CN104151403B

CN104151403B - 一类多肽或其衍生物、及其在流感病毒感染中的应用

Info

Publication number: CN104151403B
Application number: CN201410177499.3A
Authority: CN
Inventors: 郭颖; 陈勍; 郭彦伸
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2014-04-08
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2034-04-08
Also published as: CN104151403A

Abstract

本发明涉及来源于流感病毒表面蛋白血凝素的多肽或蛋白质或拟肽药物及方法，属于生物医药技术领域。本发明具体涉及可阻断流感病毒感染的包括编号SEQ ID NO：1～8的八个流感病毒血凝素片段肽。所述片段肽可抑制不同物种的阻断不同亚型的流感病毒对宿主的感染，包括高致病禽流感病毒和季节性人流感病毒等多种流感病毒株系。本发明包含肽序列(包括肽的氨基酸序列和编码肽的多核苷酸序列)、衍生物(包括肽的氨基酸序列和编码肽的多核苷酸序列)肽、肽组合物以及在抗流感病毒预防或治疗中的单独或联合应用，例如本发明中的肽与其他抗流感药物的联合用药。

Description

一类多肽或其衍生物、及其在流感病毒感染中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域中的抗流感病毒感染的方法及其中所用的多肽或蛋白质药物，包括肽序列、肽衍生物、肽组合物、以及其在制备抗流感病毒药物方面的用途。本发明涉及源自流感病毒表面蛋白血凝素的HA1亚基的新型多肽或蛋白质药物，能够防治多种流感病毒株系的感染，包括对不同亚型的现有病毒(例如人类流感和禽类流感，包括可感染人的高致病H5N1流感病毒)以及现有病毒突变的未来病毒(例如有可能出现的人与人之间传播的禽流感的未来突变株)的感染抑制作用，以及与现有或未来的抗流感药物的联合用药等用途。

背景技术

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸系统传染病，传播速度快，遗传变异性强。流感的防治是当前医学及药学领域的重要研究课题。治疗流感的药物研究和发明具有重要的潜在应用价值。

流感是人、禽、畜共患病，每年全球有超过20％的人口会至少一次感染流感病毒，约每50年会出现一次世界性流感大流行，如1918年的西班牙流感大流行，造成5000万人死亡；1957年在亚洲爆发的“亚洲流感”和1968年开始流行的“香港流感”死亡人数均在100万以上^[1]；2009年爆发的新型甲型H1N1流感，在不到3个月的时间席卷全球，成为近40年来首次世界大流行疾病^[2]，对世界及我国人民健康造成极大危害。我国是人口大国，也是流感爆发的重灾区，抗流感药物的研发是我国药物研发的重点。

流感病毒属于正粘病毒科，根据内部蛋白抗原性的不同，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，三种类型没有共同的抗原，但都能感染人^[3]。甲型流感病毒是感染人、禽和其他动物的主要流感病毒亚型，其基因组为8条节段式单链负链RNA，其中外壳蛋白包括血凝素(Hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)和M2离子通道蛋白。根据表面结构蛋白HA和NA的抗原性不同，又将甲型流感病毒分为不同血清亚型，HA包括H1～H17共17种亚型，NA包括N1～N10共10种亚型，故理论上共有170种亚型组合。禽类是流感病毒的天然宿主，不是所有亚型都能感染人类，目前发现H1N1、H2N2和H3N2亚型以人类为宿主，但高致病的H5N1、H7N7、H9N2、H7N2和H7N3等亚型也已出现感染人的病例。高致病流感病毒是主要由野生禽类传播的恶性流感，自1997年香港出现高致病H5N1流感病毒感染人的病例后，跨越了从禽到人的种间障碍，2003年末，东南亚等国突然相继出现大量H5N1禽流感感染人病例^[4]，并迅速波及我国，高致病H5N1禽流感在我国的死亡率高达65％(全球59％)。在人际间进行传播并造成新一轮的世界大流行的可能性使得世界各国对高致病流感病毒实时严格监控。高致病禽流感已被世界兽医局动物流行病组织列为甲类传染病，并被列入国际生物武器公约动物传染病名单，1992年被我国农业部列为甲类监测传染病。

流感病毒进入宿主细胞是其感染机体的第一步。流感病毒通过其包膜表面的血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)与宿主细胞表面的唾液酸(Sialic acid，SA)受体进行相互识别并结合，从而完成病毒颗粒进入细胞内的过程。流感病毒的血凝素蛋白(HA)由两个亚基组成，HA1亚基负责病毒与宿主唾液酸受体的识别结合作用，HA1亚基的110位-261位残基为受体结合区域，包含三个二级结构元件：130-loop区(134-138位残基)、190-helix区(188-198位残基)和220-loop区(221-228位残基)，是主要受体结合域^[5]。当HA1亚基与唾液酸受体结合后，会触发细胞的内吞作用，整个病毒颗粒和细胞膜形成内含体内吞进入细胞浆，在内含体中，HA2亚基发挥pH依赖的病毒膜与内含体膜的融合作用，释放病毒的遗传物质至细胞浆中，完成病毒的进入过程。目前没有以流感病毒进入环节为靶位的抗流感药物问世。

在流感的预防方面，季节性流感的预防主要依靠疫苗接种，但由于流感病毒表面抗原血清学亚型众多，常常使得流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，无法提供有效保护；流感病毒具有变异性强的特点，疫苗研发制备速度落后于病毒变异速度，新型株系病毒出现后，对应疫苗的制备至少需要6个月的时间^[4]，使得对于流感的预防处于被动状态。而且，流感疫苗的保护期仅有半年到一年，需要每年接种注射，给人们的生活造成不便。

