KR20200132931A

KR20200132931A - 급성 호흡기 바이러스 감염 치료용 항바이러스 면역 억제제

Info

Publication number: KR20200132931A
Application number: KR1020207029395A
Authority: KR
Inventors: 에브게니 알렉산드로비치 체르토리즈셰스키; 미하일 블라디미로비치 옵치니코프; 알렉세이 빅토로비치 클레지메노프
Original assignee: 피브이피 랩스 피티이.엘티디
Priority date: 2018-04-18
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2020-11-25
Also published as: ES2901193T3; JP2021511370A; EA037430B1; ZA202006656B; PL3556377T3; WO2019202380A1; RU2672888C1; KR102489519B1; CN112020367B; KR20220047893A; EA201900025A1; EP3556377A1; EP3556377B1; JP6952379B2; HRP20211906T1; RS62632B1; PH12020551709A1; CA3093492A1; US20190322701A1; PT3556377T

Abstract

본 발명의 일실시예에 의한 비강 의약 조성물은, 급성 호흡기 바이러스 질환(ARVI)의 치료를 위한 헥사펩타이드티로실--D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약 상 허용되는 염분을 함유한다.

Description

급성 호흡기 바이러스 감염 치료용 항바이러스 면역 억제제

본 발명은 의약, 특히 약리학에 관한 것으로, 급성 호흡기 바이러스 감염(ARVI), 특히 인플루엔자에 의한 ARVI 치료를 위한 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분을 함유하는 비강 약용 조성물에 관한 것이다.

급성 호흡기 바이러스 감염(ARVI)은 현재 가장 일반적인 유형의 감염으로 전체의 90% 이상을 차지한다(인플루엔자 및 독감 유사 감염 (특히 위험한 형태의 인플루엔자 감염 포함) 연구의 기본 및 응용 측면. 과제 위원회 게시판 편집자.: V.I. Pokrovsky, D.K. Lvov, O.I. Kiselyov, F.I. Yershov. 상트 페테르부르크, Roza mira, 2008.). 세계보건기구(WHO)에 따르면 매년 전 세계적으로 4천만 건 이상의 새로운 사례가 보고된다. ARVI의 사회적 부담은 대부분 결근 기간 동안의 비용, 노동 생산성 저하로 인한 경제적 손실, 환자를 돌보는 가족 구성원의 결근에 따른 비용(미국의 경우 일시적 장애로 인한 경제적 손실이 2억 3,200만 달러로 추정됨)과 같은 높은 간접 비용을 특징으로 한다(Sullivan KM, Monto AS, Longini IM. 인플루엔자의 미국 건강 영향 추정치. AmIPublicHealth, 1993, 83: 1712-1716.).

러시아에서도 이 문제와 매우 관련이 있는데, 공식 수치에 따르면 러시아 국내에서 2,730 만에서 4,120 만 건의 호흡기 감염 사례가 매년 보고된다. 전체 질병률 구조에서 비중이 높은 이 질병은 장애 일수의 약 40 %를 차지한다(연방 공중 보건 기관 “러시아 연방 로스포트례브나드조르 위생 및 역학 연방 센터 ”의 보고서에 따름. 참고 URL: http://www.fcgsen.ru/.). 현재 독감과 유사한 질병을 일으키는 200개 이상의 바이러스가 확인된 상태이다. 여러 연구팀이 다양한 국가에서 수행한 ARVI의 원인 구조에 대한 수많은 연구 결과를 분석한 결과, 가장 흔한 병원균에는 라이노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 코로나 바이러스, 메타뉴모 바이러스, 보카바이러스 및 아데노바이러스 등이 있다(Turner R. 감기의 역학, 병인 및 치료. 알레르기, 천식 및 면역학 연보, 1997, 78: 531-539.). 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소 바이러스 그룹에 속하며 구형의 형태를 가진다. 바이러스의 내부 구조는 이소폴리머라제 복합체 (PA, PB1, PB2), 리보핵 단백질 및 매트릭스 단백질로 구성된다. 외부에는 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)의 두 가지 유형의 표면 항원을 가진 외피가 바이러스를 덮고 있다. 이러한 구조를 통해 바이러스가 숙주 세포에 붙어 침투할 수 있다. 표면 항원은 가변성을 나타내며, 인플루엔자 바이러스의 새로운 균주를 생성한다. 가장 큰 가변성은 A형 인플루엔자 바이러스에 의해 나타난다. A형 인플루엔자 바이러스는 단시간 내에 전국적 또는 대륙 전체의 인플루엔자 유행을 발생시킬 수 있다. 미질병통제센터(CDC)에 따르면, 계절성 독감 유행은 연간 20 만 건의 입원을 유발하는 반면, 인구 10만 명 당 1.4-1.67명의 사망률을 보인다( Hayden F, Couch R. 아만타딘 및 리만타딘에 내성이 있는 A형 인플루엔자 바이러스의 임상적, 역학적 중요성. ReviewsinMedicalvirology, 1992, 2: 89-96.). 2009년에 시작된 유행성 독감은 유행 잠재력을 가진 A형 인플루엔자 바이러스(H1N1)에 의해 발생했다. 이 바이러스는 이후 러시아에 도달하여 2010-2011년과 2015년에 가장 많은 환자가 보고되었다(O.I. Kiselyov, E.G. Deyeva, T.V. Sologub, V.V. Tsvetkova. 성인의 인플루엔자 치료 및 예방을 위한 권장 사항. 러시아 보건부 인플루엔자 연구소. 상트페테르부르크, 2014, 4.). 1,462명의 환자를 대상으로 수행된 약물 표본 역학 조사에서 18-49세 연령대의 사람들이 환자의 84.7%를 차지한다는 사실이 밝혀졌다( E.P. Selkova. 급성 호흡기 바이러스 감염의 증상 및 병적 치료의 최근 문제. Reference Book of the Polyclinic Phycician, 2013, 01: 9-13.).

따라서, 이 질병 그룹의 확산 방지가 모든 국가에서 중요한 목표이다.

이에 따라, 관련 질병 그룹의 치료 및 예방을 위해 몇 가지 방법을 사용할 수 있다.

구체적으로, 대량 예방 접종은 전염병 예방을 위한 주요 예방 조치이다. 백신은 특정 지역 내에서 순환하는 바이러스 균주에 대한 역학 데이터를 기반으로 매년 개발된다. 그러나 인플루엔자 바이러스의 항원소 변이는 당해 백신이 개발 된 후에도 발생할 수 있다. 최근 몇 년 동안 다수의 병원체로 인한 ARVI가 흔히 발생하고 있다. 일부 추정치에 따르면, 이러한 사례는 70%의 환자들에게 영향을 미친다. 한 환자가 동시에 여러 바이러스를 전파하거나 박테리아 또는 기타 회합체와 결합하여 바이러스를 전파할 수 있다. 단일 바이러스가 감염을 유발할 수 있으며, 감염이 진행되는 동안 다른 바이러스가 관련되어 질병의 임상 경과를 악화시킬 수 있다는 보고들이 존재한다. 이러한 혼합 감염은 종종 환자의 상태를 악화시키고 질병을 장기화하며 기존의 만성 상태를 악화시키거나 2차 합병증을 유발할 수 있다(E.P. Selkova. 급성 호흡기 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 신기술. Consiliummedicum. Pediatriya, 2007, 1: 66-68.).

