CN112020367B - 用于治疗急性呼吸道传染病的抗病毒免疫调节剂 - Google Patents

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Abstract

用于治疗急性呼吸道传染病的抗病毒免疫调节剂。本发明属于医学领域，尤其是药理学，具体涉及用于治疗急性呼吸道传染病(尤其是由流感病毒引起)的含有酪氨酰基六肽‑D‑丙氨酰基‑甘氨酰‑苯丙氨酰基‑亮氨酰‑精氨酸或药理学上可接受的盐的鼻腔用复合物。已申报含有用于治疗急性呼吸道传染病的酪氨酰基六肽‑D‑丙氨酰基‑甘氨酰‑苯基丙氨酰基‑亮氨酰‑精氨酸或其药理学上可接受的盐的鼻腔用复合物的应用。

Description

用于治疗急性呼吸道传染病的抗病毒免疫调节剂
技术领域
本发明属于医学领域，尤其是药理学，具体涉及用于治疗急性呼吸道传染病(尤其是由流感病毒引起)的含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或药理学上可接受的盐的鼻腔用复合物。
背景技术
目前，传染病中最常见的是急性呼吸道传染病，占传染病总数90％以上[1]。根据世界卫生组织的信息，每年全世界登记在案的病例数量超过4000万例。急性呼吸道传染病的社会负担主要表现为高昂的间接费用，如在暂时离开工作岗位期间内产生的成本、劳动生产率下降造成的经济损失、家属在照顾患者期间暂时离开工作岗位造成的误工费(在美国，仅因暂时失去劳动能力而造成的经济损失约为2.32亿美元)[2]。
对于俄罗斯来讲，这一问题也非常迫切，因为官方数据显示，在俄罗斯每年登记在案的呼吸道感染病例数量为2730～4120万例。这是一种在总发病率结构中具有较高比重的疾病，约占暂时失去劳动能力的累计期限的40％[3]。
目前，已知200多种可引起类似流感疾病的病毒。分析不同科学家小组在不同国家进行的关于急性呼吸道传染病病因结构的一系列研究的数据后，发现最常见的病原体包括：鼻病毒、流感病毒、副流感、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、间质肺病毒、博卡病毒和腺病毒[4]。流感病毒属于正粘病毒，呈球形。病毒内部由聚合酶复合物(PA、PB1、PB2)、核糖核蛋白和基质蛋白组成。病毒外壳带有两种表面抗原：血凝素和神经氨酸酶。这些形成物能够让病毒固定在宿主细胞表面上并引入其内部。表面抗原具有改变的能力，这导致了新的流感病毒株的出现。甲型流感病毒具有最大的变异性，可在很短的时间内引起单个国家的流行病或覆盖整个大陆的全球性大流行病。根据美国疾病控制与预防中心的数据，季节性流感流行病每年导致20万例住院治疗。此外，该疾病按每10万人口计算的死亡率为1.4-1.67[5]。2009年开始的流感全球性大流行病是由具有大流行潜力的甲型流感病毒(H1N1)引起的。后来，该病毒传入俄罗斯。2010年至2011年间和2015年记录到的病例数最高[6]。在1462名患者中进行的选择性药物流行学研究表明，84.7％患者的年龄在18-49岁之间[7]。
因此，防止这种疾病的传播是各个国家面临的重要任务。
目前有几种治疗和预防这种疾病的方法。
具体来说，防止流行病传播的主要预防措施是大规模疫苗接种。疫苗是每年在考虑到关于病毒株在相应地区内传播情况的流行病学数据的基础上开发的。然而，当年研发疫苗后，流感病毒可能会遭遇抗原性漂移。近几年来，由几种不同病原体引起的急性呼吸道传染病很常见。一些数据显示，70％患者会遇到这种情况。从患者身上可以同时释放出数种病毒或由病毒和细菌的结合体或他结合物。在某些情况下，传染病可以由一种病毒引起，但在疾病过程中可以有另一种病毒加入，可能导致患者的临床病情更加严重。这种混合感染通常会使患者的健康恶化，延长疾病的持续时间，可以加剧现有的慢性疾病或导致继发性并发症的发生[8]。
此外，为治疗呼吸道传染病，也经常使用抗病毒药物。具体来说，是具有抗病毒作用的肽类。比方说，抗菌肽实际上是可能由所有多细胞动植物产生的免疫防御分子。它们就是先天免疫系统的第一线，可以在感染的早期阶段上迅速消除侵入性病原体，也可以引发全身适应性免疫反应。大多数抗菌肽是两亲分子和阳离子分子，具有与微生物膜结合的能力。这些微生物膜通常带有负电荷。根据其结构特征和/或氨基酸组成已确定并分类出数百种抗菌肽。脊椎动物中的两种抗菌肽家族——抗菌肽和防御素——主要是由白细胞和上皮细胞产生的小分子。
从背景技术中已知的含有这类肽的合成物，其中的肽能够抑制各种呼吸道病毒感染。由于能够与呼吸道病毒表面的糖蛋白结合的功能区，这种肽可以结合到病毒表面的糖蛋白，并通过胞吞作用传递到细胞核内体。由于这种肽富含碱性氨基酸，它能够防止晚期内体的pH降低，从而阻止病毒膜和内体膜的融合，随后的病毒降解和伴随的病毒核糖核酸的产生。这样，这种肽显示出强大的封锁呼吸道病毒(如流感和冠状病毒的各种亚型)感染的能力，并且可以用于封锁靶细胞中呼吸道病毒的感染，以及预防或治疗呼吸道病毒的感染(第RU2639559号专利，2017年12月21日)。
但是，如前所述，这种药物的使用受到病毒遗传物质可变性的阻碍，因此，其作用限于对这种疗法有反应的特定病原体。