高致病流感不同于季节性流感，由于病毒恶性程度过强，目前没有可用的人用疫苗，并且为避免宿主选择性压力导致的快速病毒抗原变异，多数国家采取禁止或不提倡使用该疫苗的政策^[4]。

目前临床应用的抗流感药物，按作用机理主要分为两类：一类是抑制M2离子通道蛋白的金刚烷胺和金刚乙胺^[6]；另一类是抑制流感病毒释出的神经氨酸酶抑制剂，奥司他韦和扎纳米韦^[7]。统计数据显示，目前所有已上市的抗流感药物均出现了耐药病毒株^[8，9]，由于耐药性过于严重，美国疾病控制与预防中心已建议金刚烷胺、金刚乙胺类药物不作为临床治疗使用^[10，11]。目前耐药程度最轻的扎纳米韦应用流感病毒敏感株MDCK细胞的体外实验数据显示：扎纳米韦对H5N1、H6N1、H9N2三种亚型病毒的半数抑制浓度(IC50)为8.5-14.0μM^[7]。除了上述小分子抗流感药物外，已筛选出多种抗甲型流感病毒的单味和复方中药制剂，主要是解表药和清热解毒药^[12]，用于支持疗法，因此并不是抗流感的特异性抑制剂。加之，中药一般为需煎服的汤剂，服用不方便，大多数西方国家对中药的效果持怀疑态度，也限制了抗流感中药在世界范围的推广。

利用生物技术研发的抗流感药物，例如寡核苷酸^[13]、唾液酸酶融合蛋白(DAS181)^[14]、多肽(成纤维细胞生长因子4的信号序列衍生肽EB)^[15]等，在实验室研究中显示了不同程度的抗流感活性，但目前还没有商品化的药物问世。上述表明，目前已上市的抗流感病毒药物数量少，且都出现了耐药株，对于致死率高的流感病毒，如高致病H5N1流感病毒，尚未有特效疫苗和药物。

本发明是以流感病毒进入宿主环节中所必需的识别元件-血凝素HA1亚基为基础，设计并制备可特异性与宿主细胞表面受体结合的血凝素片段肽。流感病毒的血凝素HA以三聚体的形式存在于病毒包膜上，即HA纤突由三个HA单体分子组成，每个单体HA分子由HA1和HA2两个亚基组成，球状头部由HA1组成，含有受体结合位点和抗原决定簇，杆状柄部由HA2和部分HA1组成，与病毒包膜相连。HA1亚基与HA2亚基之间依靠二硫键连接，以高致病H5N1株系为例，HA1亚基长度为345个氨基酸残基，HA2亚基长度为225个氨基酸残基，不同流感病毒HA蛋白长度略有差异。虽然流感病毒株系众多，但HA2部分都是高度保守的。在功能上，HA1亚基负责与宿主细胞表面的唾液酸受体识别并结合，使病毒驻留并吸附在宿主细胞表面，进而引发细胞的内吞作用。当整个病毒颗粒被内吞入细胞的内含体中之后，在内含体的酸性环境中，HA2亚基发生结构转换，其疏水性融合肽插入到细胞的内含体膜中，将内含体膜与病毒包膜拉近，并最终完成细胞内含体膜与病毒包膜的融合，使得病毒基因组释放到细胞浆中，完成病毒对宿主细胞的侵入。相对保守的HA2亚基的膜融合功能是通过高度保守区-七肽重复区(Heptad Repeat，HR)完成的，该区域是抗病毒药物研发的热门靶标。HR区在囊膜病毒普遍存在，如正粘病毒(如流感病毒等)、冠状病毒(如SARS病毒等)、逆转录病毒(如HIV病毒等)中都有HR域，且高度保守，均含有两段称为七肽重复(HR)序列，N端的七肽重复序列称谓HR1，C端的七肽重复序列称谓HR2，在膜融合过程中，HR2以反向平行方式附着到HR1形成的沟槽中，形成稳定的发卡结构。对于高度保守的HR区，有很多囊膜病毒药物的研究报道，对HIV-1，SARS冠状病毒(SARS-CoV)，人呼吸道合胞病毒(HRSV)等病毒的研究表明，外源加入HR1或HR2多肽能抑制病毒感染，其作用机理为：外源多肽能阻碍病毒融合蛋白上的HR2与HR1之间的相互作用，进而阻断病毒膜融合蛋白的结构转换，阻断病毒囊膜和细胞膜间的融合。其中，源于HIV-1融合蛋白gp41的HR2区的多肽恩夫韦地(T-20)，作为第一个HIV-1进入抑制剂，已于2003年上市。中国专利(发明名称：抑制流感病毒感染的方法及其药物，授权公告号CN101186637B，申请日2007.12.18)中，发明主体也为来源于流感病毒的HR1和HR2区域的多肽。该专利涉及的HR1和HR2区域的多肽通过阻断病毒HR1和HR2区之间的结合，阻断病毒与宿主细胞内含体膜的融合过程。与HA2高保守性相反，HA1保守性差，是流感病毒抗原变异的主要原因。HA1位于病毒包膜表面，包含HA蛋白上所有的5个抗原决定簇，是制备流感病毒疫苗的靶标。虽然疫苗是预防流感的重要方法，但由于HA1的易突变性，当出现新型流感病毒株系时，常常使得流感疫苗失效，需要根据新型病毒的抗原进行疫苗制备。由于HA1的保守性差，变异性强，因此对于针对HA1亚基研发抗流感药物的策略往往不作为本领域技术人员考虑的研发方向，本领域技术人员一般都以高保守的HA2为基础，进行抗流感病毒感染的研究。本发明采用一种全新的思路，以阻断病毒与宿主细胞受体的结合为靶标，通过制备大量来源于HA1亚基的多肽及衍生物，筛选得到了可结合至宿主细胞受体，从而抑制病毒与宿主细胞的识别结合，阻断病毒颗粒进入健康的宿主细胞的多肽抑制剂。本发明与可检索到的专利/文献等报道的设计思路、作用机制/靶点的理论基础完全不同。而且更重要的是，本发明是以本领域技术人员通常不会想到的保守性差的HA1亚基为基础设计的。并且，本发明所涉及的多肽序列短，序列长度更短的短肽的优势在于溶解性相对更好，毒性相对更低，不易被降解，并且更有利于进行序列优化和改造修饰、成本低。目前为止没有检索到以HA1为基础，以结合宿主细胞受体为靶点，设计制备阻断流感病毒进入的抑制剂研发的相关报道。