추가적으로, 호흡기 바이러스성 질환의 치료에는 항바이러스 효과가 있는 펩타이드 등 항바이러스 약물이 관여한다. 예를 들어, 항균펩타이드(AMPs)는 숙주 자체의 면역 방어 분자로서 모든 다세포 식물과 동물에 의해 생성된다. 향균펩타이드(AMP)는 1차 선천성 면역 물질로, 감염 초기 단계에서 침습성 병원체를 빠르게 제거하고 전신 적응 면역 반응을 일으킬 수 있다. 대부분의 향균펩타이드(AMP)는 일반적으로 음전하를 띠는 미생물 막에 결합할 수 있는 양친매성 및 양이온성 분자이다. 수많은 향균펩타이드(AMP)가 구조적 특징 및/또는 아미노산 구성으로 식별되고 분류되었다. 척추 동물의 두 가지 향균펩타이드(AMP) 계열인 카텔리시딘과 디펜신은 주로 백혈구와 상피 세포에서 생성되는 작은 분자이다.

이 펩타이드류를 포함하는 조성물은 해당 펩타이드가 다양한 호흡기 바이러스 감염을 억제할 수 있도록 하는 최신 기술로 알려져 있다. 호흡기 바이러스의 표면 당단백질에 결합할 수 있는 기능적 영역 때문에 펩타이드는 바이러스의 표면 당단백질에 결합하여 세포내이입에 의해 엔도솜 내부에 도달할 수 있다. 펩타이드에는 염기성 아미노산이 풍부하기 때문에 후기 엔도솜의 pH 감소를 방지하여 바이러스 및 엔도솜 막의 융합과 바이러스 RNA의 방출에 따른 바이러스 분해를 차단할 수 있다. 따라서, 펩타이드는 다양한 아형 인플루엔자 바이러스 및 코로나 바이러스와 같은 호흡기 바이러스에 의한 감염을 차단하는 강력한 능력을 보여준다. 펩타이드는 호흡기 바이러스에 의한 표적 세포 감염을 차단하고 바이러스성 호흡기 감염을 예방 또는 치료하는 데 사용할 수 있다(특허 RU 2639559, 21/12/2017).

그러나 앞서 언급한 바와 같이, 이러한 약품의 사용은 바이러스 유전 물질의 다양성으로 방해를 받으며, 결과적으로 약품의 효과는 이러한 유형의 치료에 반응하는 특정 병원체로 제한된다.

복합 제품을 이용한 치료 역시 사용된다. 예를 들어, ARVI의 대증 치료를 위해 해열, 진통, 항부종 및 혈관 보호 효과를 가진 복합 제품을 사용하는 것은 적극 권장될 수 있다. 복합 증상 약물의 사용은 일련의 단일 구성 약물과 관련된 부작용 발생의 감소와 관련이 있으며, 이러한 약물 사용은 경제적으로 훨씬 합리적이다(N.B. Lazareva, M.V. Zhuravlyova, L.R. Panteleyeva. ARVI: 임상 약리학의 관점에서 본 합리적 약물 요법// 의료 위원회. - 2016. - №4.).

하지만 이러한 유형의 약물 사용은 ARVI 환자들의 관련 비강 호흡 기능, 국소 특이적 및 비특이적 면역 요인 보존의 중요성을 고려하지 않는다.

한편, ARVI의 원인에는 흡입된 공기에서 병원균을 제거하는 메커니즘 작동과 관련된 비강 호흡 기능의 변화가 포함된다. 이 기능은 비강 점막과 점액 섬모 정리에 의한 비특이적 및 특이 면역 보호 인자의 생성에 따라 수행된다.

이러한 제품의 예방 및 치료 효과는 비강에서 흡입된 공기의 공격적인 유기 및 무기 요인을 제거하고, 비특이적, 특정 면역 및 점액 섬모 정리를 정상화하는 능력과 직접적으로 관련성을 가진다.

이러한 예방 효과가 유망한 영역은 신체의 비특이적 저항을 활성화하는 약품의 사용이다. 틸로론, 아르비돌 및 사이클로페론과 같은 내인성 인터페론의 유도제는 이러한 용도로 러시아 임상 진료에서 널리 사용된다.

나트륨염 형태의 디펩타이드α-글루타밀-트립토판은 참고 문헌에서 확인할 수 있다(러시아 연방 특허 2107691, 1998). 이 펩타이드는 세포 매개 및 체액성 면역 반응과 신체의 비특이적 저항성에 영향을 미치는 면역 조절제로 사용된다. 억제될 경우, 재생 과정을 자극하고 세포 대사를 향상시킨다. 또한 림프 세포의 분화 촉진, 골수 세포의 집락 형성 활동 자극, 림프구에서의 분화 수용체 발현 유도 등을 통해 다양한 면역 결핍 상태인 환자의 T 지원 세포 및 T 억제 세포의 수와 그 비율을 정상화 할 수 있다.

이 펩타이드는 상기도 질환, 특히 인플루엔자를 포함한 급성 호흡기 바이러스 감염(ARVI)의 예방 및/또는 치료에 적용되는 비강내 투여용 조성물에 사용되었다. 이 조성물은 활성 성분과 부형제를 포함하고 있으며, 활성 물질에는 다음 비율 (중량 %)의 바다 소금 및 α-글루타밀-트립토판이 포함된다.

- 해수 염분: 95.00-98.00;

- α-글루타밀-트립토판: 2.00-5.00 (특허 RU 2540496, 10/02/2015, 초기 모델).

본 비강 의약품은 해수 성분을 함유하고 있으며, 본 의약품을 통해 비강을 적극적으로 세척하여 점액을 제거하고, 감염된 분비물과 비강 점막의 부종을 줄이며, 딱지를 부드럽게 하여 제거할 수 있다. 본 제품은 비강 점막 섬모 상피의 보호 기능을 정상화하고 비강 호흡을 개선한다.

그러나 해수 염분을 추가 성분으로 사용한다고 해서 디펩타이드의 활성도가 정확히 향상되는 것은 아니며, 이는 대신 안정성과 활동성을 저하시킨다. 이로 인해 특허 명세서에 펩타이드의 일반적으로 알려진 면역 조절 특성이 언급되어 있음에도 불구하고, 현재 사용중인 항바이러스 제품과의 직접적인 조사 결과 또는 효능 비교를 다루지 않기 때문에 항바이러스 작용 메커니즘, 제품의 항 바이러스 효능 또는 선택성을 평가할 수 없다.

이러한 단점들은 ARVI의 발달을 억제하는 생리학적 메커니즘을 유발하는 뚜렷한 항바이러스 효과를 가진 새로운 펩타이드 기반 제품의 개발을 필요성을 보여준다.

특히, 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-루실-아르기닌(달라진으로 지정됨)은 선행 기술로 알려져 있으며, 이는 내인성 오피오이드 조절 펜타펩티드 류신-엔케팔린(H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COOH, 분자 중량 555.6 a.m.u.)의 합성 구조 유사체이다.

달라진은 μ(뮤), δ(델타) 및 κ(카파) 오피오이드 수용체에 대해 비특이적 친화성을 가지고 있으며, 진통제(N.B. Lazareva, M.V. Zhuravlyova, L.R. Panteleyeva. ARVI: 임상 약리학의 관점에서 본 합리적 약물 요법// 의료 위원회. - 2016. - №4.) 및 항산화(B.V. Balachevsky, A.N. Kurzanov, A.A. Slavinsky. 호중구 백혈구의 기능 대사 활성의 달라진 유도 변조 // Uspekhi Sovremennogo Yestestvoznaniya. - 2008. - №5.) 속성과 관련한 생물학적 활성의 광범위한 스펙트럼을 설명한다. 이는 위액의 산성도와 췌장의 외분비 활동을 감소시키는 약품으로 러시아 연방에 등록되어 있다 (국가 등록 의약품 데이터베이스: https://grls.rosminzdrav.ru). 또한, 이 물질은 저혈압 및 심박동 증가 효과를 유발하는 것으로 알려져 있다(A.N. Zokhirov 외 오피오이드 펩타이드의 합성 유사체인 달라진이 개의 항산화 상태에 미치는 영향 // Vestnik Kurskoy Gosudarstvennoy Selskokhozyaystvennoy Akademii. - 2016. - №9.).

