CN107224582A - 免疫增强肽在制备通过粘膜给药的增强免疫功能药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了免疫增强肽在制备通过粘膜给药的增强免疫功能药物中的应用，免疫增强肽采用非损伤性给药方式，通过粘膜给药的方式(包括口服、喷鼻、点眼等粘膜给药方式)激发或提升机体的免疫功能，用于人与动物预防和治疗与免疫调节相关的疾病，如细菌感染、病毒感染、免疫功能失调或低下的预防和治疗。

Description

免疫增强肽在制备通过粘膜给药的增强免疫功能药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及具有免疫提升功能的肽类分子--免疫增强肽作为药物成份，通过作用于机体的粘膜部位提升机体的免疫功能达到预防和治疗与免疫相关疾病的目的。

背景技术

生物体的遗传基因被存储在多聚脱氧核苷酸链上，遗传基因编码着执行生物学功能的蛋白质。生物体内的蛋白质多种多样，它们行使着各种生物学功能维持生命活动。蛋白质的种类虽然多不胜举，但它们基本上都是由20个自然界存在的天然氨基酸组成。由于氨基酸的组成和排列顺序的差异导致了蛋白质的千差万别。一般来说，含有50个以上氨基酸的分子被称为蛋白质，游离出蛋白质的一段氨基酸序列分子(序列可长可短)统称为肽段或肽，一般含10-50个氨基酸的肽链被称为多肽，少于10个氨基酸的肽链被称做寡肽或小肽。目前发现最小的功能小肽只有2个氨基酸，通常较为常见的是4个氨基酸以上的功能小肽。

由于人类基因组计划的完成和人类蛋白组计划的开展，将会有越来越多的蛋白质功能片段被发现并被作为药物应用到生物医药领域中来。蛋白质的功能片段通常是指被发现具备某种特定生物学功能的直链肽片段，它们通常是由几个，或十几个，乃至几十个氨基酸组成的肽类片段，这些被鉴定和发现的蛋白质的功能片段可通过人工合成的途径制备。现已开发并在临床上得到应用的多肽药物有“催产素”、“胸腺肽α1”、“胸腺五肽”、“Tuftsin”、“Bursin”等，也有在天然肽链的基础上进行人工改造的多肽药物，比如，用于治疗消化道出血和肢端肥大症的环状多肽药物“奥曲肽”和用于抗凝血的肽段拼接药物“水蛭肽”等。

目前应用于临床的免疫增强肽均是人体胸腺组织产生的天然免疫活性肽，一个是含有28个氨基酸的肽链Thymosinα1(胸腺肽α1),商品名“日达仙”，另一个是Thymopentin-5(胸腺五肽)。“日达仙”的临床适应症为慢性乙型肝炎，还可用于肿瘤和免疫功能低下的辅助治疗。使用时只能注射，且不能肌肉注射或静脉注射，只能使用随包装的1.0ml注射用水溶解后立即皮下注射。

“胸腺五肽”用于治疗18岁以上患者的慢性乙型肝炎、各种原发性或继发性T细胞缺陷病(如儿童先天性免疫缺陷病)、某些自身免疫性疾病(如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮)和各种细胞免疫功能低下的疾病，还可用于肿瘤的辅助治疗；使用时采取肌肉注射或加入葡萄糖中静脉滴注。

由于肽类药物属于生物活性类物质，对温度敏感，易降解，因此目前都是冻干粉针剂，且药物需采取冷链运输和低温存贮。使用时为了获得最大的药物生物利用度，达到良好的药效，需要从冷柜中取出后即刻使用。并且，为了以最快速度让药物达到最高血药浓度，发挥药效，只能采取注射途径，否则药物还未到达作用部位就已降解，严重影响生物利用度。因此，目前免疫增强肽的给药需要医护人员的专业操作才能完成，并属于创伤性给药方式，对于患有慢性病、免疫功能低下需要持续接受治疗的患者，注射给药的方式造成了额外的痛苦和不便。于是，为患者开发出一种无创伤、无痛苦、简便易行、易于实施的免疫增强肽的给药方式势在必行。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供免疫增强肽在制备粘膜给药增强免疫功能药物中的应用，所述粘膜为眼部粘膜、呼吸道粘膜(优选鼻咽腔粘膜)、消化道粘膜(优选胃肠道粘膜)、阴道粘膜、尿道粘膜、肛门直肠粘膜、动物泄殖腔粘膜。