在已获得专利保护的正在研发阶段的抗流感药物中，目前还没有商品化的、基于生物技术研发的抗流感药物问世，本发明具有全新原创性。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新的抗流感病毒肽(包括氨基酸序列和对应的多核苷酸序列)和同源性不少于50％的衍生物(包括氨基酸序列和对应的多核苷酸序列)，并提供上述肽在抗流感防治中的方法和应用。

本发明提出一种新的抗流感药物研制策略，即：以流感病毒攻击的宿主靶细胞为研究靶位，以流感病毒进入宿主环节中所必需的识别元件-血凝素HA1亚基为基础，设计并制备可特异性与宿主细胞表面受体结合的血凝素片段肽，以达到与流感病毒竞争性结合宿主受体的目的，阻止病毒进入健康的细胞。目前尚无基于流感病毒竞争结合宿主受体的理念研发的抗流感药物，也尚无以流感病毒血凝素HA1亚基多肽制剂作为抗流感药物的报道。

流感病毒可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三种类型，其中与人类关系最为密切的是甲型流感病毒。根据流感病毒包膜蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，甲型流感病毒可按血清学分类分为不同亚型。目前已发现17种HA亚型(H1～H17)和10种NA亚型(N1～N10)，因此理论上共有170种亚型。禽类是流感病毒的天然宿主，目前发现H1N1、H2N2和H3N2亚型以人类为宿主，但高致病的H5N1、H7N7、H9N2、H7N2和H7N3等亚型也已出现感染人的病例。新型流感病毒株系不断出现，例如2009年的新型甲型H1N1和2013年的H7N9流感。虽然流感病毒株系众多，但是目前发现，流感病毒(甲型和乙型)的受体均为宿主细胞表面与糖蛋白/糖脂偶联的唾液酸，因此，通过靶向于宿主细胞可阻断病毒与宿主细胞的识别结合，以该途径阻断流感病毒感染宿主细胞具有广谱性，即可抑制多种亚型流感病毒。

本发明以流感病毒表面蛋白血凝素的一级蛋白序列为基础，通过化学合成手段，共合成了59个流感病毒血凝素片段肽，通过真核细胞水平流感病毒模型的实验验证，获得8个血凝素肽(SEQ ID NO：1～8)可以高效阻断流感病毒侵入感染宿主细胞。这8个肽可有效抑制高致病H5N1流感病毒、季节性H1N1人流感病毒、2013年爆发的可感染人的H7N9流感病毒等病毒对宿主的感染。所用的流感病毒株系中，H1N1株系是季节性在人类中传播的流感病毒亚型、H5N1株系是从自禽类感染至人类的东南亚地区病人体内分离的高致病H5N1病毒亚型、H7N9株系是从自禽类感染至人类的中国安徽地区病人体内分离的新型H7N9病毒亚型。这三株病毒对应的HA亚型(H1、H5、H7)的序列同源性很低，分别属于不同的进化分支，但在宿主结合特性上有共性。本发明涉及的多肽通过与流感病毒竞争性结合宿主细胞受体，达到了广谱抗多种不同种属不同株系流感病毒感染的作用。

本发明的创新点在于采用一种全新的思路，首次提出并设计制备了基于流感病毒血凝素HA1亚基的新型抗流感病毒多肽抑制剂，其具有特定的氨基酸序列及对应的多核苷酸序列。针对HA1亚基研发抗流感药物的策略往往不被本领域技术人员考虑为研发方向，本领域技术人员一般都以更保守的HA2为基础，进行抗流感病毒感染的研究。本发明以阻断病毒与宿主细胞受体的结合为靶标，通过制备和评价大量基于HA1亚基的多肽及衍生物，获得了可结合于宿主细胞受体的活性肽，活性肽可阻断病毒与宿主细胞的识别结合，进而阻断病毒颗粒感染宿主细胞。本发明的创新之处还在于，首次发现可通过与流感病毒竞争性识别、结合宿主受体的进入抑制剂。目前已上市的抗流感药物均以病毒复制或释放环节为作用靶位，缺乏阻断病毒进入环节的药物，这导致长期以来多靶位多机制联合用药的抗流感治疗策略无法开展。本发明以流感病毒进入宿主环节中所必需的识别元件-血凝素HA1亚基为基础，设计并制备可特异性与宿主细胞表面受体结合的小肽，其作为一种新机制的抗流感药物，将充实现有抗流感的预防/治疗方案。此发明也将为同类药物的研发提供新思路。

