CN110381995A - 治疗复发-缓解病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于急性治疗复发‑缓解病症的方法，该方法包括响应于复发或在复发期间给予有需要的受试者一个或多个剂量的有效量的如权利要求1定义的肽分子的步骤，其中该方法导致所述病症缓解。

Description

治疗复发-缓解病症的方法
本发明涉及急性治疗复发-缓解病症的方法，特别是使用源自结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis)衍生的多肽伴侣蛋白60.1的肽的方法，和用于这样的方法的肽分子和药物组合物。
热休克多肽是一个存在于所有生物体中的分子家族，其功能是帮助生物分子的生物加工和稳定性(Zugel & Kauffman (1999) Role of heat shock polypeptides inprotection from and pathogenesis of infectious diseases. Clin. Microbiol.Rev. (12)1: 19-39; Ranford et al. (2000) Chaperonins are cell signallingpolypeptides: - the unfolding biology of molecular chaperones. Exp. Rev. Mol.Med., 9月15日, www.ermn.cbcu.cam.ac.uk/)。
结核分枝杆菌(M. tuberculosis)产生伴侣蛋白60.1 (Cpn60.1)，一种根据其与其它已知伴侣蛋白的氨基酸序列同一性命名的多肽。进一步的结核分枝杆菌伴侣蛋白多肽是伴侣蛋白10 (Cpn10)和伴侣蛋白60.2 (Cpn60.2)。Cpn60.2显示出与Cpn60.1的59.6%氨基酸序列同一性，和CpN 10显示出与Cpn60.1的65.6%核酸序列同一性。
国际专利申请公布号WO02/040037公开了包含来自结核分枝杆菌的Cpn60.1(MtCpn60.1)及其编码核酸分子的药物组合物。该申请还公开了许多可从全长多肽衍生的特定肽片段。还公开了这些分子的多种治疗用途，包括治疗和/或预防自身免疫性疾病、过敏性病症、以Th2-型免疫反应为典型的病症以及与嗜酸性粒细胞增多有关的病症。
国际专利申请公布号WO2009/106819公开了一系列可从MtCpn60.1衍生的新肽，包括具有以下氨基酸序列的肽(称为“肽4”)：DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID:NO:1)。肽4显示出抗炎活性，并已被证明显著减少过敏性气道炎症动物模型中嗜酸性粒细胞的募集。
另一项专利申请公开了SEQ ID: NO 1的某些子片段，其显示出改进的生物活性，特别是抑制白细胞渗出的能力。所述肽由于其相对短的氨基酸链长度(使其易于以高收率制备和分离)，特别适合作为药物开发。
然而，现有技术仅公开了这样的肽在炎性病症的慢性疗法中的应用。这样的疗法需要持续给予所述肽并维持该肽在血浆中可检测的水平，以达到治疗效果。这意味着患者需要长时间给予肽，没有任何暂缓期，这提供依从性问题的增加的可能性，并增加了患者的药物负担。因此，对急性疗法存在需要，这种疗法可以在病症发生时或在病症复发期间给予，引起缓解，但不需要进一步继续给药以维持缓解。本发明基于意想不到的观察，即与以前保持的惯例不同，可间歇性地给予伴侣蛋白肽以获得治疗效果，例如抗炎效果。观察到的效果被认为是“疾病改善”至在单独给予所需的肽后，疾病症状被最小化的程度。
因此，在第一个方面，本发明提供一种用于急性治疗复发-缓解病症的方法，该方法包括响应于复发或在复发期间给予有需要的受试者一个或多个剂量的有效量的肽分子的步骤，所述肽分子包含选自组(i)-(xv)之一的氨基酸序列或由其组成：
(i) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1)；
(ii) XHGLNVNTLSYGD (SEQ ID NO: 2)
其中X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基；或其包含ii(i)-ii(iii)的一个或多个的变体；
ii(i) 一个或多个氨基酸残基呈D构象，
ii(ii) GLNVNTLSYGD被倒置，或
ii(iii) 羧基端氨基酸残基被转化为伯羧酰胺基；
(iii) DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO: 3)；
(iv) SELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 4)；
(v) SELPAGHGLNVNTLS (SEQ ID NO: 5)；
(vi) PAGHGLNVNTLS-NH2 (SEQ ID NO: 6)；
(vii) VVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 7)；
(viii) NKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 8)；
(ix) PAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 9)；
(x) HGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 10)；
(xi) DGSVVVNKVSELPAGH (SEQ ID NO: 11)；
(xii) GLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 12)；
(xiii) DGSVVVNKVS (SEQ ID NO: 13)；
(xiv) NTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 14)；和
(xv) 多肽序列，其与(i)-(xiv)中的任何一个具有超过85%或90%或95%同一性，且其功能相当于(i)-(xiv)中的任何一个；
其中该方法导致所述病症缓解。
本发明涉及一种用于急性治疗复发-缓解病症的方法。本发明人惊奇地发现，可给予一个或多个初始剂量以提供长期的治疗效果，而不需要连续或长期定期给予治疗剂。本发明的方法引起疾病改善。据认为，本发明的药剂改善了潜在的疾病或病症，而不是简单地治疗疾病或病症的症状。本发明的肽是疾病改善剂，即它们是提供持续超过其药代动力学覆盖范围的治疗益处的药剂。术语“疾病改善剂”最初用于治疗类风湿性关节炎的药剂(疾病改善抗风湿药物，所谓的“DMARD”)的情况。然而，“疾病改善”现在医学和医药科学中得到了更广泛应用，而不仅仅适用于类风湿性关节炎。更确切地说，技术人员意识到，疾病改善是一个在治疗一系列病症的情况下使用的术语。例如，疾病改善也与治疗哮喘相关而使用。例如，Lancet Respiratory Medicine,“Clinical trial research in focus: do trialsprepare us to deliver precision medicine in those with severe asthma”,Brightling (2017), Vol 5 2017年2月, 92-95作为重要发现列出了“对哮喘的新治疗需要更有期望以达到完全的疾病缓解、疾病改善和治愈”。此外，Lancet Commission:“Afterasthma: redefining airways diseases”, Ian D Pavord et al, 2017年9月11日,S0140-6736(17)30879-6列出7项建议中的一个以“越过基于疾病控制的哮喘治疗方法·将资源指向初级预防策略(哮喘预防)和疾病改善干预(哮喘治愈)。
