JP2021511370A - 急性ウイルス性呼吸器疾患を治療するための経鼻医薬組成物 - Google Patents

急性ウイルス性呼吸器疾患を治療するための経鼻医薬組成物 Download PDF

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Abstract

急性ウイルス性呼吸器疾患を治療する抗ウイルス免疫向性薬剤本発明は、医学、特に薬剤学に関連し、急性ウイルス性呼吸器疾患、特にインフルエンザウイルスに引き起こされる疾患を治療するための、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を含有する経鼻医薬組成物の使用に関するものである。【選択図】 なし

Description

本発明は、医学、特に薬剤学に関連し、急性ウイルス性呼吸器疾患（ＡＲＶＩｓ）、特にインフルエンザウイルスに引き起こされる疾患を治療するための、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を含有する経鼻医薬組成物の使用に関するものである。
現在、最も普及しているのは急性ウイルス性呼吸器疾患（ＡＲＶＩｓ）で、全感染症の90%超を占める[1]。世界保健機関のデータによれば、世界中で毎年感染者が4000万人超登録されている。急性ウイルス性呼吸器疾患の社会的なインパクトは、まず間接的な高コストに係わる。例えば、職場不在期間によるコスト、労働生産性の低下に伴う経済的な損失、患者の看護などをする家族の職場不在時間のコストなどが挙げられる。米国では、一時的な労働不能による経済的な損失だけが2億3200万ドルに評価される[2]。
上記の問題はロシアにとっても非常に重要度が高い問題で、公式データによれば、ロシアにおいて毎年、呼吸器感染が2730〜4120万件登録されている。全体的な発生数の中で最も比重が高いこの病症には、全体的な労働不能の凡そ40%が当たる[3]。
現在、インフルエンザ様疾患を引き起こすウイルスが200以上知られている。様々な国で様々な研究グループによって行われた、急性ウイルス性呼吸器感染の病因構造をテーマにした一連の研究において得られたデータの分析結果は、最も一般的な病原体は、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、オルトニューモウイルス（呼吸器合胞体ウイルス、RSウイルス）、コロナウイルス、メタニューモウイルス、ボカウイルス及びアデノウイルスを含むことを示している[4]。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、球体形態をしている。ウイルスの内部は、ポリメラーゼ複合体（PA、PB1、PB2）、リボ核タンパク質及び基質タンパク質からなる。ウイルスの外側は、ヘマグルチニン（HA)とノイラミニダーゼ（NA)の2種類の表面抗原を含むエンベロープで覆われている。これらによって、ウイルスが宿主細胞に吸着し、細胞内部に侵入する。表面抗原は変異性を有し、インフルエンザの新しい株が出現する原因となる。最大変異性を持っているのはA型ウイルスで、これらは短時間で国規模の流行又は大陸を占める世界的流行を引き起こす能力を持っている。アメリカ疾病予防管理センター（CDC)のデータによれば、季節的なインフルエンザ流行は、年間20万入院件数を招き、死亡率は人口10万人当たり1.4〜1.67人である[5]。2009年に始まったインフルエンザのパンデミックは、パンデミックポテンシャルを持つA型インフルエンザウイルス（H1N1)によって引き起こされる。ロシアにこのウイルスが来たのはより後で、最大感染者数は2010〜2011年及び2015年に記録されている[6]。1462人の患者を対象に行われた抜取り薬剤疫学研究は、感染者の84.7%は18〜49歳の者だったと示した[7]。
従って、上記グループの疾患の拡大を防止することは、どの国でも直目している重要な課題である。
上記グループの疾患に対する複数の治療法及び予防方法が存在している。
特に、大規模流行を防止する主要な予防手段は人口の集団予防接種とされる。特定地域で広まっているウイルス株に関する免疫学的なデータを基に毎年ワクチンが開発される。しかし、本年のワクチンが開発された後、インフルエンザウイルスの抗原連続変異が発生することがある。この近年、複数の違う病原体による急性ウイルス性呼吸器疾患が頻繁に出現する。上記のような疾患は70%の患者に観察されるというデータもある。患者から同時に複数のウイルス、細菌と共にウイルス又はその他の組み合わせが分離されることがある。また、当初一種のウイルスに起因する感染症は、経過中に他種のウイルスが加わりより重い臨床経過を招く症例が報告されている。上記のような混合感染は、患者の体調を悪化させ、病気の期間を延長し、既存の慢性疾患を悪化させ、二次合併症の発展を促進する可能性がある[8]。
また、ウイルス性呼吸器疾患を治療するため、抗ウイルス剤、特に抗ウイルス効果があるペプチドも使用される。例えば、抗微生物ペプチド（AMP)は、恐らくは全ての多細胞動植物が産生するとされる、ホスト自身の免疫保護分子である。これらは先天性免疫系の最前線であり、感染の早期で侵襲性病原体を早速に壊滅させ、適応免疫系反応を引き起こすことができる。抗微生物ペプチドの殆どは、両親媒性、陽イオン性分子であり、通常陰イオン的荷電を持つ微生物の表面と結合する能力を有する。数百種類の抗微生物ペプチドは同定され、構造的特質及びアミノ酸の組成によって分類されている。カテリシジンとディフェンジンという脊椎動物に見出される２種の抗微生物ペプチドファミリーは、基本的に白血球及び上皮細胞によって生産される小さな分子である。
背景技術からは、ペプチドが様々なウイルス性呼吸器感染を抑制することができるペプチドクラスを含有する医薬組成物が知られている。呼吸器ウイルスの表面糖タンパク質と結合することができる機能ドメインによって、ペプチドはウイルスの表面糖タンパク質と結合することができて、その後エンドサイトーシスによって細胞のエンドソームに輸送される。ペプチドが塩基性アミノ酸を豊富に含有するので、後期エンドソームにおいてpHの低下を妨げることができ、それによってウイルスとエンドソームの細胞膜の融合及び、ウイルスのリボ核酸の分離に伴う後程のウイルスの分解をブロックする。従って、ペプチドは、インフルエンザウイルス及びコロナウイルスの様々な亜型といった呼吸器ウイルスによる感染をブロックする強い能力を発揮し、呼吸器ウイルスによる標的細胞の感染をブロックすること及び、呼吸器ウイルスによる感染症の予防並びに治療のために使用することが可能である（特許RU2639559 、2017年12月21日)。