현재까지 달라진의 다양한 효과를 보여주는 수십 개의 특허가 등록되어 있다. 정확히 말해서, 특허 RU 2196603는 주입 요법의 일환으로 화상 치료를 위한 달라진의 사용을 공개한다. 특허 UA 6829LJ, UA 6823U 및 UA 6826U는 급성 실험 췌장염 치료를 위한 달라진의 사용을 공개한다. 항스트레스제로서 달라진의 사용은 각각 만성 췌장염, 급성 부속기염 및 복막염의 실험 모델에 대한 특허 UA 67632, UA 67630 및 UA 67629에서 다루어졌다. 달라진의 항스트레스 활성은 특허 UA 67626의 실험적 만성 스트레스 모델에서 입증되었다. 특허 RU 2180598은 만성 약물 중독 환자의 독성 간염 치료를 위한 달라진의 사용을 공개한다. 간행물 MD1413F는 구강 점막과 편평태선의 치료를 위한 달라진의 사용을 공개하고 있으며, 간행물 MD1296F는 달라진을 사용한 편평태선의 치료에 대한 데이터를 제공한다. 특허출원 RU 2008131509는 달라진을 포함하여, 탈수초성질환의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제시한다. 특허 RU 2218896은 수포성 각막병증의 치료를 위한 달라진의 사용을 공개한다. 간행물 MD1963F 및 MD1610F는 만성 재발성 구강 궤양에서의 달라진 사용을 다루고 있으며, 특허 RU 2230549는 알레르기성 피부병 치료에 대한 사용을 다루고 있다. 또한, 특정 바이러스성 질환 치료에 대한 달라진의 효능은 특허 RU 2261722 (태아 손실 증후군이 있는 여성의 생식기 포진의 잠복성 치료) 및 RU 2167671 (진드기 매개 뇌염 치료)에서 입증되었다. 그러나 이러한 작업은 ARVI의 치료를 다루지 않으며, 다른 질병의 치료와 관련이 있다. 또한, 논의되고 있는 헥사펩타이드의 직접적인 항바이러스 효과를 나타내지 않는다.

더욱이, 특허 RU 2241488은 주사 용액의 형태로 달라진의 사용을 설명하고, 특허출원 RU 2010152024는 비강 내 약제학적 조성물용 스프레이의 형태로 달라진의 적용을 설명함에도 불구하고, 달라진은 위장병 치료를 위해 고안된 것이다.

기존에는 류신-엔케팔린을 10mg/kg으로 피하 투여한 지 24시간 및 48시간 이후 인터페론 -α (IFN-α) 분비가 증가하는 것으로 입증되었지만(L.N. Maslov 외 D-Ala2, Leu5, Arg6-enkephalin (달라진)의 심혈관 효과는 말초 오피오이드 μ- 수용체의 활성화와 관련성을 가진다 // Eksperimentalnaya i Klinicheskaya Farmakologiya. - 2008. - Vol. 71. - №2. - p. 21-28.), 달라진과 관련한 효과는 과거에 연구되지 않았다. 현재 달라진이 면역 조절 효과를 나타낸다는 것을 입증하는 충분한 수의 연구가 존재한다(N.B. Lazareva, M.V. Zhuravlyova, L.R. Panteleyeva. ARVI: 임상 약리학의 관점에서 본 합리적 약물 요법// 의료 위원회. - 2016. - №4), (Gabrilovac, J., Ikic-Sutlic, M., Knezevic, N., &Poljak, L. (1996). 류-엔케팔린은 쥐의 인터페론 분비를 향상시킨다. Research in experimental medicine, 196(1), 137-144), (V.Yu. Cherdakov 외 대퇴골 골절에서 항감염성 면역의 호중구 연결 교정을 위한 조절 펩타이드의 응용: 티모겐, 달라진, 글리실-히스티딜-리신 및 관련 조합// Kursky Nauchno-Praktichesky Vestnik Chelovek), (M.A. Zemskov 외 다른 기원의 감염에서 면역 장애의 특성과 관련 수정 // Vestnik Novykh Meditsinskikh Tekhnologiy. - 2011. - Vol. 18. - №3), (O.I. Chernyshyova, I.I. Bobyntsev. GLY-HIS-LYS 펩타이드의 생물학적 효과 // Mezhdunarodny Zhurnal Prikladnykh i Fundamentalnykh Issledovaniy. - 2014. - №11-4. - p. 688-692). 그러나 발간된 보고서는 달라진의 면역 조절 특성, 특히, 사이토카인 생성, 자연 살해 세포의 활성, 인터페론 유도 활성 또는 식세포 작용에 대한 전체 스펙트럼을 다루지 않는다. 실제로 이러한 연구는 헥사펩타이드의 영향으로 국소 면역이 향상한다는 것을 입증하지 못한다.

위의 내용을 요약하면, 지금까지 발표된 자료는 달라진의 실제 항바이러스 작용과 관련이 없고, 면역 조절 특성을 완전히 공개하지 않으며 ARVI 요법에서 이 약물의 사용 가능성을 다루지 않는다.

따라서 본 발명의 목적은 직접적인 항바이러스 효과, 비강 내 국소 투여 이후 국소 및 전신 면역 인자를 향상시키는 능력을 인플루엔자를 포함한 ARVI의 치료 및 예방을 위한 제품으로서 단일 요법으로 사용하거나 기타 의약품과 병용할 수 있는 급성 호흡기 바이러스 감염 치료용 항바이러스 면역 억제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 급성 호흡기 바이러스 질환(ARVI)의 치료를 위한 헥사펩타이드티로실--D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약 상 허용되는 염분을 함유한다.

여기서, 이 질병은 인플루엔자일 수 있다.

그리고, 약제학적으로 허용되는 염분은 티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 디아세테이트일 수 있다.

여기서, 비강 조성물은 활성 성분으로서 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분을 0.01% - 3% 중량 백분율로 함유하고 나머지 보조 첨가제로 구성된 스프레이 형태로 제조될 수 있다.

그리고 조성물이 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분 및 첨가제를 다음 성분의 중량 백분율로 함유하는 특징의 적용: 헥사펩타이드: 0.01-3%, 나머지는 물로 구성될 수 있다.

여기서, 조성물은 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분 및 첨가제를 다음 성분의 중량 백분율로 함유하는 것을 특징으로 한다: 헥사펩타이드 0.01-3%, 염화나트륨 7-11%, 나머지는 물로 구성될 수 있다.

여기서, 조성물이 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분 및 첨가제를 다음 성분의 중량 백분율로 함유하는 것을 특징으로 하는 적용: 헥사펩타이드 0.01-3%, 염화나트륨 7-11%, 염화벤즈알코늄 0.1-0.2 %, 나머지는 물로 구성될 수 있다.

그리고 상기 조성물은 부형제로서 염화나트륨 및 물을 다음 질량 백분율로 함유하는 것을 특징으로 하는 적용: 염화나트륨 9%, 물 90%로 구성될 수 있다.

여기서, 조성물이 물로서 주사용 또는 정제수를 함유할 수 있다.

직접적인 항바이러스 효과, 비강 내 국소 투여 이후 국소 및 전신 면역 인자를 향상시키는 능력을 인플루엔자를 포함한 ARVI의 치료 및 예방을 위한 제품으로서 단일 요법으로 사용하거나 기타 의약품과 병용할 수 있는 효과가 있다.