所述增强免疫功能药物包括预防和治疗鼻炎、咽炎、气管炎的药物，增强免疫功能药物通过与分布在鼻咽腔黏膜的免疫细胞相互作用，有效提升机体免疫机能，达到预防和治疗鼻炎、咽炎、气管炎的目的；优选的，所述鼻炎、咽炎、气管炎是由细菌感染引发的。

所述增强免疫功能药物还包括预防和治疗免疫相关疾病的药物，所述免疫相关疾病如细菌性感染疾病、病毒性感染疾病，免疫功能失调或低下。

所述免疫增强肽包括天然的免疫增强肽，和非天然序列、非天然结构的免疫增强肽。

所述免疫增强肽选自胸腺肽α1、胸腺五肽、促吞噬肽、囊素、CN 101838305A所述T2多肽合成产物、CN 101838306A所述K4多肽合成产物、CN 106349334A所述多肽化合物等；

所述T2多肽合成产物的结构通式为(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₂＞K-X₂，X_A和X_C分别选自丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、谷氨酰胺(Asn，N)和天门冬酰胺(Gln，Q)中的一种，X_B和X_D分别选自组氨酸(His，H)、赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)中的一种，K代表赖氨酸(Lys)，X₁和X₂分别代表由0-10个任意氨基酸组成的氨基酸序列；优选的，所述T2多肽合成产物为(TKPR)₂＞K；

所述K4多肽合成产物的结构通式为：(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄＞(K-X₂)₂＞K-X₃，X_A为丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、谷氨酰胺(Asn，N)或天门冬酰胺(Gln，Q)，X_B和X_D分别选自组氨酸(His，H)、赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)中的一种，X_C为甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)或蛋氨酸(Met，M)，K代表赖氨酸(Lys)，X₁、X₂和X₃分别代表由0-5个任意氨基酸组成的氨基酸序列；优选的，所述K4多肽合成产物为(TKLK)₄＞K₂＞K-G；

所述多肽化合物的结构式为：(X_AX_BX_CX_DX_EX_FX_G-X)₂KY，或{(X_AX_BX_CX_DX_EX_FX_G-X)₂K}₂KY，或{({X_AX_BX_CX_DX_EX_FX_G-X}₂K)₂K}2KY，X_A、X_B、X_D、X_E和X_G分别选自丙氨酸(Ala,A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)或谷氨酰胺(Gln，Q)，X_C和X_F分别选自丙氨酸(Ala,A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)或脯氨酸(Pro,P)，K为赖氨酸(Lys,K)，X或Y为空、任意一个氨基酸、多个氨基酸组成的肽片段、或能将氨基酸或肽片段连接起来的化学基团。

所述增强免疫功能药物的剂型为液体剂型，如滴眼液、滴鼻液、液体喷雾剂、软胶囊等；或所述增强免疫功能药物的剂型为固体剂型，如粉雾剂、片剂、泡腾片、胶囊、膏剂、剂型、滴丸等。

所述增强免疫功能药物还包括促渗剂、促溶剂、稳定剂、等渗维持剂、支撑剂等。

所述粘膜给药的方式为眼部粘膜给药、呼吸道粘膜给药、消化道粘膜给药、阴道粘膜给药、尿道粘膜给药、肛门直肠粘膜给药、动物泄殖腔粘膜给药等，优选眼部粘膜给药、呼吸道粘膜给药(优选鼻咽腔给药)、消化道粘膜给药(优选肠粘膜给药，即口服)。

所述免疫增强肽作为药物的主要成份，其给药剂量范围：哺乳动物口服：0.1mg/kg体重-1mg/kg体重，哺乳动物外用：1μg/日/次-100μg/日/次，禽类口服：1μg/kg体重-100μg/kg体重。