しかし、上述したように、ウイルスの遺伝物質の変異性がこれらの薬品の使用を妨げるほか、これらの薬品の作用は、一種の治療に応答した特定の病原体に限られている。
また、混合薬を使った治療も使用されている。例えば、日常診療においては、急性ウイルス性呼吸器疾患の対症療法のために、解熱効果、鎮痛効果、充血除去効果及び血管保護効果を持つ混合薬の使用は適切とされる。対症療法の混合薬の使用は、単一成分薬剤の組み合わせを使用した場合に比べて、有害事象が少なく、経済的にも適切である[9]。
しかし、このグループの薬剤の使用は、急性ウイルス性呼吸器疾患を持った患者の鼻呼吸機能の保持並びに局所的な特異的及び非特異的免疫因子の重要な役割を考慮に入れない。
同時に、急性ウイルス性呼吸器疾患の原因は、吸い込まれる空気からの病原体除去メカニズムなどに関連している鼻呼吸機能における変化を含む。上記機能は、鼻腔粘膜によって産生される特異的・非特異的免疫防御の因子及び、粘液線毛クリアランスに依存する。
このような薬剤の予防・治療効果は、吸い込まれる空気の刺激的な有機並びに無機の因子を鼻腔から排除させ、特異的・非特異的免疫防御及び、粘液線毛クリアランスの働きを正常化させる能力に直接に関係する。
上記のような予防の有望な方向は、身体の自然耐性を活性化する薬剤の使用である。上記を目的に、ロシアの臨床診療においては、チロロン、アルビドールやシクロフェロンという内因性インターフェロン誘導剤が幅広く使われている。
文献からは、ナトリウム塩の形態をしているα‐グルタミル‐トリプトファンジペプチドが知られている(特許RF2107691、1998年)。ペプチドは、細胞性免疫及び液性免疫の反応及び身体の非特異的耐性に影響する免疫調節剤として使用されている。また、抑制されている再生過程の場合、これらを促進し、細胞の代謝を向上させる。リンパ様細胞の分化過程を強化し、骨髄細胞のコロニー形成活性を促進し、リンパ球にある分化受容体の発現を誘導し、様々な免疫不全症状を持つ患者のヘルパーT細胞数、サプレッサーT細胞数及びそれらの割合を正常化する。
本ペプチドは、上気道疾患、特にインフルエンザなどの急性ウイルス性呼吸器疾患の予防及び治療のために適用される経鼻医薬組成物において使用されていた。本医薬組成物は、有効成分と添加剤を含有する。有効成分は海塩及びα‐グルタミルトリプトファンを含む。それら有効成分の割合(質量％）は下記の通りである。
‐海塩95.00〜98.00、
‐α‐グルタミルトリプトファン2.00〜5.00（特許RU2540496、2015年2月10日、プロトタイプ）。
このような経鼻薬剤は、海水の成分を含有し、鼻腔の確実な洗浄を確保する。該薬剤は、粘液の除去、感染による分泌物及び鼻粘膜の充血の減少、鼻糞の軟化及び除去に役立つ。該薬剤は鼻粘膜の線毛上皮組織の防御機能を正常化し、鼻呼吸を向上させる。
しかし、添加剤として海塩の使用は、使用されるジペプチドの活性を正確には高めず、むしろその安定性及び活性の低下を招く。その結果、特許明細書で本ペプチドの一般的に知られている免疫調節作用が指摘されているという事実にもかかわらず、研究の直接な結果及び、既存の抗ウイルス剤との効果比較が反映されておらず、該薬剤の抗ウイルス薬効メカニズム、その抗ウイルス効果及び選択性の評価を不可能にしている。
上記の欠点は、顕著な抗ウイルス薬効を持ち、体内で急性ウイルス性呼吸器疾患の進行を防止するメカニズムを引き起こす、新規なペプチドを基にした薬剤の開発を必要とする。
特に、背景技術からは、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド（ダラルギンとして記載）が知られ、これはロイシン‐エンケファリン内因性オピオイド調節ペンタペプチド(H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COOH、分子量555.6原子質量単位)の合成的構造アナログである。
ダラルギンは、μ-、δ-及びκ-オピオイド受容体に対する非特異的親和性を持っているので、鎮痛作用[9]や抗酸化作用[10]などの生理活性のスペクトルが広くなっている。本薬剤は、胃液の酸性及び、膵臓の外分泌活性を低下させる剤としてロシア連邦において登録されている(薬剤国家登記簿、https://grls.rosminzdrav.ru)。また、成分の降圧作用及び陽性変時作用も知られている[11]。
現時点では、ダラルギンの様々な効果を紹介する数十件の特許が登録されている。例えば、特許RU2196603は、ダラルギンを点滴療法の一部として熱傷疾患を治療するために適用することを開示する。特許UA6829LJ、UA6823U及びUA6826Uは、ダラルギンを実験的急性膵炎を治療するために適用することを開示する。ダラルギンの抗ストレス剤としての適用は、慢性膵炎、急性付属器炎及び腹膜炎の実験的モデルを基に、それぞれ特許UA67632、UA67630及びUA67629において開示された。ダラルギンの抗ストレス活性は、特許UA67626において、実験的慢性ストレスのモデルで示された。特許RU2180598は、ダラルギンを慢性薬物依存症の患者の中毒性肝炎を治療するために適用することを開示する。公開MD1413Fは、ダラルギンを口腔粘膜及び扁平苔癬を治療するために適用することを開示し、公開MD1296Fは、扁平苔癬のダラルギン治療に関するデータを提供した。特許出願RU2008131509は、脱髄疾患に対する療法のため、ダラルギンを含む医薬組成物を開示する。特許RU2218896は、水疱性角膜症の治療のためのダラルギンの使用を開示する。公開MD1963F及びMD1610Fは、慢性再発性アフタ性口内炎に対する、特許RU2230549は、アレルギー性皮膚炎に対するダラルギンの適用を解明する。また、一部のウイルス性疾患に対する治療におけるダラルギンの効果は、特許RU2261722(胎児消失症候群を持った女性患者の性器ヘルペスの潜伏形態の治療)及び、RU2167671(ダニ媒介性脳炎の治療)で紹介された。しかし、上記文献は急性ウイルス性呼吸器疾患の治療を開示せず、それ以外の疾患の治療に関する。また、これらの中で、該ヘキサペプチドの直接な抗ウイルス効果の指摘は無い。