还可以使用联合用药疗法。例如，在日常实践中，以对症治疗急性呼吸道传染病为目的，使用具有解热、止痛、抗水肿和血管保护作用的联合药物是合理的。与单组分对症药物的使用相比，与联合对症药物的使用有关的不良后果更少，并且在经济上更合理[9]。
但是，在急性呼吸道传染病患者中使用这类药物时考虑的并不是保留鼻呼吸功能及局部特异性和非特异性免疫因素的重要作用。
同时，引起急性呼吸道传染病损害的原因之一是鼻呼吸功能的改变，这也与吸入空气消毒机制的作用有关。实现该功能的机制是鼻腔粘膜产生的非特异性和特异性免疫保护因子，以及粘膜纤毛清除作用。
这类药物的预防和治疗效果直接取决于药物从鼻腔中清除所吸入的大气带有的有机和无机因子以及使非特异性和特异性免疫保护功能正常化的能力，以及粘膜纤毛清除作用。
这种预防的一个有前景的方向是使用旨在激活身体非特异性免疫力的药物。为此，在俄罗斯临床实践中广泛使用内源性干扰素的诱导剂，如泰洛龙、阿比朵尔和Cycloferon。
从文献中已知具钠盐形式的二肽α-谷氨酰-色氨酸(第RF2107691号专利，1998年)。这种肽用作免疫调节剂，可影响身体的细胞和体液免疫反应，以及非特异性免疫力。在再生过程受到抑制的情况下，对其起到刺激作用，并改善细胞的代谢过程。它有助于加强淋巴样细胞的分化过程，具有刺激骨髓细胞集落形成的能力，诱导分化受体在淋巴细胞中的表达，使患者处于不同免疫缺陷状态的辅助性T细胞、抑制性T细胞的数量及其比例正常化。
这种二肽用于制作旨在预防和/或治疗上呼吸道疾病，尤其是急性呼吸道传染病(如感染)的鼻腔用复合物。这种复合物含有活性和辅助性物质。活性物质中使用海盐和α-谷氨酰-色氨酸。活性物质的比例(wt％)如下：
——海盐：95.00-98.00；
——α-谷氨酰-色氨酸：2.00-5.00(第RU2540496号专利，2015年2月10日，原型)。
这种鼻用药物含有海水成分，并保障鼻腔的积极灌洗：有助于去除粘液，减少受感染的分泌物和鼻粘膜肿胀，使硬皮变软并去除。该制剂使鼻粘膜纤毛上皮的保护作用正常化，并改善鼻呼吸。
然而，选择海盐作为附加组分对所用二肽的活性起到不理想的作用，并会导致其稳定性和活性的丧失。鉴于此，尽管专利说明书中指出了所用肽的普遍已知的免疫调节特性，它并未反映研究的直接成果，以及其与现有抗病毒药物在效力方面的比较，使得我们无法评估所述药物的抗病毒作用机理、抗病毒效能和选择性。
上述缺点使我们意识到有必要开发具有显着的抗病毒作用并在体内触发抵消急性呼吸道传染病发育的机制的新肽基药物。
具体来说，从背景技术中已知的酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸(称为“达拉根”)，是一种内源性阿片类调节性亮氨酸-脑啡五肽(H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COOH，分子质量：555.6u)。
达拉根对阿片类μ-、δ-和κ-受体起到非特异性结合作用。这说明了其较广的生物学功能范围：止痛[9]和抗氧化[10]特性。该药物已作为降低胃液酸度和胰腺的外分泌功能的制剂在俄罗斯联邦境内注册登记(国家药物登记簿数据库：https://grls.rosminzdrav.ru)。该物质的降压和正性变时作用已知[11]。
目前已注册了数十项显示达拉根不同功效的专利。例如，第RU2196603号专利阐述了达拉根作为输液疗法组成部分在治疗灼伤中的用途。第UA6829LJ号、第UA6823U号和第UA6826U号专利阐述了达拉根在治疗实验性急性胰腺炎中的用途。第UA67632号、第UA67630号和第UA67629号专利依据慢性胰腺炎、急性附件炎和腹膜炎的实验模型分别阐述了达拉根作为抗应激剂的用途。在第UA67626号专利中说明的实验性慢性应激模型，显示了达拉根的抗应激作用。第RU2180598号专利阐述了达拉根在治疗慢性药物成瘾患者的中毒性肝炎中的用途。第MD1413F号出版物阐述了达拉根在治疗口腔粘膜和扁平苔藓中的用途。第MD1296F号出版物提供了关于采用达拉根治疗扁平苔藓的数据。在第RU2008131509号申请中显示了用于治疗脱髓鞘病的药物复合物，其中包括达拉根。第RU2218896号专利阐述了达拉根在治疗大疱性角膜病变中的用途。第MD1963F号和第MD1610F号出版物介绍了达拉根在治疗慢性复发性阿弗他口炎中的用途。第RU2230549号专利阐述了达拉根在治疗过敏性皮肤病的用途。此外，第RU2261722号(有妊娠丢失综合征的女性的隐性生殖器疱疹的治疗)和第RU2167671号(蜱传脑炎的治疗)专利显示了达拉根在治疗特定病毒性疾病的效力。然而，上述著作中未阐明急性呼吸道传染病的治疗方法，都与其他疾病的治疗有关。此外，其中未指出所研究的六肽的直接抗病毒作用。
同时，尽管第RU2241488号专利描述了具注射液形式的达拉根，以及第RU2010152024号申请中阐述了具鼻内用药物复合物喷雾剂形式的达拉根，上述两部著作涉及的达拉根是计划用于治疗肠胃疾病。
前期研究表明，皮下注射10毫克/千克亮氨酸脑啡肽24和48小时后，α-干扰素生产率有所增加[12]，但对于达拉根，该作用之前尚未进行过研究。目前有足够的研究证实达拉根具有免疫调节作用[9、13、14、15、15、16]。但是，在已发表的著作中未阐明达拉根的免疫调节作用的全部范围，尤其是对细胞因子生产率、天然杀伤细胞活性、干扰素诱导作用或吞噬作用的影响。实际上，上述著作并未证明在六肽的作用下可见的局部免疫力的增加现象。