또한, ARVI 치료를 위한 비강 조성물 개발용 기술 툴킷 확장할 수 있고, 비강에서 흡입된 공기의 유기 및 무기 요인을 제거하고 비특이적 및 특정 면역 보호를 정상화할 수 있는 제품을 개발할 수 있으며, 유기체 및 진입구에 존재하는 ARVI 유발 병원체에 대한 직접적인 항바이러스 효과를 나타낼 수 있는 펩타이드 기반 제제를 개발할 수 있고, 따라서, 본 발명의 참신성과 본질은 주요 ARVI 유발 병원체인 인플루엔자 바이러스 및 아데노 바이러스에 대한 달라진의 실제 항바이러스 작용을 입증하는 제품 개발 뿐만 아니라, 관련 질병의 치료에 있어서 면역 조절 활성 성분이 향상될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 달라진, 아비돌 및 위약 투여 후 쥐의 혈장 내 IFN-α 농도를 나타내는 그래프.
도 2는 자연살해세포의 세포 독성 활성화에 대한 달라진의 효과를 나타내는 그래프.
도 3은 달라진의 효과에 따른 전염증성 사이토카인 합성 억제를 나타내는 그래프.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

예 1. 달라진 준비.

달라진 및 이의 약제학적으로 허용되는 염분 제조 방법은 기존에 설명되었으며, 이 방법은 펩타이드 합성의 고전적인 방법이다.

달라진의 합성 방법에 대한 설명은 아래에 제공된다.

H-Phe- Leu-Arg 합성

750g의 Z-Leu-ONSu를 3L의 DMF에 녹이고, 368g의 Arg를 결과물인 용액에 추가하여 24시간 동안 교반한다. 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전증발기로 DMF를 증발시킨다. 부탄올 15L에 결과 오일을 용해하고, 교반기가 장착된 유리 데시케이터로 옮긴다. 데시케이터에 10L의 증류수를 추가한다. 층이 완전히 분리될 때(10-24 시간) 까지 5분 간 교반한다. 깨끗한 용기에 물을 따라낸다. 유기층을 증류수 3L로 3회 더 세척한다. 수층과 헹굼물을 모으고 추가로 부탄올 4L를 추출한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 43℃의 회전증발기로 부탄올을 증발시킨다.

생성된 Z-Leu-Arg 오일을 에탄올 3L에 녹인다. 용액을 수소화 반응기로 옮긴다. 1.5L의 물에 현탁된 Pd/C 50g을 추가한다. 수소화 이전에 니트로겐으로 반응기를 청소한다. 반응기를 수소로 2kgf/cm²까지 가압하고 43℃ 이하로 온도를 유지하면서 재순환 펌프를 시동한다. 촉매를 여과하고 2L의 증류수로 반응기를 세척한 후 동일한 물로 필터의 촉매를 세척한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 43℃의 회전증발기로 여과액을 증발시킨다.

생성된 H-Leu-Arg 오일을 DMF 3L에 용해하고, 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 회전증발기로 1L를 증발시킨다. DMF 2L에 든 Z-Phe-ONsu 용액 785g을 결과 용액에 추가하고 24시간 동안 교반한다. 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전증발기로 DMF를 증발시킨다. 부탄올 15L에 결과 오일을 용해하고, 교반기가 장착된 유리 데시케이터로 옮긴다. 데시케이터에 10L의 증류수를 추가한다. 5분간 교반한다. 유기층을 증류수 3L로 3회 더 세척한다. 수층과 헹굼물을 모으고 추가로 부탄올 4L를 추출한다. 부탄올 부분을 모으고 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 43℃의 회전 증발기로 부탄올을 증발시킨다.

생성된 Z-Phe-Leu-Arg 오일을 에탄올 3L에 녹여 6L의 용액을 만든다. 용액을 수소화 반응기로 옮긴다. 물 1.5L로 현탁된 탄소에 팔라듐 50g을 추가한다. 수소화 이전에 니트로겐으로 반응기를 청소한다. 반응기를 수소로 2kgf/cm²로 가압하고 재순환 펌프를 시동한다. 재순환으로 인해 가열 작용이 발생하는데, 온도를 43℃ 이하로 유지한다. 촉매를 여과한 후 2L의 증류수로 반응기를 세척한 다음 동일한 물로 필터의 촉매를 세척한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 43℃의 회전증발기로 여과액을 증발시킨다. 생성된 H-Phe-Leu-Arg를 DMF 3L (용액 kg당 약 0.6 몰)에 녹인 후, 단백질 가교결합을 위해 용액을 사용한다.

(Boc-Tyr(Boc)-Ala-Gly-ONP 합성)

H-Gly(OBzl)*Tos 907g을 DMF 3L에 녹이고, N-메틸모르폴린으로 pH를 7.2-7.5로 조정한다. 수조에서 냉각하면서 DMF 2L에 Boc-Ala-ONSu 용액 773g을 단일 부분에 추가한다. T ≤25℃. 수조를 제거하고 실온에서 젓는다. TLC 통제. 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전증발기로 DMF를 증발시킨다. 15L의 에틸아세테이트에 생성된 오일을 용해하고, 교반기가 장착된 유리 데시케이터로 옮긴다. 유기층을 물 3L로 3회 세척한다. Na₂CO₃ 포화 용액 200mL를 물 3L에 섞고 이 용액으로 유기층을 세척한 후, 물 3L로 3회 더 세척한다. 물 3L에 20% 황산 6.5mL를 섞은 용액을 준비하고 이 용액으로 유기층을 세척한 후, 물 3L로 3회 더 세척한다. 세척 시 마다 에틸아세테이트를 0.5L 추가한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전 증발기로 에틸아세테이트를 증발시킨다.

생성된 Boc-Ala-Gly (OBzl)를 얼음 수조에서 냉각하고, 강하게 교반하면서 +5°C로 냉각된 3.4kg의 트리플루오로아세트산에 용해시킨다. 완전히 용해된 후, 수조를 제거하고 실온에서 1.5시간 더 교반한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 41°C의 회전 증발기로 TFA를 증발시킨다. 그런 다음 벤젠 0.5L와 함께 3회 동시 증발시킨다.

생성된 H-Ala-Gly(OBzl) 오일을 수조에서 냉각하는 상태에서 DMF 2.5L에 용해하고, pH를 7.2-7.4로 조정한다. DMF 2L에 1,183g의 Boc2-Tyr-ONSu 용액을 추가한다, Т≤ 25℃수조를 제거하고 실온에서 12시간 동안 교반한다. TLC 통제. 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전증발기로 DMF를 증발시킨다. 15L의 에틸아세테이트에 생성된 오일을 용해하고, 교반기가 장착된 유리 데시케이터로 옮긴다. 유기층을 물 3L로 3회 세척한다. Na₂CO₃ 포화 용액 200mL를 물 3L에 섞고 이 용액으로 유기층을 세척한 후, 물 3L로 3회 더 세척한다. 물 3L에 20 % 황산 7.5mL를 섞은 용액을 준비하고, 이 용액으로 유기층을 세척한 다음 물 3L로 3 회 더 세척한다. 41℃의 회전 증발기로 에틸아세테이트를 증발시킨다. 2.6L의 뜨거운 이소프로필 알코올에 오일을 녹이고, 약 1시간에 걸쳐 부분적으로 헥산 7.5L를 첨가하고 침전물이 생성될 때까지 교반한다. 침전된 Boc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl)를 여과하고, 헥산/IPA 혼합액(4.2/0.8) 5L로 2번 세척한다. 자연 건조시킨다. 산출량 1,300g.