如本文所用的“治疗”指相对于治疗前的症状，减轻、缓和或消除正在治疗的病症的一种或多种症状。术语“急性治疗”被用来指肽在病症发生时或在病症复发期间给予，但不一定连续给予肽。特别是，在病症缓解期间，可能没有必要给予该肽。因此，根据本发明的“急性治疗”可以与用于治疗复发-缓解病症的已知方法区分开来，所述方法提供需要连续、长期地给予药物而没有任何治疗中断的慢性疗法。提供急性治疗为患者提供明显的益处。由于本发明的肽只需在短时间内给予，副作用，例如注射部位反应减少。此外，在缓解期间，患者享受改善的生活方式，不需要记住剂量方案。
不受理论的束缚，要理解，本发明的肽不仅影响病症或疾病的症状，而且它们还能改善潜在的病症或疾病本身。因此，本发明的肽的给予具有长期的效果。
在一个实施方案中，病症的缓解得到维持，而不需要给予更多剂量的肽。应该注意到，急性治疗可能包括在病症发生时或在病症复发期间给予一个或多个剂量的有效量的肽分子。在某些情况下，在缓解期内可能需要给予一个或多个剂量的肽。然而，不需要连续给予有效量的肽。优选地，在缓解期间不需要给予更多的剂量。
在特别优选的实施方案中，单剂量的肽分子被给予受试者。
在另一个实施方案中，两个或更多个剂量(优选3个剂量)在短时间内，例如在1天、3天、28天、56天或112天时间内给予。给予受试者的剂量间隔时间可为前一剂量后3小时、1天、14天、28天或56天。
缓解通常包括减轻、缓和或消除病症的一种或多种症状。典型地，缓解或临床缓解包括没有与复发-缓解疾病相关的症状的时间段或与疾病相关的症状在严重程度和/或数量上降低的时间段。与病症、疾病或障碍相关的症状包括与疾病或障碍相关的任何临床或实验室表现。因此，临床缓解可以由例如临床医生和研究人员根据相关的量表或缓解指标来测量，所述量表或缓解指标对于每种疾病都是不同的，并且是医学领域众所周知的。反过来说，病症的复发可以被定义为该病症的一种或多种症状的增加或出现。应该理解，待减轻、缓和或消除的症状取决于要治疗的特定的复发-缓解病症。例如，哮喘的症状可能是呼吸短促；呼吸困难；胸闷；咳嗽；肺活量下降；由呼吸短促、咳嗽或喘息引起的睡眠困难；在吸入、咳嗽或喘息发作时发出的呼啸声或喘息声，这些症状因呼吸道病毒例如感冒或流感而恶化。此外，症状可能包括住院、失去工作/上学、或死亡。
一种或多种症状的减轻或消除通常是一种或多种症状的显著减轻或消除，如由医生所确定的。复发-缓解病症的症状可以用众所周知的诊断测试来测量和量化。例如，肺功能测试，如肺活量测定和乙酰甲胆碱攻击测试，可被用来采用ACQ评分来量化哮喘的症状。ACQ是一个简单的问卷，用来测量哮喘控制的充分性和哮喘控制的变化(其自发或作为治疗的结果而发生)。ACQ具有评估症状的多维结构(5项-自给予)和救护支气管扩张药使用(1项-自给予)，和由临床工作人员完成的1分钟用力呼气量(FEV1) (1项) (Juniper EF, O'Byrne PM, Guyatt GH, Ferrie PJ, King DR. Development and validation of aquestionnaire to measure asthma control. Eur Respir J 1999; 14: 902-907)。
除了提供缓解的临床定义外，还可能定义缓解的生物学或机制定义。在特别优选的实施方案中，病症与嗜酸性粒细胞增多和/或中性粒细胞增多有关。在该情况下，缓解包括相对于未给予肽分子的对照受试者，运送到人类或动物受试者的炎症部位的中性粒细胞数量和/或嗜酸性粒细胞数量的显著减少。如果病症是肺部病症，缓解包括募集到肺部或在循环系统内发现的中性粒细胞数量和/或嗜酸性粒细胞数量的显著减少。
缓解还可能与相对于对照受试者，人受试者中淋巴细胞数量的显著减少或巨噬细胞数量的显著增加相关。缓解可能进一步与相对于对照受试者，人受试者中一种或多种炎性标记物例如细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10或IL-13的量的显著变化相关。缓解可包括相对于对照受试者，在人受试者中IL-10的量的显著增加。缓解可包括相对于对照受试者，在人受试者中IL-4、IL-5或IL-13的量的显著减少。
复发-缓解病症是具有一个或多个复发期的任何病症，其中每一次复发之后都有一段缓解期。
在这些无症状期或缓解期中，患者不需要可量化的循环水平的治疗肽。在一个优选的实施方案中，当血浆肽浓度低于定量下限时，缓解维持。该定量限可取决于所采用的检测方法而不同。通常，在循环水平小于40 ng/mL (例如小于30 ng/mL或20 ng/mL)时，无法检测到血浆肽浓度。测定血浆肽浓度的典型方法是高分辨率精确质量(HRAM) LC-MS/MS。
在一个优选的实施方案中，病症的缓解期为在无法检测到受试者血浆中肽分子浓度后至少7天，例如14天，至少28天，更优选地至少6个月。
在另一个实施方案中，病症的缓解期为在给予最后剂量的肽后至少7天，任选地至少14天，任选地至少28天，任选地至少6个月。
典型地，复发-缓解病症是炎性病症。优选地，病症选自哮喘、克罗恩氏病、过敏性炎性病症例如特应性皮炎和鼻炎、类风湿性关节炎和炎性肠病。
本发明的肽分子的一个重要优点是，它们是具有中性粒细胞组分的病症的有效治疗，所述病症例如严重哮喘、囊性纤维化、支气管扩张(包括非-CF)、肺动脉高压、肺纤维化和急性呼吸窘迫综合征炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病和COPD。此外，中性粒细胞驱动的疾病可包括哮喘、痛风发作、肾小球肾炎、风湿热、胶原蛋白血管疾病和超敏反应和代谢性疾病，如糖尿病酮症酸中毒、先兆子痫和尿毒症，尤其是尿毒性心包炎。中性粒细胞驱动的胶原蛋白病、高歇氏病、库欣综合征、骨髓纤维化、肿瘤性中性粒细胞增多、真性红细胞增多症、银屑病、炎性肠病。其他实例包括韦格纳血管炎、囊性纤维化、斯耶格伦综合征、慢性移植排斥、1型糖尿病移植物抗宿主疾病、甲状腺炎、脊椎关节病、强直性脊柱炎、葡萄膜炎和多软骨炎或硬皮病。
在备选的实施方案中，本发明提供了在复发-缓解病症为自身免疫性疾病时，在此定义的肽的用途。可以用本发明的肽分子预防和/或治疗的自身免疫性疾病的例子包括自身免疫性疾病，例如溶血性贫血、血小板减少症、恶性贫血、阿狄森氏病、自身免疫性糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、自身免疫性脑炎、结缔组织病、多发性硬化症(包括复发性多发性硬化症)、自身免疫性肺部炎症、格林-巴利综合征、自身免疫性甲状腺炎、移植物抗宿主病和自身免疫性炎性眼病。优选的自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
在备选的实施方案中，本发明提供了如本文定义的肽用于缓解过敏性病症的用途。用本发明的肽分子治疗可改善或进行缓解的过敏性病症和障碍的例子包括湿疹、特应性皮炎、变应性鼻炎(枯草热)、过敏性气道疾病、高嗜酸粒细胞综合征；以嗜酸性气道炎症和气道高反应性为特征的呼吸道疾病，如哮喘，包括过敏性哮喘和内源性哮喘、过敏性支气管肺曲霉病、嗜酸粒细胞肺炎、过敏性支气管炎支气管扩张症、间质性肺病、高嗜酸粒细胞综合征、荨麻疹、血管水肿、多形性红斑、史蒂文斯-约翰逊综合征、过敏性结膜炎，特应性角膜结膜炎、性病性角膜结膜炎和巨大乳头状结膜炎。优选的过敏性障碍和病症包括哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎。在另一个方面，病症包括过敏性病症(包括哮喘)的病毒性恶化。在另一个方面，病症涉及与细菌感染相关的恶化。
优选地，缓解包括在一个时间段内减轻、缓和或消除病症的一种或多种症状，所述时间段明显超过了肽的血浆药代动力学半衰期。这通常意味着疾病严重程度在一个时间段内显著降低，所述时间段明显超过了肽治疗剂的血浆药代动力学半衰期。
根据本发明，当患者还被给予一种或多种治疗剂，或所述肽与一种或多种治疗剂联合提供时，可使用该肽。治疗剂可选自，但不限于疾病改善剂，包括生物免疫调节剂、镇痛剂、支气管扩张剂、抗炎药、抗过敏药、变应原免疫治疗剂、抗病毒药、抗生素、抗体、类固醇和根据本发明常用于治疗复发-缓解病症的药物。