特許RU2241488はダラルギンを注射液として、特許出願RU2010152024は経鼻医薬組成物用のスプレーとして適用されることを記述するにもかかわらず、上記文献ではダラルギンが消化器疾患を治療する薬剤として考えられていた。
以前は、10mg/kgの用量でロイシン-エンケファリンを皮下注射した24時間後及び48時間後にα‐インターフェロン(IFN-α)の産生増加が示されたが[12]、ダラルギンに関して上記の効果が以前研究されなかった。現在、ダラルギンの免疫調節効果を確認する研究が充分にある[9, 13, 14, 15, 16]。しかし、公開されている論文では、ダラルギンの免疫調節活性の完全なスペクトルが解明されていない。特に、サイトカインの産生、ナチュラルキラー細胞の活性、インターフェロン誘導効果や食作用への影響は無視されている。事実上、上記論文では、ヘキサペプチドの作用による局所免疫の向上が示されていない。
上記の記述をまとめると、現時点で公開されている資料は、ダラルギンの抗ウイルス効果自体を考慮せず、その免疫調節作用を完全には開示せず、この薬剤を急性ウイルス性呼吸器疾患を治療するための使用の適性を取り上げていない。
発明の詳細な説明
同時に、実施した研究は次の結果を示した。ダラルギンの効果、特に、局所的な経鼻投与後における、直接な抗ウイルス効果や局所免疫防御及び免疫系の因子を向上させる能力は、これを単剤治療及び他の薬剤との組み合わせで、インフルエンザウイルスを含む急性ウイルス性呼吸器疾患の予防・治療の薬剤として適用することができる。
得られた結果は、急性ウイルス性呼吸器疾患、特にインフルエンザウイルスに引き起こされる疾患を治療するために、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を含有する経鼻医薬組成物を開発して、適用を提供することを可能にした。
本発明の実施の具体的態様では、上記のような疾患とはインフルエンザである。
本発明の実施の具体的態様では、医薬上許容される塩とは、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンジアセタートである。
本発明の実施の具体的態様では、経鼻医薬組成物は、有効成分としてチロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を質量百分率0.01〜3%で、残りは添加剤という割合で含有するスプレーとして調製される。
本発明の実施の具体的態様では、医薬組成物は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩及び添加剤を、ヘキサペプチドは質量百分率0.01〜3%、塩化ナトリウムは質量百分率7〜11%、残りは水という割合で含有することを特徴とする。
本発明の実施の具体的態様では、医薬組成物は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩及び添加剤を、ヘキサペプチドは質量百分率0.01〜3%、残りは水という割合で含有することを特徴とする。
本発明の実施の具体的態様では、医薬組成物は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩及び添加剤を、ヘキサペプチドは質量百分率0.01〜3%、塩化ナトリウムは質量百分率7〜11%、塩化ベンザルコニウムは質量百分率0.1〜0.2%、残りは水という割合で含有することを特徴とする。
本発明の実施の具体的態様では、医薬組成物は、添加剤として塩化ナトリウム及び水を、塩化ナトリウムは質量百分率9%、水は90%という割合で含有することを特徴とする。
本発明の実施の具体的態様では、医薬組成物は、水として注射用水を含有することを特徴とする。
本発明の実施の具体的態様では、医薬組成物は、水として精製水を含有することを特徴とする。
クレーム発明の技術的な結果を下記に述べる。
‐急性ウイルス性呼吸器疾患の治療用である経鼻医薬組成物を開発するための技術的な手段の拡大。
‐吸い込まれる空気の有機並びに無機の因子を鼻腔から排除させ、特異的・非特異的免疫防御を正常化させる能力を持つ薬剤の開発。
‐体内及び感染の進入路における急性ウイルス性呼吸器疾患の病原体に対して直接な抗ウイルス作用を与える能力を持つペプチドを基にする薬剤の開発。
従って、本発明の新しさ及び本質は、急性ウイルス性呼吸器疾患の主な病原体であるインフルエンザウイルスやアデノウイルスに対するダラルギンの抗ウイルス効果を発揮し、上記の疾患の治療におけるダラルギンの免疫調節能力を現実的なものとして開示する薬剤を開発することにある。
ダラルギン、アルビドール及びプラセボの投与後、マウス血清におけるインターフェロンαの濃度 ナチュラルキラー細胞の細胞障害活性に対するダラルギンの影響 ダラルギンの影響下の炎症誘発性サイトカインの合成の抑制
発明の実施
下記に本発明の実施例を記載する。
＜実施例１＞ダラルギンの製造
ダラルギン及びその医薬上許容される塩の製造方法は前述したものであり、典型的なペプチド合成法である。
ダラルギンの合成法の説明を、下記に記載する。
＜H-Phe- Leu-Argの合成＞
Z-Leu-ONSu 750gをDMF 3 lに溶解して、得られた溶液にArg 368gを添加して、24時間攪拌する。ロータリーエバポレーターで、ロータリーベーンポンプの真空下温度41℃でDMFを蒸留する。得られたオイルをブタノール 15 lに溶解して、ミキサー付きのガラス製デシケーターに移す。デシケーターに蒸留水10 lを添加する。層が完全に分離するまで5分間攪拌する(10〜24時間）。該水をクリーンな容器に流す。有機層を3回繰り返しに、毎回蒸留水を3 l使って洗浄する。水層と洗浄水を合わせ、更にブタノール 4 lで抽出する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度43℃でブタノールを蒸留する。
得られたZ-Leu-Argオイルをエタノール 3 lに溶解する。該溶液を水素化反応器に移す。水1.5 l に懸濁したパラジウム炭素50gを添加する。水素化する前に反応器を窒素でパージする。水素を２kgfs/cm2まで圧縮し、循環ポンプを起動して、温度が43℃以下に維持する。触媒を濾過して、反応器を蒸留水2 lで洗浄し、同じ蒸留水でフィルターにある触媒も洗浄する。ロータリーエバポレーターを用い、ダイアフラムポンプの真空下にて温度43℃で濾過液を蒸留する。
