JP2017025055A - エズリン由来ペプチド、およびその医薬組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】合成的に調製され、高い免疫賦活活性を有する新規なペプチドの提供。【解決手段】医学の分野、具体的には、化学および製薬産業の分野に関し、エズリン由来ペプチド、特に、一般式（Ｉ）Ｘ１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ２Ｘ３のアミノ酸配列を含み、各Ｘは非極性アミノ酸残基を表すペプチド。免疫賦活剤としての前記ペプチドの使用、より具体的には、抗ウイルス感染症、抗細菌感染症および抗真菌感染症を治療および予防するための使用、ならびにＧＩ管の疾患、特にＧＩ管の潰瘍性障害の治療。本発明はまた、前記ペプチドを含む医薬組成物。さらに、それを必要とする患者に前記ペプチドを投与することを含む、感染症および消化管の潰瘍性疾患の治療方法。【選択図】なし

Description

本発明は医学の分野、具体的には、化学および製薬産業の分野に関し、エズリン由来ペプチド、特に、一般式（Ｉ）Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３のアミノ酸配列を含み、各Ｘは非極性アミノ酸残基を表すペプチド、に関する。免疫賦活剤としての前記ペプチドの使用、より具体的には、抗ウイルス感染症、抗細菌感染症および抗真菌感染症を治療および予防するための使用、ならびにＧＩ管の疾患、特にＧＩ管の潰瘍性障害の治療。本発明はまた、前記ペプチドを含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、それを必要とする患者に前記ペプチドを投与することを含む、感染症およびＧＩ管の潰瘍性疾患の治療方法に関する。

サイトビリン（ｃｙｔｏｖｉｌｌｉｎ）またはビリン−２（ｖｉｌｌｉｎ−２）としてもまた知られているエズリン（Ｅｚｒｉｎ）タンパク質は、ＥＺＲ遺伝子によってヒトでコードされるタンパク質である。エズリンタンパク質に由来し生物学的活性を有するペプチドは、よく知られている。本発明のペプチドに最も近い類似体は、医薬テトラデカペプチドＮＨ_２＿Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ＿ＣＯＯＨであり、１４個のアミノ酸残基を含み、ＨＥＰ−１ペプチドまたはヒトエズリンペプチド１（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）として知られており、ＨＩＶ感染症［Ｒ．Ｄ．Ｈｏｌｍｓ， ＡＩＤＳ ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃｓ． ＰＣＴ／ＧＢ９５／００１２８５， ０２．０６．９５， ＷＯ ９５／３３７６８］と、さらに、広い範囲の細菌、真菌およびウイルス感染症の治療のために、開発された。

ＨＥＰ−１ペプチドを約９６％含む凍結乾燥医薬製品ＧＥＰＯＮ（登録商標）（販売承認番号： Р Ｎ００００１５／０１−０１０９１１）が、ロシア連邦において医療目的で広く使用されている（Ｋｌａｄｏｖａ， Ｏ．Ｖ．， Ｋｈａｒｌａｍｏｖａ， Ｆ．Ｓ．， Ｓｈｃｈｅｒｂａｋｏｖａ， Ａ．Ａ．， Ｌｅｇｋｏｖａ， Ｔ．Ｐ， Ｆｅｌｄｆｉｘ， Ｌ．Ｉ．， Ｚｎａｍｅｎｓｋａｙａ， Ａ．Ａ．， Ｏｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖａ， Ｇ．Ｓ．， Ｕｃｈａｉｋｉｎ， Ｖ．Ｆ． Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐｏｎ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． ／／ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ， ２００２， Ｎｏ． ２， ｐｐ． ８６−８８）， （Ｐｏｌｙａｋｏｖａ Ｔ．Ｏ．， Ｍａｇｏｍｅｄｏｖ， Ｍ．Ｍ．， Ａｒｔｅｍｙｅｖ， Ｍ．Ｅ．， Ｓｕｒｉｋｏｖ， Ｅ．Ｖ．， Ｐａｌｃｈｕｎ， Ｖ．Ｔ． Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈａｒｙｎｘ ／／ Ａｔｔｅｎｄｉｎｇ Ｄｏｃｔｏｒ， ２００２， Ｎｏ． ４， ｐｐ． ６４−６５）， （Ｎｏｖｏｋｓｈｏｎｏｖ， Ａ．Ａ．， Ｕｃｈａｉｋｉｎ， Ｖ．Ｆ．， Ｓｏｋｏｌｏｖａ， Ｎ．Ｖ．， Ｔｉｋｈｏｎｏｖａ， Ｏ．Ｎ．， Ｐｏｒｔｎｙｋｈ， Ｏ．Ｙｕ． Ｂｉｏｃｅｎｏｓｉｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ． ／／ Ｒｕｓｓｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ｓｐｅｃｉａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ “Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｓｙｓｔｅｍ”， ２００４， ｖｏｌｕｍｅ ６， Ｎｏ． １）， （Ｐａｒｆｅｎｏｖ， Ａ．Ｉ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｈｅｐｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｙｓｂｉｏｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ． ／／ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ２００３， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ６６−６９），． （Ｔｉｓｈｃｈｅｎｋｏ， Ａ．Ｌ． Ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ． ／／ Ａｔｔｅｎｄｉｎｇ Ｄｏｃｔｏｒ， ２００２， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ４６−４７）， （Ｔｅｌｕｎｔｓ， Ａ．Ｖ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ ｉｎ ｉｎｆａｎｔｓ． ／／ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ， Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ， ａｎｄ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇｙ， ２００４， ｖｏｌ． ３， Ｎｏ． ４， ｐｐ． ８９−９０）， （Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ， Ｒ．Ｉ．， Ｈｏｌｍｓ， Ｒ．Ｄ．， Ｋａｔｌｉｎｓｋｙ， Ａ．Ｖ．， Ｐｉｃｈｕｇｉｎ Ａ．Ｖ．， Ｐａｐｕａｓｈｖｉｌｉ， Ｍ．Ｎ．， Ｓｈｉｓｈｋｏｖａ， Ｎ．Ｍ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｈｅｐｏｎ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ． ／／ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ， ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００２， Ｎｏ． １０， ｐｐ． ３−１１）， （Ｃｈｅｒｅｄｎｉｃｈｅｎｋｏ， Ｔ．Ｖ．， Ｕｃｈａｉｋｉｎ， Ｖ．Ｆ．， Ｃｈａｐｌｙｇｉｎａ， Ｇ．Ｖ．， Ｋｕｒｂａｎｏｖａ， Ｇ．Ｍ． Ａ ｎｅｗ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．／／ Ａｔｔｅｎｄｉｎｇ Ｄｏｃｔｏｒ， ２００３， Ｎｏ． ３， ｐｐ． ８２−８３）， （Ｇｏｒｂａｒｅｔｓ， Ｉ．Ｐ．， Ｖｏｒｏｎｋｏｖａ， Ｎ．Ｖ．， Ｌｏｐａｔｉｎａ， Ｔ．Ｖ．， Ｉｖａｎｏｖｓｋａｙａ， Ｖ．Ｎ．， Ｂｒａｇｉｎｓｋｙ， Ｄ．Ｍ．， Ｂｌｏｋｈｉｎａ， Ｎ．Ｐ．， Ｍａｌｙｓｈｅｖ， Ｎ．Ａ． Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｕｓｅ ｏｆ Ｈｅｐｏｎ ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｓｉｄｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｙ．／／ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， ２００３， Ｎｏ． ４， ｐｐ． ２３−２８）， （Ｌａｚｅｂｎｉｋ， Ｌ．Ｂ．， Ｚｖｅｎｉｇｏｒｏｄｓｋａｙａ， Ｌ．Ａ．， Ｆｉｒｓａｋｏｖａ， Ｖ．Ｙｕ．， Ｐｉｃｈｕｇｉｎ， Ａ．Ｖ．， Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ， Ｒ．Ｉ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐｏｎ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｒｏｓｉｖｅ ｕｌｃｅｒｏｕｓ ｌｅｓｉｏｎｓ ｏｆ ｇａｓｔｒｏｄｕｏｄｅｎａｌ ｚｏｎｅ．／／ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， ２００３， Ｎｏ． ３， ｐｐ． １７−２０）， （Ｍａｌａｋｈｏｖａ， Ｎ．Ｓ．， Ｐｉｃｈｕｇｉｎ， Ａ．Ｖ．， Ｋｈａｌｉｆ， Ｉ．Ｌ．， Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ， Ｒ．Ｉ． Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐｏｎ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ．／／ Ｆａｒｍａｔｅｋａ， ２００５， Ｎｏ． ６ ［１０１］， ｐｐ． １０５−１０８）， Ｄｕｄｃｈｅｎｋｏ， Ｍ．Ａ．， Ｌｙｓｅｎｋｏ， Ｂ．Ｆ．， Ｃｈｅｌｉｓｈｖｉｌｉ， Ａ．Ｌ．， Ｋａｔｌｉｎｓｋｙ， Ａ．Ｖ．， Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ， Ｒ．Ｒ． Ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒｏｐｈｉｃ ｕｌｃｅｒｓ．／／ Ａｔｔｅｎｄｉｎｇ Ｄｏｃｔｏｒ， ２００２， Ｎｏ． １０， ｐｐ． ７２−７５）， （Ｂａｒｄｙｃｈｅｖ， Ｍ．Ｓ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｉｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｌｏｃａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．／／ Ｒｕｓｓｉａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２００３， ｖｏｌｕｍｅ １１， Ｎｏ． １１ （１８３）， ｐｐ． ６４６−６４７）， Ｓａｌａｍｏｖ Ｇ．， Ｒ．Ｈｏｌｍｓ， Ｗ． Ｂｅｓｓｌｅｒ， Ｒ． Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｅｚｒｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｎｅ （ＨＥＰ１） ｉｎ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ．／／ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ （Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ２００７； ５７（７）： ４９７−５０４］。

