 수 있었다.
더 낮은 것은 뇌심근염 바이러스 100 LD50 용량에서 인터페론으로 인하여 사망으로부터 세포의 50%를 보호하는 농도이며, 더 높은 것은 시험된 화합물의 항바이러스(인터페론-유도) 활성이다.
14개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 (HP-V2)(서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와, 이의 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE), 또는 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR). 또는 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)와의 조성물을 면역자극 (항바이러스, 인터페론-유도) 활성에 대해 시험하였다.
실시예 6. 인간 간암 세포주 컬쳐에서 펩티드들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성의 연구
PLC/PRF/5 (Alexander) 인간 간암 세포주를 Research Institute of Virology named after Ivanovskiy (Moscow)로부터 수득하였다. 세포 배양용 완전 배지는 10% 태소 혈청(FCS), L-글루타민 (300 ㎍/ml), 및 페니실린 (100 U/ml)이 보충된 MEM Eagle 배지를 기본으로 제조하였다.
다음과 같은 펩티드를 시험하였다:
HEP-1 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE);
HP1-5 (서열번호 3: TEKKR);
HP6-14 (서열번호 4: RETVEREKE);
HP-V2 (서열번호. 1: GEKKRRETVEREGG);
펩티드의 혼합물:
MXHP1-5+HEP-1 - 90%의 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)와 10%의 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR)의 혼합물;
MXHP6-14+ HEP-1 - 90%의 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)와 10%의 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)의 혼합물;
MXHP-V2+HP1-5 - 90%의 HP-V2 펩티드 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와 10%의 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR)의 혼합물;
MXHP-V2+HP6-14 - 90%의 HP-V2 펩티드 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와 10%의 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)의 혼합물.
MXHP-V2+HEP-1 - 95%의 HP-V2 펩티드 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와 5%의 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)의 혼합물.
펩티드를 증류수에 용해시킨 다음, 기공 크기가 0.2 ㎛인 필터에 통과시킴으로써 멸균시켜 1-2 mg/ml의 스톡 용액을 수득하였다. 0일째에, 세포를 완전 배양 배지중의 96개-웰 플레이트에 1 ml 중 200-thousands의 세포 밀도로 씨딩하였다. 1일째에, 각각의 시험 샘플의 계열희석액 (2씩 증가시키면서 24개의 계열희석액)을 상기 96개-웰 플레이트의 웰에 3중으로 제조하였다. 3일째에, 모든 컬쳐를 100 TCID50/ml 용량의 뇌심근염 바이러스 균주 "Columbia SK-Col-SK"로 감염시켰다. 마지막으로, 4일째에, 상기 바이러스의 세포변성 효과를 상이한 농도의 시험 펩티드의 존재하에서 또는 펩티드 없는 컬쳐(대조군)에서 Leitz 도립현미경을 사용하여 평가하였다.
약물 제품의 항바이러스 효과는 100 TCID50/ml 용량에서 뇌심근염 바이러스에 의해 유발되는 사망으로부터 세포의 50%를 보호하는 이들의 최소 농도를 기준으로 하여 평가하였다. 인터페론 적정농도(titre) (U/ml)는 100 TCID50/ml 용량에서 뇌심근염 바이러스에 의해 유발되는 사망으로부터 세포의 50%를 보호한, 약물 제품의 최대 희석액에 역인 값으로 계산하였다.
수득한 데이타가 표 1에 제시되어 있다. 시험한 펩티드 및 이들의 조합물이 모두 인간 간암 세포에서 뇌심근염 바이러스의 복제를 방지함이 분명하다. 상기 펩티드들은 인터페론 생산을 유도함으로써 바이러스의 세포변성 효과로부터 간암 세포를 보호하였다. 상기 펩티드들과 이들의 조성물의 효과는 상이하였다. 최고 수준의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성은 HP-V2 펩티드와 이의 HP1-5 펩티드의 조성물로 기록되었다.