本发明提供的免疫增强肽采用非损伤性给药方式，通过粘膜给药的方式(包括口服、喷鼻、点眼等粘膜给药方式)激发或提升机体的免疫功能，达到对疾病的预防及治疗的目的。该粘膜给药增强免疫功能药物是以免疫增强肽为核心的有效成份，或与其它物质组合形成协同效应的复合型制剂，也可与粘膜通透剂、促渗剂、吸收促进剂配伍帮助免疫增强肽更好地被吸收利用，提高药效；还可与稳定剂、等渗调节剂、药物支撑剂、保护剂配伍形成稳定的药物剂型。本发明提供的免疫增强肽作为药物核心成份，通过机体粘膜部位(如眼部粘膜、呼吸道粘膜、消化道粘膜、阴道粘膜、尿道粘膜、肛门直肠粘膜、动物泄殖腔粘膜等)激发和提升机体的免疫功能，通过粘膜给药的途径用于治疗和预防与免疫相关的疾病，如细菌感染引发的眼结膜炎、鼻炎、咽炎、气管炎、阴道炎、肠炎等。免疫增强肽与疫苗混合通过滴眼、喷雾吸入鼻咽腔等呼吸道、口服进入消化道粘膜的方式使免疫增强肽(及疫苗)与机体粘膜接触，起到有效预防传染病的作用。

具体实施方式

1963年美国洛克菲勒大学生物化学教授R.Bruce Merrifield开创性地发明了便利省时高效的多肽固相合成技术，使得人工合成多肽分子易于实施，为开展多肽研究及开发多肽药物提供了便利及可能。

本发明提到的免疫增强肽可通过多肽固相合成技术制备，将它们用于临床及畜牧兽医领域对疾病进行预防及治疗。

本发明提到的免疫增强肽的固相合成机理，如下：

1963年美国科学家R.B.Merrifield发明创立了将目的肽的氨基酸的羧基端(C端)固定在不溶性树脂上，树脂上结合的氨基酸的氨基端(N端)与有待连接的氨基酸的羧基端进行缩合反应达到延长肽链的固相合成法。也就是从多肽的羧基端(C端)开始逐个氨基酸缩合并向多肽段的氨基端(N端)方向不断延伸。因此，在进行氨基酸的缩合反应时，要将有待连接的氨基酸上的氨基及侧链基团保护起来避免发生反应。目前常用的有叔丁氧羰基(Boc)保护法和芴甲氧羰基(Fmoc)保护法，因此每连接上一个氨基酸就要经历一次脱保护的过程(即固相载体上的氨基先脱保护，再同过量的有待连接的下一个目标氨基酸的羧基发生缩合反应以延长肽链)。通过这样的步骤反复多次地进行下去，即：缩合、洗涤、脱保护、中和、洗涤，再进入下一轮缩合(接上一个目标氨基酸)、洗涤、脱保护、中和、洗涤，直至达到所需要合成的目标肽链长度。合成完成后采用TFA法将目的多肽从树脂上裂解下来，得到目的肽的粗品。目的肽的粗品还要经过纯化，纯化过程依次为：粗肽、溶解、脱盐、纯化、冻干、纯品。

采用色谱柱型号Daiso C18(10μm,50x 250mm)，色谱操作流动相A为(按体积百分含量，含0.05％三氟乙酸，2％乙腈的水溶液)，流动相B为乙腈与水的体积比为9:1的乙腈水溶液，流速为每分钟25毫升，紫外检测波长220纳米。收集流出峰溶液，获得目的肽纯品溶液。

收集到的目的肽纯品溶液经过冷冻干燥呈白色絮状固体，即目的肽纯品，其纯度可达99％以上。目的肽纯品经密封包装后放入冰箱保存待用。

本发明提到的免疫增强肽特指具有增强机体免疫功能的肽类化合物，包括天然来源的免疫增强肽、经过人为技术改造而成的非天然结构及序列的免疫增强肽及其几何异构体、其药学上可接受的盐或溶剂化合物，或经过附加化学修饰或包裹的免疫增强肽；在作为主要药效成分制备药物时还包括可药用载体、赋形剂或药用辅料，也可以是以免疫增强肽为核心有效成份与其它物质组合构成协同效应形成的复合型制剂。免疫增强肽具体的，包含临床应用的胸腺肽α1、胸腺五肽，还包括有过报道的囊素Bursin、促吞噬肽Tuftsin，以及其它具有增强免疫活性的各种肽类物质。

人体或动物体与外界接触或相通的粘膜部位主要有鼻咽腔粘膜、眼睛粘膜、肠粘膜、雌性哺乳动物阴道粘膜、肛门直肠粘膜、动物泄殖腔。其中，鼻咽腔粘膜由于其生理特点成为最易于实施粘膜给药的部位。