具体而言，本发明的第一方面，包括可抑制流感病毒感染宿主的肽或其衍生物，其序列来自于人源高致病H5N1流感病毒(A/Vietnam/1203/04)包膜表面血凝素蛋白HA(图1)。其中，代表序列为SEQ ID NO：1～8的氨基酸序列或将SEQ ID NO：1～8的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸残基的替换和/或删减和/或增加而获得的，与SEQ ID NO：1～8任一段氨基酸序列具有至少50％同源性的且具有抑制流感病毒感染作用的序列，优选50％、55％、61％、66％、72％、77％、83％、88％、94％同源性(例如SEQ ID NO：17～27中的任一序列)。

上述一个或多个氨基酸残基的替换和/或删减和/或增加包括在肽或蛋白质序列内部的任意位置和序列两端的增加和/或删减。在变异的氨基酸残基中，优选突变为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸。侧链性质相似的氨基酸分别为亲水性氨基酸(例如R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)，疏水性氨基酸(例如A、I、L、M、F、P、W、Y、V)，脂肪族侧链的氨基酸(例如G、A、V、L、I、P)，羟基侧链的氨基酸(例如S、T、Y)，含硫原子侧链的氨基酸(例如C、M)，含羧基和酰胺侧链的氨基酸(例如D、N、E、Q)，含碱性基团侧链的氨基酸(例如R、K、H)，含酸性基团侧链的氨基酸(例如E、D)，含芳香族侧链的氨基酸(例如H、F、Y、W)。

本发明的第二方面，涉及上述肽的衍生物。例如，对肽进行化学修饰，如标记异硫氰酸荧光素(FITC)、生物素(Biotin)、聚乙二醇修饰(PEG)、固定化修饰等(包括但不限于此)；对肽进行序列和结构修饰，如乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、引入非肽结构等(包括但不限于此)；或者在多肽或衍生物上还连接有用于多肽或蛋白质检测和纯化的标签，如组氨酸标签(His₆)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、N位点利用蛋白(Nus)、血凝素标签蛋白(HA)、免疫球蛋白(IgG)、FLAG标签蛋白、c-Myc标签蛋白、Profinity eXact融合标签蛋白等(包括但不限于此)。上述修饰手段均为多肽或蛋白质的常规修饰方法，在机体内可通过脱脂酶等方式降解。

本发明的第三方面，涉及编码上述肽或衍生物的多核苷酸序列，其序列选自下列多核苷酸序列之一：1)SEQ ID NO：9～16的多核苷酸序列；2)编码SEQ ID NO：1～8的氨基酸序列的多核苷酸序列；3)与编码SEQ ID NO：1～8的任一段氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列的多核苷酸序列，且编码可抑制流感病毒感染的多肽或蛋白质的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：28～SEQ ID NO：38中任一序列)；4)在高严谨条件下，可与编码SEQ IDNO：1～8的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，且编码可抑制流感病毒感染的多肽或蛋白质的多核苷酸序列。

所述“在高严谨条件下的杂交”是指多核苷酸能在Molecular Cloning：ALaboratory Manual2^nd ed.(Maniatis T.等，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)中所述的条件或类似条件下进行杂交。例如，是指在下述条件下的杂交能力：1)将SEQ ID NO：9～16所示的多核苷酸分子在酸、碱或热处理后使双链分子变性，而后固定于硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他可与单链DNA分子结合的固相基质上，经变性后加入含有特定序列的外源多核苷酸分子的杂交液，在68℃杂交4-20小时，若外源多核苷酸分子能和固定在膜上的多核苷酸分子形成双链，即为该两种分子能进行杂交：2)在杂交液中加入SEQ ID NO：9～16所示的多核苷酸分子，经变性后加入外源多核苷酸分子，在68℃杂交4-20小时，杂交后形成的双链可以特异地吸附到羟基磷灰石或其他能与双链DNA分子结合的基质上，通过离心可以收集吸附有双链核酸分子的羟基磷灰石或基质，从而获得杂交的双链DNA分子，此种情况也表明该外源多核苷酸分子可以和本发明中的序列进行杂交。

本发明的第四方面，涉及肽的获得方式，包括本发明第一方面的肽(或其衍生物)和/或第二方面的肽衍生物和/或包含按照本发明第三方面的多核苷酸表达或合成的多肽或蛋白质，如人工合成或以重组蛋白方式纯化而得的多肽或蛋白质产物。所述多肽人工合成方式是生物合成领域技术人员所常规应用的肽合成及修饰方法，所述的多肽或蛋白质基因重组表达纯化方式是本领域技术人员常规选择的载体、宿主细胞、转化技术、表达纯化技术，包括原核细胞表达技术和真核细胞表达技术。

本发明的第五方面，涉及含有上述多核苷酸序列的载体。载体可包括本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物病毒载体、动物病毒载体及其他各种病毒载体。本发明适用的载体包括但不限于：原核细胞载体(如细菌克隆/表达载体等)、酵母细胞载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、昆虫细胞载体(如杆状病毒载体等)、哺乳动物细胞载体(如腺病毒载体、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等)、植物病毒载体及在哺乳动物器官特异性表达载体如乳腺表达载体等，即在宿主细胞中可稳定复制传代的任何载体都可使用。优选的表达载体包含选择标记基因，如细菌氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等；酵母细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因；酵母细胞的缺陷选择标记，如His、Leu、Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及组氨酸标签基因、荧光蛋白标记基因等。本领域技术人员可利用本领域已知的生物化学及分子生物学技术，构建本发明所述的多核苷酸序列、转录和翻译序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染适合的宿主细胞或生物，以便获得所需的目的蛋白或多肽。