ＨＥＰ−１は、抗ウイルス性Ｃ型肝炎の生物学的活性を有し、Ｃ型肝炎患者の治療のために使用され得る［Ｒ．Ｄ．Ｈｏｌｍｓ， Ｒ．Ｉ．Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ． ＨＣＶ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ． ＰＣＴ／ＧＢ２００４／０００３３０， ２７．０１．２００４， ＷＯ２００４０６７０２４ Ａ２］。

ＨＥＰ−１は、抗潰瘍生物学的活性を有し、消化管の潰瘍性疾患の治療のために使用され得る［Ｒ．Ｄ．Ｈｏｌｍｓ， Ｒ．Ｉ．Ａｔａｕｌｌａｋｈａｎｏｖ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ｕｌｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００４３９０， ２３．１１．２００６， ＷＯ／２００７／０６０４４０］。

本発明者らは、合成的に調製され、高い免疫賦活活性を有する新規なペプチドを開発した。生物学的試験が示しているように、記載された本発明のペプチドおよびその医薬組成物は高い免疫賦活活性を有し、ＧＥＰＯＮ（登録商標）薬物製品の主成分であるＨＥＰ−１ペプチドの活性を超えている。

本発明の第１の側面では、一般式（Ｉ）Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３（配列番号：５）のアミノ酸配列を含み、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれは非極性アミノ酸残基を表すペプチドが提供される。

非極性アミノ酸残基は、独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニンおよびトリプトファンからなる群、ならびに／またはそれらの組み合わせから選択され得る。

ある実施形態では、Ｘ_１、Ｘ_２および／またはＸ_３は、独立して、小さいＲ基を有する非極性アミノ酸、特にグリシン、アラニンおよび／またはバリン、および／またはそれらの組み合わせから選択され得る。従って、本発明のある実施形態では、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれは、独立して、グリシン、アラニンおよびバリンからなる群から選択される。

ある実施形態では、Ｘ_１、Ｘ_２および／またはＸ_３はすべて同一のアミノ酸であり得る。好ましい実施形態では、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３の少なくとも一つはグリシンである。より好ましい実施形態では、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３の少なくとも２つはグリシンである。最も好ましい実施形態では、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれはグリシンである。一実施形態では、ペプチドは、一般式（Ｉ）Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３のアミノ酸配列を含み、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれは非極性アミノ酸であり、ならびに、さらに、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３の少なくとも１つ、または少なくとも２つはグリシンである。好ましい実施形態では、ペプチドは、配列ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧを有する。

本開示では、一文字コードは種々のアミノ酸を指定するために使用されてきた。三文字および一文字コードアミノ酸の使用はまた、以下のように言及され得る：グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、チロシン（ＹまたはＴｙｒ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、リジン（ＫまたはＬｙｓ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）およびトレオニン（ＴまたはＴｈｒ）。残基がアスパラギン酸またはアスパラギンでもよい場合、記号ＡｓｘまたはＢが使用され得る。残基がグルタミン酸またはグルタミンでもよい場合、記号ＧｌｘまたはＺが使用され得る。文脈が別途に明記する場合を除き、アスパラギン酸への言及はアスパラギンを含み、グルタミン酸への言及はグルタミンを含む。

ペプチドという用語は、本明細書中に開示されるアミノ酸配列を含む組成物を含んでもよい。例えば、当業者により適当とみなされるように、または必要に応じて、ペプチドは、分解からそれらを保護するため、またはそれらのバイオアベイラビリティおよび／または生体適合性を高めるために、（例えばＣまたはＮ末端が）修飾されてもよい。「本発明のペプチド」に関連する特徴は、一般式で特定されたアミノ酸配列に等しく適用されることに留意すべきである。

本発明のペプチドは、本明細書に記載のように、アミノ酸配列が一般式（Ｉ）Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３を含み、各Ｘが非極性アミノ酸残基を表すものであれば、任意の長さであってよい。

ある実施形態では、ペプチドは、１４〜２５残基の長さ、例えば１４〜２０残基の長さ、または１４〜１８残基の長さであり、一般式（Ｉ）のアミノ酸配列を（または、それらの定義された実施形態をさらに）含む。ある実施形態では、ペプチドは、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基であり、一般式（Ｉ）のアミノ酸の配列を（または、それらの定義された実施形態をさらに）含む。さらなる実施形態では、ペプチドは、１４〜２５残基の長さ、例えば１４〜２０残基の長さ、または１４〜１８残基の長さであり、配列番号：１（ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）の配列を含む。ある実施形態では、ペプチドは、長さが１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５残基であり、配列番号：１（ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）の配列を含む。一実施形態では、ペプチドは、１４〜１８残基の長さであり、一般式（Ｉ）Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３のアミノ酸配列を含み、それぞれのＸ_１、Ｘ_２およびＸ_３は非極性であり、さらに、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３の少なくとも２つはグリシンである。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、少なくとも１４アミノ酸の長さであり、配列番号：１（ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）を含む。

好ましくは、本発明のペプチドは、１４アミノ酸残基の長さである。本発明の最も好ましい実施形態では、ペプチドは、ＮＨ２＿Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ＿ＣＯＯＨ（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）の配列を有する（本明細書では、ＨＰ−Ｖ２と称される）。