得られたH-Leu-ArgオイルをDMF 3 lで溶解して、ロータリーエバポレーターを用い、ロータリーベーンポンプの真空下にて1 l蒸留する。得られた溶液に、DMF 2 lに溶解したZ-Phe-ONsu 785gの溶液を添加して、24時間攪拌する。ロータリーエバポレーターを用いて、ロータリーベーンポンプの真空下にて温度41℃でDMFを蒸留する。得られたオイルをブタノール 15 lに溶解して、ミキサー付きのガラス製デシケーターに移す。デシケーターに蒸留水10 lを添加する。5分間攪拌する。有機層を3回繰り返し、毎回蒸留水3 lを使って洗浄する。水層と洗浄水を合わせ、更にブタノール 4 lで抽出する。ブタノールを合わせ、ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度43℃で蒸留する。
得られたZ-Phe-Leu-Argオイルを、溶液の量が6 lになるようにエタノール3 lに溶解する。該溶液を水素化反応器に移す。水1.5 l に懸濁したパラジウム炭素 50gを添加する。水素化する前に反応器を窒素でパージする。水素を２kgf/cm2まで圧縮し、循環ポンプを起動する。循環によって加熱が進む。温度が43℃以下に維持する。触媒を濾過して、反応器を蒸留水2 lで洗浄し、同じ蒸留水でフィルターにある触媒も洗浄する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度43℃で濾過液を蒸留する。得られたH-Phe-Leu-ArgをDMF 3 lに溶解する（該溶液1 kg当たり約0.6モル）。その後、該溶液をタンパク質架橋の際に使用する。
＜Boc-Tyr(Boc)-Ala-Gly-ONPの合成＞
H-Gly(OBzl)*Tos 907gをDMF 3 lに溶解し、N-メチルモルホリンを用いて、pHを7.2〜7.5にする。温度がТ≦ 25℃であるウォーターバスで冷却しながら、DMF 2 l中の Boc-Ala-ONSu 773gを1回で添加する。該バスを外して、常温で攪拌する。ＴＬＣコントロール。ロータリーエバポレーターを用いて、ロータリーベーンポンプの真空下にて温度41℃でDMFを蒸留する。得られたオイルを酢酸エチル15lに溶解して、ミキサー付きのガラス製デシケーターに移す。有機層を3回繰り返して、毎回蒸留水3 l用いて洗浄する。飽和Na2CO3溶液 200 ml に水を添加しながら量を3 lまで増やす。該溶液で有機層を洗浄し、その後、更に3回繰り返して、毎回蒸留水3 lを用いて洗浄する。水3 lに20%硫酸6.5 mlを溶解した溶液を調製し、該液体で有機層を洗浄し、その後、更に3回繰り返して、毎回蒸留水3 l使って洗浄する。洗浄のたびに、酢酸エチル0.5lずつ添加する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度41℃で酢酸エチルを蒸留する。
氷浴での冷却下+5℃まで冷却されたトリフルオロ酢酸3.4kgに、得られたBoc-Ala-Gly(OBzl)を溶解させ、激しく攪拌する。完全に溶解した後、該バスを外して、更に1.5時間常温で攪拌する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度41℃でトリフルオロ酢酸を蒸留する。その後、3回繰り返して、毎回ベンゼン0.5 lで共蒸留する。
得られたH-Ala-Gly(OBzl)オイルをウォーターバスで冷却しながらDMF 2.5 lに溶解し、pHを7.2〜7.4に調整する。Boc2-Tyr-ONSu 1183gの溶液を温度がТ≦ 25℃のDMF2 lに溶解する。該バスを外して、12時間常温で攪拌する。ＴＬＣコントロール。ロータリーエバポレーターを用いて、ロータリーベーンポンプの真空下にて温度41℃でDMFを蒸留する。得られたオイルを酢酸エチル15lに溶解して、ミキサー付きのガラス製デシケーターに移す。有機層を3回繰り返し、毎回蒸留水3 lを使って洗浄する。飽和Na2CO3溶液200mlに水を添加しながら量を3 lまで増やす。該液体で有機層を洗浄し、その後、更に3回繰り返して、毎回蒸留水3 l用いて洗浄する。水3 lに20%硫酸7.5 mlを溶解した溶液を調製し、該液体で有機層を洗浄し、その後、更に3回繰り返して、毎回蒸留水3 l用いて洗浄する。ロータリーエバポレーターを用いて、温度41℃で酢酸エチルを蒸留する。オイルを加温したイソプロパノール2.6 lに溶解して、ヘキサン7.5 lを数回に分けて約1時間で添加し、沈殿が生じるまで攪拌する。沈殿したBoc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl)を濾過して、2回繰り返して、毎回ヘキサンとイソプロパノール（4.2/0/8）の混合液5 lを用いて洗浄する。常温空気で乾燥させる。収量1300グラム。
得られたBoc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl)を、溶液の量が6 lになるようにエタノール5 lに溶解する。該溶液を水素化反応器に移す。水1.5 l に懸濁したパラジウム炭素 50 gを添加する。水素化する前に反応器を窒素でパージする。水素を２kgf/cm2まで圧縮し、循環ポンプを起動する。循環によって加熱が進む。温度が43℃以下に維持する。3時間でＴＬＣコントロール。触媒を濾過する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度41℃で濾過液を蒸留する。DMF2 lに溶解して、ロータリーエバポレーターを使って、ロータリーベーンポンプの真空下にて温度41℃で1 lを蒸留する。DMF 1 lと酢酸エチル3.5 lを添加して、その後、ニトロフェノール 310gを酢酸エチル0.5 l及びDMF 0.3 lに添加する。-18℃まで冷却する。酢酸エチル0.8 l及びDMF 0.4 lにDCC 470gを溶解して溶液を調製する。-18℃まで冷却する。熱平衡に達した後、両方の溶液を混合して、常温で24時間放置する。沈殿した尿素を濾過して、2回繰り返して、毎回酢酸エチル2 lを用いて洗浄する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプ、次にオイルポンプの真空下にて温度41℃で濾過液を蒸留する。得られたオイルを、加温したイソプロパノールとヘキサンから結晶化する（以下の比率で）。Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONPの0.6モルに対してイソプロパノールを0.8 l、ヘキサンを0.4 lを取り、沈殿が生じるまで攪拌する。沈殿したBoc2-Tyr-Ala-Gly-ONPを濾過して、2回繰り返して、毎回ヘキサンとイソプロパノール（1/2）の混合液5 lを使って洗浄する。収量1170グラム。
Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP 530gをDMF 1.2 lに溶解して、ウォーターバスで冷却しながら、H-Phe-Leu-Arg溶液の計算量 (1/1)に添加する。2時間攪拌する。ロータリーエバポレーターを用いて、ロータリーベーンポンプの真空下にて温度41℃でDMFを蒸留する。オイルを加温したイソプロパノール3.2 lに溶解して、加温したヘキサン4.5 lを数回に分けて、攪拌しながら添加する。該溶液が約40〜45℃まで冷却したとき、氷酢酸110gを添加する。2時間攪拌する。沈殿したBoc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Argを濾過して、2回繰り返して、毎回ヘキサンとイソプロパノール（2/1）の混合液1.5 lを用いて洗浄する。常温空気で乾燥させる。収量700グラム。
＜ダラルギンの合成＞
Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg 100gを、氷浴での冷却下、トリフルオロ酢酸180 mlに溶解する。完全に溶解した後、1時間攪拌する。ロータリーエバポレーターを用いて、ダイアフラムポンプの真空下にて温度41℃でトリフルオロ酢酸を蒸留する。残渣をジエチルエーテル1.5 lと混合し、濾過して、3回エーテルで洗浄する。ダイアフラムポンプの真空下にて温度35℃で6時間乾燥する。収量95グラム。
＜実施例2＞ヘキサペプチドの経鼻医薬組成物の調剤
ダラルギン含有のスプレータイプ医薬組成物の調製は、ダラルギン溶液の調製とバイアルへの注入とを含む。
経鼻医薬組成物を調剤するために、温度が20〜25℃の注射用水50mlに、ヘキサペプチドを0.01〜3g(溶液の組成による）添加する。その後、得られた溶液の量を注射用水で100mlまで増やす。得られた溶液を、無菌条件で細孔直径が0.22 μmのフィルターに通しながら、膜濾過法によって殺菌する。不活性ガス環境下、ポリマー又はガラス製のバイアルに注入し、最終物が入ったバイアルを密栓する。
医薬組成物の調製工程の一部として、更に塩化ナトリウムを添加してもよい。そのため、温度が20〜25℃の注射水50mlに、攪拌しながら塩化ナトリウムを7〜11g(溶液の組成による）溶解する。その次に、攪拌しながらヘキサペプチドを0.01〜3g（溶液の組成による）添加する。その後、得られた溶液の量を注射用水で100mlまで増やす。得られた溶液を、無菌条件で細孔直径が0.22 μmのフィルターに通しながら、膜濾過法によって殺菌する。不活性ガスの環境下でポリマー又はガラス製のバイアルに注入し、最終物が入ったバイアルを密栓する。
また、経鼻医薬組成物の調製工程の一部として、更に塩化ベンザルコニウムを添加してもよい。そのために、温度が20〜25℃の注射用精製水50mlに、掻き混ぜながら塩化ナトリウムを7〜11g（溶液の組成による）及び、塩化ベンザルコニウム0.1〜0.2gを添加する。その次に、攪拌しながらヘキサペプチドを0.01〜3g（溶液の組成による）添加する。その後、得られた溶液の量を精製水で100mlまで増やす。得られた溶液を、無菌条件で細孔直径が0.22μmのフィルターに通しながら、膜濾過法によって殺菌する。不活性ガスの環境下でポリマー又はガラス製のバイアルに注入し、最終物が入ったバイアルを密栓する。
上記方法によって下記組成の医薬組成物が調製し得る。
Figure 2021511370
Figure 2021511370
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下記に、抗ウイルス剤及び免疫調節剤としてのダラルギンの効果を確認する実験の結果を記載する。上記の実施例に記載された研究は、抗ウイルス剤、免疫調節剤及びインターフェロン誘導剤の臨床前の開発に関する現行の研究法規格の通りに行われた[17]。
＜実施例3＞インフルエンザウイルス株A/H1N1のエタロン株に対するヘキサペプチドの抗ウイルス活性のin vitro研究
MDCK細胞のモデルにインフルエンザウイルス株A/NewCaledonia/20/99(H1N1)を用いて、アルビドール薬剤との比較を行う。
濃度が10.0 mkg/mlのアルビドールの（ウイルス流行株の再生に対する）100%の抑制作用を考慮して、インフルエンザウイルスA型の同感染度の条件で該薬剤の抗ウイルス活性を比較するために、該濃度（水中）が選択された。
また、それぞれの薬剤に関し、ウイルス再生を50%に抑制する濃度（MIC50）を計算した。
表1に示したデータによれば、両方の物質がインフルエンザウイルス株A/NewCaledonia/20/99(H1N1)に対して高い坑ウイルス活性を持つことが見て取れる。ただし、ヘキサペプチドのほうが、溶液における極端に低い含有量の条件下、より低いMIC値を特徴とする。
＜実施例4＞マウスの肺炎のモデルにおけるインフルエンザA型に対するダラルギンの抗ウイルス効果
マウス（n=40、BALB系の雌、平均体重は18〜22 g)を、エーテルでのマイルドな麻酔下でインフルエンザウイルス株A/Aichi/2/69 (H3N2)で経鼻経路を通じて感染させた。LD50 10を含有するウイルスの用量を予め確定した。この目的で、マウス5〜6匹からなるグループを、尿膜ウイルス及び一連の10倍希釈液（10-1から10-6まで）の50 μlの用量で感染させた。得られたデータに基づいて、LD50はウイルスの10-3希釈液であると確定した。次に、全てのマウスは10倍のLP50用量（50μl）で感染させた。
活性対照としてはアルビドールを選択した。ランダム（ランダム法にて）にマウスを10匹ずつ下記の4つのグループに分けた。