本发明的第六方面，涉及含有上述载体的细胞。所述细胞可以是原核细胞或真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染了含本发明所述的编码能抑制流感病毒感染的多肽和蛋白的多核苷酸序列后，可用于生产所需蛋白或多肽，或将其直接用于抗流感病毒预防/治疗给药。本领域技术人员可恰当选择合适的载体、宿主细胞，并熟知载体高效转化或转染入细胞的方法，所用方法包括但不限于，氯化钙法、氯化铯法、电穿孔法等用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法等用于酵母细胞，脂质体法、磷酸钙共沉淀法、电融合法、显微注射法等用于哺乳动物细胞、昆虫细胞等真核细胞的方法。

本发明的第七方面，提供用于预防/治疗流感病毒感染的药物，其包括预防/治疗有效量的按照本发明第一方面的肽(或其衍生物)和/或第二方面的肽衍生物和/或包含按照本发明第三和/或第四方面的多核苷酸表达或合成的多肽或蛋白质或组合物和/或包含按照本发明第五方面和/或第六方面的载体或细胞表达的多肽或蛋白质或组合物。

本发明的药物可以制成注射液、片剂或喷雾剂，药物可依照药学领域的常规方法制备。需要时，还可在上述药物中加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、吸收促进剂、粘合剂、湿润剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可加入香味剂、甜味剂等。

本发明的第八方面，提供预防/治疗流感病毒感染的方法，其包括对受试者给药预防/治疗有效量的按照本发明第一方面的肽(或其衍生物)和/或第二方面的肽衍生物和/或包含按照本发明第三和/或第四方面的多核苷酸表达或合成的多肽或蛋白质或组合物和/或包含按照本发明第五方面和/或第六方面的载体或细胞表达的多肽或蛋白质或组合物。

所述给药可通过所属技术领域技术人员常规的方式进行给药，如注射、口服、肺部、鼻腔、口腔给药等，优选方式为鼻腔、口腔和肺部给药。给药剂量可根据制剂形式和期望的作用时间以及预防/治疗对象的情况而有所变化，实际预防/治疗所需量(有效剂量)可由医师根据实际情况(如受试者的病情、年龄、体重等)而确定。对于注射给药剂量，优选每kg体重100ng-10mg，更优选的是每kg体重1μg-1mg，最优选的是每kg体重10μg-100μg。

本发明的第九方面，提供用于预防/治疗流感病毒感染的试剂盒，其包括1)按照本发明第一方面的肽(或其衍生物)和/或第二方面的肽衍生物和/或包含按照本发明第三和/或第四方面的多核苷酸表达或合成的多肽或蛋白质或组合物和/或包含按照本发明第五方面和/或第六方面的载体或细胞表达的多肽或蛋白质或组合物；2)使用说明书。包括说明书指示给药的方法，如给药次序、时间、剂量、给药方式等。

本发明的第十方面，提供联合用于预防/治疗流感病毒感染的药物的联合用药，包括1)按照本发明第一方面的肽(或其衍生物)和/或第二方面的肽衍生物和/或包含按照本发明第三和/或第四方面的多核苷酸表达或合成的多肽或蛋白质或组合物和/或包含按照本发明第五方面和/或第六方面的载体或细胞表达的多肽或蛋白质或组合物；2)使用说明书。包括说明书指示给药的方法，如给药次序、时间、剂量、给药方式等。按照上述要求与已上市的抗流感药物的联合用药。

为了方便理解，以下将通过实施例、图片等对本发明进行详细描述。需要特别指出的是：这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。根据本说明书的论述，本发明可提供一类针对流感病毒进入环节为靶点的多肽抑制剂，与流感病毒竞争性结合宿主受体，从而达到广谱抗多种属多株系流感病毒的目的。本发明中的多肽抑制剂抗流感活性好，肽链长度短(序列长度短的短肽的优势在于溶解性相对更好，毒性相对更低，不易被降解，并且更有利于进行序列优化和改造修饰)，合成技术成熟，制备成本低廉，其有益效果对所属领域的技术人员来说都是显而易见的。本发明引用的公开文献为了更清楚的描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

图1：本发明所涉及的流感病毒血凝素HA蛋白一级结构示意图，HA蛋白分为HA1(1-346位氨基酸)和HA2(347-569位氨基酸)两个亚基，图示中斜线区域为受体结合保守结构域(Receptor binding domain)在HA1亚基中的位置。

图2：流感病毒血凝素肽SEQ ID NO：1～8的HPLC液相层析多肽纯化图及MS质谱分子量鉴定图。(A1)SEQ ID NO：1HPLC纯化图；(A2)SEQ ID NO：1质谱图；(B1)SEQ ID NO：2HPLC纯化图；(B2)SEQ ID NO：2质谱图；(C1)SEQ ID NO：3HPLC纯化图；(C2)SEQ ID NO：3质谱图；(D1)SEQ ID NO：4HPLC纯化图；(D2)SEQ ID NO：4质谱图；(E1)SEQ ID NO：5HPLC纯化图；(E2)SEQ ID NO：5质谱图；(F1)SEQ ID NO：6HPLC纯化图；(F2)SEQ ID NO：6质谱图；(G1)SEQ ID NO：7HPLC纯化图；(G2)SEQ ID NO：7质谱图；(H1)SEQ ID NO：8HPLC纯化图；(H2)SEQID NO：8质谱图。

图3：(A)流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：7)抗H1N1流感病毒感染的细胞病变图；(B)流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8)抗H1N1流感病毒感染的细胞病变图；(C)流感病毒血凝素衍生肽(SEQIDNO：18)抗H1N1流感病毒感染的细胞病变图。

流感病毒血凝素肽及衍生肽可有效抑制流感病毒H1N1对MDCK细胞的感染。图中，正常细胞组为未进行病毒感染、未进行肽处理的细胞对照组；病毒对照组为仅进行病毒感染、未进行肽处理的对照组；病毒+肽组为在进行病毒感染后，加入含不同浓度肽溶液的加药检测组。孵育72小时后，于光学显微镜下观察并记录细胞病变情况，并按照Reed-Muench方法计算药物抑制病毒半数抑制浓度(IC50)。