本発明の目的は、強化された免疫賦活活性を有するペプチド化合物の範囲の拡張である。また、本発明の目的は、最も高い免疫賦活活性を有し、および請求項に記載のペプチドと既知のエズリンペプチドに基づいた広範な作用を有する、医薬組成物の調製である。一般に、配列番号：２を含む又はからなるペプチドと比較した場合、本発明のペプチドは、より高い免疫賦活プロファイルおよび／またはより高い抗ウイルス活性を有する。免疫賦活および抗ウイルス活性は、当業者に公知の任意の方法によって測定されてもよい。例えば、ペプチドの免疫学的活性は、Ｊ−９６細胞におけるサイトカインｍＲＮＡの合成に及ぼす影響に従って評価され得る（例えば：ＩＦＮ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）。抗ウイルス活性は、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭ）に対する細胞毒性効果に従って、および／またはＥＭＣウイルスの複製を阻害するペプチドについてのＩＣ５０に従って、測定され得る。他の方法は、当業者には明らかであろう。

所望の目的は、式（Ｉ）の配列を含む提案された新規ペプチドおよび本明細書で説明されるその誘導体、より具体的には配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧの配列、を用いて達成されることができる。本発明のこれらのペプチドは、合成的に調製され、高い免疫賦活活性を有する。データベースｈｔｔｐ：／／ｒｅｓｅａｒｃｈ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｕｄｅｌ．ｅｄｕ／ｐｅｐｔｉｄｅｍａｔｃｈ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐでのペプチド配列の検索、およびデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｂｌａｓｔ／でのタンパク質配列の検索は、１４個のアミノ酸残基（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）を含むペプチド（ＨＰ−Ｖ２）の新規性を確認した。

生物学的試験が示しているように、本発明のペプチドおよびその医薬組成物は高い免疫賦活活性を有し、ＧＥＰＯＮ（登録商標）薬物製品の主成分であるＨＥＰ−１ペプチドの活性を超える。

既知のエズリンペプチドＨＥＰ−１（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）、および２つのより小さなペプチド：これ以降はＨＰ１−５として定義される式ＮＨ_２＿Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ＿ＣＯＯＨ（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）のＨＰ１−５ペプチド、およびこれ以降はＨＰ６−１４として定義される式ＮＨ_２＿Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ＿ＣＯＯＨ（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）のＨＰ６−１４ペプチドが、本発明のペプチドとの医薬組成物の調製のために使用された。後者の二つのペプチドはＨＥＰ１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）の切断産物であり、以前に記載されたものと同一の配列を有する［Ｒ．Ｄ．Ｈｏｌｍｓ． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ／ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｆ ｅｚｒｉｎ． ＰＣＴ／ＧＢ００／０３５６６， １５．０９．２０００， ＷＯ ０１／０２５２７５］。ＨＰ１−５ペプチドおよびＨＰ６−１４ペプチドは、ＧＥＰＯＮ（登録商標）薬物製品で不純物として発見された２つの付随ペプチド（ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）である。

ある実施形態において、本発明のペプチドは、ＨＥＰ−１（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）とともに、またはこれ以降はＨＰ１−５として定義される式ＮＨ_２＿Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ＿ＣＯＯＨ（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）のＨＰ１−５ペプチドとともに、またはこれ以降はＨＰ６−１４として定義される式ＮＨ_２＿Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ＿ＣＯＯＨ（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）のＨＰ６−１４ペプチドとともに、組み合わせられ得る。

本発明のペプチドおよび本明細書に記載のペプチドの組合せは、例えば、ウイルス、細菌および真菌感染症の治療および予防において使用される、ならびに粘膜および軟組織の潰瘍疾患の治療用の、医薬において有用であり得る。

本発明の第２の側面では、医薬において使用される本発明のペプチド（一般式（Ｉ）のペプチドなど、特に配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド）が提供される。特定の医学的用途は、感染症の治療または予防を含む。感染症は、ウイルス、細菌および真菌感染症であり得る。本発明のさらなる実施形態は、胃、大腸、十二指腸または小腸の潰瘍のような消化管の粘膜の潰瘍形成の治療または予防、ならびに胃、大腸、十二指腸または小腸の潰瘍に関連する疾患および／または障害ならびに過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を含む炎症性腸疾患の治療または予防を含む。本発明のペプチドはまた、潰瘍性大腸炎およびクローン病の治療または予防における使用のために提供される。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、下部消化管の炎症および／または潰瘍形成の治療または予防における使用のために提供される。

また、被験体での免疫応答の刺激において使用される、本発明のペプチド（一般式（Ｉ）のペプチドなど、特に、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド）が提供される。本発明のある実施形態では、ペプチドは、被験体におけるインターフェロンの内因性の産生を刺激するために使用され得る。ペプチドはまた、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化を刺激するために使用されてもよい。

本発明のある実施形態では、本発明のペプチドは、ＨＥＰ−１（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）とともに、またはこれ以降ＨＰ１−５として定義される式ＮＨ_２＿Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ＿ＣＯＯＨ（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）のＨＰ１−５ペプチドとともに、またはこれ以降ＨＰ６−１４として定義される式ＮＨ_２＿Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ＿ＣＯＯＨ（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）のＨＰ６−１４ペプチドとともに、組み合わせられ得る。例えば、一般式（Ｉ）のペプチド、特に配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチドは、配列番号２、３または４の１つ以上と組み合わせられ得る。そのような組み合わせは、感染症の治療または予防を含む、本発明の医学的態様において有用である。感染症は、ウイルス、細菌または真菌感染症であり得る。ペプチドの組合せはまた、胃、大腸、十二指腸または小腸の潰瘍のような消化管の粘膜の潰瘍形成の治療または予防に、ならびに胃、大腸、十二指腸または小腸の潰瘍に関連する疾患および／または障害および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を含む炎症性腸疾患の治療または予防に有用である。本発明のペプチドはまた、潰瘍性大腸炎およびクローン病の治療または予防における使用のために提供される。好ましい実施形態では、本発明のペプチド組合せは、下部消化管の炎症および／または潰瘍形成の治療または予防における使用のために提供される。

本発明の実施形態は、さらに、本発明のペプチド（一般式（Ｉ）のペプチドなど、特に、配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド）を、それを必要とする患者に投与することを含む、感染症、胃、大腸、十二指腸または小腸の潰瘍、胃、大腸、十二指腸または小腸の潰瘍に関連する疾患および／または障害、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、潰瘍性大腸炎、およびクローン病を、治療しまたは予防する方法にまで及ぶ。感染症は、ウイルス、細菌または真菌感染症であってもよい。本発明のペプチドは治療上の有効量で投与され、１つ以上の他の薬学的に活性な化合物と共に投与されてもよい。特に、本発明のペプチドは、配列番号２、３および／または４のペプチドの１つ以上と組み合わせて投与されてもよい。

従って、医薬において使用される、本発明のペプチド（一般式（Ｉ）のペプチドなど、特に配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド）、および配列番号２、３、または４のアミノ酸配列を含むペプチドの組合せが提供される。このような医薬用途は、感染症（ウイルス、細菌または真菌感染症など）、消化管の粘膜の潰瘍形成（胃潰瘍、大腸潰瘍、十二指腸潰瘍および小腸潰瘍など）、または炎症性腸疾患もしくは炎症性腸疾患に関連した疾患もしくは障害（ＩＢＳ、潰瘍性大腸炎またはクローン病など）を治療しまたは予防することを含む。好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、下部消化管の炎症および／または潰瘍形成の治療または予防に使用における使用のために提供される。このような医薬用途はまた、被験体において免疫応答を刺激することを含む。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドがＨＥＰ−１、ＨＰ１−５またはＨＰ６−１４との組み合わせで使用されるときは、追加のペプチドは配列番号：２、３、または４のアミノ酸配列からなる。

また、それを必要とする患者に本発明のペプチド（一般式（Ｉ）のペプチドなど、特に配列番号：１のアミノ酸配列を含むペプチド）の治療上の有効量を投与することを含む、被験体における免疫応答を刺激する方法が提供される。