-対照群（生理食塩水）
-アルビドール群
-ダラルギン筋肉内注射群
-ダラルギン経鼻投与群
ダラルギン、アルビドール又はプラセボの用法：感染24時間前及び1時間前、感染後に5日間24時間ごと。ダラルギンは、1日用量として2 mg/kg筋肉内注射又は経鼻投与した。アルビドールは、胃管（経口経路）を通じて投与した。
推薦される筋肉内投与量（0.5 ml)又は経鼻投与量（0.01 ml）に達するよう、塩化ナトリウムの使用・不使用にて、ダラルギンを、実施例2のように必要な濃度まで希釈された医薬組成物として投与した。
治療中の動物及び対照の動物を毎日観察した。マウスの体重計測は、感染後3日目、５日目及び１５日目に行った。
マウスのインフルエンザ性肺炎のモデルにおける化合物の化学療法的な活性を、平均寿命及び体重減少速度（対症群と比較して）という2つのクリテリアで評価した。
マウスの平均寿命は、MSD = ・f*(d -1)/nの数式で計算した。ここで、fはd日時点で死亡したマウス数である。生存したマウスもfに含まれ、その場合dは15となる。nはグループに含まれるマウスの数である。
マウスの体重計測は、感染後3日目、５日目及び１５日目に行った。体重の減少又は増加は、マウス別に計算し、パーセンテージで表した。体重の100%とは、マウスの感染前の体重とされた。同じグループのマウスに関し、体重減少又は増加の平均パーセンテージを確定した。
対照群では、マウスの体重が最も減少したのは感染後の5日目である。比較される薬剤の投与群では、両方の対照群に比較して、体重減少が統計的に有意に少なかった。アルビドール投与群とダラルギン投与群の比較では、体重減少速度の有意な差がなかった。
対照群では、マウスの平均寿命が最短になり、8.5日だった。アルビドール又はダラルギンを使った治療は、マウスの平均寿命を11〜14日まで延長した。しかし、治療は、（プラセボに比べて）マウスの感染後の生存率を向上させる可能性を提供しつつも、マウスの死亡を完全に防止することができなかった(表2参照）。
該データは、ダラルギンの筋肉内又は経鼻の5日間の投与（用量は1日2 mg/kg）が、プラセボに比べてインフルエンザ性肺炎に起因するマウスの死亡率を低下させ、体重減少を軽減することを示す。また、ダラルギンは、アルビドールに比べて、平均寿命の延長及び生存率の上昇に関し、より高い効果を示した。ダラルギンの筋肉内投与と経鼻投与は、抗ウイルス活性に関して類似の結果を示した。
＜実施例5＞アデノウイルス感染に対するダラルギンの抗ウイルス効果の実験的な研究
本研究では、1998年にイワノフスキーD.I.記念ウイルス学研究所から入手した、連邦国営施設「ロシア連邦国防省の第４８中央研究所・ウイルス学センター」の支所の特殊蒐集に保管されているアデノウイルス5型を使用して実施した。
密度が200〜250千/mlであるHeLa培養細胞（子宮頸癌腫の細胞）を使用した。ウシ血清をそれぞれ7.5%及び2%含有するハンクス溶液に基づく半合成培地を使用した。４８時間のHeLa培養細胞の単層をアデノウイルス5型で感染させた（1細胞当たり、TCID50:0.01）。その後、培養細胞の単層を37±0,5℃の条件で96時間インキュベートした。
薬剤の抗ウイルス効果を、HeLa培養細胞の形成された単層にウイルスを入れたときの、HeLa培養細胞におけるウイルスの細胞変性効果（CPE）の抑制によって評価した。
試験薬剤の有効性基準は、CPEの検出頻度及び抑制係数（Ki，%）である。抑制係数を次の通りに計算した。抑制係数Kiは、100*（Cc−Ct）/Cc（ここで、Cc及びCtは、それぞれ、対照検体におけるウイルス感染力価及び試験検体におけるウイルス感染力価である）である。
細胞の単層をアデノウイルス（1細胞当たり、TCID50:0.01の用量、100、20と10 μ/ml濃度）で感染させる24時間前にダラルギンを投与した場合、本薬剤はほぼ完全に細胞をウイルスの細胞変性効果から保護した。10 μg/mlの濃度では、薬剤の防御効果が40.0%となった。感染の24時間前にダラルギンを維持培地に投与した場合、感染の2時間後に投与した場合に比べて、本薬剤の防御効果は10〜20%向上した。
従って、ダラルギンの投与は、HeLa細胞の単層培養細胞においてアデノウイルス5型の再生を抑制し、該結果は、アデノウイルス感染に対する本薬剤の抗ウイルス効果を裏付ける（表３参照）。
＜実施例６＞マウスにおけるダラルギンのインターフェロン誘導効果の研究
全てのウイルス性感染において、早期サイトカイン反応の一部としてインターフェロンが産生される。それらは、ウイルス遺伝子の転写及び翻訳を抑制する一連の酵素をリボソームに生成させ、ウイルス再生を抑制する。ウイルスに感染された変性細胞は、ナチュラルキラー細胞及び細胞傷害性リンパ球の助力で排除される。これにより、インターフェロンα及びインターフェロンβの効果により、感染されていない細胞の抗ウイルス防御が活性化される。従って、内因性インターフェロンの無毒誘導剤及び、その生成の促進方法の検索は、主たる興味であり、医学ウイルス学にとって重要な課題である[18、19]。
比較薬剤として、インターフェロン誘導活性を持つ抗ウイルス剤であるアルビドールを選択した。
実験は、CBA х C57BI/6系のマウス（雄、体重20〜25 g）を40匹用いて行われた。マウスをランダム化して、10匹ずつ下記の4つのグループに分けた。実薬群(ダラルギン投与群とアルビドール投与群）が２つ及び、対照群が2つであった。対照群の一つは、初期段階（試験前）のインターフェロンレベルを、もう一つの対照群は、プラセボ（生理食塩水）の投与24時間後のインターフェロンレベルを決定するために使用され、条件の同様性を確保した。
マウスは、自然な明暗サイクルを備えた防音室に置いてあるケージに入れられ、気温は20〜22℃維持され、餌及び水をad libitumで与えられた。
ダラルギンを1 mg/kgの用量で投与した。上記用量はヒトの場合5〜6mgに相当する。
アルビドールを、事前に調剤された1%のデンプンゲルを用いた懸濁液として胃内投与した。
統計解析は、様々な試験に関してボンフェローニ補正を用いて実施した。