PLC/PRF/5(Alexander) 인간 간암 세포주에서 펩티드들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성
화합물 시험된 최고 농도 (㎍/ml) 항바이러스 효과
(㎍/ml) † 		유도된 인터페론의 적정농도
(U/ml) ‡
HEP-1 100 3.0 320
HP1-5 100 1.6 640
HP6-14 100 0.78 1280
MXHP1-5+ HEP-1 200 62.5 16
MXHP6-14+ HEP-1 200 62.5 16
MXHP-V2+HP1-5 100 0.1 10240
MXHP-V2+HP6-14 100 3.0 320
MXHP-V2+HEP1 100 0.78 1280
HP-V2 100 0.78 1280
각주:
†항바이러스 효과는 100 LD50의 뇌심근염 바이러스 감염 결과로서 사망으로부터 세포의 50%를 보호하는, 화합물의 최소 농도로 나타낸다
‡유도된 인터페론의 적정농도(titre)는 100 LD50의 뇌심근염 바이러스의 감염 결과인 사망으로부터 세포의 50%를 보호한, 화합물의 최대 희석액에 역인 값으로 계산하였다.
실시예 7. 인간 자궁경부암 세포주 컬쳐에서 펩티드들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성의 연구
HELA 인간 자궁경부암 세포주를 Research Institute of Virology named after Ivanovskiy (Moscow)로부터 수득하였다. 세포 배양용 완전 배지, 펩티드들 및 이들의 조성물뿐만 아니라, 이들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성에 대한 평가 방법은 실시예 5에 기재된 바와 동일하였다.
수득한 데이타가 표 2에 제시되어 있다. 시험한 펩티드 및 이들의 조합물이 모두 인간 자궁경부암 세포에서 뇌심근염 바이러스 감염의 발달을 방지함이 분명하다. 상기 펩티드들은 인터페론 생산을 유도함으로써 바이러스의 세포변성 효과로부터 자궁경부암 세포를 보호하였다. 상기 펩티드들과 이들의 조성물의 효과는 상이하였다. 최대 항바이러스 (인터페론-유도) 활성은 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR)와 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE) 뿐만 아니라 이의 HP-V2 펩티드와의 조성물을 사용할 때 검출되었다.
HELA 인간 자궁경부암 세포주에서 펩티드들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성
화합물 시험된 최고 농도 (㎍/ml) 항바이러스 효과
(㎍/ml) † 		유도된 인터페론의 적정농도 (U/ml) ‡
HEP-1 1000 3.9 256
HP1-5 1000 0.49 2048
HP6-14 1000 0.49 2048
MXHP1-5+ HEP-1 2000 7.8 256
MXHP6-14+ HEP-1 2000 1.95 1024
MXHP-V2+HP1-5 1000 0.97 1024
MXHP-V2+HP6-14 1000 0.49 2048
HP-V2 1000 7.8 128
각주:
†항바이러스 효과는 100 LD50의 뇌심근염 바이러스 감염 결과로서 사망으로부터 세포의 50%를 보호하는, 화합물의 최소 농도로 나타낸다
‡유도된 인터페론의 적정농도는 100 LD50의 뇌심근염 바이러스의 감염 결과로서 사망으로부터 세포의 50%를 보호한, 화합물의 최대 희석액에 역인 값으로 계산하였다.
실시예 8. GH ( Girardi Heart) 인간 상피 세포주 컬쳐에서 펩티드들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성의 연구
Girardi Heart 인간 상피 세포주를 Research Institute of Virology named after Ivanovskiy (Moscow)로부터 수득하였다. 세포 배양용 완전 배지, 펩티드들 및 이들의 조성물뿐만 아니라, 이들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성에 대한 평가 방법은 실시예 5에 기재된 바와 동일하였다.
수득한 데이타가 표 3에 제시되어 있다. 시험한 펩티드 및 이들의 조합물이 모두 Girardi Heart 인간 상피 세포주에서 뇌심근염 바이러스 감염의 발달을 방지함이 분명하다. 시험한 펩티드들과 이들의 조성물은 인터페론 생산을 유도하고 상기 바이러스의 세포변성 효과로부터 Girardi Heart 상피 세포주를 보호하는데 있어서 매우 효과가 있었다. 최대 항바이러스 (인터페론-유도) 활성은 HEP-1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)를 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR)와 HP6-14 펩티드 (서열번호 4: RETVEREKE)와 함께 사용할 때뿐만 아니라, HP-V2 펩티드 (서열번호 1: GEKKRRETVEREGG)와 HP1-5 펩티드 (서열번호 3: TEKKR)의 조합 및 HEP1 펩티드 (서열번호 2: TEKKRRETVEREKE)의 조합을 사용할 때 검출되었다.