鼻咽腔粘膜是机体呼吸道的首要门户，也是机体粘膜最广泛、最先接触外界的气息及外源微生物(包含致病微生物病原体)、颗粒、粉尘的部位。因此鼻咽腔粘膜被认为是人体通过呼吸道阻止病原体入侵机体的第一道重要防线或屏障。

哺乳类动物(包括人类)、鸟类的鼻咽部有丰富的血流供应并分布有大量的免疫细胞。哺乳类动物包括人的鼻咽腔内有鼻咽扁桃体、双侧腭扁桃体、双侧舌扁桃体、双侧咽淋巴环及双侧咽峡管。鼻咽腔粘膜附着有T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、多形核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等丰富的免疫细胞。将免疫增强肽通过滴鼻、喷雾等诸多方式使其分布至鼻咽腔，与鼻咽腔粘膜接触并被吸收后，与分布在鼻咽腔黏膜的免疫细胞相互作用，可有效提升机体免疫机能，从而达到对人、家畜、家禽的防病治病的目的。本发明旨在将通常免疫增强肽的注射给药方式转变成行之有效的非创伤性粘膜给药的方式，从而拓展受药群体的易于接纳程度和提高给药的安全舒适度。

本发明通过以下实验例阐述采用口服、点眼、滴鼻的粘膜给药途径给予受试动物免疫增强肽，表明通过粘膜给药的方式同样具有提升免疫功能的作用，在临床及畜牧业生产上对防病治病具有实施便捷、效率高、效果好、接受程度高的重大实际意义。

实验例一：不同给药方式对受试动物免疫应答能力的影响

引起鸡流行性疾病的新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)能够与鸡红细胞发生凝集现象，根据此原理若先用特异性抗体与病毒作用，然后再加入红细胞则可抑制红细胞发生凝集，这一试验被称为“血凝抑制试验”(Hemagglutination Inhibition test,HI),检测所用的抗血清稀释的最高倍数定义为抗体的滴度。经过NDV疫苗免疫的鸡血清内的抗体滴度越高，说明鸡体内对NDV的免疫应答效果越好，免疫防御效果越好。

实验目的：采用注射、点眼、滴鼻、口服的方式比较免疫增强肽的作用效果。

实验方法：

1、选取7日龄无特定病原(Specific Pathogen Free)雏鸡(以下简称为SPF雏鸡)48只，饲养在隔离器内。

2、以8只为一组将SPF雏鸡分为空白对照组、疫苗组、皮下注射组、点眼组、滴鼻组、口服组，一共六组。

3、将鸡新城疫冻干弱毒疫苗(ND-Lasota)(购自成都天邦生物制品有限公司，以下简称为疫苗)稀释至1羽份/0.2ml后，使1羽份/0.2ml的疫苗内含10μg免疫增强肽(即CN101838305A中公开的T2多肽合成产物、CN 101838306A中公开的K4多肽合成产物、CN106349334A中公开的多肽化合物)，然后分别对皮下注射组、点眼组、滴鼻组、口服组的SPF雏鸡进行免疫。

4、在免疫后的第7天和第14天分别从各组SPF鸡翅下静脉采血1ml，血浆置于Eppendrof试管中，室温静置2小时，移至4℃冰箱中静置至少1小时以上。经过4℃1000rpm离心10分钟，取上层的血清部分作为样本进行血凝抑制(HI)抗体效价的检测。血凝抑制试验检测鸡新城疫抗体效价方法参考《新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程》SN/T 1109-2002，以CN 101838305A中公开的T2多肽合成产物(TKPR)₂K(MW：1111.34，纯度>98％)为例,检测结果见表1。

表1SPF雏鸡免疫实验结果

组别	给药剂量	第7天抗体效价平均值	第14天抗体效价平均值
				皮下注射组	疫苗+10μg免疫增强肽	3.5(log2)	6.3(log2)
点眼组	疫苗+10μg免疫增强肽	5.7(log2)	7.8(log2)
				滴鼻组	疫苗+10μg免疫增强肽	5.4(log2)	7.5(log2)
口服组	疫苗+10μg免疫增强肽	5.1(log2)	7.3(log2)
				免疫对照组	注射疫苗	2.5(log2)	5.3(log2)
空白对照组	无	0(log2)	0(log2)