图4：(A)流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8)与临床用抗流感药物利巴韦林联合作用抗H1N1流感病毒感染的细胞病变图；(B)流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8)和临床用抗流感药物磷酸奥司他韦联合作用抗H1N1流感病毒感染的细胞病变图。

流感病毒血凝素肽与临床抗流感药物的联合作用可提高抗流感药物抑制流感病毒H1N1对MDCK细胞感染的药效。图中，正常细胞组为未进行病毒感染、未进行药物或肽处理的细胞对照组；病毒对照组为仅进行病毒感染、未进行药物或肽处理的对照组；病毒+药物组为在进行病毒感染后，加入含不同浓度的药物溶液的加药检测组。病毒+肽+药物组为在进行病毒感染后，加入含相同浓度(15μM)的流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8)和不同浓度的药物溶液，孵育72小时后，于光学显微镜下观察并记录细胞病变情况，并按照Reed-Muench方法计算药物抑制病毒半数抑制浓度(IC50)。

具体实施方式

实施例1：流感病毒血凝素肽的化学合成

根据序列表中的SEQ ID NO：1～8的氨基酸序列，应用固相多肽合成法(SYMPHONY型12通道多肽合成仪)合成纯度大于90％的肽分子(长度为18个氨基酸)，通过HPLC液相层析和MS质谱鉴定纯度和分子量，SEQ ID NO：1～8的HPLC纯度鉴定图及质谱图如图2所示。

实施例2：高致病H5N1流感重组病毒的制备及流感病毒血凝素肽对高致病H5N1流感重组病毒感染的抑制活性测定

1)高致病H5N1流感重组病毒的制备

高致病H5N1流感病毒的制备方法如下：将HIV载体质粒(pNL4-3.Luc.R.E.，从NIH获得)和克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1的HA的质粒共转染至293T细胞(人胚肾细胞)后，生成以HIV为核心并包裹HA外壳蛋白的重组病毒颗粒。该病毒颗粒具有以下特点：1)由于外壳蛋白是血凝素，因此病毒颗粒对宿主细胞的选择性取决于血凝素的特性。实验中的HA蛋白来源于可感染人的高致病H5N1流感病毒(A/Vietnam/1203/2004)，因此具有高致病H5N1病毒的感染特性；2)HIV载体敲除了env、nef和vpr基因，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，这保证了体系的安全性；3)HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，被该病毒感染的宿主细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可检测细胞被病毒感染的程度。

2)流感病毒血凝素肽对高致病H5N1流感重组病毒感染的抑制活性测定

感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将293T细胞接种于24孔板，细胞培养基为DMEM+10％FBS(GIBCO)，细胞培养条件为37℃，5％CO₂。感染前15分钟向细胞培养液中加入PBS(pH7.4)稀释的肽溶液，以PBS溶液为空白对照，每组设2个复孔。加入适宜稀释度的病毒液(HA/HIV)感染宿主细胞。感染48小时后，被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(Promega)于4℃裂解细胞20分钟，将30μl荧光素酶底物(Promega)与20μl细胞裂解液混合后于FB15荧光检测仪(Sirius)测定细胞荧光素酶的相对活性，此活性的强弱反映了病毒的感染水平。结果如表1所示。

表1流感病毒血凝素肽抑制高致病流感病毒HA/HIV侵入宿主细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

编号	IC<sub>50</sub>(μM)	编号	IC<sub>50</sub>(μM)
				SEQ ID NO：1	61.6	SEQ ID NO：5	65.3
SEQ ID NO：2	21.9	SEQ ID NO：6	63.4
				SEQ ID NO：3	6.2	SEQ ID NO：7	17.6
SEQ ID NO：4	66.0	SEQ ID NO：8	13.4

实施例3：季节性H1N1人流感病毒的制备及流感病毒血凝素肽抑制季节性H1N1人流感病毒感染宿主细胞病变的活性测定

1)季节性H1N1人流感病毒的制备：

为了检测流感病毒血凝素肽对不同种属、不同株系流感病毒感染的作用，我们制备了感染人的季节性H1N1人流感病毒A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)株系，制备方法如下：将病毒储液接种9日龄鸡胚的尿囊腔和羊膜腔，37℃培养鸡胚2-3天后，收获尿囊液和羊水中的病毒，离心后分装，-70℃保存。选用适合流感病毒生长的敏感细胞株系MDCK细胞(犬肾细胞)为病毒感染细胞，DMEM+0.2％BSA+2μg/mlTPCK为病毒维持液，将病毒液作10倍梯度稀释接种于MDCK细胞，每个梯度设3个复孔，37℃培养3天后，观察细胞病变，并按照Reed-Muench方法计算病毒半数感染量(TCID₅₀)。

2)流感病毒血凝素肽抑制季节性H1N1人流感病毒感染宿主细胞的细胞病变测定

感染前一天，按每孔3×10⁴个细胞的密度将MDCK细胞接种于96孔板，细胞培养基为DMEM+10％FBS(GIBCO)，细胞培养条件为37℃，5％CO₂。感染当天，MDCK细胞长至90-100％满后弃去细胞培养液，将细胞用PBS溶液(pH7.4)洗涤2次，用无血清DMEM培养基洗涤1次(排除血清对流感病毒感染宿主细胞的干扰)。将季节性人流感病毒H1N1病毒液稀释至100TCID₅₀，加入细胞孔中，同时设不加病毒的正常细胞对照组和只加病毒、不加多肽的病毒对照组，37℃孵育1-2小时后弃去病毒溶液，用PBS溶液(pH7.4)洗涤2次，用无血清DMEM培养基洗涤1次。用病毒维持液稀释多肽，每孔100μl，每组设4个复孔，37℃，5％CO₂培养3天后观察细胞病变，并按照Reed-Muench方法计算药物抑制病毒半数抑制浓度(IC₅₀)。