Girardi Heart 인간 상피 세포주에서 펩티드들의 항바이러스 (인터페론-유도) 활성
화합물 시험된 최고 농도 (㎍/ml) 항바이러스 효과
(㎍/ml) † 		유도된 인터페론의 적정농도
(U/ml) ‡
HEP-1 1000 0.0015 655 360
HP1-5 1000 0.0015 655 360
HP6-14 1000 0.006 163 840
MXHP1-5+ HEP-1 2000 0.0005 4 194 304
MXHP6-14+ HEP-1 2000 0.0005 4 194 304
MXHP-V2+HP1-5 1000 0.0002 5 242 880
MXHP-V2+HP6-14 1000 0.006 163 840
MXHP-V2+HEP1 1000 0.0008 1　310 720
HP-V2 1000 0.0015 655 360
각주:
†항바이러스 효과는 100 LD50의 뇌심근염 바이러스 감염 결과로서 사망으로부터 세포의 50%를 보호하는, 화합물의 최소 농도로 나타낸다
‡유도된 인터페론의 적정농도는 100 LD50의 뇌심근염 바이러스의 감염 결과로서 사망으로부터 세포의 50%를 보호한, 화합물의 최대 희석액에 역인 값으로 계산하였다.
생물학적 시험의 설명과 함께 제공된 실시예와 표가 증명하는 바와 같이, 제안되는 신규한 HP-V2 펩티드는 높은 면역자극 활성을 가지며, 이는 공지의 HEP-1 펩티드의 활성과 비교할 때 동일하거나 (표 3) 4배 더 높다 (표 1). 또한, HEP-1 펩티드 및 이의 조성물에 대해 알려져 있는 면역자극 활성과 작용 범위보다 수배 더 높은, 최고의 면역자극 활성과 넓은 작용 범위를 갖는 약제학적 조성물은 특허청구되는 HP-V2 펩티드와 공지의 에즈린(Ezrin) 펩티드를 기본으로 수득되었다.
실시예 9: 조직 수복과 세포 증식에서의 분자 메카니즘에 대한 펩티드의 영향을 밝히기 위한 연구
다음 연구는 본 발명의 펩티드(HP-V2)가 조직 수복과 세포 증식의 분자 메카니즘에 연관되어 있다는 증거를 제공한다. 세포 증식의 분자 메카니즘, 예를 들어, TGFβ 발현의 조절에 영향을 주는 화합물은 소화관 수복(repair)과 연관된 것으로 알려져 있다 (Monteleone et al,, "Mongersen, an Oral SMAD7 Antisense Oligonucleotide, and Crohn's Disease", New England Journal of Medicine, 372:1104-1113). 또한, 아키타 등(Akita et al., "Basic Fibroblast Growth Factor in Scarless Wound Healing", Adv . Wound Care, 2013, 2(2):44-49)은 임상응용 및 기본 메카니즘에 있어서 무반흔 상처 회복(scarless wound healing)에서의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 잇점과 역할에 대해 논하고 있다. bFGF는 상처와 궤양을 치료하는데 널리 사용되는 당단백질이다. bFGF는 어떠한 타입의 상처에도 용이하게 적용할 수 있어 색상, 조직, 및 견고함(firmness)에 있어서 좋은 결과를 가져온다. 첸 등(Chen et al., "NGF Accelerates Cutaneous Wound Healing by Promoting the Migration of Dermal Fibroblasts via the PI3K/Akt-Rac1-JNK and ERK Pathways", BioMed Research International, Volume 2014, Article ID 547187)은 NGF가 래트에서 피부 절개 상처의 치유를 크게 촉진시켰으며 NGF에 의해 유도된 섬유아세포 이동이 이런 치유 과정에 기여할 수 있음을 밝혔다. 이는 또한 PI3K/Akt, Rac1, JNK, 및 ERK의 활성화가 모두 NGF-유도된 섬유아세포 이동의 조절에 관여되어 있음도 밝혔다. 추가로, 라페토 등(Raffetto et al., "Mitogen-activated protein kinase pathway regulates cell proliferation in venous ulcer fibroblasts", Vasc . Endovascular Surg ., 2006, 40(1):59-66)은 MAPK ERK 경로가 정맥성 궤양 섬유아세포에서의 세포 증식에 있어 중요하다는 것을 밝혔다.