疾病改善剂包括例如羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、甲氨蝶呤和米诺环素，以及靶向TNFα的生物制剂，例如阿巴西普(abatacept)、阿达木单抗、依那西普、英利昔单抗和戈利木单抗，或免疫调节剂，例如阿仑单抗(alemtuzumab)、干扰素β-1b、β-干扰素-1a富马酸二甲酯、copaxone、那他珠单抗(natalizumab)和特立氟胺(teriflunomide)。镇痛剂包括扑热息痛、非甾体抗炎药例如布洛芬和阿司匹林、可待因、曲马多、吗啡、阿米替林、加巴喷丁和阿片类药物。
抗炎药包括白三烯受体拮抗剂、茶碱、选择性PDE4抑制剂如罗氟司特、双PDE3/4抑制剂如RPL 554，低、中和高剂量皮质类固醇，经吸入、皮下、肌肉内、舌下、静脉内和口服给予。抗病毒药包括奥司他韦(oseltamivir)。抗生素包括阿莫西林。抗体包括抗-IgE抗体(如omaluzimab)、改变细胞因子信号传导的抗体(如抗-IL-5mab mepoluzimab)。类固醇包括丙酸氟替卡松和富马酸氟替卡松、二丙酸倍氯米松、布地奈德、环索奈德(ciclesonide)、氟尼缩松和莫米松。当从皮质类固醇、抗白三烯、细胞因子单克隆抗体或茶碱中选择另外一种或多种治疗剂时，根据本发明的用途可能是优选的。当另外的药剂是支气管扩张药时，用途也可能是优选的。优选的支气管扩张药包括，短效B2激动剂如沙丁胺醇，长效B2激动剂如沙美特罗、福莫特罗、奥达特罗(olodaterol)和维兰特罗(vilanterol)，短效毒蕈碱受体拮抗剂如异丙托溴铵，和长效毒蕈碱受体拮抗剂，如溴化吖啶(aclidinum bromide)、噻托溴铵和格隆溴铵。
本发明的肽是以化学或重组方式合成的，和与全长伴侣蛋白60.1具有许多不同的化学、结构和功能性质。
所谓“功能等效的”肽是指具有与所定义的氨基酸序列(i)-(xiv)中的一个或多个所显示的或归属于其的任何功能相同或基本上相似的功能(如生物活性)的任何肽和/或其变体或片段。例如，由(i)中定义的氨基酸序列组成的肽减少免疫细胞(例如嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞)向炎症部位的转运，允许其用于预防和/或治疗各种疾病和障碍，包括哮喘、类风湿性关节炎和炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。关于特定生物活性的功能等效性可以用传统的模型和方法来测量；例如，通过测量炎症原诱导的免疫细胞，如嗜酸性粒细胞或中性粒细胞，在致敏(炎症原-卵清蛋白/室内尘螨)或幼稚(naïve) (炎症原-LPS)动物中的肺流入量。
肽的氨基酸序列可与上述序列(i)-(xiv)具有80%或更多，90%或更多，或95%或更多的同一性。这些利用例如重组DNA技术产生的肽分子可能因氨基酸插入、缺失和替换而不同。可以通过将特定多肽的序列与同源肽的序列进行比较，尽量减少在高同源区(保守区域)中发生的氨基酸序列变化的数目，或者通过用共有序列替换氨基酸，找到确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加或缺失而不消除感兴趣的活性的指导。
另外，编码这些相同或相似多肽的重组变体可以通过利用遗传密码中的"冗余"来合成或选择。可以引入各种密码子替换，例如产生不同限制性位点的沉默变化，以优化到质粒或病毒载体中的克隆或在特定原核或真核系统中的表达。多核苷酸序列的突变可以反映在多肽或添加到多肽以改变多肽的任何部分的性质的其它肽的结构域中，以改变特征例如配体结合亲和性、链间亲和性或降解/周转率。
优选地，氨基酸"替换"是一个氨基酸用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替代的结果，即保守的氨基酸替代。"保守的"氨基酸替换可以根据所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"优选地是在约1-10个氨基酸的范围内，更优选是1-5个氨基酸，如1、2、3、4或5个氨基酸。允许的变异可以通过使用重组DNA技术或合成技术如固相合成，系统地在多肽分子中插入、缺失或替换氨基酸，并测定产生的重组变体的生物活性，经实验确定。
或者，在需要改变功能的情况下，插入、缺失或非-保守性的改变可以被设计以产生改变的多肽。例如，这样的改变可以改变本发明的多肽的一个或多个生物功能或生化特性。例如，这样的改变可改变多肽的特性，如配体结合亲和性、链间亲和性或降解/周转率。此外，可以选择此类改变，以便产生更适合于合成生产或在选择用于表达的宿主细胞中表达、规模放大等的多肽。
本发明还包括能够显示出生物活性的本发明的肽的片段。这样的片段可呈线性形式，或者它们可用已知的方法环化，例如，如在H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology10, 773-778 (1992)和在R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992)中所述，这两篇文献通过引用并入本文。这样的片段可与载体分子(如免疫球蛋白)融合，用于许多目的，包括增加蛋白质结合位点的价位。
所谓“同一性”是指在比对序列和引入空位之后，如果需要的话，达到最大的百分比序列同一性，并且不考虑任何保守的替换作为序列同一性的一部分，候选序列中与感兴趣序列的氨基酸残基或核酸残基相同的氨基酸残基或核酸残基的数目或百分比(取决于结果的表示)。
两个多核苷酸或多肽之间的百分比序列同一性可以使用合适的计算机程序来确定，例如University of Wisconsin Genetic Computing Group的GAP程序，并且应该意识到，相对于其序列被最优比对的多肽，计算百分比同一性。比对也可以使用Clustal W程序进行(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)。使用的参数可如下列出：快速成对比对参数：K-数组(字)大小：1，窗口大小：5，空位罚分：3，顶部对角线数：5。得分方法：x%；多重比对参数：空位打开罚分：10，空位扩展罚分：0.05。评分矩阵：BLOSUM。
序列同一性可例如采用Jotun Hein方法测定(Hein, J. (1990) MethodsEnzymol. 183:626-645)。序列之间的同一性也可以通过本领域已知的其它方法，如通过不同的杂交条件来确定。
本发明的肽可使用本领域已知的常规方法制备和/或分离。例如，采用传统方法进行液相或固相合成，或使用固相自动合成仪，例如如在I. Coin, Nature Protocols,2007, 2, 3247-3256中所述。优选地，本发明的肽采用类似于G.B. Fields and R.L.Noble, Int. J. Peptide Protein Res., 1990, 35(3), 161-214中描述的方法，通过FMOC固相合成制备。
在该方法优选的实施方案中，肽分子由选自组(a)-(s)之一的氨基酸序列组成：
(a) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1)；
(b) XHGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 15)；
(c) XdGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO: 16)；
(d) XhGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO: 17)；
(e) hGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO: 18)；
(f) HGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO: 19)；
(g) hGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 20)；
(h) DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO: 3)；