マウスの血清内のインターフェロンαレベルを、薬剤投与の24時間後に測定した。インターフェロンの定量測定のための血液採取は、ネンブタール麻酔（60 mg/kg）の下で心臓から行った。採取した血液検体を、凝固するために2時間常温で放置した。血清を遠心分離法で分離し、プール化し（1つのプール当たりマウス2匹）、冷凍して、測定をする時間まで‐20℃で保管した。インターフェロンレベルを測定するために、市販の、VeriKine（登録商標）製（米国）の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを使用した。ＥＬＩＳＡは、試薬セットの製造者によるマニュアルにて推奨された希釈剤を使用しながら、プール化された血清を2倍希釈した後で行った。試料及び希釈したスタンダードを、ダブル化してプレートに載せた。固相免疫アッセイにおいて、分析対象物質は結合部位（エピトープ）が2つある抗原（Ａｇ）であり、認識試薬は2種類のモノクローナル抗体（Ａｂ）である（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）。1種類の抗体は、固相に固定され、液相にある分析対象物質分子の一つのエピトープと結合する。2種類目の抗体は、ビオチンとの結合にあり、分析対象物分子の二つ目のエピトープと結合する。標識剤は、ストレプトアビジンHRPコンジュゲートである。認識系では、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）が基質として使用された。結合したペルオキシダーゼの活性を、Picon製のUNIPLAN（登録商標）の免疫測定分析器で測定した（波長450 nm)。
対照群は、プラセボ（生理食塩水）投与の前後、インターフェロンレベルの差を示さなかった。アルビドール投与の24時間後に採取された血清の検体には、インターフェロンαレベルのある程度の上昇が発見されたが、不確実である。
また、ダラルギン投与群は、対照群及びアルビドール投与群（p<0.001)に比べても、インターフェロンαレベルの産生の有意的な増加を示した（図1）。
＜実施例７＞ナチュラルキラー細胞の機能性活性に対するダラルギンの影響の評価
ナチュラルキラー細胞とは、表現型CD3-CD16+CD56+の大形顆粒リンパ球で、標的細胞を事前感作なしで識別して、殺すことができる。それは、特に、抗腫瘍免疫の機能及び、細胞内寄生菌による感染の際に最重要になる。
ナチュラルキラー細胞の機能性活性に対するインビトロでのダラルギンの影響を評価する際に、健康な献血者の末梢血単核細胞の懸濁液から該細胞を得た(n=20)。
ナチュラルキラー細胞の機能性活性を、細胞障害反応（ナチュラルキラー細胞は骨髄芽球様株細胞及びリンパ芽球様株細胞を溶解できる）に基づいて放射分析法で測定した。これを実施するために、転培養から2日目に、K-562 の骨髄芽球様株細胞の濃度を106/mlにして、用量が細胞懸濁液の3 μCi/mlの3H-ウリジンと共に37℃で1時間培養した。次に、培養後、放射ラベルを除去するために、199培地で3回洗った。
細胞傷害反応は、200 mlの量で、96穴丸底プレートを用いて行った。そのため、献血者の末梢血からの標識された標的細胞を100 μlと単核細胞（エフェクター細胞）を100μl、各希釈ごとにトリプレットで1:50の割合にして混合した。
一つのケースでは、エフェクター細胞と標的細胞をプレートに適用した後、ダラルギンを添加した（モル濃度5*10-8 М、約0.036 μg/ml）。対照試料には薬剤を添加しなかった。放出された標識を測定するために、標的細胞に同量のトリトンX-100を添加した。その後、プレートをCO2培養装置に入れ、37℃で24時間温置した。そして、ガラス繊維フィルターに移し、洗浄し、乾燥して、蛍光液が入っているバイアルに注入し、ベータ粒子測定器で放射性を測定した。細胞傷害指数（ＣＩ）を次の数式で確定した。細胞傷害指数は、((A-B)/(C-B))*100%である。ここで、Aはエフェクター細胞の存在下での標的細胞の放射性であり、Bは標的細胞をトリトンX-100処理した後の残留放射性であり、Cはエフェクター細胞の非存在下での標的細胞の放射性である。
図2に示すように、実験結果は、ナチュラルキラー細胞に対するダラルギンの免疫向性ポテンシャルを示す。
＜実施例８＞食作用に対するダラルギンの影響の研究
現在、ダラルギンは、人間のための医学的適用（1回用量は1〜5 mg）[20]が承認され、マウスのために換算すると、約0.2〜1 mg/kgとなる。従って、マウスの腹腔内滲出液の食細胞のモデルにおいて薬剤の効率を研究するための用量を0.2 mg/kgとした。また、食細胞の機能性活性に対する薬剤投与経路の可能な影響の研究も重要である。
薬剤の免疫調節活性を研究するために、顕微鏡法を適用した。試験はBALB系のマウスを雄60匹（体重18〜22 g）で行った。マウスを均等に6つのグループ（それぞれに10匹ずつ）に分けた。2つのグループは対照群とした。実薬投与群は、ダラルギンの筋肉内又は経鼻投与された（1回用量は0.2 mg/kg）。試験薬剤の投与日の翌日、マクロファージ及び好中球の抽出を行った。
好中球を蓄積するために、マウスに化学誘引物質として10%ペプトン溶液の3〜4 mlの腹腔内投与をした2時間後、クロロホルムを用いて安楽死させた。その後、無菌条件で解剖した。腹腔内からスポイトで液体を吸い上げ、試験管に入れ、10分間、回転数1000rpmで遠心分離を行った。その後、沈殿物を再懸濁させて、好中球の濃度を2.5 百万/mlにした。
マクロファージを単離するために、マウスをペプトン投与から3日目に安楽死させた。そして、10%ウシ胎児血清と共に199培地を3〜4 ml腹腔内に投与して、この液体を吸い上げた。
事前にプールマウス血清によってオプソニン化された（37℃、10分間）Staph. aureus細菌（Aタンパク質を含有しない株）を、同量の食作用細胞の懸濁液に10:1の比率（即ち25 百万/ml）で添加した。培養後、塗抹標本を作った（ロマノフスキー・ギムザ染色）。
好中球の食作用活性を、食作用指数及び食細胞数の２つのクリテリアで評価した。マクロファージの機能性活性を、顕微鏡法と、活性化状態でニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を吸収する能力とによって評価した。