鉴于以上，可以肯定地说，到现在为止发表的资料与达拉根的具体抗病毒作用无关，未全面阐明其免疫调节特性，也未阐明该药物在急性呼吸道传染病治疗中显示的相关性。
发明内容
同时，我们进行的研究表明，达拉根的作用，其中包括直接抗病毒作用以及在通过鼻子局部注射的条件下增加局部和全身免疫保护因子的能力，允许我们将作为单药疗法组成部分或与其他药物联合使用的达拉根，用作治疗和预防急性呼吸道传染病(尤其是流感)的手段。
所取得的成果使我们能够开发并建议使用含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受的盐的鼻腔用药物复合物，以治疗急性呼吸道传染病(尤其由流感病毒引起的)。
在本发明的一个具体实施方案中，这种疾病就是流感。
在本发明的一个具体实施方案中，药理学上可接受的盐是酪氨酰-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸二乙酸盐。
在本发明的一个具体实施方案中，鼻腔用复合物具有喷雾剂形式并含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受(0.01-3wt％)的盐作为活性物质及其他辅助物质。
在本发明的一个具体实施方案中，该复合物的特征在于：它含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受(0.01-3wt％)的盐及其他辅助物质，成分比例(wt％)为：六肽0.01-3％、氯化钠7-11％，以及剩余为水。
在本发明的一个具体实施方案中，该复合物的特征在于：它含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受(0.01-3wt％)的盐及其他辅助物质，成分比例(wt％)为：六肽0.01-3％，以及剩余为水。
在本发明的一个具体实施方案中，该复合物的特征在于：它含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受(0.01-3wt％)的盐及其他辅助物质，成分比例(wt％)为：六肽0.01-3％、氯化钠7-11％、苯扎氯铵为0.1-0.2％，以及剩余为水。
在本发明的一个具体实施方案中，该复合物的特征在于：它含有氯化钠和水作为辅助物质，成分比例(wt％)为：氯化钠9％、水90％。
在本发明的一个具体实施方案中，该复合物的特征在于：它含有注射用水作为水分。
在本发明的一个具体实施方案中，该复合物的特征在于：它含有净化水作为水分。
所述发明的技术成果如下所列：
——扩大了用于创造旨在治疗急性呼吸道传染病的鼻腔用复合物的技术手段范围；
——创造了能够从鼻腔中清除所吸入的大气带有的有机和无机因子以及使非特异性和特异性免疫保护功能正常化的药物。
——创造了一种能够对体内和传染入口的急性呼吸道传染病病原体产生直接抗病毒作用的肽基药物。
因此，本发明的新颖性和实质在于开发一种证明达拉根对急性呼吸道传染病的主要病原体(流感病毒和腺病毒)起到实际抗病毒作用，并充分揭示出达拉根在治疗上述疾病中的免疫调节活性成分。
附图说明
图1为达拉根、阿比朵尔和安慰剂注射后小鼠血清中IFN-α的浓度示意图。
图2为达拉根对自然杀伤细胞毒性的影响示意图。
图3为在达拉根影响下出现的促炎性细胞因子合成的抑制示意图。
具体实施方式
以下是对本发明技术方案的实施实例
具体实施例1。达拉根的制备方法。
先前已描述了达拉根及其药理学上可接受的盐的制备方法。该方法采用了经典的肽合成法。
以下是达拉根的合成方法。
H-Phe-Leu-Arg的合成方法
将750g Z-Leu-ONSu溶解于3升DMF中，将368g Arg添加到所得的溶液中，搅拌24小时。在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将DMF蒸煮使浓缩。将所得的油溶于15升丁醇中，转移至装有搅拌器的玻璃萃取器中。往萃取器中加入10升蒸馏水。搅拌5分钟直至各层彻底分离(10-24小时)。将水排入干净的桶中。分别用3升蒸馏水对有机层进行3次冲洗。将水层和洗涤水融合在一起，再额外萃取4升丁醇。在薄膜式泵的真空中在43℃下采用旋转蒸发器将丁醇蒸煮使其浓缩。
将所得的Z-Leu-Arg油溶于3升乙醇中。将溶液转移至加氢反应器中。加入50g Pd/C悬浮于1.5升水中。加氢前用氮气吹扫反应器。将氢气的压力增加至2千克力每平方厘米，开启循环泵，并保持不高于43℃的温度。应对催化剂进行过滤，用2升蒸馏水冲洗反应器，然后用该水冲洗过滤器上的催化剂。在薄膜式泵的真空中在43℃下采用旋转蒸发器将滤液蒸煮使浓缩。
将所得的H-Leu-Arg油溶于3升DMF中，并在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将其中的1升进行蒸馏。往所得的溶液中加入溶于2升DMF中的785g Z-Phe-ONsu，并搅拌24小时。在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将DMF蒸煮使浓缩。将所得的油溶于15升丁醇中，转移至装有搅拌器的玻璃萃取器中。往萃取器中加入10升蒸馏水。搅拌5分钟。用3升蒸馏水将有机层再冲洗3次。将水层和洗涤水融合在一起，再额外萃取4升丁醇。将丁醇合并在一起并在薄膜式泵的真空中在43℃下采用旋转蒸发器将其蒸煮使浓缩。