생성된 Boc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl)를 5L의 에탄올로 용해해서 6L 용액을 만든다. 용액을 수소화 반응기로 옮긴다. 물 1.5L로 현탁된 탄소에 팔라듐 50g을 추가한다. 수소화 이전에 니트로겐으로 반응기를 청소한다. 반응기를 수소로 2kgf/cm²로 가압하고 재순환 펌프를 시동한다. 재순환으로 인해 가열 작용이 발생하는데, 온도를 43℃ 이하로 유지한다. 3시간 후에 TLC 통제한다. 촉매를 여과하고, 다이어프램 펌프 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전 증발기로 여과액을 증발시킨다. DMF 2L에 용해하고, 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전 증발기로 1L를 증발시킨다. DMF 1L와 에틸아세테이트 3.5L를 추가한 다음, 에틸아세테이트 0.5L와 DMF 0.3L에 니트로페놀 용액 310g을 추가한다. -18℃로 냉각한다. 에틸아세테이트 0.8L와 DMF 0.4L에 DCC 용액 470g을 준비한다. -18℃로 냉각한다. 열평형 후 두 용액을 혼합하고 상온에서 24시간 동안 그대로 둔다. 침전된 요소를 여과하고 에틸아세테이트 2L로 2회 세척한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태로, 그런 다음 41℃의 회전식 베인 펌프 진공 상태에서 회전 증발기로 여과액을 증발시킨다. 뜨거운 이소프로판올과 헥산에서 침전된 오일을 Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP 0.6mol 당 이소프로판올 0.8L과 헥산 0.4L 비율로 결정화하여 침전물이 생성될 때까지 교반한다. Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP 침전물을 여과하고, 헥산/이소프로패놀 혼합물(1/2) 5L로 2회 세척한다. 산출량 1,170g.

DMF1.2L에 Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP 530g을 용해하고, 수조로 냉각하는 상태에서 용해액을 계산된 양의 H-Phe-Leu-Arg (1/1) 용액에 추가한다. 2시간 동안 교반한다. 회전식 베인 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전증발기로 DMF를 증발시킨다. 오일을 뜨거운 이소프로판올 3.2L에 용해하고, 교반하면서 뜨거운 헥산 4.5L을 조금씩 첨가한다. 용액이 약 40-45℃로 냉각되면, 빙초산 110g을 추가한다. 2시간 동안 교반한다. 침전된 Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg를 여과하고, 헥산/이소프로판올 혼합액(2/1) 1.5L로 2번 세척한다. 자연 건조시킨다. 산출량 700g.

달라진 합성

얼음 수조에서 냉각하는 상태에서 Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg 100g을 TFA 180mL에 용해한다. 완전히 용해된 후, 1시간 동안 교반한다. 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 41℃의 회전증발기로 TFA를 증발시킨다. 디에틸에테르 1.5L로 잔여물을 혼합하고 여과한 후, 에테르로 3회 세척한다. 6시간 동안 다이어프램 펌프의 진공 상태에서 35℃로 건조한다. 산출량 95g.

예 2. 헥사펩타이드의 비강 조성물 제조

스프레이 형태의 달라진 함유 조성물 제조에는 달라진 용액 준비, 바이알 충전이 포함된다.

비강 조성물을 제조하기 위해 20-25℃의 온도에서 주사용 물 50mL에 헥사펩타이드 0.01-3g(용액의 조성에 따라 상이함)을 추가한다. 생성된 용액을 주사용 물과 합쳐 100mL로 만든다. 0.22μm 필터로 생성된 용액을 통과시켜 무균 조건에서 멤브레인 여과로 살균하고, 불활성 가스 보호층에서 폴리머 또는 유리 바이알에 채워 완제품을 담은 바이알을 밀봉한다.

또한, 조성물 제조 과정의 일부로 염화나트륨을 첨가할 수 있다. 이를 위해 20~25℃의 온도에서 염화나트륨 7~11g(용액 조성에 따라 상이함)을 주사용 물 50mL에 교반하면서 용해한다. 이후, 헥사펩타이드(용액 조성에 따라 상이함) 0.01-3g을 교반하면서 첨가한다. 생성된 용액을 주사용 물과 합쳐 100mL로 만든다. 0.22μm 필터로 생성된 용액을 통과시켜 무균 조건에서 멤브레인 여과로 살균하고, 불활성 가스 보호층에서 폴리머 또는 유리 바이알에 채워 완제품을 담은 바이알을 밀봉한다.

또한, 조성물 제조 공정의 일부로 염화 벤즈알코늄을 첨가할 수 있다. 이를 위해, 20~25℃ 온도에서 염화나트륨 7-11g(용액 조성에 따라 상이함)과 염화 벤즈알코늄 0.1-0.2g을 주사용 정제수 50mL에 교반하면서 용해한다. 이후, 헥사펩타이드(용액 조성에 따라 상이함) 0.01-3g을 교반하면서 첨가한다. 생성된 용액을 정제수와 합쳐 100mL로 만든다. 0.22μm 필터로 생성된 용액을 통과시켜 무균 조건에서 멤브레인 여과로 살균하고, 불활성 가스 보호층에서 폴리머 또는 유리 바이알에 채워 완제품을 담은 바이알을 밀봉한다.

이 방법을 이용하여 (표 1)의 다음 조성의 제형을 생산할 수 있다.

이름	내용물, g/mL
헥사펩타이드(생리학적으로 허용되는 염분)	0.01-3
주사용 물	최대 100mL
이름	내용물, g/mL
헥사펩타이드(생리학적으로 허용되는 염분)	0.01-3
염화나트륨	7-11
주사용 물	최대 100mL
이름	내용물, g/mL
헥사펩타이드(생리학적으로 허용되는 염분)	0.01-3
염화나트륨	7-11
염화 벤즈알코늄	0.1-0.2
정제수	최대 100mL

항바이러스 및 면역 조절 제품으로서 달라진의 효능을 확인한 실험 결과는 다음과 같다. 본 예시에서 인용된 연구는 항바이러스 의약품, 면역 조절 약품 및 인터페론 유도제의 임상전 개발과 관련된 효과적인 절차 지침에 따라 설계 및 수행되었다(V.A. Zemskova, S.S. Zemskova, V.I. Domnich, V.I. Shabunina. 다양한 기원의 화농성 염증 질환의 차별화된 면역 요법의 작용 기전 // Prikladniye Informatsionniye Aspekty Meditsiny. - 2009. - Vol. 12. - №2. - p. 71-77).예 3. A형 인플루엔자/H1N1 바이러스의 참조 균주에 대한 헥사펩타이드의 항바이러스 활성에 대한 시험관 내 연구.MDCK 조직 배양 모델에서 A형 인플루엔자 바이러스/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1) 균주를 사용하여 아비돌에 대한 실험을 수행했다.

아비돌은 10.0μg/mL 농도에서 100% 억제 효과(유행 바이러스 균주의 번식 관련)를 나타냄에 따라, A형 인플루엔자 바이러스 감염 정도가 동일한 조건에서 약품의 항바이러스 효능을 비교하기 위해 해당 농도를 선택하였다.

또한, 각 약품에 대해 바이러스 번식을 50% 억제하는 농도(MIC50)를 계산했다.

치료	바이러스 재생 억제
치료	MIC50, μg/mL	10μg/mL에서 활성 (생존 세포 비율 (%))
아비돌	6.0	100
달라진	0.8	100

표 2에 제시된 데이터에서 두 물질 모두 A형 인플루엔자 바이러스/뉴 칼레도니아/20/99 (H1N1) 균주에 대해 높은 항바이러스 활성을 나타냄을 알 수 있으며, 헥사펩타이드는 매우 낮은 농도의 용액에서 낮은 MIC 값을 가지는 것을 알 수 있다. 예 4. 쥐의 폐렴 모델에서 A형 인플루엔자 바이러스에 대한 달라진의 항바이러스 효능 연구.