(i) SELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 4)；
(j) SELPAGHGLNVNTLS (SEQ ID NO: 5)；
(k) PAGHGLNVNTLS-NH2 (SEQ ID NO: 6)；
(l) VVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 7)；
(m) NKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 8)；
(n) PAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 9)；
(o) HGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 10)；
(p) DGSVVVNKVSELPAGH (SEQ ID NO: 11)；
(q) GLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 12)；
(r) DGSVVVNKVS (SEQ ID NO: 13)；和
(s) NTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 14)；
其中大写字母表示L-氨基酸残基，小写字母表示D-氨基酸残基，X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基。
氨基酸和肽衍生物的命名符合IUPAC-IUB规则(J. Peptide Sci. 1999, 5, 465- 471)。D-氨基酸由小写字母缩写指明，如Ala或A表示L-丙氨酸，ala或a表示D-丙氨酸。
本发明的肽优选地由从5到50、5至40个氨基酸残基，优选5至35，或5至20个氨基酸残基组成。
在特别优选的实施方案中，所述肽包含氨基酸序列DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1)。肽长度优选地少于50个氨基酸残基，最优选地长度少于40个残基。在特别优选的实施方案中，肽由31个氨基酸残基SEQ IDNO: 1组成。
在一个优选的实施方案中，分离或重组肽分子由氨基酸序列HGLNVNTLSYGD-NH2(SEQ ID NO: 21)或其功能等效的片段或变体组成。
在一个优选的实施方案中，分离或重组肽分子由氨基酸序列bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 22)或其功能等效的片段或变体组成。
在另一个优选的实施方案中，分离或重组肽分子由氨基酸序列Ac-dGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO: 23)、Ac-hGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO: 24)或其功能等效的片段或变体组成。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供一种由氨基酸序列hGLNVNTLSYGd-NH2(SEQ ID NO: 18)或其功能等效的片段或变体组成的分离或重组肽分子。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种由氨基酸序列HGLNVNTLSYGd-NH2(SEQ ID NO: 19)或其功能等效的片段或变体组成的分离或重组肽分子。
在进一步优选的实施方案中，提供由氨基酸序列hGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO:20)或其功能等效的片段或变体组成的分离或重组肽分子。
在另一个优选的实施方案中，提供由氨基酸序列DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO:3)或其功能等效的片段或变体组成的分离或重组肽分子。
在进一步的方面，本发明提供用于如上定义的方法中的如上定义的肽分子。
复发-缓解病症可以是自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎或炎性肠病(IBD)。
本发明的肽分子和药物组合物可通过“Trojan肽”引入细胞。这些是一类称为穿透蛋白(penetratins)的多肽，其具有改变位置的性质，并且能够携带亲水性化合物跨越质膜。该系统允许低聚肽直接靶向细胞质和细胞核，并且可能是非细胞类型特异性的，而且效率很高。见Derossi et al. (1998), Trends Cell Biol 8, 84-87。
要理解，本发明所用的化合物包括盐。代谢物和前药也包括在内。本发明所用的化合物还包括任何同位素衍生物。
在此描述的化合物可以用任何方便的方式来配制以供给药。本发明提供一种包含如上所定义的肽分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，用于如上所定义的方法。
本发明的肽可用于人类或非-人动物，通常为哺乳动物。
任何适当的给药途径都可使用。例如，口服、局部、胃肠外、眼、直肠、阴道、吸入、含服、舌下和鼻内递送途径的任何一种都可能是合适的。
用于胃肠外给予的药物组合物可能是优选的。本发明的肽分子和药物组合物可经胃肠外给予，例如静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、室内、胸骨内、颅内、肌肉内或皮下，或它们可通过输注技术给予。它们最好以无菌水溶液的形式使用，这种水溶液可含有其它物质，例如，足够的盐或葡萄糖，以使溶液与血液等渗。如有必要，应适当缓冲所述水溶液(优选从3至9的pH)。在无菌条件下制备合适的胃肠外制剂通过标准的制药技术很容易地完成，这些技术对本领域技术人员来说是众所周知的。皮下给药可能是优选的。
适合于胃肠外给予的药物和药物组合物包括水性和非水性无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预定的接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含助悬剂和增稠剂。药物和组合物可以在单位剂量或多剂量容器中提供，例如密封安瓿和小瓶，和可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在临用前添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射液和悬浮液可由之前所述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
本发明的分子、药物和药物组合物也可以通过鼻内或吸入方式给予，并且可以方便地例如以干粉吸入剂或使用适当的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃例如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA227EA)、二氧化碳或其它适当气体从加压容器、泵、喷雾器或雾化器中提供的气雾喷雾剂的形式递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可通过提供一个递送计量的量的阀门来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可含有活性剂的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可能还含有润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。可配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如从明胶制成)，以含有本发明的药剂和适当的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