表1的结果显示，在给予相同剂量的样品肽条件下，最佳给药免疫的方式为：点眼>滴鼻>口服>注射，说明点眼、滴鼻、口服等非创伤性给药免疫方式能够有效地刺激和提升机体对疫苗的免疫应答，粘膜部位是免疫增强肽所用的有效场所。

其它免疫增强肽也有类似效果，在此不一一赘述。

实验例二：口服给药方式对受试动物免疫应答能力的影响

实验目的：检测免疫增强肽的口服给药效果。

实验方法：

1、选取6周龄SPF鸡60只，饲养在隔离器内。

2、以10只为一组将SPF鸡分为空白对照组、免疫组、皮下注射低浓度组、皮下注射高浓度组、口服低浓度组、口服高浓度组，一共六组。

3、将鸡新城疫冻干弱毒疫苗(ND-Lasota)(购自成都天邦生物制品有限公司，以下简称为疫苗)稀释至1羽份/0.2ml后，加入免疫增强肽(即CN 101838305A中公开的T2多肽合成产物、CN 101838306A中公开的K4多肽合成产物、CN 106349334A中公开的多肽化合物)分别使1羽份/0.2ml的疫苗内含10μg样品肽,或1μg样品肽(即高浓度组和低浓度组)，然后分别对免疫组、皮下注射低浓度组、皮下注射高浓度组、口服低浓度组和口服高浓度组的SPF鸡进行免疫，给药方式见表2；

4、在免疫后的第21天对各组SPF鸡翅下静脉采血1ml，按实验例1中所提及的方法，检测新城疫抗体水平，以CN 101838306A中公开的K4多肽合成产物〔(TKLK)₂K〕₂KG(MW：2324.2，纯度>98％)为例,检测结果见表2。

表2 SPF鸡免疫实验结果

组别	肽剂量	血清抗体平均值(log2)
			空白对照组	无	0
疫苗免疫组	疫苗	7.7
			皮下注射低浓度组	疫苗+1μg/只	8.8
皮下注射高浓度组	疫苗+10μg/只	9.1
			口服低浓度组	疫苗+1μg/只	9.0
口服高浓度组	疫苗+10μg/只	9.3

表2结果显示，随着给药剂量从1μg/只增加到10μg/只，受试鸡体内识别新城疫病毒的抗体滴度随之提高。对于新城疫冻干弱毒疫苗的最佳免疫部位首选是粘膜区域，口服免疫方式比注射具有更好的免疫提升作用。本实验表明通过口服免疫增强肽能够有效地刺激和提升机体对疫苗的免疫应答反应。

其它免疫增强肽也有类似效果，在此不一一赘述。

实验例三：口服免疫增强肽剂量对受试动物细胞免疫能力的影响

实验原理：

机体各组织器官及外周血中分布着许多T淋巴细胞，通过组织液、淋巴液、血液为载体在体内循环，发挥细胞免疫功能，分泌细胞因子、免疫应答清除病源微生物。因此血液中T淋巴细胞的数量在一定程度上与机体免疫功能呈正相关，所以检测淋巴细胞中T淋巴细胞的比值是迅速判定免疫功能发挥程度的简便易行的操作方式。

1975年Mueller发现酸性α-醋酸萘酯酶(Acidα-Naphthyl Acetate Esterase,简称ANAE)能特异性地标记小鼠T淋巴细胞，由于T淋巴细胞的胞浆中的酯酶能水解α-醋酸萘酯，产生α-醋酸萘酚与重氮付品红欧联生成棕红色的颗粒。根据这一特点在普通显微镜下可观察并计算出T淋巴细胞的数量。采用ANAE方法计数T淋巴细胞操作简便、快速、无需特殊设备，因此在临床和畜牧兽医得到广泛的应用。

实验方法：

1、选取刚出生1日龄的SPF雏鸡32只，饲养在隔离器内；

2、将SPF雏鸡分为空白对照组、给药A组、给药B组、给药C组，共四组(8只/组)，每日口服给予各组雏鸡免疫增强肽(即CN 101838305 A中公开的T2多肽合成产物、CN101838306 A中公开的K4多肽合成产物、CN 106349334 A中公开的多肽化合物)一次，连续给药2周(14天)，给药剂量见表3；