本発明の第３の側面では、本発明のペプチドおよび薬学的に許容される担体または増量剤を含む医薬組成物が提供される。本発明のある実施形態において、医薬組成物は、追加の薬学的に活性な化合物を含んでもよい。具体的には、医薬組成物は、ＨＥＰ−１（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）、ＨＰ１−５（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）、またはＨＰ６−１４（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）をさらに含んでもよい。

したがって、一実施形態において、本発明は、長さ１４〜１８残基のペプチドおよび薬学的に許容される担体または増量剤を含み、前記ペプチドは配列Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３を有するアミノ酸配列を含み、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれは非極性であり、さらにＸ_１、Ｘ_２およびＸ_３の少なくとも２つはグリシンである医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、鎮痛剤および／または抗炎症性物質のような他の薬学的に活性な物質を含んでもよい。医薬組成物は、任意の適当なアジュバントおよび／または生理学的に許容される希釈剤を用いて製剤化されてもよい。

薬物送達技術の当業者によって通常使用される増量剤、担体、保存剤、および安定剤は、提供される医薬組成物の製造のために、許容される担体または増量剤として使用され得る。注射剤のためには、蒸留水または生理食塩水が主に使用される。

医薬組成物は、例えば、経口（口腔または舌下を含む）、経直腸、経鼻、局所（口腔、舌下または経皮を含む）、経膣または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内を含む）経路のような、任意の適切な経路による投与に適合させられ得る。このような組成物は、例えば無菌条件下で有効成分を担体（複数可）または賦形剤（複数可）と混合することなどの、薬学の分野において公知の任意の方法によって調製され得る。特定の実施形態では、本発明のペプチドを含む本発明の医薬組成物は、グルコース錠剤のような経口投与のための錠剤の形態である。ある実施形態では、錠剤は溶解性である。

経口投与に適した医薬組成物は、カプセルまたは錠剤のような個別の単位として；粉末または顆粒として；溶液、シロップまたは懸濁液として（特に、水性または非水性液体で；または可食性の泡もしくはホイップとして；またはエマルションとして）提供され得る。グルコースの錠剤のような経口投与のための錠剤の形態である。ある実施形態では、錠剤は溶解性である。

本発明のある実施形形態では、ペプチドは、凍結乾燥粉末または顆粒の形態で提供される。

錠剤または硬ゼラチンカプセルに適した賦形剤は、ラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、ステアリン酸またはその塩が挙げられる。軟ゼラチンカプセル剤と共に使用するのに適した賦形剤は、例えば植物油、ワックス、脂肪、半固体または液体ポリオール等が挙げられる。

液剤およびシロップ剤の製造のためには、使用することができる賦形剤は、例えば水、ポリオールおよび糖が挙げられる。懸濁液の調製のために、水中油型または油中水型懸濁液を提供するために油脂（例えば植物油）が使用され得る。

経皮投与に適した医薬組成物は、長期間にわたりレシピエントの表皮と密接に接触し続けることが意図された個別のパッチとして、提供されてもよい。例えば、活性成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３（６）， ｐａｇｅ３１８ （１９８６）に一般的に記載されるようなイオントフォレーシスによりパッチから送達されてもよい。

局所投与に適した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油脂として製剤化されてもよい。眼、または例えば口および皮膚のような他の外部組織の感染症のために、組成物は、局所的軟膏またはクリームとして適切に適用される。軟膏に製剤化される場合、活性成分は、パラフィン系または水混和性軟膏基剤のいずれかと共に用いられてもよい。あるいは、活性成分は、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤と共にクリーム中に製剤化され得る。眼への局所投与に適した医薬組成物は、活性成分が適切な担体、特に水性溶媒に溶解または懸濁された点眼剤を含む。口腔内の局所投与に適した医薬組成物は、ロゼンジ、トローチおよび洗口剤を含む。

直腸投与に適した医薬組成物は、坐剤または浣腸剤として提供されてもよい。

担体が固体である経鼻投与に適した医薬組成物は、例えば２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含む。担体が液体である適切な組成物は、鼻内スプレーまたは点鼻薬として投与するために、活性成分の水性または油性溶液を含む。

吸入による投与に適した医薬組成物は、定量加圧エアロゾル、ネブライザーまたは吸入器の種々のタイプの手段によって生成され得る微粒子ダストまたはミストを含む。

膣内投与に適した医薬組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡状またはスプレー製剤として提供されてもよい。

非経口投与に適した医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤とを実質的に等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性の注射液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。注射液のために使用され得る賦形剤は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。組成物は、例えば密封アンプルおよびバイアルのような単位用量または複数回用量容器で提供されてもよく、例えば注射用水のような携帯される滅菌液体の添加のみを使用直前に必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。即席の注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製されてもよい。

医薬組成物は保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香料、塩（本発明の物質それ自体が、薬学的に許容される塩の形態で提供さえ得る）、緩衝剤、コーティング剤、または酸化防止剤を含んでもよい。それらはまた、本発明の物質に加えて、治療上の活性な薬剤を含有してもよい。

本発明の医薬組成物の用量は、治療される疾患または障害、治療される個人の年齢および症状などに依存して広い範囲で変えることができ、使用される適切な投与量は最終的に医師が決定するであろう。

このような組成物は、ヒトまたは獣医学用に製剤化され得る。本出願は、文脈が明らかに他を意味しない限り、動物だけでなくヒトに同様に等しく適用されると解釈されるべきである。

一実施形態において、本発明は、長さ１４〜１８残基のペプチドおよび薬学的に許容される担体または増量剤を含み、前記ペプチドは配列Ｘ_１ＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＸ_２Ｘ_３を有するアミノ酸配列を含み、Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれは非極性であり、さらにＸ_１、Ｘ_２およびＸ_３の少なくとも２つはグリシンである、経口投与のための錠剤、特にグルコース錠剤の形態の、医薬組成物を提供する。より好ましい実施形態では、ペプチドは、配列ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧを有する。

本発明は、本明細書に明確に記載された用途のいずれかにおいて使用するための、適切な医薬組成物の製造方法、ならびに医薬における使用ための医薬品の製造における本発明のペプチドの使用方法にも及ぶ。

本発明のさらなる態様では、配列番号：１または配列番号：５のようなアミノ酸配列を含むペプチドのような、本発明のペプチド、特に一般式Ｉのペプチドをコードする核酸配列が提供される。

核酸は、クローニングによって得られるか、化学合成によって生産される、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡであってもよい。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コードセンス鎖であってもよく、または非コードもしくはアンチセンス鎖であってもよい。

本発明のさらに別の側面において、本発明の核酸を含むベクターが提供される。本発明のさらに別の側面では、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。そのような核酸、ベクターおよび宿主細胞の製造または取得方法も本発明に含まれており、当技術分野で知られている。

本発明のペプチドはペプチド合成化学によって合成されることができ、例えば、本発明のペプチドは標準的な手順を使用する液相合成（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｅｄ． Ｈｉｃｈａｍ Ｆｅｎｎｉｒｉ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （２０００））、または例えば「Ｆｍｏｃ」または「Ｂｍｏｃ」合成のような固相合成により合成され得る（Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓ．）， ｅｄ．ｓ Ｗ． Ｃｈａｎ ＆， Ｐｅｔｅｒ Ｗｈｉｔｅ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （２０００））。固相合成を用いた場合、ポリスチレン樹脂もしくはポリアミド樹脂、またはＰＥＧハイブリッドポリスチレン樹脂、またはＰＥＧに基づく樹脂などの固相が使用される。例えば、Ｎ末端保護基、ｔ−ＢｏｃまたはＦＭＯＣ保護基のような、様々な保護基が合成中に使用される。また、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基もしくはアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）保護基、もしくは光除去（リソグラフィ）保護基、または側基保護技術が使用され得る。ペプチド生成物は、ＨＰＬＣ分離または任意の他の精製方法により精製される。ペプチド構造は、アミノ酸分析、質量分析、および高速液体クロマトグラフィーデータによって確認される。