气雾剂或干粉制剂优选被安排以使每个计量剂量或“喷出物”含有至少100pg或200pg的本发明分子，用于递送至患者。应该意识到，气雾剂的每日总剂量因患者与患者的不同而异，并可在一天中以单剂量给予，或更常见的是在一天中以分剂量给予。
本发明的肽分子和药物组合物也可经口服递送。该过程可采用口服摄取维生素B12和/或维生素D至体内的天然过程，以共同递送蛋白质和肽。通过搭载维生素B12和/或维生素D摄取系统，本发明的核酸、分子和药物制剂可以穿过肠壁移动。在维生素B12类似物和/或维生素D类似物与药物之间合成复合物，其既在复合物的维生素B12部分/维生素D部分中对内在因子(IF)保持显著亲和力，又保持该复合物的活性物质的显著生物活性。
本发明的肽分子和药物组合物通常以含有活性成分的药物组合物的形式由任何胃肠外途径或经鼻给予，和在某些实施方案中口服给予。根据将治疗的疾病和患者，以及给药途径，组合物可以按不同剂量给予。
在人类的治疗中，本发明的肽分子和药物组合物可以单独给予，但通常以与关于预定的给药途径和标准的制药实践选择的合适药用赋形剂、稀释剂或载体的混合物给予。
优选地，本发明的药物组合物是含有活性成分的每日剂量或单位、每日亚剂量或其适当部分的单位剂量。
例如，本发明的肽分子和药物组合物可以片剂、胶囊、胚珠(ovules)、酏剂、溶液或悬浮液的形式口服、含服或舌下给予，这些形式可含有调味剂或着色剂，以供立即释放、延迟释放或控制释放应用。本发明的肽分子和药物组合物也可通过海绵体内注射给予。
这样的片剂可含有赋形剂例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢二钙和甘氨酸，崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及造粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外，还可包括润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸和甘油二十二烷酸酯。
类似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填料。这方面的优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性悬浮剂和/或酏剂，本发明的药剂可与各种甜味剂或调味剂、色素或染料、乳化剂和/或助悬剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合联合。
对于人受试者的口服和胃肠外给药，本发明的分子、药物和药物组合物的每日剂量水平通常为以单剂量或分剂量给予的从200pg至100 mg/成人/天。
因此，例如，本发明的分子的小瓶、片剂或胶囊可含有从200pg至100mg的活性剂，用于每次给予单个或两个或更多个，视情况而定。医生在任何情况下将决定最适合于任何个别患者的实际剂量，并且它将随具体患者的年龄、体重和反应而变化。上述剂量是平均情况的示例。当然，可以有值得更高或更低的剂量范围的个别情况，并且这些在本发明的范围内。
或者，本发明的分子、药物和药物组合物可以栓剂或阴道栓剂的形式给予，或它们可以洗剂、溶液、霜剂、凝胶、软膏或扑粉的形式局部应用。本发明的分子、药物和药物组合物还可以例如通过使用皮肤贴剂经皮给予。它们也可以通过眼途径给予，特别是用于治疗眼睛的疾病。
对于眼科用途，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制为等渗、pH调节、无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选作为等渗、pH调节、无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂如苯扎氯铵组合。或者，它们可以在软膏，例如凡士林中配制。
对于皮肤局部应用，本发明的分子、药物和药物组合物可以配制为合适的软膏，其含有悬浮或溶解在例如含以下一种或多种试剂的混合物中的活性剂：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯试剂、乳化蜡和水。或者，它们可以配制为悬浮或溶解在例如以下一种或多种试剂的混合物中的合适的洗剂或霜剂：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二醇、苄醇和水。
适用于口内局部给药的制剂包括含矫味基质(通常为蔗糖、阿拉伯树胶或黄蓍胶)中的活性成分的糖锭剂；含有在惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分的软锭剂；以及在合适的液体载体中含有活性成分的口腔洗剂。
对于兽医使用，本发明的分子、药物和药物组合物根据正常兽医实践作为适当可接受的制剂给予，并且兽医将确定最适合于特定动物的给药方案和给药途径。
方便地，该制剂是一种药物制剂。有利的是，该制剂是兽医制剂。
有利地，在根据本发明的用途中，日剂量水平为从10pg至100mg。优选地，日剂量水平为从20pg至50mg、20pg至10mg或20pg至8mg，以单剂量或分剂量给予。
优选的药物制剂包括其中活性成分以至少0.000001%直至5%重量存在的那些制剂。也就是说，药物组合物的活性成分与其它组分(即辅剂、稀释剂和载体的添加)的比例为至少1:99 (如至少10:90，优选至少30:70和最选至少50:50)重量。
优选地，本发明的药物组合物或药物被配制以允许通过至少一种途径给予，所述途径选自包括或由以下途径组成的组：鼻内、口服、胃肠外、局部、经眼、栓剂、阴道栓剂或吸入途径。适用于此类给药途径的制剂是药学和医药领域的技术人员所熟知的，并在上面和所附的实施例中对示例性制剂作了说明。
附图简述
现在将参照以下附图描述非限制性实施例：
图1显示了研究SEQ ID NO: 1的影响的室内尘螨(HDM)攻击方法的示意图。
图2显示了SEQ ID NO: 1对用HDM处理3周敏化的雌性Balb/c小鼠在7天时间点(用HDM初始攻击后7天)的肺细胞募集的影响。测定以下各组中的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的数量：盐水、盐水/HDM、0.02 µg/kg SEQ ID NO: 1/HDM、0.2 µg/kg SEQ ID NO: 1/HDM和2 µg/kg/HDM SEQ ID NO: 1。统计分析的细节列于图中。
图3显示SEQ ID NO: 1对用HDM处理3周敏化的雌性Balb/c小鼠在给药后7天时间点的肺细胞募集的影响。存在与处理组相关的肺中巨噬细胞募集增加的趋势。
图4显示SEQ ID NO: 1对用HDM处理3周敏化的雌性Balb/c小鼠在14天时间点(用HDM二次攻击后4小时) (对应于疾病改善时间点)的肺细胞募集的影响。测定以下各组中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的数量：盐水、盐水/HDM、0.02 µg/kg SEQ ID NO:1/HDM、0.2 µg/kg SEQ ID NO: 1/HDM和2 µg/kg/HDM SEQ ID NO: 1。统计分析的细节列于图中。
图5显示了在HDM研究中，在疾病改善时间点(给药后14天)，SEQ ID NO:1对支气管肺泡灌洗液中过敏相关细胞因子水平的影响。数据指的是以0.02 µg/kg、0.2 µg/kg和2 µg/kg经i.n.给予的SEQ ID NO:1。统计分析的细节列于图中。
图6显示在给药后7天，SEQ ID NO: 1对支气管肺泡灌洗液中抗-炎细胞因子IL-10水平的影响。这可能与图3中所示的巨噬细胞募集的增加有关，并反映了具有促消退抗炎免疫特性的SEQ ID NO:1的促进作用。统计分析的细节列于图中。
图7显示静脉内SEQ ID NO:1给药后10天，在OVA攻击后24小时和OVA-再次攻击后24小时对嗜酸性粒细胞浸润到肺内的影响。在每次OVA攻击前，SEQ ID NO:1已以20ng/kg的剂量用于使用变应原处理一周敏化的Balb/c小鼠中。