将所得的Z-Phe-Leu-Arg油溶于3升乙醇中，使溶液体积增加至6升。将溶液转移至加氢反应器中。再加入50g钯碳催化剂悬浮于1.5升水中。加氢前用氮气吹扫反应器。将氢气的压力增加至2千克力每平方厘米，再开启循环泵。由于循环，出现加热现象。应将温度保持在不高于43℃的水平上。对催化剂进行过滤后，应用2升蒸馏水冲洗反应器，再用该水冲洗过滤器上的催化剂。在薄膜式泵的真空中在43℃下采用旋转蒸发器将滤液蒸煮使浓缩。将所得的H-Phe-Leu-Arg溶于3升DMF中(大概每千克溶液0.6摩尔)，再使用该溶液进行蛋白质交联。
Boc-Tyr(Boc)-Ala-Gly-ONP合成法
将907g H-Gly(OBzl)*Tos溶于3升DMF中，用N-甲基吗啉将其pH值调节至7.2-7.5。在水浴中冷却的同时，一次加入773g溶于2升DMF中的Boc-Ala-ONSu。温度不得超过25℃。移开浴液，并在室温下搅拌一段时间。TLC控制。在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将DMF进行蒸馏。将所得的油溶于15升醋酸乙酯中，转移至装有搅拌器的玻璃萃取器中。分别用3升水对有机层进行3次洗涤。用水将200毫升Na2CO3饱和溶液的体积增加至3升，用该溶液对有机层进行洗涤，然后分别用3升水再进行3次洗涤。将6.5毫升20％硫酸溶于3升水，用该溶液对有机层进行洗涤，然后分别用3升水再进行3次洗涤。每次洗涤时应加入0.5升醋酸乙酯。在薄膜式泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将醋酸乙酯蒸煮使浓缩。
将所得的Boc-Ala-Gly(OBzl)在冰浴中冷却并剧烈搅拌的同时，将其溶于3.4千克冷却至+5℃的三氟乙酸中。完全溶解后移开浴液，并在室温下再搅拌1.5小时。在薄膜式泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将三氟乙酸进行蒸馏。然后与0.5升苯共蒸制3次。
将所得的H-Ala-Gly(OBzl)油在水浴中冷却的同时溶于2.5升DMF中，并将pH值增加至7.2-7.4。加入1183gBoc2-Tyr-ONSu溶液至2升DMF中，温度不得超过25℃。移开浴液后在室温下搅拌12小时。TLC控制。在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将DMF进行蒸馏。将所得的油溶于15升醋酸乙酯中，转移至装有搅拌器的玻璃萃取器中。分别用3升水对有机层进行3次冲洗。用水将200毫升Na2CO3饱和溶液的体积增加至3升，用该溶液对有机层进行冲洗，然后分别用3升水再进行3次冲洗。将7.5毫升20％硫酸溶于3升水，用该溶液对有机层进行冲洗，然后分别用3升水再进行3次冲洗。在41℃下采用旋转蒸发器将醋酸乙酯蒸煮使浓缩。将油溶于2.6升热异丙醇中，大概用1小时分批加入7.5升己烷，并搅拌一段时间，直至形成沉淀。对沉淀的Boc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl)进行过滤，并分别用5升己烷+IPA(4.2+0.8)混合物冲洗2次。空气干燥。获得1300g。
将所得的Boc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl)溶于5升乙醇中，使溶液体积增加至6升。将溶液转移至加氢反应器中。再加入50g钯碳催化剂悬浮于1.5升水中加氢前用氮气吹扫反应器。将氢气的压力增加至2千克力每平方厘米，再开启循环泵。由于循环，出现加热现象。应将温度保持在不高于43℃的水平上。过3个小时以后，应进行TLC控制。将催化剂过滤，在薄膜式泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将滤液蒸煮使浓缩。溶于2升DMF，并在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将其中1升进行蒸馏。加入1升DMF和3.5升醋酸乙酯，再将310g硝基苯酚溶液加入0.5升醋酸乙酯和0.3升DMF中。冷却至-18℃。在0.8升醋酸乙酯和0.4升DMF中备制470g DCC。冷却至-18℃。恒温调节后，将两种溶液混合并在室温下放置一天。对沉淀的尿素进行过滤，并分别用2升醋酸乙酯冲洗2次。在薄膜式泵及随后油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将滤液蒸煮使浓缩。用热异丙醇和己烷结晶出油，比例如下：对于0.6摩尔Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP，取0.8升异丙醇和0.4升己烷，然后搅拌一段时间，直至形成沉淀。对沉淀的Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP进行过滤，并分别用5升己烷+乙丙醇(1+2)混合物冲洗2次。获得1170g。