结果显示，流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8)对季节性人流感病毒H1N1株系对宿主细胞的感染有显著抑制作用，半数抑制浓度(IC₅₀)分别为34.0μM和22.2μM，细胞病变图如图3(A)和图3(B)所示。

实施例4：感染人的H7N9流感病毒的制备及流感病毒血凝素肽对H7N9流感重组病毒感染的抑制活性测定

1)感染人的H7N9流感重组病毒的制备

H7N9流感重组病毒的制备方法如下：将HIV载体质粒(pNL4-3.Luc.R.E.，从NIH获得)和克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1的HA(A/Anhui/1/2013)的质粒共转染至293T细胞(人胚肾细胞)后，生成以HIV为核心并包裹HA外壳蛋白的重组病毒颗粒。

2)流感病毒血凝素肽对H7N9流感重组病毒感染的抑制活性测定

检测方法同实施例2，结果显示，SEQ ID NO：7多肽可有效抑制H7N9流感病毒进入宿主细胞，其半数抑制浓度(IC₅₀)为51.0μM。

实施例5：流感病毒血凝素衍生肽抑制流感病毒感染的活性测定

1)流感病毒血凝素衍生肽抑制高致病流感重组病毒侵入宿主细胞的活性测定

根据序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸序列，合成同源性94％的衍生肽(SEQ ID NO：17～ 24)、同源性83％的衍生肽(SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26)、同源性77％的衍生肽(SEQID NO：27)、同源性50％的衍生肽(SEQ ID NO：8)，应用高致病H5N1流感重组病毒感染模型检测上述衍生肽的抗病毒活性，检测方法同实施例2。

结果显示，流感病毒血凝素衍生肽对高致病H5N1流感病毒的感染有显著抑制作用，见表2。

表2流感病毒血凝素衍生肽抑制高致病流感重组病毒侵入宿主细胞的半数抑制浓度(IC50)

2)流感病毒血凝素衍生肽抑制季节性人流感病毒感染宿主细胞的细胞病变测定

应用季节性H1N1流感病毒感染MDCK细胞的感染模型检测流感病毒血凝素衍生肽(SEQ ID NO：18)对宿主细胞的保护作用，检测方法同实施例3。

结果显示，流感病毒血凝素衍生肽对季节性H1N1流感病毒的感染有显著抑制作用，按照Reed-Muench方法计算半数抑制浓度(IC₅₀)为22.2μM，细胞病变图如图3(C)所示。

实施例6：流感病毒血凝素肽和临床用抗流感药物联合作用的活性测定

1)流感病毒血凝素肽与利巴韦林联合作用抑制流感病毒H1N1感染宿主细胞病变的药效测定

按照实施例3中所述方法，检测血凝素肽(SEQ ID NO：8)和利巴韦林(Ribavirin)联合作用对流感病毒H1N1在MDCK细胞上形成的细胞病变抑制效果。用病毒维持液稀释利巴韦林，终浓度为3μM、10μM、30μM，同时加入终浓度15μM的血凝素肽(SEQ ID NO：8)，每组设3个复孔，37℃，5％CO₂培养3天后观察细胞病变情况。结果如图4(A)所示，流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8)可以提高抗流感药物利巴韦林对季节性人流感病毒H1N1的半数抑制浓度，单独应用利巴韦林对H1N1的IC₅₀为27.8μM，联合流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8，15μM)的IC₅₀为15.5μM。

2)流感病毒血凝素肽与磷酸奥司他韦联合作用抑制流感病毒H1N1感染宿主细胞病变的药效测定

按照实施例3中所述方法，检测血凝素肽(SEQ ID NO：8)和磷酸奥司他韦(Oseltamivir Phosphate)联合作用对流感病毒H1N1在MDCK细胞上形成的细胞病变抑制效果。用病毒维持液稀释磷酸奥司他韦，终浓度为10μM、33μM、100μM、330μM，同时加入终浓度15μM的血凝素肽(SEQ ID NO：8)，每组设3个复孔，37℃，5％CO₂培养3天后观察细胞病变情况。结果如图4(B)所示，流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8)可以提高抗流感药物磷酸奥司他韦对季节性人流感病毒H1N1的抑制效果，联合应用流感病毒血凝素肽(SEQ ID NO：8，15μM)使得磷酸奥司他韦在终浓度为10μM时，即可达到对MDCK细胞的有效保护。

总结

上述多个实施例的结果表明：

1)本发明提供的流感病毒血凝素肽和衍生肽对高致病H5N1流感病毒、季节性H1N1流感病毒、H7N9流感病毒的感染均有显著抑制作用，其体外药效和已有临床药物(如扎纳米韦)属于同一剂量水平。

2)在分别和已有临床抗流感药物(利巴韦林、磷酸奥司他韦)的联合作用实验中，流感病毒血凝素肽均表现了很好地提高药物疗效的作用，由于流感病毒血凝素肽的作用环节为病毒进入环节，与现有抗流感药物的作用位点都不同，因此可以作为协同作用药物参与抗流感的多靶位联合预防/治疗。

3)本发明提供的流感病毒血凝素肽及衍生肽长度短，合成方法技术成熟，制备成本低廉，可满足大量生产的需要。

综上所述，本发明提供的流感病毒血凝素肽及衍生肽具有高效抑制高致病H5N1流感病毒、季节性H1N1流感病毒、H7N9流感病毒的广谱抗流感病毒感染的作用，是新型抗流感多肽抑制剂。同时，本发明中的多肽抑制剂作为抗流感病毒感染的特异性侵入抑制剂抗流感活性好，肽链长度短，合成技术成熟，制备成本低廉，并可作为抗流感预防/治疗的协同药物，提高抗流感联合药效，因此有着良好的开发前景。

参考文献

[1]Ten concerns if avian influenza becomes a pandemic[OL].

http://www.who.int/csr/dis ease/influenza/pandemic10things/en/.2005-10-14.