いくつかの例では、固相方法を用いて断片が合成され、次いで溶液中で一緒にカップリングされてもよい。この方法ではアミノ酸鎖のカルボニル基側からアミノ基側へとペプチドが合成され得るが、細胞内では反対方向にペプチドが合成される。このような方法では、アミノ保護されたアミノ酸が、カルボニル基と樹脂との間に共有結合を形成している基質ビーズ（すなわち、樹脂ビーズ）に結合させられる。次いで、アミノ基が脱保護され、次のアミノ保護されたアミノ酸のカルボニル基と反応させられる。所望のペプチド鎖を形成するために、必要とされる頻度でサイクルが繰り返される。合成されたペプチドは、その後、手順の最後にビーズから切断される。このペプチド合成で主に使用されるアミノ基の保護基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（「Ｆｍｏｃ」）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（「Ｂｏｃ」）である。Ｆｍｏｃ基は塩基でアミノ末端から除去されるのに対し、Ｂｏｃ基は酸で除去される。

医薬組成物の調製のために本発明で使用されるＨＥＰ−１ペプチド、ＨＰ１−５ペプチド、およびＨＰ６−１４ペプチドは、ライセンス製造業者「Ｉｍｍａｐｈａｒｍａ」、ＬＬＣ（モスクワ）によって液相合成法により調製された。

本発明のさらなる側面では、本発明のペプチド、特に配列番号：１または配列番号：５のアミノ酸配列を含むペプチドのような、一般式（Ｉ）のペプチドを製造する方法が提供される。この方法は、液相合成または固相合成によりペプチドを合成することを含んでもよい。

本発明の一実施形態では、長さが１４アミノ酸であって、アミノ酸配列がＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧであるペプチドが提供される。ペプチドは医薬において、特に、下部消化管の炎症および／または潰瘍形成を治療することに有用である。ペプチドは、経口投与のための錠剤、特にグルコース錠剤の形態で提供されてもよい。

本発明の第２およびその後の側面についての好ましい特徴には、第１の側面が準用される。

ただの参照目的のために存在し、かつ発明を限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例を参照する手段で、本発明が説明される。実施例では、参照が以下の図面の番号でされる：

ＨＥＰ−１ペプチドの高速液体クロマトグラフィー。Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、４．６×２５０ｍｍ、５．０μｍ粒子。移動相：А−水、５％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ−０．１％ＴＦＡ；プログラム ２０分間で５−２５％ＡＣＮ。流速：１ｍｌ／分。Ｘ軸：時間、Ｙ軸：ＵＶ吸収（ｍＶ、上側の線、ピークと共に）、圧力（下側、水平線）。 ＨＥＰ−１ペプチドおよびＨＰ１−５ペプチドの混合物の高速液体クロマトグラフィー。Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、４．６×２５０ｍｍ、５．０μｍ粒子。移動相：А−水、５％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ−０．１％ＴＦＡ；プログラム ２０分間で５−２５％ＡＣＮ。流速：１ｍｌ／分。Ｘ軸：時間、Ｙ軸：ＵＶ吸収（ｍＶ、上側の線、ピークと共に）、圧力（下側、水平線）。 ＨＥＰ−１ペプチドおよびＨＰ６−１４ペプチドの混合物の高速液体クロマトグラフィー。Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、４．６×２５０ｍｍ、５．０μｍ粒子。移動相：А−水、５％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ−０．１％ＴＦＡ；プログラム ２０分間で５−２５％ＡＣＮ。流速：１ｍｌ／分。Ｘ軸：時間、Ｙ軸：ＵＶ吸収（ｍＶ、上側の線、ピークと共に）、圧力（下側、水平線）。 ＨＥＰ−１ペプチドおよびＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物の高速液体クロマトグラフィー。Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、４．６×２５０ｍｍ、５．０μｍ粒子。移動相：А−水、５％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ−０．１％ＴＦＡ；プログラム ２０分間で５−２５％ＡＣＮ。流速：１ｍｌ／分。Ｘ軸：時間、Ｙ軸：ＵＶ吸収（ｍＶ、上側の線、ピークと共に）、圧力（下側、水平線）。 ＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物の高速液体クロマトグラフィー。Ｌｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、４．６×２５０ｍｍ、５．０μｍ粒子。移動相：А−水、５％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ；Ｂ−０．１％ＴＦＡ；プログラム ２０分間で５−２５％ＡＣＮ。流速：１ｍｌ／分。Ｘ軸：時間、Ｙ軸：ＵＶ吸収（ｍＶ、上側の線、ピークと共に）、圧力（下側、水平線）。 ＨＥＰ−１ペプチドおよびＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物のＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦスペクトル

実施例
高速液体クロマトグラフィーの方法は、医薬組成物の製造中の各成分濃度の正確な評価のために使用された。この研究の結果は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の条件では、ＨＥＰ−１ペプチドと類似のアミノ酸の数を有するＨＰ−Ｖ２ペプチドを区別することは不可能であったことを実証した。この事実が、ＨＰ−Ｖ２とＨＥＰ−１を基本とする組成物の定量的な濃度にアクセスさせない（実施例４；図１、図４、図５）。なお、請求項に記載されたＨＰ−Ｖ２ペプチド、ならびに付随ペプチドＨＰ１−５およびＨＰ６−１４の定量的組成は、それらの良好な分離の結果としてクロマトグラムに基づいて容易に計算され得る（実施例２、３；図２、図３）。

しかしながら、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ質量分析は、１４アミノ酸残基を含む２つのペプチドの混合物中で、特に、ＨＰ−Ｖ２として定義されるＨＰ−Ｖ２ペプチド（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）およびＨＥＰ−１として定義されるＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）の混合物中で、明確に各ペプチドを検出する（実施例５、図６）。

実施例１． ＨＰ−Ｖ２ペプチドの調製
ＨＰ−Ｖ２ペプチドの合成は、アルコキシベンジルポリマーを使用した固相法によって行われた。カップリングは： １）テトラフルオロホウ酸Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＢＴＵ）；または ２）１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（НОВТ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、のいずれかの使用に基づく方法を用いて行われた。未反応のアミノ基がカップリング反応後に成長するペプチジル−ポリマー上に見つかった場合を除き、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸残基の順次的な結合が一つずつ実施された。ペプチジル−ポリマー中の未反応のアミノ基含有量の制御は、ニンヒドリン試験の手法により行われた。チオアニソール、フェノール、エタンジチオール、トリイソプロピルシラン、および水を加えたトリフルオロ酢酸が、ペプチドとポリマー担体との分離のために、および最終的なブロック解除のために使用された。所望の生成物の構造および均一性は、アミノ酸分析、質量分析、および高速液体クロマトグラフィーデータによって確認された。

提供されたＨＰ−Ｖ２ペプチド（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）、および以下のペプチドとのその混合物に基づく以下の医薬組成物が、提案された。

医薬組成物：
配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧのペプチドの有効量、および薬学的に許容される担体または増量剤 − その他、を含む医薬組成物。

配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧのペプチドの有効量、配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥのペプチド、および薬学的に許容される担体または増量剤 − その他、を含む医薬組成物。

配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧのペプチドの有効量、配列番号３：ＴＥＫＫＲによるペプチド、および薬学的に許容される担体または増量剤 − その他、を含む医薬組成物。

配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧのペプチドの有効量、配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥのペプチド、および薬学的に許容される担体または増量剤を含む医薬組成物。