따라서, 본 발명의 펩티드는 하부 소화관 염증 및 궤양화를 예방하고 치료하는데 유용하다.
펩티드 GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1)는 조직 재생뿐만 아니라 상처와 궤양의 치유에 관여하는 주요한 세포 타입인 섬유아세포의 활성화를 유도한다. 이런 예는 마우스 섬유아세포에 대해 펩티드 GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1)가 직접 활성화에 영향을 주고, MAPK-ERK 시그널화 경로의 수준에 대해 상기 세포 내에서의 신속한 활성화 특징을 드러냄을 증명한다.
펩티드 GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1)는 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득하였으며, BALB/c 마우스 섬유아세포는 American Type Culture Collection로부터 구매하여 10% 소태아 혈청, 1 mM 소듐 피루베이트, 1:50 MEM 비-필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 10 ㎍/ml 젠타마이신 및 50 μM β-머캅토에탄올이 보충된 고 글루코오스 DMEM으로 이루어진 완전 배지에서 번식시켰다. 세포는 10 cm 컬쳐 디쉬에서, 5% CO2 및 37℃에서 성장시켰다. 세포 계대(cell passage)는 50-60% 컨플루언시(confluency)에서 이루어졌다. 세포 분리(detachment)를 위하여, 10% FCS를 함유하는, 10-배 용적의 세척 매질에서 0.05% 트립신/EDTA를 다음 농도 (470 x g, 15분)로 사용하여 트립신을 중단시켰다. 상등액을 경사시켜 버리고 세포 펠릿을 10 ml의 완전 배양 배지에 현탁시킨 다음, 세포를 실험용으로 사용하기 전에 혈구계산판을 사용하여 세포 수를 계수하였다.
섬유아세포를 8개-웰 컬쳐 플레이트에서 배양시키고, 조사된 펩티드 또는 사이토킨 TGF-β1 (포지티브 대조군) 용액, 또는 등용적의 배양 배지 (네가티브 대조군)를 각각 3중 컬쳐로 첨가하였다. 세포를 펩티드 GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1)(10 ㎍/ml) 또는 TFG-β1의 존재하에서, 또는 어떠한 작동인자(effector) 화합물도 없이 1 또는 6시간 동안 5% CO2 및 37℃에서 배양시켰다. 표시된 시점에, 세포를 하베스트하여, PBS로 2회 세척하고 세포 추출 완충액을 사용하여 프로테아제 억제제의 존재하에서 30분 동안 4℃에서 용해시켰다. 추출물을 원심분리 (14,000 x g, 10분, 4℃)로 클리어링(clearing)시켰다. 단백질 검정 시약 (Pierce. 23225)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 이어서, 추출물의 적절한 희석액 (트랙 당 10 ㎍ 단백질)을 8% SDS-PAGE에서 분획화시킨 다음 면역 블로팅을 위하여 PVDF-막 (Amersham)으로 이동시켰다. 포스포-p44/42 MAPK (Cell Signaling, 4370) 및 GAPDH (Abcam ab8245)에 특이적인 항체를 사용하여 표적으로 하는 단백질을 검출하였다. 단백질 밴드를 가시화시킨 다음 이들의 강도를 ImageJ 소프트-웨어를 사용하여 측정하였다. 데이타는 각각의 GAPDH-밴드의 값에 대해 공칭화된 ERK1, ERK2 또는 포스포-EFK1 및 포스포-ERK2의 값 (밴드 당 픽셀)으로 표시하였다. 3번의 독립적인 실행 데이타를 사용하여 평균값+SD를 계산하였다.