쥐(n = 40, BALB 암컷, 평균 체중 18-22g)를 에테르로 가볍게 마취한 후, A형 인플루엔자 바이러스/아이치/2/69(H3N2)를 비강 내 챌린지 투여하였다. 10 LD50을 포함하는 바이러스 용량은 미리 결정되었다. 이를 위해, 5-6 마리의 쥐 그룹에 요막액의 전체 바이러스 50μL와 10배 희석액 (10^-1 ~ 10^-6)을 챌린지 투여하였다. 데이터에 따르면, LD50은 바이러스의 10^-³ 희석량에 해당한다는 것을 보여준다. 추가로, 모든 동물에게 바이러스의 10배 치사량 중앙값 50μL로 챌린지 투여하였다.

아비돌이 활성 대조군으로 선택되었다. 다음 4개의 동물 그룹(각각 10 마리)이 무작위로 구성(무작위화에 의하여)되었다.

- 대조군 (식염수);

- 아비돌 투여 그룹;

- 근육 내 달라진 투여 그룹;

- 비강 내 달라진 투여 그룹.

달라진, 아비돌 및 위약 투여 계획: 챌린지 투여 24시간 및 1시간 전, 이후 5일 간 챌린지 투여 후 매 24 시간. 달라진은 1일 2mg/kg 용량으로 근육 내 또는 비강 내 투여되었다. 아비돌은 위관 (경구)을 통해 투여되었다.

달라진은 근육 내(0.5mL) 또는 비강 내(0.01mL) 투여 경로에 대한 권장 부피를 맞추기 위해 염화나트륨을 포함 또는 포함하지 않고, 예 2에서와 같이 필요한 농도로 희석된 약제학적 조성물로 투여되었다(의약품의 임상 연구에 대한 지침; 1 부. 모스크바. Grif i K, 2012. - 944 p).

처리군 및 대조군 동물은 매일 모니터링되었다. 챌린지 투여 후 3일, 5일 및 15일에 쥐의 체중을 측정하였다.

쥐들의 인플루엔자 유발 폐렴 모델에서 화합물의 화학 요법 활성은 1) 평균 수명 및 2) 시간 경과에 따른 체중 감소 (대조군과 비교)의 두 가지 기준에 따라 평가되었다.

쥐의 평균 수명은 MSD = f * (d -1)/n 공식을 사용하여 계산되었다. 여기서 f는 d일에 사망한 쥐의 개체수이다. 생존한 쥐도 f에 포함되며, 이 경우 d는 15이다. n은 그룹 내 쥐의 개체 수이다.

챌린지 투여 후 3일, 5일 및 15일에 쥐의 체중을 측정하였다. 체중 감소 또는 증가는 각 쥐들에 대해 별도로 계산되었으며, 백분율로 표시되었다. 투여 이전의 체중을 100%로 보았다. 평균 체중 감소 또는 증가백분율은 그룹 내 모든 쥐를 대상으로 계산되었다.

대조군에서는 챌린지 투여 후 5일째에 가장 체중 손실이 컸다. 테스트 약물을 투여받은 그룹에서 체중 감소는 두 대조군보다 통계적으로 유의하게 적었다. 아비돌 또는 달라진을 투여받은 그룹은 각자 시간이 지남에 따라 체중 감량에 큰 차이를 보이지 않았다.

대조군에서 쥐의 평균 수명은 8.5일로 가장 짧았다. 아비돌 또는 달라진으로 치료할 경우, 쥐의 평균 수명이 증가하여 11-14일로 늘어났다. 그러나 이 치료법을 통해 챌린지 후 생존하는 동물의 비율(위약 대비)을 증가시킬 수는 있었지만, 사망을 완전히 방지하지는 못했다 (표 3).

그룹	생존율	사망률 %	평균 수명
달라진 (IM, 2 mg/kg/일, n = 10)	9/10	10	14.0
달라진(비강 내, 2 mg/kg/일 n = 10)	8/10	20	12.5
아비돌(구강, 60 mg/kg/일, n = 10)	7/10	30	11.2
대조군(위약, n=10)	2/10	80	8.5

데이터에 따르면, 5일 간 달라진을 2mg/kg/일 용량으로 근육 내 또는 비강 내 투여할 경우, 인플루엔자 유발 폐렴으로 인한 쥐의 사망률이 감소하고 위약에 비해 체중 감소가 줄어든다. 달라진은 평균 수명과 생존율 증가 측면에서 아비돌에 비해 더 큰 효능을 보였다. 달라진의 근육 내 및 비강 내 투여는 항바이러스 활성 측면에서 유사한 결과를 보였다.예 5. 아데노 바이러스 감염에 대한 달라진의 항바이러스 효능에 대한 실험적 연구.

본 작업은 1998년 D.I. 이바노프스키 바이러스 연구소에서 조달하였고, 러시아 국방부 제48 중앙 연구소-컴퓨팅 센터 지점의 전문 컬렉션에 저장된 5형 아데노바이러스를 사용하여 수행되었다.

밀도가 200-250,000/mL인 HeLa 유형 배양물(자궁 경부 암종 세포)을 사용했다. 소 혈청 7.5% 및 2%를 각각 함유한 행크 용액 기반의 반합성 성장 배지를 사용했다. HeLa 세포의 48시간 단층 배양은 세포 당 0.01 TCID50의 용량으로 5형 아데노바이러스로 감염되었다. 단층 배양물은 이후 96시간 동안 37 ± 0.5℃에서 배양되었다.

약품의 항바이러스 효능은 HeLa 세포의 확립된 단층 배양에 바이러스를 적용한 후, HeLa 배양에서 바이러스의 세포 병원성 효과(CPE)를 억제함으로써 평가되었다.

시험 약물의 효능 기준은 CPE 검출률 및 억제 상수(Ki, %)이다. 억제 상수는 Ki = 100 · (Cc-Ct) / Cc 공식에 따라 계산되었으며, 여기서 Cc 및 Ct는 각각 대조 샘플 및 테스트 샘플에서 바이러스의 감염 역가이다.

100, 20, 10 μg/mL의 농도에서 세포 당 0.01 TCID50의 용량으로 단층 배양을 아데노 바이러스로 챌린지하기 24 시간 전에 달라진을 투여했을 때, 약품은 바이러스의 세포 변성 작용으로부터 세포를 거의 완벽하게 보호했다. 10μg/mL에서 약품의 보호 효능은 40.0%이었다. 달라진을 챌린지 24시간 이전 유지 배지에 투여했을 때, 약품의 보호 효능은 챌린지 2시간 이후 약물 투여에 비해 10-20 % 증가했다.

따라서 달라진의 적용은 단층 HeLa 배양에서 5형 아데노바이러스의 번식을 억제했으며, 그 결과 아데노 바이러스 감염에 대한 연구 약물의 항바이러스 효능을 확증했다 (표 4)

투여 요법	달라진 (정량, μg/ml)	CPE 감지율	CPE 억제(Ki, %)
챌린지 전 24시간	100.0	1/10	90.0
	20.0	4/10	60.0
	10.0	6/10	40.0
챌린지 후 2시간	100.0	2/10	80.0
	20.0	5/10	50.0
	10.0	8/10	20.0
대조군 (무치료)	-	10/10	-
중간 대조군	-	0/10	-

예 6. 쥐를 대상으로 달라진의 인터페론 유도 효과 연구모든 바이러스 감염에서 인터페론(INF)은 초기 사이토카인 반응의 일부로 생성된다. 인터페론은 리보솜이 바이러스 번식을 억제하는 바이러스 게놈의 전사 및 옮김을 억제하는 다수의 효소를 생성하도록 한다. 바이러스에 감염되어 변형된 세포는 NK 세포와 세포 독성 T 세포의 도움으로 제거되는 반면, IFN-α 및 IFN-β의 영향으로 인해 감염되지 않은 세포의 항바이러스 방어기제가 활성화된다. 이러한 이유로 내인성 인터페론의 무독성 유도제와 그 형성을 촉진하는 방법에 대한 검색은 의료 바이러스학에있어 주요 관심사이며 중요한 사항이다 ( 의약품의 임상 연구에 대한 지침; 1 부. 모스크바. Grif i K, 2012. - 944 p), ( I.E. Makarenko 외 실험 동물에 대한 의약품 투여의 가능한 경로 및 양 // Mezhdunarodny Vestnik Veterinarii. - 2013. - №3. - p. 78-84).