将530g Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP溶于1.20升DMF中，并在水浴中冷却的同时将其加入计算的H-Phe-Leu-Arg溶液(1+1)数量中。搅拌2小时。在油泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将DMF蒸煮使浓缩。将油溶于3.2升热异丙醇中，并在搅拌下分批加入4.5升热己烷。当溶液冷却至40-45℃左右时，应加入110g冰醋酸。搅拌2小时。对沉淀的Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg进行过滤，分别用1.5升己烷+异丙醇(2+1)的混合物冲洗两次。空气干燥。获得700g。
达拉根的合成方法
将100g Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg溶于180毫升三氟乙酸中，并同时在冰浴中对其进行冷却。完全溶解后搅拌1小时。在隔膜泵的真空中在41℃下采用旋转蒸发器将三氟乙酸蒸煮使浓缩。用1.5升乙醚调制残留物，将其过滤，并用乙醚冲洗3次。在隔膜泵的真空中在35℃下干燥6小时。获得95g。
具体实施例2。六肽鼻腔用复合物的制备方法。
具喷雾剂形式且含达拉根的复合物的生产阶段包括：达拉根溶液制备和小瓶装灌。
制备鼻腔用复合物，应往温度为20-25℃的50毫升注射用水中在搅拌下加入0.01g至3g六肽(取决于溶液成分)。然后用注射用水使所得溶液的体积增加至100毫升。在无菌条件下采用薄膜过滤法对所得溶液进行灭菌，使其通过孔径为0.22μm的过滤器，在惰性气氛中倒入聚合物或玻璃小瓶中，并对带有成品的小瓶进行密封。
在复合物的制备过程中，可以另外加入氯化钠。为此，应往50毫升温度为20-25℃的注射用水中在搅拌中溶解7g至11g氯化钠(取决于溶液成分)。然后在一边搅拌一边加入0.01g至3g六肽(取决于溶液成分)。然后用注射用水使所得溶液的体积增加至100毫升。在无菌条件下采用薄膜过滤法对所得溶液进行灭菌，使其通过孔径为0.22μm的过滤器，在惰性气氛中倒入聚合物或玻璃小瓶中，并对带有成品的小瓶进行密封。
另外，在复合物的制备过程中可以另外加入苯扎氯铵。为此，应往50毫升温度为20-25℃的净化水中在搅拌下溶解7g至11g氯化钠(取决于溶液成分)和0.1g至0.2g苯扎氯铵。然后边搅拌边加入0.01g至3g六肽(取决于溶液组成)。然后用净化水使所得溶液的体积增加至100毫升。在无菌条件下采用薄膜过滤法对所得溶液进行灭菌，使其通过孔径为0.22μm的过滤器，在惰性气氛中倒入聚合物或玻璃小瓶中，并对带有成品的小瓶进行密封。
使用上述方法，可以获得具有以下组成的复合物：
名称 含量(g/毫升)
六肽(药理学上可接受的盐) 0.01-3
注射用水 最多100毫升
Figure BDA0002719973810000121
Figure BDA0002719973810000131
名称 含量(g/毫升)
六肽(药理学上可接受的盐) 0.01-3
氯化钠 7-11
苯扎氯铵 0.1-0.2
净化水 最多100毫升
以下为证实达拉根作为抗病毒剂和免疫调节剂的效力的实验结果。这些具体实施例中介绍的研究是根据关系到抗病毒药物、免疫调节剂和干扰素诱导剂临床前开发的目前有效的方法建议而设计并完成的[17]。
具体实施例3。六肽对甲型/H1N1流感病毒参考株的体外抗病毒作用的研究。
使用甲型流感/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒株，基于MDCK组织培养细胞模型上与阿比朵尔进行了比较。
考虑到阿比朵尔在10.0微克/毫升浓度下具有100％抑制作用(针对病毒流行株的繁殖)，选择该水溶液浓度的的目的是比较药物在相同程度的甲型流感病毒感染条件下起到的抗病毒作用。
另外，对于每种药物，计算出了抑制病毒繁殖50％(MIC50)的浓度。
表1为比较药物在MDCK组织培养菌细胞中对甲型流感/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒参考株的最低抑菌浓度(MIC50)和活性。如表1所示的数据显示，两种物质均对甲型流感/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒株具有很高的抗病毒活性，同时六肽的MIC值在溶液中含量极低的条件下更低。
具体实施例4。我们采用小鼠肺炎模型研究了达拉根对甲型流感病毒起到抗病毒作用。
小鼠(n＝40，BALB系雌性，平均体重18-22g)在轻度醚麻醉下以鼻腔内途径接受甲型流感/Aichi/2/69(H3N2)病毒的感染。预先确定了含有10LD50的病毒剂量。为此，由5-6只小鼠组成的小组接受了全尿囊病毒及其连续10倍稀释液(10-1至10-6)的感染。体积为50μl。数据显示，在此情况下LD50为病毒的10-3稀释液。接下来，所有动物都被感染了体积为50μl的10倍半致死剂量的病毒。
我们以阿比朵尔选为活性对照剂。然后采用随机法形成了4组动物(每组10只)：
——对照组(生理盐水)；
——接受阿比朵尔的小组；