실험 결과는 펩티드 GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1)와 포지티브 대조군 TGF-β1이 둘다 섬유아세포에서 MAPK/ERK 시그널화 경로의 신속한 활성화를 유도함을 보여준다. 이들 작동인자 화합물을 접종시킨 지 1시간 후 포스포릴화된 ERK1 (44 kD)와 ERK2 (42 kD)의 농도가 대략 3 내지 5배 증가하였다. 따라서, GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1) 펩티드 (10 ㎍/ml) 또는 TGF-β1 (5 ng/ml)로 섬유아세포를 활성화시킨 지 1시간 후, 포스포-ERK1 공칭화된 값은 네가티브 대조군에서의 0.1+0.002와 비교하여 각각 0.4+0.02 (p< 0.01) 및 0.5+0.02 (p< 0.01)이었으며, 포스포-ERK2 값은 네가티브 대조군에서의 0.4+0.01과 비교하여 각각 1.3+0.05 (p< 0.01) 및 1.9+0.1 (p< 0.01)이었다. 이후, 활성화시킨 지 6시간 후, 펩티드 GEKKRRETVEREGG (서열번호: 1) 또는 TGF-β1에 의해 활성화된 섬유아세포중의 포스포-ERK1의 값은 각각 0.1+0.006 (p> 0.1) 및 0.3 +0.02 (p< 0.05)인 한편, 네가티브 대조군 컬쳐에서는 0.1+0.01이었다. 6시간 시점에서의 포스포-ERK2 값은 펩티드, TGF-β1 및 비-활성화된 컬쳐에서 각각 0.1 + 0.01 (p> 0.1), 0.35+0.02 (p< 0.01) 및 0.1+0.007 이었다.
이 연구는 HP-V2의 활성이 TGF-β1 (포지티브 대조군)의 활성과 닮았으며, 따라서 하부 소화관 염증 및 궤양화의 예방 및 치료에 사용할 수 있음을 보여준 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Nearmedic International Limited <120> Ezrin-Derived Peptides and Pharmaceutical Compositions Thereof <130> P103771% <150> RU2015120667 <151> 2015-06-01 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Synthetic peptide - HP-V2 peptide <400> 1 Gly Glu Lys Lys Arg Arg Glu Thr Val Glu Arg Glu Gly Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Fragment of human ezrin protein - HEP-1 <400> 2 Thr Glu Lys Lys Arg Arg Glu Thr Val Glu Arg Glu Lys Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Satellite peptide of human ezrin protein - HP1-5 <400> 3 Thr Glu Lys Lys Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Satellite peptide of human ezrin protein - HP6-14 <400> 4 Arg Glu Thr Val Glu Arg Glu Lys Glu 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> synthetic fragment of human ezrin protein - general formula I <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> /replace="Gly" /replace="Ala" /replace="Val" /replace="Leu" /replace="Met" /replace="Ile" /replace="Pro" /replace="Phe" /replace="Trp" <220> <221> Variant <222> (13)..(13) <223> /replace="Gly" /replace="Ala" /replace="Val" /replace="Leu" /replace="Met" /replace="Ile" /replace="Pro" /replace="Phe" /replace="Trp" <220> <221> Variant <222> (14)..(14) <223> /replace="Gly" /replace="Ala" /replace="Val" /replace="Leu" /replace="Met" /replace="Ile" /replace="Pro" /replace="Phe" /replace="Trp" <400> 5 Xaa Glu Lys Lys Arg Arg Glu Thr Val Glu Arg Glu Xaa Xaa 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> fragment of human ezrin protein - HEP-1 residues 2-12 <400> 6 Glu Lys Lys Arg Arg Glu Thr Val Glu Arg Glu 1 5 10

Claims (18)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항의 펩티드 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 필러(filler)를 포함하는 소화관 점막의 궤양화의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로,
    상기 소화관 점막의 궤양화는 위궤양, 대장 궤양, 십이지장 궤양 또는 소장의 궤양인 약제학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    서열번호: 2(TEKKRRETVEREKE)의 펩티드 유효량을 더 포함하는 소화관 점막의 궤양화의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    서열번호: 3(TEKKR)의 펩티드 유효량을 더 포함하는 소화관 점막의 궤양화의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    서열번호: 4(RETVEREKE)의 펩티드 유효량을 더 포함하는 소화관 점막의 궤양화의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
  9. 제1항의 펩티드를 포함하는 면역자극제.
  10. 제1항의 펩타이드를 포함하는 감염에 의한 질환을 치료 또는 예방하는 조성물로서,
    상기 감염에 의한 질환은 바이러스, 세균 또는 진균의 감염에 의한 질환인 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항의 펩타이드를 포함하는 염증성 장질환 치료 또는 예방용 약제학적 조성물로서,
    상기 염증성 장질환은 과민성 대장증후군 (IBS), 궤양성 대장염 및 크론씨병(Crohn's disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.

  14. 삭제
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  17. 삭제
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