인터페론을 유도하는 활동을 하는 항바이러스 제품인 아비돌이 비교 약물로 선정되었다.

실험은 체중이 20-25g인 40 CBA x C57BI/6/수컷 쥐를 대상으로 실시되었다. 동물들은 무작위로 4개 그룹(각각 10 마리)로 구분되고, 2개의 활성 그룹(달라진 또는 아비돌 투여) 및 2개의 대조군으로 분류되었다. 한 대조군은 기준 INF 수준(실험 시작 전)을 결정하도록 설계되었으며, 다른 그룹은 위약(식염수) 투여 24시간 후 INF 수준을 결정하여 조건의 균일성을 보장하도록 설계되었다.

동물들은 20-22°C에서 자연스럽게 조명의 밝음과 어둠이 교차되며 방음 처리실 내의 우리에 수용되었으며, 사료와 물은 자유롭게 공급받을 수 있었다.

달라진은 1mg/kg의 용량으로 투여되었으며, 이는 인체 대상의 경우 5-6mg의 용량에 해당한다.

아비돌은 1% 전분 겔에 미리 혼합된 현탁액 형태로 위 내 투여되었다.

다중 실험을 위해 본페로니 보정을 사용하여 통계 분석을 수행했다.

약물 투여 24시간 이후, 쥐 혈장의 IFN-α 수치를 측정했다. 넴푸탈 마취 (60 mg / kg)하에 인터페론 측정을 위한 혈액을 심장에서 채취했다. 혈액 샘플을 2시간 동안 실온에 두어 응고를 유도했고, 혈장을 원심 분리를 통해 분리했으며, 풀링(풀 당 쥐 2마리) 및 동결한 후, 실험까지 -20°C에서 보관하였다. IFN 수준을 결정하기 위해 VeriKine™미국)에서 제조하여 시판하는 ELISA(효소 면역 분석법) 키트를 사용하였다. ELISA는 키트 제조업체의 설명서에서 권장하는 희석제를 사용하여 풀링된 혈청을 2배 희석한 후 수행되었다. 실험 샘플과 희석된 표준 물질을 플레이트에 이중으로 적용했다. 사용되는 고체상 면역 분석에서 분석물은 두 개의 결합 부위(에피토프)가 있는 항원 (Ag)이며, 인식제는 두 가지 유형의 단일 클론 항체(Ab)로 표시하였다(ELISA 샌드위치 기법). Ab의 한 유형은 고체상에 고정되고 액체상에 존재하는 분석물 분자의 한 에피토프에 결합하였으며, 두 번째 유형의 Ab는 비오틴 접합체에 존재하고 분석물 분자의 두번째 에피토프에 결합하였다. 스트렙타비딘과 결합된 양고추냉이 과산화효소가 지표 성분이다. 테트라메틸벤지딘(TMB)은 검출 시스템에서 기질로 사용되었다. 결합된 퍼옥시다아제의 활성은 450nm에서 UNIPLAN ™(Picon) 면역 측정 분석기로 측정되었다.

대조군은 위약 (식염수) 투여 전후에 IFN 수준의 차이가 없었다. IFN-α 수치의 수치적 (그러나 미미한) 증가치가 아비돌 투여 24시간 이후 분석을 위해 수집된 혈청 샘플에서 검출되었다.

한편, 도 1에서는 달라진 그룹은 대조군과 아비돌에 비해 상당한 양의 INF-α 생산을 보여주었다 (p <0.001).

예 7. 자연 살해(NK) 세포의 기능적 활동에 대한 달라진의 효과 평가.

자연 살해 세포는 CD3-CD16 + CD56 + 표현형을 가진 큰 입상 림프구로, 사전 감작없이 표적 세포를 인식하고 죽일 수 있으며, 이는 특히 항종양 면역 기능 및 세포내 기생충 감염의 경우에 중요하다.

NK 세포의 기능적 활성에 대한 시험관 내 달라진의 효과를 평가할 때, 이 세프들은 건강한 기증자(n= 20)의 말초 혈액 단핵 세포의 현탁액에서 확보되었다.

NK 세포의 기능적 활성은 방사선 분석법을 사용하여 세포 독성 반응(NK는 골수 모세포 및 림프 모세포 계통의 세포를 용해 가능)을 토대로 결정되었다. 이를 실행하기 위해, 10/mL 농도의 K-562 골수모세포 계통을 계대 배양 2일 후 세포 현탁액 3 μCi/mL에서 ³H-우리딘과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 배지 199에서 세포의 방사성 표지를 3회 세척했다.

세포 독성 반응은 둥근 바닥의 96-웰 플레이트에서 200μL 표본으로 수행되었다. 이를 위해, 100μL의 표지된 표적 세포와 기증자 말초 혈액 내 100μL의 단핵(이펙터) 세포를 각 희석에 대해 1:50 비율로 3회 혼합했다.

한 사례에서, 이펙터 세포와 표적 세포를 플레이트에 주입한 후, 달라진을 5·10^-8M (

0.036 μ/ 의 몰 농도로 첨가했다. 약물은 대조군 샘플에 추가되지 않았다. 방출된 표지를 확인하기 위해 동일한 양의 트리톤 X-100을 표적 세포에 추가했다. 이어서 플레이트를 37℃의 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양한 후, 내용물을 유리 섬유 필터로 옮기고 세척 및 건조한 후 섬광 액체가 담긴 바이알에 넣고 β입자 계수기를 사용하여 방사능을 측정했다. 세포 독성 지수(CI)는 CI = ((А-В)(C-B)100% 공식을 사용하여 결정되었으며, 여기서 A는 이펙터 세포가 있을 때 표적 세포의 방사능, B는 트리톤 X-100로 표적 세포 처리 후 잔류 방사능, C는 이펙터 세포가 없을 때 표적 세포의 방사능이다.

그림 2에 도시된 바와 같이, 실험 결과는 자연 살해 세포에 대한 달라진의 면역 잠재력을 나타낸다.

예 8. 식균 작용에 대한 달라진의 효과 연구

달라진은 현재 1-5mg [20]의 단일 용량 범위에서 사람이 사용할 수 있도록 승인되었으며, 쥐를 대상으로 용량을 재계산할 경우, 약 0.2-1mg/kg에 해당된다. 따라서, 쥐의 식세포성 복막 삼출물 세포에서 약물 효능을 평가하기 위해 0.2 mg/kg의 용량을 사용했다. 추가 관심 분야는 식세포의 기능적 활성에 대한 약물 투여 경로의 가능한 효과 연구였다.

현미경을 통해 약물의 면역 조절 활성을 관찰했다. 실험은 체중 18-22g의 수컷 BALB/c 쥐 60마리를 대상으로 수행되었다. 해당 쥐들은 각각 10마리씩 6개의 동등한 그룹으로 분류되었다. 2개의 그룹은 대조군 역할을 했다. 활성 요법 그룹은 달라진을 0.2 mg/kg의 단일 용량으로 근육 내 또는 비강 내 투여를 받았다. 연구 약물 투여 다음날 대식세포 및 호중구 추출 절차를 수행했다.

쥐에게 호중구 축적을 유발하는 화학 유인 물질로서 10% 펩톤 용액 3-4mL를 복강 내 주사를 했고, 2시간 후 클로로포름을 사용해서 안락사시켰다. 이후 무균 상태에서 부검되었다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 복강에서 나온 액체를 얻어 시험관에 넣고 1000rpm에서 10분 간 원심 분리를 수행했다. 이후 침전물을 재현탁하여 250만/mL의 호중구 농도를 달성했다.