医薬組成物の調製のために使用されたＨＰ−Ｖ２ペプチド、およびＨＥＰ−１、ＨＰ１−５、ＨＰ６−１４を含む特定の混合物は、実施例６で提供される。

０．０１ｍｇから１０００ｍｇの量でＨＰ−Ｖ２ペプチドまたは上記のペプチドとのその混合物が、容量１ｍｌから１０ｍｌの滅菌水に溶解される。剤形は、調製された溶液に基づいて調製されてもよく、経口で、肛門に、または経膣で、または液滴として鼻腔内へ、または吸入用スプレーとして使用されてもよい。

０．０１ｍｇから１０００ｍｇの量のＨＰ−Ｖ２ペプチドまたはペプチドの組合せが、薬物送達技術の当業者によって通常使用される適切な増量剤、担体、保存剤、および安定剤との組み合わせで、錠剤もしくはカプセル剤、または坐剤、またはゲル、または軟膏製剤中に入れられる。

上記医薬組成物中のＨＰ−Ｖ２ペプチドまたはペプチドの組合せは、経口で、肛門に、もしくは経膣で、または局所的に適用されることができる剤形の調製に使用されてもよい。１ｍｌから１０ｍｌの容量の注射用水または任意の生理食塩水に溶解された０．０１ｍｇから１０００ｍｇのＨＰ−Ｖ２ペプチドまたはペプチドの組合せを含む滅菌溶液が、皮下、筋肉内または静脈内経路で注射として投与される。

実施例２． ＨＰＬＣによるＨＥＰ−１およびＨＰ１−５ペプチドの分離
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、その保持時間に基づいたペプチドの分離のために使用された。ＨＥＰ−１およびＨＰ１−５ペプチドのストック溶液は、１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度での脱イオン水中へのそれらの可溶化に続き、孔径０．２μｍのミリポアフィルターを通す濾過滅菌の手法で調製された。８０％のＨＥＰ−１ペプチド、および２０％のＨＰ１−５ペプチドを含有する組成物は、適切な容量での対応するストック溶液の混合によって調製された。

ＨＰＬＣは、５μｍ粒子が充填されたＬｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、サイズ４．６×２５０ｍｍで行われた。移動相はＡ相およびＢ相のプログラム混合によって調製され、Аは水、５％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０．１％ＴＦＡを含有し、Ｂは０．１％ＴＦＡを含有した。プログラムされた勾配５から２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）が、２０分間で形成された。サンプル容量は２０μｌであり；流速は１ｍｌ／分であった。ピークは、異なる保持時間でのそのＵＶ吸収によって自動的に記録された。

図１は、９および１−分の間の典型的な保持時間を有するＨＥＰ−１ペプチドのＨＰＬＣピークを示す。図２は、ＨＰＬＣによる２つのピーク、ＨＥＰ−１（ＲＴ＝９．８２２分）およびＨＰ１−５（ＲＴ＝３．６６６分）、の明確な分離を示す。

実施例３． ＨＰＬＣによるＨＥＰ−１およびＨＰ６−１４ペプチドの分離
ＨＥＰ−１およびＨＰ６−１４ペプチドのストック溶液ならびにそれらの混合物は、実施例２に記載されているように調製された。ペプチドおよびその混合物のＨＰＬＣによる分析は、実施例１に記載されるように、５μｍ粒子が充填されたＬｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、サイズ４．６×２５０ｍｍで行われた。

使用されたＨＰＬＣ条件では、ＨＥＰ−１およびＨＰ６−１４ペプチドの混合物は、はっきりと２つのピークに分離され（図３）、その一方はＨＰ６−１４ペプチド（ＲＴ＝９．４９５分）に典型的な保持時間を有しており、他方はＨＥＰ−１ペプチド（ＲＴ＝９．８９４分）に典型的な保持時間を有していた。

実施例４． ＨＥＰ−１およびＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物のＨＰＬＣによる分析
ＨＥＰ−１およびＨＰ−Ｖ２ペプチドのストック溶液ならびにそれらの混合物は、実施例２に記載されているように調製された。ペプチドおよび混合物のＨＰＬＣ分析は、実施例２に記載されるように、５μｍ粒子が充填されたＬｕｎａ Ｃ１８（２）カラム、サイズ４．６×２５０ｍｍで行われた。

使用されたＨＰＬＣ条件では、ＨＥＰ−１およびＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物は、ＨＥＰ−１ペプチドについて典型的な保持時間を有する一つのピーク（図４）としてカラムから溶出された。ＨＰ−Ｖ２ペプチド溶液単独のＨＰＬＣ分析は、このペプチドの保持時間が、実際に、ＨＥＰ−１ペプチドの保持時間と同じであったこと（図５）を示している。これは、このＨＰＬＣ条件ではＨＰ−Ｖ２とＨＥＰ−１ペプチドとを区別できないことを意味する。

実施例５． ＨＥＰ−１およびＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物の質量分析
ＨＥＰ−１およびＨＰ−Ｖ２ペプチドのストック溶液ならびにそれらの混合物は、実施例２に記載されているように調製された。ＭＡＬＤＩ ＴＯＦスペクトルは、２，５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとして用いて、Ｂｒｕｋｅｒ Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析器で再整理された。

ＨＥＰ−１およびＨＰ−Ｖ２ペプチドの混合物の質量スペクトル（図６）は、ＨＥＰ−１については１８１８．０７２６（ＭＷ）およびＨＰ−Ｖ２については１６３０．９３８５（ＭＷ）のそれらの分子イオンを両ペプチドが持つことを、はっきりと示す。

実施例６〜８の前書き
以下の実施例６〜８は、全ての使用されるペプチドおよびこれらの混合物の生物学的活性を証明する。これらのペプチドは、インターフェロン産生を誘導し、インビトロでの細胞培養において、１００ＴＣＩＤ５０／ｍｌの用量での細胞変性脳心筋炎ウイルスの感染により引き起こされる死から様々なタイプのヒト細胞の種類を保護する。

１４個アミノ酸残基を含むペプチド（ＨＰ−Ｖ２）（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）、およびＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）との、またはＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）との、またはＨＰ６−１４ペプチド（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）とのその組成物が、様々な細胞の培養におけるＩ型インターフェロンの産生による抗ウイルス応答を誘導するそれらの能力について調べられた。我々は、免疫賦活、抗ウイルス薬、およびインターフェロン誘導物質のスクリーニングのために広く使用される、インビトロでの培養液中の化合物の抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性を試験する従来手法を、使用した。

インビトロのこの方法では、我々は、研究されるペプチドを用いて様々なタイプの細胞を前処理し、その後細胞は１００ＬＤ５０の用量の脳心筋炎ウイルスに感染させられた。感染から２４時間後、試験化合物の保護活性を評価するために、細胞にとって致命的であるウイルスに対して細胞を抵抗性状態にする能力を後者が有するかどうか、ウイルスの細胞変性効果が評価された。

よく知られているように、ほとんどの場合、化合物のこのような保護活性は、インターフェロンの誘導時に予測される（用語≪インターフェロン≫は、細胞により産生され、ウイルスの複製を防止する化合物を意味する。）。インビトロで、前記ペプチドおよびそれらの組成物の様々な濃度を用いて、これらの化合物の抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性を評価することが可能であった。

低い方は、脳心筋炎ウイルスの１００ＬＤ５０の用量でインターフェロンによって死から５０％の細胞を保護する濃度であり、高い方は、試験化合物の抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性である。

１４アミノ酸残基を含むペプチド（ＨＰ−Ｖ２）（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）、およびＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）との、またはＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）との、またはＨＰ６−１４ペプチド（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）とのその組み合わせが、免疫賦活（抗ウイルス、インターフェロン誘導）活性に関して試験された。