——以肌肉内途径接受达拉根的小组；
——以鼻腔内途径接受达拉根的小组。
达拉根、阿比朵尔或安慰剂的接受方案：在感染24小时和1小时前，然后在感染后每24小时，持续5天。达拉根的每日剂量为2毫克/千克(肌肉内或鼻腔内)。阿比朵尔则是通过胃管(口服)给予的。
达拉根的注射形式是药物复合物。如具体实施例2所述，应将该药物复合物稀释至必要的浓度，同时可以采用也可以不采用氯化钠，以达到肌肉注射(0.5毫升)或鼻腔内注射(0.01毫升)的推荐剂量[18]。
对经过治疗和对照的动物组每天进行了监控。感染后第3天、第5天和第15天对小鼠进行称重。
根据以下两种标准评估了基于小鼠流感性肺炎模型的化合物的化学治疗活性：1)平均寿命和2)体重减轻动态(与对照组相比)。
小鼠的平均寿命由下式计算：MSD＝f*(d-1)/n(其中f是指在d日中死亡的小鼠数量，f也包括存活的小鼠，在这种情况下，d为15，n是指该组中的小鼠数量)。
感染后第3天、第5天和第15天对小鼠进行称重。分别计算了每只小鼠体重的减少量或增加量，并将该数值以百分比表示。在这种情况下，感染前的动物体重为100％。对于同一组中的所有小鼠，确定了体重减少或增加百分比的平均值。
在对照组中，动物最高的体重减少量处于感染后第5日。在接受比较药物的动物组中，体重减少量在统计学上显著低于两个对照组。接受阿比朵尔或达拉根的动物组，在体重减少动态上没有显着差异。
表2为以小鼠流感性肺炎模型为例的化合物抗病毒效力。如表2所示，对照组中小鼠的平均寿命最短，仅为8.5天。用阿比朵尔或达拉根进行的治疗导致了动物的平均寿命增加至11-14天。虽然该疗法提供了增加感染后存活的动物比例的可能性(与安慰剂相比)，但仍未能完全防止动物死亡。
这些数据表明，与安慰剂相比，在5日内按2毫克/千克/日的剂量以肌肉内和/或鼻腔内途径给予的达拉根，可降低因流感病毒性肺炎发生的小鼠死亡率，延长平均寿命并降低体重减少量。与阿比朵尔相比，达拉根在提高平均寿命和延长存活时间方面均显示出更突出的疗效。以肌肉内和鼻腔内途径注射的达拉根，在抗病毒活性方面显示出可比的结果。
具体实施例5。达拉根对腺病毒感染的抗病毒作用的实验研究
我们在研究中使用了D·I·伊万诺夫斯基病毒学研究所于1998年取得的5型腺病毒。该病毒目前存储在联邦国立机构“俄罗斯国防部第48号中央研究所”分支机构的特别收藏中。
我们使用了典型海拉细胞系培养(宫颈癌细胞)(密度为20-25万/毫升)。另使用了基于汉克斯溶液的半合成生长培养基，分别含有7.5％和2％的牛血清。对两天的海拉细胞培养单层细胞采用5型腺病毒进行感染，剂量：0.01细胞病性效应50/每细胞。然后将细胞培养菌单层在37±0.5℃下培育96小时。
将病毒应用于形成好的海拉细胞培养菌单层后，通过该制剂抑制病毒在海拉细胞培养菌中的细胞病性效应评估了它的抗病毒效力。
被研究制剂效力的标准是：病毒细胞病性效应的发现次数和抑制系数(Ki，％)。抑制系数是按以下公式计算的：Ki＝100*(Ck-Co)/Ck(其中Ck和Co分别是对照和实验样品中的病毒感染滴度)。
在注射达拉根(浓度：100、20、10微克/毫升)的情况下，在用0.01细胞病性效应50/每细胞腺病毒感染单层细胞24小时前，该制剂几乎完全保护了细胞免受病毒的细胞病性影响。在10微克/毫升浓度下，该制剂的保护效率达到了40.0％。将达拉根在感染24小时前注入维持培养基中后，与感染2小时后的注入相比，该制剂的保护效率提高了10-20％。
表3为达拉根在海拉细胞系贴壁培养中对5型腺病毒显示的效力。如表3所示，这意味着，达拉根的注入在海拉细胞培养菌单层中抑制了5型腺病毒的繁殖。此外，所获得的结果证实了该制剂对腺病毒感染的抗病毒效力。
具体实施例6。达拉根在小鼠中起到的干扰素诱导作用的研究
在所有病毒感染框架下，在早期细胞因子反应的过程中都会产生干扰素。它们促使核糖体形成一系列酶。这些酶能抑制病毒基因组的转录和自体再生，从而抑制病毒繁殖。被病毒感染的变异细胞在NK-细胞和细胞毒性淋巴细胞的参与下被消除，同时在α-IFN和β-IFN的影响下诱导了未感染细胞的抗病毒保护作用。因此寻找内源性干扰素的无毒诱导剂及其形成的刺激方法，引起了科学界的极大兴趣，并且是医疗病毒学当前较迫切的问题[18，19]。
我们将具有干扰素诱导作用的抗病毒药物——阿比朵尔选为参考药物。
实验用40只CBA x C57BI/6系雄性小鼠进行，小鼠体重为20-25g。将动物随机分为4组(每组10只)：两个实验组(接受达拉根或阿比朵尔)和两个对照组。其中一个对照组用于确定INF的初始水平(在实验开始之前)，另一组则用于确定INF在注入安慰剂(生理盐水)24小后的水平，以确保条件的一致性。
将动物布置于隔音室内的笼子里，并同时确保光照条件的自然变化和20-22℃的温度。参与实验的动物可以随意喂食和喝水。
达拉根以1毫克/千克剂量以肌肉内途径注射，相当于人的5-6毫克。
给予阿比朵尔时采用了胃内途径——具1％淀粉凝胶形式的预先制备的悬浮液。
统计分析包括应用邦费罗尼校正以进行多个比较。