图8显示了在卵清蛋白致敏小鼠中卵清蛋白变应原攻击后，鼻内SEQ ID NO:3 (5和50 ng/小鼠)对肺中的细胞募集的影响。募集的细胞总数和嗜酸性粒细胞的分类计数被显示。
图9显示SEQ ID NO:1在人巨噬细胞中增强LPS刺激的IL-10分泌的作用。
图10显示SEQ ID NO:1的作用机制与树突状细胞成熟和T细胞成熟/发育相关的证据。
图11显示SEQ ID NO:1在削弱与树突状细胞成熟相关的IL-10基因表达的抑制中的作用，SEQ ID NO:1作用机制与抗炎细胞因子IL-10的表达/释放再次相关。超过2倍的表达变化被认为是显著的。
实施例
实施例1 (室内尘螨研究)
本研究的目的是使用3周鼻内(i.n.) HDM敏化模型在Balb/c小鼠中研究在盐水溶液中的3种不同浓度的肽对室内尘螨(HDM)-诱导的肺部炎症的抑制作用。示出了SEQ ID NO: 1的结果。本研究还考察了SEQ ID NO: 1的时间点效应；除了HDM攻击后7天，还研究了另一个时间点，即第二次HDM攻击(第一次HDM攻击后14天)后4h，以评估SEQ ID NO: 1对过敏性反应的缓解的影响。
HDM攻击模型是一种成熟建立且可靠的模型，其中变应原被鼻内递送(i.n.)以诱导气道炎症。
1. 肽合成
根据以下步骤合成和分离肽：
合成和纯化使用芴甲氧羰基固相肽合成(Fmoc SPSS)。使用基于Fmoc/叔-丁基的固相合成策略，在用多种可裂解的接头之一衍生的Wang树脂上合成了肽。Fmoc-基团提供了暂时的N-氨基保护作用，用叔丁基醚保护酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸羟基侧链，而叔丁酯保护天冬氨酸和谷氨酸残基的侧链。组氨酸和赖氨酸侧链分别作为它们的N-三苯甲基和N-Boc衍生物得到保护，半胱氨酸作为其S-三苯甲基衍生物和精氨酸胍部分作为其Pbf衍生物得到保护。
合成完成后，通过用含三异丁基硅烷和水的三氟乙酸(TFA)作为清除剂进行处理，从固体载体上裂解肽，并去除侧链保护基团。通过在乙醚中蒸发和研磨去除TFA和清除剂后，用反相制备型HPLC纯化肽，然后冷冻干燥。纯化的产物随后用反相HPLC和质谱分析。
2. 实验方案
方法
采用3周致敏和攻击模型，其中n=90只大约6~8周龄雌性Balb/c小鼠，研究开始时使用大约20-25g。
经过11天的驯化后，所有小鼠均接受5天/周i.n.递送的25µg (总蛋白) HDM，持续3周。HDM致敏在每个给药日进行，和所有的鼻内给药均在使用异氟烷轻度麻醉小鼠的情况下进行。最后的HDM致敏剂量后2周，所有小鼠接受单次50 µL i.n.剂量的肽的盐水溶液或盐水(0.9% w/v氯化钠)媒介溶液。对于SEQ ID NO: 1，剂量溶液是0.02μg/kg、0.2μg/kg和2μg/kg。肽或盐水媒介剂量后15分钟，所有小鼠接受经i.n.给予的盐水(0.9% w/v氯化钠)或100µg HDM的单次50uL攻击。
几组动物在致敏后4周接受了第二次50 µL i.n.给予剂量的盐水或者HDM 100µg剂量。然后动物在第二次攻击(相当于给药后14天)后4小时被安乐死。
所有小鼠均经腹膜内(i.p.)过量(0.2mL)的戊巴比妥钠(200mg/mL)实施安乐死。死亡经颈椎脱位证实。
死后样品采集
BAL液体
用1mL的BAL (支气管肺泡灌洗)液体经气管灌洗肺。样品放置在湿冰(4℃)上，使用Sysmex XT2000i vet细胞分析仪进行细胞分类计数，然后以1300 rcf离心BAL样品7 min。200µL BAL上清液样品被放置在聚丙烯U底96孔板中并在-20℃冷冻，用于随后使用标准MSD方案进行细胞因子分析。
数据分析
数据分析使用Graphpad PRISM 6执行。用于确定统计显著性的统计检验是方差分析(ANOVA)，接着事后检验或未配对T-检验。
3. 结果
BAL细胞流入量 - 7天时间点
细胞浸润分析显示，与盐水/盐水组相比，所有HDM处理的小鼠的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞水平升高。与盐水/HDM比较，SEQ ID NO:1 2μg/kg处理的动物显示出中性粒细胞和嗜酸性粒细胞水平下降，但无统计学意义(图2)。
分析还显示，与SEQ ID NO:1处理组相关的浸润巨噬细胞增加的趋势(图3)。
BAL细胞流入量 - 14天时间点
与盐水/HDM比较，SEQ ID NO:1 2μg/kg处理的动物显示出中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的水平的显著下降。
经所有给药途径，当与盐水/盐水比较时，给予盐水/HDM的动物的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞流入量水平显著更高。
当与i.n.给予盐水/HDM的那些动物比较，给予SEQ ID NO:1 2μg/kg的动物显示中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞水平显著更低(图4)。
BAL细胞因子释放
在14天时间点，与盐水/HDM相比，SEQ ID NO:1 2μg/kg显示对IL-4、IL-5和IL-13水平的显著抑制作用(图5)。
SEQ ID NO:1显示在7天时间点，与盐水/HDM相比，抗炎细胞因子IL-10有明显的剂量反应性释放(图6)。
4. 结论
动物对第二次HDM攻击有反应，在阳性和阴性对照动物之间观察到有统计学意义的差异。与第二次HDM攻击(给药后14天时间点)后4小时接受盐水/ HDM的动物相比，用最高剂量的SEQ ID NO: 1 (2µg/kg/HDM)观察到对BAL嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞流入量的统计学显著的抑制作用。
与在7天时间点接受盐水/HDM的动物相比，SEQ ID NO:1处理组观察到巨噬细胞流入量增加的趋势。在该时间点，SEQ ID NO:1处理的动物显示在BAL中抗-炎细胞因子IL-10的剂量相关增加。IL-10可以从巨噬细胞中释放出来。这些数据加在一起提示可部分解释14天时间点数据的促消退抗炎表型的转变。
与盐水/HDM组比较，在给药后14天和攻击后4h，BAL中的过敏性相关Th2-细胞因子IL-4、IL-5、IL-13被SEQ ID NO:1 2μg/kg抑制。
这些结果表明，单剂量的肽(这里对于SEQ ID NO: 1所示)提供了长期的效果，而不考虑循环水平的肽不再存在。
实施例2 (卵清蛋白研究)
图7和图8分别显示了在小鼠卵清蛋白模型中静脉给予SEQ ID NO:1和鼻内给予SEQ IDNO: 3对过敏性炎症的抑制作用。
方法：
在本研究中，雌性BALB/c小鼠用吸收至饱和氢氧化铝溶液中的30 µg鸡蛋清蛋白(2.5mg/ml)经腹膜内免疫。对照只接收氢氧化铝。一周后(第7天)，重复注射OVA。在第15天，所有动物均用卵清蛋白的气雾化溶液(3%)攻击25分钟，每日一次，连续3天。SEQ ID NO:1稀释于无菌盐水中，并在每次卵清蛋白攻击前10分钟，经静脉内给予25 µl/小鼠(20 ng/kg)，共3次处理。在另一组实验中，SEQ ID NO:3被稀释在无菌盐水中，并每次卵清蛋白攻击前10分钟以5和50 pg/小鼠的浓度经鼻内给予，共3次处理。对照只接收媒介。
在最后一次OVA攻击后10天，已接受SEQ iD NO:1的动物用OVA再次攻击另外连续3天。在这个阶段不涉及用SEQ ID NO: 1的处理(图7)。