表3各组SPF雏鸡的每日给药剂量

	给药A组	给药B组	给药C组	空白对照组
					免疫增强肽剂量/次/日	10μg	50μg	100μg	无

3、分别在给药第7天，第14天和停止给药后第7天对各组SPF雏鸡翅下静脉采血，用全血涂片。采用ANAE法检测各组SPF雏鸡的T淋巴细胞数量，将涂片置于显微镜下观察，计数100个淋巴细胞中胞质具有红褐色颗粒的T淋巴细胞的比值。实验方法参考张凌志、李福生、薛文志、韩维廉“应用酯酶标记染色法检查鸡血液T淋巴细胞”《家畜传染病》1985(1)：37-39，以CN 106349334 A中公开的多肽化合物(TRPRKEG)₂KG(MW:1853.1,纯度>98％)为例,结果见表4-表6。

表4给药第7天各组SPF雏鸡血中T淋巴细胞所占比例

表4结果显示，给药第7天给药C组T淋巴细胞比例最高，与其它组相比差异极其显著(P≤0.01)，给药A组与给药B组的T淋巴细胞比例略高于空白对照组(P>0.05)

表5给药第14天各组SPF雏鸡血中T淋巴细胞所占比例

样本	给药A组	给药B组	给药C组	空白对照组
					1	45％	52％	70％	26％
2	32％	42％	58％	35％
					3	43％	37％	65％	37％
4	27％	49％	67％	39％
					5	32％	51％	54％	32％
6	29％	38％	72％	27％
					7	46％	40％	57％	30％
8	42％	35％	69％	38％
					平均值	37％	43％	64％	33％

表5结果显示，给药第14天给药C组T淋巴细胞比例最高，与给药A组、空白对照组相比差异极显著(P≤0.01)，与给药B组相比差异显著(P≤0.05)。

表6停止给药第7天各组SPF雏鸡血中T淋巴细胞所占比例

样本	给药C组	空白对照组
			1	54％	28％
2	45％	34％
			3	36％	28％
4	46％	32％
			5	47％	34％
6	38％	41％
			7	40％	29％
8	46％	30％
			平均值	44％	32％

表6结果显示，停止给药7天后给药C组的T淋巴细胞与空白对照组相比差异依然显著(P≤0.05)，表明受试动物口服免疫增强肽对免疫系统的T淋巴细胞数比值的提升有显著影响。

其它免疫增强肽也有类似效果，在此不一一赘述。

综上，将免疫增强肽冻干粉经注射用水(或生理盐水、磷酸缓冲液)溶解后给予受试动物，或与疫苗混合同时进行免疫接种后，结果显示免疫增强肽与疫苗联用，采取滴鼻、点眼、口服处理的动物体内的抗体滴度明显高于未经处理的动物。该结果说明通过受试动物的粘膜给药，可以有效提升机体的免疫应答反应，从而提高受试动物的抗病生存能力。将免疫增强肽给予动物口服，能有效提升T淋巴细胞的比值，表明免疫增强肽具有提升免疫功能的细胞学基础。

由于各种炎症，包括眼结膜炎、咽炎、鼻(窦)炎、肠炎、阴道炎等诸多炎症都与细菌或病毒的侵染有关，提升机体自身的免疫抵抗能力就是强化了抵抗细菌病毒的能力，就是提升了机体恢复重健的能力。从以上结果可知：免疫增强肽可以通过粘膜部位显著提升体内特异抗体的滴度，有效提升T淋巴细胞比值，证明通过粘膜途径免疫增强肽可有效提高机体的免疫抗病能力，抵抗细菌病毒的侵袭，从而表明免疫增强肽通过粘膜途径可以改善机体的免疫功能低下。

本发明的免疫增强肽可以在禽类动物的眼部粘膜、鼻咽腔粘膜，肠粘膜发挥作用，推广到人药的临床应用，考虑到肠粘膜给药(即口服)需要经过胃中胃酸及酶的消化，可以采用肠溶型胶囊或用肠溶型包衣包裹药物制剂，使得免疫增强肽在抵达肠道后释放出来被小肠绒毛吸收，直接与肠道免疫细胞相互作用达到提升免疫功能的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.免疫增强肽在制备通过粘膜给药的增强免疫功能药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述粘膜为眼部粘膜、呼吸道粘膜(优选鼻咽腔粘膜)、消化道粘膜(优选胃肠道粘膜)、阴道粘膜、尿道粘膜、肛门直肠粘膜、动物泄殖腔粘膜。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述增强免疫功能药物包括预防和治疗鼻炎、咽炎、气管炎的药物，优选的，所述鼻炎、咽炎、气管炎是由细菌感染引发的。