実施例６． ヒト肝癌細胞株の培養物におけるペプチドの抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性の研究
ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（アレクサンダー）ヒト肝癌細胞株は、イバノフスキー（Ｉｖａｎｏｖｓｋｉｙ）にちなんで名付けられたウイルス学研究所（モスクワ）から入手された。細胞培養のための完全培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミン（３００μｇ／ｍｌ）、およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充したＭＥＭイーグル培地に基づいて調製された。

以下のペプチドが試験された：
ＨＥＰ−１（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）；
ＨＰ１−５（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）；
ＨＰ６−１４（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）；
ＨＰ−Ｖ２（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）；
ペプチドの混合物：
ＭＸＨＰ１−５＋ＨＥＰ−１ − ９０％ＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）および１０％ＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）の混合物；
ＭＸＨＰ６−１４＋ＨＥＰ−１ − ９０％ＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）および１０％ＨＰ６−１４ペプチド（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）の混合物；
ＭＸＨＰ−Ｖ２＋ＨＰ１−５ − ９０％ＨＰ−Ｖ２ペプチド（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）および１０％ＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）の混合物；
ＭＸＨＰ−Ｖ２＋ＨＰ６−１４ − ９０％ＨＰ−Ｖ２ペプチド（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）および１０％ＨＰ６−１４ペプチド（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）の混合物。
ＭＸＨＰ−Ｖ２＋ＨＥＰ−１ − ９５％ＨＰ−Ｖ２ペプチド（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）および５％ＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）の混合物。

ペプチドは蒸留水に溶解され、次いで１〜２ｍｇ／ｍｌのストック溶液を得るために、孔径０．２μｍのフィルターを通すことにより滅菌された。０日目に、細胞は、１ｍｌ中に２０万の細胞の細胞密度で、９６ウェルプレートのウェル内の完全培地中に播種された。１日目に、各試験サンプルの連続希釈液が、９６ウェルプレートのウェル中に３連で調製された（増分２で２４段階希釈）。３日目に、全ての培養物は、１００ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの用量の脳心筋炎ウイルス株「コロンビアＳＫ−Ｃｏｌ−ＳＫ」で感染させられた。最後に、４日目に、ウイルスの細胞変性効果は、異なる濃度のペプチドの存在下またはペプチド無しの培養物中（コントロール）で、ライツ倒立顕微鏡を用いて評価された。

薬品の抗ウイルス効果は、１００ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの用量で、脳心筋炎ウイルスによって引き起こされる死から５０％の細胞を保護する、その最小濃度に基づいて評価された。インターフェロン力価（Ｕ／ｍｌ）は、１００ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの用量で、脳心筋炎ウイルスによって引き起こされる死から５０％の細胞を保護した薬品の最大希釈の逆数値として計算された。

得られたデータは、表１に示されている。全ての試験されたペプチドおよびその組み合わせが、ヒト肝癌細胞における脳心筋炎ウイルスの複製を防止することが明らかである。ペプチドは、インターフェロン産生を誘導することにより、ウイルスの細胞変性効果から肝癌細胞を保護した。ペプチドおよびその組成物の有効性は異なっていた。抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性の最高レベルは、ＨＰ−Ｖ２ペプチド、およびそのＨＰ１−５ペプチドとの組成物で記録された。

実施例７． ヒト子宮頚癌細胞株の培養物におけるペプチドの抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性の研究
ＨＥＬＡヒト子宮頚癌細胞株は、イバノフスキー（Ｉｖａｎｏｖｓｋｉｙ）にちなんで名付けられたウイルス学研究所（モスクワ）から入手された。細胞培養のための完全培地、ペプチドおよびその組成物、ならびにそれらの抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性の評価方法は、実施例５の記載と同じであった。

得られたデータは、表２に示されている。全ての試験されたペプチドおよびその組成物が、ヒト子宮頸癌細胞株における脳心筋炎ウイルスの発症を防止することが明らかである。ペプチドは、インターフェロン産生を誘導することにより、ウイルスの細胞変性効果からヒト子宮頸癌細胞を保護した。ペプチドおよびその組成物は、異なる活性を有した。最大の抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性は、ＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）およびＨＰ６−１４ペプチド（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）、ならびにＨＰ−Ｖ２ペプチドとのこれらの組み合わせの場合に、検出された。

実施例８． ジラルディハートヒト上皮細胞株の培養物中でのペプチドの抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性
ジラルディハートヒト上皮細胞株の培養物は、イバノフスキー（Ｉｖａｎｏｖｓｋｉｙ）にちなんで名付けられたウイルス学研究所（モスクワ）から入手された。細胞培養のための完全培地、ペプチドおよびその組成物、ならびにそれらの抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性の評価方法は、実施例５の記載と同じであった。

得られたデータは、表３に示されている。全ての試験されたペプチドおよびその組成物が、ジラルディハートヒト上皮細胞株の細胞における脳心筋炎ウイルスの発症を防止することが、示されたデータから明らかである。試験したペプチドおよびその組成物は、インターフェロン産生の誘導およびウイルスの細胞変性効果からジラルディハート上皮細胞株の保護に非常に有効であった。最大の抗ウイルス（インターフェロン誘導）活性は、ＨＥＰ−１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）とＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）およびＨＰ６−１４ペプチド（配列番号４：ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）との組み合わせ、ならびにＨＰ−Ｖ２ペプチド（配列番号１：ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ）のＨＰ１−５ペプチド（配列番号３：ＴＥＫＫＲ）との及びＨＥＰ１ペプチド（配列番号２：ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）との組み合わせを使用した場合に検出された。

生物学的試験の説明と共に提供された実施例や表が示すように、提案された新規のＨＰ−Ｖ２ペプチドは高い免疫賦活活性を保有し、既知のＨＥＰ−１ペプチドの活性と比較した場合に、同じである（表３）または４倍高い（表１）。また、既知のＨＥＰ−１ペプチドおよびその組成物のものよりも何倍か高く、最も高い免疫刺激活性および広範囲の活性（表１−３）を有する医薬組成物が、請求項に記載のＨＰ−Ｖ２ペプチドおよび既知のエズリンペプチドに基づいて得られた。

実施例９． 組織修復および細胞増殖における分子機構に対するペプチドの影響を示すための研究
以下の研究は、本発明のペプチド（ＨＰ−Ｖ２）が、組織修復および細胞増殖の分子機構に関与しているという証拠を提供する。細胞増殖の分子機構、例えばＴＧＦβ発現の調節、に影響を与える化合物は、消化管の修復に関連することが知られている（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ，， “Ｍｏｎｇｅｒｓｅｎ， ａｎ Ｏｒａｌ ＳＭＡＤ７ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ， ａｎｄ Ｃｒｏｈｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ”， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ３７２：１１０４−１１１３）。また、アキタ（Ａｋｉｔａ）ら、“Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｓｃａｒｌｅｓｓ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ”， Ａｄｖ． Ｗｏｕｎｄ Ｃａｒｅ， ２０１３， ２（２）：４４−４９は、臨床応用と基本的なメカニズムにおける傷跡を残さない創傷治癒における、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）の利益および役割を説明する。ｂＦＧＦは、創傷および潰瘍の治療に広く使用される糖タンパク質である。ｂＦＧＦは任意の型の創傷に容易に適用可能であり、色、テクスチャ、および硬さについてより良い結果をもたらす。チェンら、“ＮＧＦ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｗｏｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ ｂｙ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｖｉａ ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ−Ｒａｃ１−ＪＮＫ ａｎｄ ＥＲＫ Ｐａｔｈｗａｙｓ”， ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｖｏｌｕｍｅ ２０１４， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ５４７１８７）は、ラットにおける皮膚切除創傷の治癒をＮＧＦが大幅に加速し、ＮＧＦによって誘導された線維芽細胞遊走がこの治癒プロセスに寄与し得ることを示した。これはまた、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、Ｒａｃ１、ＪＮＫ、およびＥＲＫの活性化が、すべてＮＧＦ誘発性の線維芽細胞遊走の制御に関与することを示した。さらに、ラフェット（Ｒａｆｆｅｔｔｏ）ら、“Ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｅｎｏｕｓ ｕｌｃｅｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ”， Ｖａｓｃ． Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｕｒｇ．， ２００６， ４０（１）：５９−６６は、ＭＡＰＫ ＥＲＫ経路が、静脈潰瘍線維芽細胞における細胞増殖のために重要であることを示した。