該データは、ダラルギン（0.2 mg/kg）がペプトンによって遊離されたマウスの好中球の食作用活性を増やす能力を持つことを示した。投与経路による効果の相違は発見されなかった。腹腔内滲出液のマクロファージのためにも、ニトロブルーテトラゾリウムを還元する能力の強化に伴う、食作用に対するダラルギンの刺激的な影響が発見された。投与経路による相違は見られなかった（表４参照）。
従って、ダラルギンは非特異的免疫の食作用部分に刺激的な影響を与える。
＜実施例９＞炎症誘発性サイトカインの産生に対するダラルギンの影響の研究
サイトカインIL-1（インターロイキン‐1）、IL-6（インターロイキン‐6）及び腫瘍壊死因子-α（TNF-α)の合成に対するダラルギンの影響の評価は、健康な献血者の末梢血単核培養細胞を用いたin vitro試験によって行われた(n=20)。炎症誘発性サイトカインの誘導のために、腸内細菌目細菌の多糖刺激を行った。
単核細胞の懸濁液を作るために、血液を1:2の割合で199培地を用いて希釈して、Ficoll-Paque媒体に塗り重ねて（d=1,077 g/cm3）、40分間、400gで遠心分離を行った。相の界面にできる、単核細胞を含有する白色のリングを丁寧にスポイトで吸い上げ、10分間の遠心分離（200g）によって、199培地で2回洗浄した。培地で沈殿物を再懸濁させ、Goryayev血球計算盤でカウントして、必要な濃度にした。
多糖及び単核細胞の懸濁液を有する試験サンプルに、ダラルギンを添加した（モル濃度5*10-8 М、約0.036 μg/ml）。対照サンプルには薬剤を添加しなかった。
血清におけるサイトカインの定量をtwo-site ELISAを用いて実施した。
図3に表示される結果は、リポ多糖によって誘導されたIL-6、IL-1及びTNF-αの産生に対するダラルギンの有意な抑制効果を示している。炎症誘導性サイトカインの産生程度は、100%とみなされた対照検体における含有の比率として示される。
従って、試験対象のヘキサペプチドが抗ウイルス及び免疫調節特性を有することを認識すべきである。自然免疫及び獲得免疫の細胞の活性を調節する。ダラルギンは、免疫の食作用部分（マクロファージと好中球）及びナチュラルキラー細胞の活性を高める。また、薬剤は内因性インターフェロンの産生も促進する。
その他、ダラルギンは、炎症誘導性サイトカイン（IL-1、IL-6、TNF-α）の過剰分泌を抑制する能力を発揮しながら、中毒を軽減し、その他の炎症カスケードの事象を制御することができる。
従って、本医薬組成物は、1日当たりの用量2 mg/kgでダラルギンの経鼻投与をされたマウスを使った試験において抗ウイルス活性を発揮した。上記用量は、人間の場合は1日当たりの用量10 mgに相当する。
人間のための投与の場合、1回の経鼻投与用の溶液用量は、各鼻腔1〜2滴（合計で2〜4滴）、すなわち0.1〜0.2mlとなる。
行った実験に基づいて、経鼻投与用の医薬組成物のヒト当量濃度が0.01〜30 mg/ml（0.01〜3%のダラルギン溶液）であるという結論が出される。
本医薬組成物は、経鼻投与の際に筋肉内投与と同様な抗ウイルス効果及び免疫調節効果を特徴とするので、特に臨床適用のために重要である。
Figure 2021511370
Figure 2021511370
MDCK組織培養におけるインフルエンザウイルス株A/NewCaledonia/20/99(H1N1)のエタロン株に対する、比較される薬剤の最小発育阻止濃度（MIC50)及び活性
Figure 2021511370
マウスのインフルエンザ性肺炎のモデルにおける化合物の抗ウイルス効果
Figure 2021511370
単層培養のHeLa細胞におけるアデノウイルス5型に対するダラルギンの効果
Figure 2021511370
マウスの好中球及びマクロファージの食作用活性に対するダラルギンの影響
Figure 2021511370
本発明は、医学、特に薬剤学に関連し、急性ウイルス性呼吸器疾患（ＡＲＶＩｓ）、特にインフルエンザウイルスに引き起こされる疾患を治療するための、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を含有する経鼻医薬組成物の使用に関するものである。特に、本発明は、急性ウイルス性呼吸器疾患（ＡＲＶＩｓ）を治療するための経鼻医薬組成物に関するものである。


Claims (9)

  1. 急性ウイルス性呼吸器疾患（ＡＲＶＩ）を治療するための、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を含有する経鼻医薬組成物の使用。
  2. 前記疾患は、インフルエンザである、請求項1に記載の使用。
  3. 前記医薬上許容される塩は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニン‐ジアセタートである、請求項1に記載の使用。
  4. 前記経鼻医薬組成物は、有効成分としてチロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩を0.01〜3質量%で、残りは添加剤という割合で含有する、スプレーの形態にて調剤されたものである、請求項1に記載の使用。
  5. 前記医薬組成物は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩及び添加剤を、ヘキサペプチドは0.01〜3質量%、残りは水という割合で含有する、請求項4に記載の使用。
  6. 前記医薬組成物は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩及び添加剤を、ヘキサペプチドは0.01〜3質量%、塩化ナトリウムは7〜11質量%、残りは水という割合で含有する、請求項4に記載の使用。
  7. 前記医薬組成物は、チロシル-D-アラニル‐グリシル‐フェニルアラニル‐ロイシル‐アルギニンヘキサペプチド又はその医薬上許容される塩及び添加剤を、ヘキサペプチドは0.01〜3質量%、塩化ナトリウムは7〜11質量%、塩化ベンザルコニウムは0.1〜0.2%、残りは水という割合で含有する、請求項6に記載の使用。
  8. 前記医薬組成物は、添加剤として塩化ナトリウム及び水を、塩化ナトリウムは9質量%、水は90質量%という割合で含有する、請求項１の使用。
  9. 前記医薬組成物は、水として注射用水又は精製水を含有する、請求項5〜8のいずれかに記載の使用。

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