4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述增强免疫功能药物还包括预防和治疗免疫相关疾病的药物，所述免疫相关疾病如细菌性感染疾病、病毒性感染疾病，免疫功能失调或低下。

5.根据权利要求1-4任一所述应用，其特征在于，所述免疫增强肽包括天然的免疫增强肽，和非天然序列、非天然结构的免疫增强肽。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述免疫增强肽选自胸腺肽α1、胸腺五肽、促吞噬肽、囊素、CN 101838305 A所述T2多肽合成产物、CN 101838306 A所述K4多肽合成产物、CN 106349334 A所述多肽化合物等；

所述T2多肽合成产物的结构通式为(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₂＞K-X₂，X_A和X_C分别选自丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、谷氨酰胺(Asn，N)和天门冬酰胺(Gln，Q)中的一种，X_B和X_D分别选自组氨酸(His，H)、赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)中的一种，K代表赖氨酸(Lys)，X₁和X₂分别代表由0-10个任意氨基酸组成的氨基酸序列；优选的，所述T2多肽合成产物为(TKPR)₂＞K；

所述K4多肽合成产物的结构通式为：(X_A-X_B-X_C-X_D-X₁)₄＞(K-X₂)₂＞K-X₃，X_A为丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、脯氨酸(Pro，P)、谷氨酰胺(Asn，N)或天门冬酰胺(Gln，Q)，X_B和X_D分别选自组氨酸(His，H)、赖氨酸(Lys，K)和精氨酸(Arg，R)中的一种，X_C为甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)或蛋氨酸(Met，M)，K代表赖氨酸(Lys)，X₁、X₂和X₃分别代表由0-5个任意氨基酸组成的氨基酸序列；优选的，所述K4多肽合成产物为(TKLK)₄＞K₂＞K-G；

所述多肽化合物的结构式为：(X_AX_BX_CX_DX_EX_FX_G-X)₂KY，或{(X_AX_BX_CX_DX_EX_FX_G-X)₂K}₂KY，或{({X_AX_BX_CX_DX_EX_FX_G-X}₂K)₂K}2KY，X_A、X_B、X_D、X_E和X_G分别选自丙氨酸(Ala,A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)或谷氨酰胺(Gln，Q)，X_C和X_F分别选自丙氨酸(Ala,A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸(Met，M)、半胱氨酸(Cys，C)、精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)、甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、天冬氨酸(Asp,D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、色氨酸(Trp,W)、组氨酸(His,H)或脯氨酸(Pro,P)，K为赖氨酸(Lys,K)，X或Y为空、任意一个氨基酸、多个氨基酸组成的肽片段、或能将氨基酸或肽片段连接起来的化学基团。

7.根据权利要求1-6任一所述应用，其特征在于，所述增强免疫功能药物的剂型为液体剂型，如滴眼液、滴鼻液、液体喷雾剂、软胶囊等；或所述增强免疫功能药物的剂型为固体剂型，如粉雾剂、片剂、泡腾片、胶囊、膏剂、剂型、滴丸等。

8.根据权利要求1-7任一所述应用，其特征在于，所述增强免疫功能药物还包括促渗剂、促溶剂、稳定剂、等渗维持剂、支撑剂等。

9.根据权利要求1-8任一所述应用，其特征在于，所述粘膜给药的方式为眼部粘膜给药、呼吸道粘膜给药、消化道粘膜给药、阴道粘膜给药、尿道粘膜给药、肛门直肠粘膜给药、动物泄殖腔粘膜给药等，优选眼部粘膜给药、呼吸道粘膜给药(优选鼻咽腔给药)、消化道粘膜给药(优选肠粘膜给药，即口服)。

10.根据权利要求1-9任一所述应用，其特征在于，免疫增强肽作为药物的主要成份，其给药剂量范围：哺乳动物口服：0.1mg/kg体重-1mg/kg体重，哺乳动物外用：1μg/日/次-100μg/日/次，禽类口服：1μg/kg体重-100μg/kg体重。