[2]Epidemiological Update on the Global Situation and PreliminaryOverview of the Southern Hemisphere Winter Influenza Season(as of6August2009)[OL].2009-08-06.

[3]Webster RG，Yakhno M，Hinshaw VS，et al.Intestinal influenza：replication and characterization of influenza viruses in ducks.Virology，1978，84(2)：268-278

[4]Kamps BS，Hoffmann C，Preiser W.Influenza report2006.2006，FlyPublisher，Paris，France.

[5]James Stevens，et al.Structure and receptor specificity of thehemagglutinin from an H5N1influenza virus.Science，2006，312：404-410.

[6]Skehel JJ.Influenza virus.Amantadine blocks thechannel.Nature.1992，358(6382)：110-1.

[7]Leneva IA，Goloubeva O，Fenton R J，Tisdale M，Webster RG.Efficacy ofzanamivir against avian influenza A viruses that possess genes encodingH5N1interal proteins and are pathogenic in mammals.Antimicrob AgentsChemo.2001，45(4)：1216-24.

[8]Gregory A.Poland，et al.Influenza Virus Resistance to AntiviralAgents：A Plea for Rational Use.Clin Infect Dis.2009.48(9)：1254-1256.

[9]Memoli MJ，et al.Rapid selection of oseltamivir-and peramivir-resistant pandemic H1N1virus during therapy in2immunocompromised hosts.ClinInfect Dis.2010.50(9)：1252-1255.

[10]Deyde，V.M.，et al.Surveillance of resistance to adamantanes amonginfluenza A(H3N2)and A(H1N1)viruses isolated worldwide.J.Infect.Dis.2007.196：249-257.

[11]Cheung CL，Rayner JM，Smith.Distribution of amantadine-resistantH5N1avian influenza variants in Asia.J Infect Dis.2006，193(12)，1626-1629.

[12]张卫民，杨增崎，卿素珠.抗病毒的中草药研究进展.动物医学进展.2001，22(4)：16-21.

[13]Jeon S H，et al.A DNA aptamer prevents influenza infection byblocking the receptor binding region of the viral hemagglutinin.J Biol Chem，2004，279(46)，48410-48419.

[14]Belser J A，et al.DAS181，a novel sialidase fusion protein，protectsmice from lethal avian influenza H5N1virus infection.J Infect Dis，2007，196(10)，1493-1499.

[15]Cross K J，et al.Mechanisms of cell entry by influenzavirus.Expert Rev Mol Med，2001，3(21)，1-18。

Claims

1.一类多肽或其衍生物，其中所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，3，4，6，7，8所示序列，所述衍生物的氨基酸序列为SEQ ID NO:17～27。

2.根据权利要求1中所述的多肽或其衍生物，其特征在于，在多肽或其衍生物上可进行常规修饰；或者在多肽或其衍生物上还连接有用于多肽或蛋白质检测或纯化的标签。

3.根据权利要求2所述的多肽或其衍生物，其特征在于，所述的常规修饰包括乙酰化、酰胺化、环化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰、固定化修饰；所述的标签包括His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、Profinity eXact。

4.编码权利要求1所述多肽或其衍生物的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列是SEQ ID NO:9，11，12，14，15，16，28～38所示序列。

6.根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征还在于，所述多核苷酸序列是编码权利要求1-2任一项所述多肽或其衍生物的多核苷酸序列。

7.一种克隆或表达载体，其包含权利要求4或5或6所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的载体。

9.一种药物组合物，其特征在于，以单独或联合的方式包含治疗有效量的权利要求1-3任一项所述的多肽或其衍生物、和/或权利要求4或5或6所述的多核苷酸、和/或权利要求7所述的载体、和/或权利要求8所述的宿主细胞，以及生物学或药学上可接受的载体或赋形剂。

10.权利要求1-3任一项所述的多肽和/或其衍生物、和/或权利要求4或5或6所述的多核苷酸、和/或权利要求7所述的载体、和/或权利要求8所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗H5N1流感病毒、H1N1流感病毒或H7N9流感病毒感染的药物中的应用。

11.根据权利要求10的应用，其特征在于，所述的多肽和/或其衍生物、所述的多核苷酸、所述的载体、所述的宿主细胞可以单独或联合应用。

12.根据权利要求10的应用，其特征在于，所述的多肽和/或其衍生物、所述的多核苷酸、所述的载体、所述的宿主细胞也可以与其他的抗流感药物单独或联合应用。

13.权利要求9所述的药物组合物在制备预防和/或治疗H5N1流感病毒、H1N1流感病毒或H7N9流感病毒感染的药物中的应用。

14.一种用于治疗流感病毒感染的试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述的多肽或其衍生物、和/或权利要求4或5或6所述的多核苷酸、和/或权利要求7所述的载体、和/或权利要求8所述的宿主细胞、和/或权利要求9所述的药物组合物以及使用说明书。

15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述流感病毒是H5N1流感病毒、H1N1流感病毒或H7N9流感病毒。