给药24小时后测定了小鼠血清中的α-IFN含量。在戊巴比妥麻醉下(60毫克/千克)从小鼠心脏取下血液样品以对干扰素进行定量测定。将所得的血液样品在室温下放置2小时以进行凝结，采用离心法对血清进行的分离，合并在一起(按2只小鼠)，并冷冻后在-20℃下存放，直至进行测定为止。为确定IFN浓度，我们使用了由VeriKineTM(美国)公司制造的酶联免疫测定用商业试剂盒。用试剂盒制造商说明书中推荐的稀释剂将合并的血清稀释两倍后，进行了酶联免疫测定。将受测样品和经过稀释的标准液滴到板上，共两份。我们使用了固相酶联免疫测定法，其中待测物是具有两个结合位点(抗原表位)的抗原(AG)，而测定物则是两个单克隆抗体(AT)类型(“三明治”法)。其中，第一类AT固定在固相上，并在液相中结合待测物分子的一个抗原表位。第二类AT与生物素共轭，并结合待测物分子的第二个抗原表位。指示成分是与链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶。在测定系统中使用的培养基是四甲基联苯胺。我们采用UNIPLANTM酶免疫分析仪(Picon)在450nm波长下测定了结合过氧化物酶的活性。
给予安慰剂(生理盐水)前后，对照组的IFN水平未显示明显差异。在给予阿比朵尔24小时后取下的研究用血清样本中，尽管不可靠，但还是记录到α-IFN水平的增加现象。
同时，如图1所示，与对照组和阿比朵尔组相比，接受达拉根的动物组表现出α-INF生产率的显著增加(p<0.001)。
具体实施例7。达拉根对自然杀伤细胞功能活性影响的评估。
天然/自然杀伤细胞是具有CD3-CD16+CD56+表型的大型颗粒状淋巴细胞，能够在无事先敏化的条件下识别和杀死靶细胞，这在实施抗肿瘤免疫力和感染细胞内寄生虫方面尤其重要。
在评估达拉根对自然杀伤细胞功能活性的体外影响时，另使用了来自健康供体(n＝20)的周围血液单核细胞的悬浮液作为这些细胞的来源。
自然杀伤细胞的功能活性是根据细胞毒性反应(自然杀伤细胞能够裂解成髄髓细胞系和淋巴母细胞系细胞)采用放射法测定的。为此，在移植第二日，将浓度为106/毫升的成髄髓细胞系细胞K-562与3N-尿苷一起在3mKI/毫升细胞悬浮液中在37℃下培育1小时。
然后，培育后，将它们在介质199中冲洗3次，以除去RFID标签。
细胞毒性反应器是圆底96孔板，体积：200μl。为此，将供体周围血液的100μl带有标记的靶细胞和100μl单核细胞(效应细胞)以1:50的比例混合在三联体中，以满足每次稀释的需求。
在一种情况下，发掘出效应细胞和靶细胞后，将达拉根以5*10-8M(约为0.036微克/毫升)的摩尔浓度添加至平板中。我们未将药物添加至对照样品中。为确定标记的释放，将等量的Triton X-100加入靶细胞中。然后将平板在37℃下放置于CO2培育箱中静置24小时，然后将内容物转移至玻璃纤维滤器上，洗涤干燥后置于带有闪烁液的小瓶中，并用贝塔粒子计数器测定了其放射性。细胞毒性指数(IC)是按以下公式计算的：IC＝((A-B)/(C-B))*100％，其中A是指靶细胞在效应细胞存在下显示的放射性，B是指靶细胞用Triton X-100处理后显示的残留放射性，C是指靶细胞在无效应细胞的情况下显示的放射性。
如图2所示，实验结果表明达拉根对自然杀伤细胞具有的免疫潜能。
具体实施例8。达拉根对吞噬作用的影响的研究
目前，达拉根已被批准用于人群众。单次剂量范围为1-5毫克[20]，对于小鼠而言，相应的剂量约为0.2-1毫克/千克。因此，为研究该药物在小鼠腹膜渗出吞噬细胞模型中的效力，选用的剂量为0.2毫克/千克。对药物给予途径对吞噬细胞功能活性的可能影响也非常值得研究。
为对制剂的免疫调节作用进行研究，使用了显微镜法。为此，我们使用了60只BALB系雄性小鼠，体重为18-22g。将动物分为6组，每组10只。两组作为对照组。积极的治疗组以0.2毫克/千克的单剂量肌内或鼻内接受达拉根治疗。在给予受研究药物后第二天，对巨噬细胞或中性粒细胞进行了提取。
为积累中性粒细胞作为化学吸引剂，往小鼠腹膜内注射了3-4毫升10％蛋白胨溶液，然后在2小时后用氯仿对它们进行安乐死。接下来，在无菌条件下进行了解剖检查。用巴斯德吸管从腹腔中吸出了液体，然后将其放入试管中，并以1000rpm离心10分钟。接下来，将沉淀物再次稀释，以达到中性粒细胞的250万/毫升浓度。
以提取巨噬细胞，在施用蛋白胨后第3天，对小鼠进行安乐死方法。然后，往腹膜内注射3-4毫升含10％胎牛血清的培养基199。
对于Staph.aureus细菌(不含蛋白A的菌株)，用小鼠血清预调理(在37℃下10分钟)，再以等体积按10:1比例(即2500万单位/毫升)将其加入吞噬细胞悬液中。培育后，准备一个涂片(罗曼诺夫斯基-吉耶姆萨染色法)。
根据吞噬指数和吞噬值评估中性粒细胞的吞噬活性。采用显微镜评估了巨噬细胞的功能活性，同时也考虑了它们在活化状态下吸收氯化硝基四氮唑蓝的能力。所得的结果表明了达拉根(0.2毫克/千克)能够提高由蛋白胨激活的小鼠中性粒细胞的功能活性(吞噬作用)。同时，给药途径在效力方面未显示突出的差异。表4为达拉根对小鼠中性粒细胞和巨噬细胞吞噬活性的影响。如表4所示，对于腹膜渗出液的巨噬细胞，也显示了达拉根对其吞噬作用的刺激作用，其中包括增强它们恢复氯化硝基四氮唑蓝的能力。取决于给药途径的差异未发现。
这样，达拉根对非特异性免疫力的吞噬作用起到刺激作用。
具体实施例9。达拉根对消炎细胞因子的生产率的影响的研究