小鼠在攻击后24小时用过量的聚氨酯(25%溶液i.p.)进行安乐死，并将插管插入暴露的气管，并将3份0.5 ml的盐水等分液注入肺内，并作为支气管肺泡灌洗(BAL)液体取出。将来自BAL液体的等分液(50 µl)加入到50 µl溶血溶液(Turk溶液, Fluka, UK)中。用改良的Neubauer血球计对灌洗液中的细胞总数进行计数。为了进行细胞分类计数，在室温下，使用Shandon Cytospin 2 (Shandon Southern Instruments, Sewickley, PA, USA)以1000 rpm离心1分钟，从BAL液体的等分液(100 µL)中制备细胞离心涂片(cytospin)制备物。细胞用Diff Quick (DADE Behring, Germany)染色，并计数总共100个细胞，以用标准的形态学标准测定中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的比例。
结果和结论：
最后一次卵清蛋白(OVA)攻击后24小时，从OVA-攻击小鼠获得的BAL液体中定量的细胞总数明显高于假处理小鼠，这通过募集到OVA-攻击小鼠的气道中的嗜酸性粒细胞数量显著更多得到反映。在每次OVA攻击前，在用SEQ ID NO:1静脉内处理的动物中，炎性反应的强度明显降低(图7)。
在最后的OVA攻击后10天，用OVA再次攻击动物另外连续三天。在这一阶段，未涉及用SEQ ID NO: 1的处理。结果显示，在最后的OVA攻击后10天，肺内对OVA反应的嗜酸性粒细胞数量减少。在此后阶段期间，用SEQ ID NO:1处理在抑制嗜酸性粒细胞的募集方面是有效的，而不管这样的事实，即肽的循环水平不再能被检测到(图7)。
图8显示在最后的变应原攻击后24h，在OVA模型中鼻内剂量的SEQ ID NO:3的影响。根据细胞总数和嗜酸性粒细胞数二者，炎性反应的强度在每次OVA攻击前用50ng/小鼠的SEQ ID NO:3鼻内处理的动物中显著减少。
实施例3 (SEQ ID NO:1在从LPS刺激的巨噬细胞的IL-10释放中的影响)
图9显示在LPS刺激的巨噬细胞中，由SEQ ID NO:1增强IL-10分泌。
方法
用50 nM佛波醇豆蔻酸乙酸酯在96孔板(100K个细胞/孔)上使人类THP-1单核细胞分化为巨噬细胞48小时。
在SEQ ID NO:1 (1nM)的存在或不存在下，用递增浓度的细菌脂多糖(LPS 10-6-10µg/ml)刺激巨噬细胞。在LPS刺激后6小时，取出30µl细胞培养液样品，进行IL-10alphaLISA以测定IL-10的释放。
结果和结论：
LPS刺激IL-10从THP-1分化的巨噬细胞中释放。用SEQ ID NO:1 (1nM)处理增强了在最高LPS剂量(1-10µg/ml；图9)时的IL-10的释放。
实施例4 (从肺组织样品的Affymetrix微阵列分析)
图10显示了来自实施例1的HDM研究的肺组织的Affymetrix微阵列分析的结果，表明SEQ ID NO:1与树突状细胞的成熟和T细胞的活化/发育相关。
方法
在室内尘螨(HDM, 100µg)刺激后4小时或7天，分析暴露于4种处理(盐水、SEQ ID NO:10.02 µg\kg、SEQ ID NO:1 2 µg\kg或阳性对照糠酸氟替卡松)之一的来自实施例1研究的25个小鼠肺组织FFPE (福尔马林固定石蜡包埋)样品。每个时间点的单一盐水样品被包括在内作为无HDM刺激的媒介对照。
从这些样品中提取RNA，并对每个样品的质量进行评估，发现它们与其它FFPE样品一致并如所预期的。从样品中获得了充足的RNA，以进行cDNA的生成。使用Nugen Ovation®FFPE WTA系统生成29种cDNA。
cDNA通过了FFPE的典型QC，并继续标记和与GeneChip®小鼠基因组430 2.0阵列杂交。
结果和结论
结果通过两个独立的生物信息学小组进行盲法分析，其结论相似，即SEQ ID NO:1的作用机制与树突状细胞成熟和T-细胞的活化和发育有关(图10)。
实施例5 (SEQ ID NO:1对树突状细胞成熟相关基因表达的影响)
图11显示了在LPS/IFNγ刺激后SEQ ID NO:1如何减弱与树突状细胞成熟相关的IL-10基因表达的抑制。
方法
CD14+单核细胞从3个健康供体的血液分离并经GM-CSF和IL4处理5天(+/- SEQ ID NO:1 (400nM, 0.04nM))分化为未成熟树突状细胞(iDC)。用流式细胞术确认iDC的表型，并经LPS (1μg/ml)和IFN-γ (IU/ml)处理，使它们进一步分化为成熟树突状细胞(mDC)。
来自所有3个供体的样品(空白；媒介+LPS/IFNγ；SEQ ID NO:1 400 ng/mL +LPS/IFNγ；SEQ ID NO:1 0.04 ng/mL + LPS/IFNγ)，共12个，在Human Dendritic Cell &Antigen Presenting Cell RT2 Profiler阵列(APC阵列)上运行，其寻找>85个相关基因的变化。
结果和结论
LPS/IFNγ处理抑制数个基因，特别是IL-10的表达。用SEQ ID NO:1 400ng/ml处理实现显著减弱IL-10基因的LPS/IFNγ抑制(图11)。

Claims (39)

1.一种用于急性治疗复发-缓解病症的方法，该方法包括响应于复发或在复发期间给予有需要的受试者一个或多个剂量的有效量的肽分子的步骤，所述肽分子包含选自组(i)-(xv)之一的氨基酸序列或由其组成：
(i) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1)；
(ii) XHGLNVNTLSYGD (SEQ ID NO: 2)
其中X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基；或其包含i(i)-i(iii)的一个或多个的变体；
ii(i) 一个或多个氨基酸残基呈D构象，
ii(ii) GLNVNTLSYGD被倒置，或
ii(iii) 羧基端氨基酸残基被转化为伯羧酰胺基；
(iii) DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO: 3)；
(iv) SELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 4)；
(v) SELPAGHGLNVNTLS (SEQ ID NO: 5)；
(vi) PAGHGLNVNTLS-NH2 (SEQ ID NO: 6)；
(vii) VVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 7)；
(viii) NKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 8)；
(ix) PAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 9)；
(x) HGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 10)；
(xi) DGSVVVNKVSELPAGH (SEQ ID NO: 11)；
(xii) GLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 12)；
(xiii) DGSVVVNKVS (SEQ ID NO: 13)；
(xiv) NTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 14)；和
(xv) 多肽序列，其与(i)-(xiv)中的任何一个具有超过85%或90%或95%同一性，且其功能相当于(i)-(xiv)中的任何一个；
其中该方法导致所述病症缓解。
2.依据权利要求1的方法，其中所述肽分子由选自组(a)-(s)之一的氨基酸序列组成：
(a) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1)；
(b) XHGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 15)；
(c) XdGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO: 16)；
(d) XhGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO: 17)；