대식세포를 추출하기 위해 펩톤 투여 3일 후에 쥐를 안락사시켰다. 이후 소의 태혈청 10%을 함유한 3-4 mL의 배지 199를 복강 내에 투여하고 액체를 흡인했다.

풀링된 쥐 혈청(37℃에서 10분)으로 사전 옵소닌화된 황색 포도상구균(단백질 A를 포함하지 않는 균주)을 동일한 부피의 식세포 현탁액에 10:1 비율 (즉, 2,500만/mL)로 첨가했다. 배양 후 도말을 준비했다(Romanovsky―Giemsa 염색)

호중구의 식세포 활성은 식세포 지수 및 식세포 수와 같은 매개 변수에 따라 평가되었다. 대식세포의 기능적 활성은 활성화 상태에서 NBT(니트로블루 테트라졸륨)를 흡수하는 능력과 더불어 현미경을 통해 평가되었다.

달라진(0.2 mg/kg)이 쥐에서 펩톤 동원된 호중구의 식세포 활성(식균작용)을 증가시킬 수 있다는 결과가 확인되었다. 투여 경로는 효능에 영향을 주지 않았다. 달라진은 또한 복막 삼출물 대식세포의 식균 작용에 대한 자극 효과를 나타내어 NBT 감소 능력을 향상시켰다. 투여 경로와 관련된 차이는 발견되지 않았다.(표 5)

호중구
그룹	식세포 지수	식세포 개수
대조군 (n = 10),	19.1 ± 0.45	2.25 ± 0.10
달라진 (IM, 0.2 mg/kg, n = 10)	32.43 ± 0.56*	3.01 ± 0.13*
달라진 (비강 0.2 mg/kg, n = 10)	31.87 ± 0.43*	2.93 ± 0.15*
대식세포
그룹	식세포 지수	식세포 활동(%)
대조군(n = 10)	55.2 ± 4.6	10.3 ± 0.7
달라진 (IM, 0.2 mg/kg, n = 10)	67.7 ± 6.1*	19.8 ± 1.2*
달라진 (비강 0.2 mg/kg, n = 10)	63.9 ± 5.7*	19.1 ± 1.1*

의견: * =유의 수준 p < 0.05 (대조군에 상대적)따라서, 달라진은 비특이적 면역의 식세포 성분에 자극 효과를 주는 것을 보여주었다.예 9. 전염증성 사이토카인 생성에 대한 달라진의 효과 연구.

사이토카인 IL-1 (인터루킨-1), IL-6 (인터루킨-6) 및 TNF-α (종양 괴사 인자 α)의 합성에 미치는 달라진의 효과 평가는 건강한 기증자(n = 20)의 말초 혈액 단핵 세포 배양을 사용한 시험관 내 실험을 통해 수행되었다. 전염증성 사이토카인의 생성을 유도하기 위해 장내 세균성 다당류에 의한 자극이 사용되었다.

단핵 세포의 현탁액을 얻기 위해 혈액을 배지 199로 1:2 비율로 희석하고, 피콜(Ficoll-Paque) 밀도 구배(d = 1.077g/cm³)에 적용한 후, 400g에서 40분 동안 원심 분리했다. 상 경계면에서 생성되어 단핵 세포를 포함하는 백색 고리를 파스퇴르 피펫으로 주의해서 흡인하고, 10분 간 원심 분리(200g)를 사용하여 배지 199로 2회 세척했다. 침전물을 영양 배지에 재현탁하고 고르야예프(Goryayev) 계수 챔버에서 계수하고 필요한 농도로 조정했다.

달라진은 5 · 10^-8M (

0.036 μ의 몰 농도로 다당류 및 단핵 세포 현탁액이 있는 테스트 샘플에 첨가되었다. 약물은 대조군 샘플에 추가되지 않았다.

2-사이트 ELISA를 사용하여 혈청 내 사이토카인을 정량 측정했다.

그림 3에 제시된 결과에서 달라진에 의한 IL-6, IL-1 및 TNF-α의 리포 다당류 유도 생산이 현저하게 억제된다는 것이 확인되었다. 전염증성 사이토카인의 생성 정도는 대조군 샘플의 농도에 대한 비율로 표시되었으며, 이는 100%로 간주되었다.

따라서, 시험 헥사펩타이드가 항바이러스 및 면역 조절 특성을 나타낸다는 점에 유의해야 한다. 헥사펩타이드는 선천성 및 적응성 면역 세포의 활동을 조절한다. 달라진은 면역의 식세포 성분(대식세포 및 호중구) 활동과 자연 살해 세포의 활동을 향상시킨다. 이 제품은 내인성 인터페론의 생성 역시 자극한다.

또한, 달라진은 전염증성 사이토카인(IL-1, IL-6 및 TNF-α)의 과분비를 억제하여 중독을 줄이고 염증성 캐스케이드의 기타 증상을 억제할 수 있다.

따라서, 약제학적 조성물은 달라진을 2mg/kg/일의 용량으로 비강 내 투여한 쥐를 대상으로 한 실험에서 항바이러스 활성을 나타냈으며, 이는 사람의 경우 1일 10mg 용량에 해당한다.

인간 대상 단일 비강 내 투여 용액 용량은 콧구멍 당 1-2방울(총 2-4 방울)이며, 부피는 0.1-0.2mL에 해당된다.

수행된 실험을 통해 비강 내 투여용 약제학적 조성물의 인간 등가 농도는 0.01-30 mg/mL (0.01-3%의 달라진 용액)라는 결론을 내릴 수 있다.

비강 내 투여시, 조성물은 근육 내 투여에 필적하는 항바이러스 및 면역 조절 효과를 나타내며, 이는 특히 임상 적용과 관련이 있다.

이상, 바람직한 실시예를 통하여 본 발명에 관하여 상세히 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니며, 특허청구범위 내에서 다양하게 실시될 수 있다.

Claims

급성 호흡기 바이러스 질환(ARVI)의 치료를 위한 헥사펩타이드티로실--D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약 상 허용되는 염분을 함유하는 비강 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 급성 호흡기 바이러스 질환(ARVI)은, 인플루엔자 질환과 관련되는,
비강 의약 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제약 상 허용되는 염분은, 티로실 -D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 디아세테이트인,
비강 의약 조성물.
제1항에 있어서,
비강 조성물이 활성 성분으로서 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분을 0.01% - 3% 중량 백분율로 함유하고 나머지 보조 첨가제로 구성된 스프레이 형태로 제조되는,
비강 의약 조성물.
제4항에 있어서,
조성물이 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 분 및 첨가제를 헥사펩타이드: 0.01-3%, 나머지는 물의 중량 백분율로 함유하는,
비강 의약 조성물.
제4항에 있어서,
조성물이 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분 및 첨가제를 헥사펩타이드 0.01-3%, 염화나트륨 7-11%, 나머지는 물의 량 백분율로 함유하는,
비강 의약 조성물.
제6항에 있어서,
조성물이 헥사펩타이드티로실-D-알라닐-글리실-페닐알라닐-류실-아르기닌 또는 그의 제약상 허용되는 염분 및 첨가제를 헥사펩타이드 0.01-3%, 염화나트륨 7-11%, 염화벤즈알코늄 0.1-0.2 %, 나머지는 물의 중량 백분율로 함유하는,
비강 의약 조성물.
제1항에 있어서,
조성물은 부형제로서 염화나트륨 및 물을 염화나트륨 9%, 물 90%의 질량 백분율로 함유하는,
비강 의약 조성물.
제5 내지 8항에 있어서,
조성물이 물로서 주사용 또는 정제수를 함유하는,
비강 의약 조성물.