我们在体外实验中使用健康供体的周围血液单核细胞培养菌(n＝20)评估了达拉根对细胞因子IL-1(白介素-1)、IL-6(白介素-6)和阿尔法-肿瘤坏死因子的合成进程的影响。为诱导消炎细胞因子，使用了肠道菌用多糖刺激方法。
为获得单核细胞悬浮液，将血液用培养基199以1:2稀释后，将其分层置于菲可尔-希帕克二氏密度梯度(d＝1.077g/cm3)，并在400g下离心40分钟。用巴斯德吸管小心吸出在相界面形成且含有单核细胞的白环，并采用10分钟离心(200g)方法用培养基199冲洗2次。将沉积物重悬在营养培养基中，并在血细胞计数室中计数以确保必要的浓度。
将摩尔浓度为5*10-8M(约为0.036微克/毫升)的达拉根与多糖一起加入单核细胞悬液中。我们未将药物添加至对照样品中。
采用双中心酶联免疫测定法对血清中的细胞因子进行了定量测定。
图3中显示的结果表明了达拉根显着抑制脂多糖诱导的IL-6、IL-1和阿尔法-肿瘤坏死因子的生产率的能力。促炎性细胞因子的生产率以其与对照样品中含量的比率表示(为100％)。
应当指出，所研究的六肽起到抗病毒和免疫调节作用。它能够调节先天性和适应性免疫细胞的活性。达拉根也可以增强免疫力(巨噬细胞和中性粒细胞)吞噬环节的活性，以及淋巴细胞(自然杀伤细胞)的活性。此外，该药物能够刺激内源性干扰素的生产率。
此外，达拉根具有抑制促炎性细胞因子(IL-1、IL-6、阿尔法-肿瘤坏死因子)过度合成的能力，能够降低中毒程度并阻止炎症级联反应的其他表现。
这意味着，该药物复合物在参与实验且每日以鼻腔内途径接受2毫克/千克(相当于人类的剂量10毫克/日)达拉根的小鼠中表现出了抗病毒活性。
适用于人类的溶液一次性鼻腔内注射量是1-2滴/鼻孔(一共2-4滴)，相当于0.1-0.2毫升。
基于所进行的实验可以得出的结论是，适用于人类的鼻腔用药物复合物的浓度为0.01-30毫克/毫升(0.01％-3％达拉根溶液)。
同时，以鼻腔内途径给药时，该复合物的特征在于：类似于肌肉内注射的抗病毒和免疫调节作用。对于临床应用而言，这个特征尤其重要。
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表1
Figure BDA0002719973810000251
表2
Figure BDA0002719973810000252
表3
Figure BDA0002719973810000253
表4
Figure BDA0002719973810000261
备注：*是指显著性水平p<0.05(与对照组相比)。

Claims (9)

1.一种含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受的盐的鼻腔用复合物在制备用于治疗急性呼吸道病毒传染病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述传染病是流感。
3.根据权利要求1所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的药理学上可接受的盐是酪氨酰-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸二乙酸盐。
4.根据权利要求1所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的鼻腔用复合物具有喷雾剂形式并含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受的盐作为活性物质及其他辅助物质，所述活性物质的含量为0.01-3wt％。
5.根据权利要求4所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的鼻腔用复合物含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受的盐及其他辅助物质，成分比例wt％为：六肽0.01-3％，剩余为水。
6.根据权利要求4所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的鼻腔用复合物含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受的盐及其他辅助物质，成分比例wt％为：六肽0.01-3％、氯化钠7-11％，剩余为水。
7.根据权利要求6所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的鼻腔用复合物含有酪氨酰基六肽-D-丙氨酰基-甘氨酰-苯基丙氨酰基-亮氨酰-精氨酸或其药理学上可接受的盐及其他辅助物质，成分比例wt％为：六肽0.01-3％、氯化钠7-11％、苯扎氯铵0.1-0.2％，剩余为水。
8.根据权利要求6所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的鼻腔用复合物含有氯化钠和水作为辅助物质，成分比例wt％为：氯化钠9％、水90％。
9.根据权利要求5-8任一项所述的鼻腔用复合物的用途，其特征在于：所述的鼻腔用复合物含有注射用水或净化水作为水分。
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