(e) hGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO: 18)；
(f) HGLNVNTLSYGd-NH2 (SEQ ID NO: 19)；
(g) hGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 20)；
(h) DGSVVVNKVSEL-NH2 (SEQ ID NO: 3)；
(i) SELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 4)；
(j) SELPAGHGLNVNTLS (SEQ ID NO: 5)；
(k) PAGHGLNVNTLS-NH2 (SEQ ID NO: 6)；
(l) VVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 7)；
(m) NKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 8)；
(n) PAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 9)；
(o) HGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 10)；
(p) DGSVVVNKVSELPAGH (SEQ ID NO: 11)；
(q) GLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 12)；
(r) DGSVVVNKVS (SEQ ID NO: 13)；和
(s) NTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 14)；
其中大写字母表示L-氨基酸残基，小写字母表示D-氨基酸残基，X不存在或选自β丙氨酸残基、9-氨基-3,6-二氧杂辛酸和乙酰基。
3.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD (SEQ ID NO: 1)组成。
4.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列HGLNVNTLSYGD-NH2(SEQ ID NO: 21)或其功能等效的片段或变体组成。
5.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列bAla-HGLNVNTLSYGD-NH2 (SEQ ID NO: 22)或其功能等效的片段或变体组成。
6.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列Ac-dGysltnvnlGh-NH2 (SEQ ID NO: 23)、Ac-hGlnvntlsyGd-NH2 (SEQ ID NO: 24)或其功能等效的片段或变体组成。
7.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列hGLNVNTLSYGd-NH2(SEQ ID NO: 18)或其功能等效的片段或变体组成。
8.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列HGLNVNTLSYGd-NH2(SEQ ID NO: 19)或其功能等效的片段或变体组成。
9.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列hGLNVNTLSYGD-NH2(SEQ ID NO: 20)或其功能等效的片段或变体组成。
10.依据权利要求1或权利要求2的方法，其中肽分子由氨基酸序列DGSVVVNKVSEL-NH2(SEQ ID NO: 3)或其功能等效的片段或变体组成。
11.依据任一项前述权利要求的方法，其导致疾病改善。
12.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解在不需要给予更多剂量的肽的情况下维持。
13.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解包括减轻、缓和或消除病症的一种或多种症状。
14.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解包括在一段时间内减轻、缓和或消除病症的一种或多种症状，所述时间明显超过肽的血浆药代动力学半衰期。
15.依据任一项前述权利要求的方法，其中当血浆肽浓度低于定量下限时，缓解维持。
16.依据权利要求15的方法，其中血浆肽浓度低于20 ng/mL以下的循环水平的定量下限。
17.依据任一项前述权利要求的方法，其中病症缓解期为受试者的血浆中肽分子浓度低于定量下限后至少7天。
18.依据任一项前述权利要求的方法，其中病症缓解期为给予最后剂量的肽后至少7天。
19.依据任一项前述权利要求的方法，其中病症缓解期为给予最后剂量的肽后至少14天。
20.依据任一项前述权利要求的方法，其中病症缓解期为给予最后剂量的肽后至少28天。
21.依据任一项前述权利要求的方法，其中病症缓解期为给予最后剂量的肽后至少6个月。
22.依据任一项前述权利要求的方法，其中单剂量的肽被给予人受试者。
23.依据任一项前述权利要求的方法，其中所述病症是炎性病症。
24.依据任一项前述权利要求的方法，其中所述病症选自哮喘、克罗恩氏病、过敏性炎性病症例如特应性皮炎和鼻炎、类风湿性关节炎和炎性肠病。
25.依据任一项前述权利要求的方法，其中所述病症与嗜酸性粒细胞增多和/或中性粒细胞增多有关。
26.依据权利要求25的方法，其中缓解包括转运到人受试者的炎症部位的中性粒细胞数量和/或嗜酸性粒细胞数量相对于未给予肽分子的对照受试者显著减少。
27.依据权利要求26的方法，其中缓解包括在人受试者的炎症部位发现的中性粒细胞数量相对于对照受试者显著减少。
28.依据权利要求26或权利要求27的方法，其中所述病症是肺部病症，且缓解包括募集到肺部或在循环系统内发现的中性粒细胞数量和/或嗜酸性粒细胞数量的显著减少。
29.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解包括相对于对照受试者，在人受试者中淋巴细胞数量的显著减少或巨噬细胞数量的显著增加。
30.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解包括相对于对照受试者，在人受试者中一种或多种炎性标记物，例如细胞因子如IL-4、IL-5、IL-10或IL-13的量的显著变化。
31.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解包括相对于对照受试者，在人受试者中IL-10的量的显著增加。
32.依据任一项前述权利要求的方法，其中缓解包括相对于对照受试者，在人受试者中IL-4、IL-5或IL-13的量的显著减少。
33.依据任一项前述权利要求的方法，其中病症的复发包括与病症相关的症状的数量或严重程度的增加。
34.一种如在任一项前述权利要求中定义的肽分子，其用于如在任一项前述权利要求中定义的方法中。
35.一种药物组合物，其包含如在任一项前述权利要求中定义的肽分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂，用于如在任一项前述权利要求中定义的方法中。
36.根据任一项前述权利要求的方法、使用的肽或药物组合物，其中患者还被给予一种或多种治疗剂，或其中所述肽与一种或多种治疗剂联合提供。
37.依据权利要求36的方法、使用的肽或药物组合物，其中治疗剂选自疾病改善剂、镇痛剂、抗炎药、抗过敏药、变应原免疫治疗剂、抗病毒药、抗生素、抗体和类固醇。
38.依据权利要求36的方法、使用的肽或药物组合物，其中治疗剂是支气管扩张药。
39.依据权利要求36的方法、使用的肽或药物组合物，其中治疗剂选自皮质类固醇、抗白三烯、细胞因子、单克隆抗体和茶碱。
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