それゆえ、本発明のペプチドは、下部消化管炎症および潰瘍形成の予防および治療に有用である。

ペプチドＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）が、組織の再生ならびに創傷および潰瘍の治癒を担う主な細胞タイプである線維芽細胞の活性化を誘導することが、示されている。この例は、マウス線維芽細胞に対するペプチドＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）の直接的な活性化の影響を証明し、ＭＡＰＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路のレベルで細胞内の早期活性化の特徴を明らかにしている。

ペプチドＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）は実施例１に記載したように得られ、ＢＡＬＢ／ｃマウス線維芽細胞はアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入され、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１：５０ＭＥＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび５０μＭ βメルカプトエタノールを補充した高グルコースＤＭＥＭから成る完全培地中で増殖させられた。細胞は５％ＣＯ２および３７℃で、１０ｃｍ培養皿中で増殖させられた。細胞継代は、５０〜６０％の密集度で行われた。細胞を剥がすために、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡが使用され、続けてトリプシンを抑えるために１０％ＦＣＳを含有する１０倍容量の洗浄培地中で遠心分離（４７０ｘｇ、１５分）した。上清は廃棄され、細胞ペレットが１０ｍｌの完全培地に懸濁され、その後、細胞が実験に使用される前に血球計を用いて細胞数が計数された。

線維芽細胞は８ウェル培養プレートで培養され、試験されたペプチドまたはサイトカインＴＧＦ−β１（陽性対照）溶液、または等容量の培養培地（陰性対照）が、それぞれ３連の培養物に添加された。細胞は、ペプチドＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ 配列番号：１（１０μｇ／ｍｌ）もしくはＴＧＦ−β１の存在下で、またはエフェクター化合物無しで、５％ＣＯ２および３７℃にて１または６時間の間インキュベートされた。示された時点で細胞は回収され、ＰＢＳで２回洗浄され、プロテアーゼ阻害剤の存在下で細胞抽出緩衝液を使用して４℃で３０分間溶解された。抽出物は遠心分離（１４，０００ｘｇ、１０分間、４℃）により清澄にされた。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ社、２３２２５）を用いて測定された。次いで、抽出物の適切な希釈液（トラック当たり１０μｇタンパク質）が８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画され、その後、免疫ブロッティングのためにＰＶＤＦメンブレン（アマシャム社）に転写された。標的タンパク質は、リン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（セルシグナリング社、４３７０）およびＧＡＰＤＨ（Ａｂｃａｍ社 ａｂ８２４５）に特異的な抗体を用いて検出された。タンパク質バンドが可視化された後、ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用してその強度が測定された。データは、それぞれのＧＡＰＤＨバンドの値に対して正規化されたＥＲＫ１、ＥＲＫ２またはリン酸化ＥＲＫ１およびリン酸化ＥＲＫ２の値（バンドあたりのピクセル数）として表された。平均値＋ＳＤが、３つの独立した実験のデータを用いて計算された。

我々の実験結果は、ペプチドＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）および陽性対照ＴＧＦ−β１の両方が、線維芽細胞においてＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の急速な活性化を誘導することを示している。これらのエフェクター化合物の接種後１時間で、リン酸化ＥＲＫ１（４４ｋＤ）およびＥＲＫ２（４２ｋＤ）の濃度は約３〜５倍に増加された。したがって、ＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）またはＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）による線維芽細胞の活性化から１時間後、リン酸化ＥＲＫ１正規化値は、陰性対照での０．１＋０．００２と比較して、それぞれ０．４＋０．０２（ｐ＜０．０１）および０．５＋０．０２（ｐ＜０．０１）であり、リン酸化ＥＲＫ２値は、陰性対照での０．４＋０．０１と比較して、１．３＋０．０５（ｐ＜０．０１）および１．９＋０．１（ｐ＜０．０１）であった。その後、活性化から６時間後、ペプチドＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）またはＴＧＦ−β１で活性化された線維芽細胞におけるリン酸化ＥＲＫ１の値は、それぞれ０．１＋０．００６（ｐ＞０．１）および０．３＋０．０２（ｐ＜０．０５）であったのに対し、陰性対照培養物中では０．１＋０．０１であった。６時間の時点でのリン酸化ＥＲＫ２の値は、ペプチド、ＴＧＦ−β１および非活性化培養物で、それぞれ、０．１＋０．０１（ｐ＞０．１）、０．３５＋０．０２（ｐ＜０．０１）、および０．１＋０．００７であった。

上記の研究は、ＨＰ−Ｖ２の活性がＴＧＦβ（陽性対照）の活性と類似し、それゆえ下部消化管の炎症および潰瘍形成の予防および治療における使用についての可能性を示している。

Claims (18)

1. 一般式（Ｉ）のアミノ酸配列
   ただし、前記Ｘ_１、Ｘ_２およびＸ_３のそれぞれは、非極性アミノ酸残基を表す、
   を含むペプチド。
2. 前記非極性アミノ酸が、独立に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、および／またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
3. Ｘ_１Ｘ_２および／またはＸ_３がグリシンである、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
4. 前記アミノ酸配列がＧＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＧＧ（配列番号：１）である、請求項３に記載のペプチド。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドの有効量、および薬学的に許容される担体または増量剤を含む、医薬組成物。
6. 配列番号２（ＴＥＫＫＲＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）のペプチドの有効量をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 配列番号３（ＴＥＫＫＲ）のペプチドの有効量をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
8. 配列番号４（ＲＥＴＶＥＲＥＫＥ）のペプチドの有効量をさらに含む、請求項５に記載の医薬組成物。
9. 被験体での免疫応答の刺激において使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
10. ウイルス、細菌または真菌感染症の治療または予防において使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 消化管の粘膜の潰瘍形成の治療または予防において使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
12. 前記消化管の粘膜の潰瘍形成が、胃潰瘍、大腸潰瘍、十二指腸潰瘍、または小腸の潰瘍である、請求項１１に記載の使用のためのペプチドまたは医薬組成物。
13. 炎症性腸疾患、または炎症性腸疾患に関連する疾患もしくは障害の治療または予防において使用される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
14. 炎症性腸疾患に関連する前記疾患または障害が、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のためのペプチドまたは医薬組成物。
15. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療上の有効量を被験体に投与することを含む、免疫応答の刺激を必要とする被験体において免疫応答を刺激する方法。
16. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチドまたは請求項５〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物の治療上の有効量を被験体に投与することを含む、ウイルス、細菌または真菌感染症を治療および／もしくは予防する方法、または消化管の粘膜の潰瘍形成を治療もしくは予防する方法、または炎症性腸疾患もしくは炎症性腸疾患に関連する疾患もしくは障害を治療もしくは予防する方法。
17. 前記消化管の粘膜の潰瘍形成が胃潰瘍、大腸潰瘍、十二指腸潰瘍、または小腸の潰瘍である、請求項１６に記載の方法。
18. 炎症性腸疾患に関連する前記疾患または障害が、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、潰瘍性大腸炎およびクローン病からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。