JP4866612B2

JP4866612B2 - 生理活性複合体

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Publication number: JP4866612B2
Application number: JP2005515453A
Authority: JP
Inventors: 忠範真弓; 康央堤; 晋作中川; まどか谷合; 角二鳥越; 光清藤井; 宏山内; 雅夫池田; 雅司栗本
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2003-11-12
Filing date: 2004-11-12
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2024-11-12
Also published as: JPWO2005046715A1; WO2005046715A1

Description

この発明はインターフェロンα活性を有する生理活性物質に関するものであり、とりわけ、人のインターフェロンαサブタイプα８へ水溶性の高分子を結合せしめてなる生理活性複合体に関するものである。

近年、人のインターフェロンαのサブタイプα８（以下、単に「インターフェロンα８」と称することもある。）は、サブタイプα２ａおよび２ｂなどの他のサブタイプのインターフェロンαよりも優れた活性を有するという報告がなされている。例えば、フォスター・ジー・アール（ＦｏｓｔｅｒＧＲ）、ロドリグエス・オー（ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＯ）、ゴーゼ・エフ（ＧｈｏｕｚｅＦ）、シュルテ−フローリンデ・イー（Ｓｃｈｕｌｔｅ−ＦｒｏｈｌｉｎｄｅＥ）、テスタ・ディー（ＴｅｓｔａＤ）、リアオ・エム・ジェイ（ＬｉａｏＭＪ）、スターク・ジー・アール（ＳｔａｒｋＧＲ）、リードビーター・エル（ＬｅａｄｂｅａｔｅｒＬ）及びトーマス・エイチ・シー（ＴｈｏｍａｓＨＣ）（ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサーチ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆ＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ）、第１６巻、第１２号、１０２７乃至１０３３頁、１９９６年）は、インターフェロンα８が他のサブタイプのインターフェロンαよりも、極めて抗ウイルス活性が高いことを報告しており、さらに、ヤナイ・ワイ（ＹａｎａｉＹ）、ホリエ・エス（ＨｏｒｉｅＳ）、ヤマモト・ケイ（ＹａｍａｍｏｔｏＫ）、ヤマウチ・エイチ（ＹａｍａｕｃｈｉＨ）、イケガミ・エイチ（ＩｋｅｇａｍｉＨ）、クリモト・エム（ＫｕｒｉｍｏｔｏＭ）及びキタムラ・ティー（ＫｉｔａｍｕｒａＴ）（ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサーチ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ＆ＣｙｔｏｋｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ）、第２１巻、第１２号、１，１２９乃至１，１３６頁、２００１年）は、インターフェロンα８が他のサブタイプのインターフェロンαよりも、腎臓癌に対して優れた抗腫瘍活性を有していることを報告している。

しかしながら、インターフェロンα８は、他のサブタイプのインターフェロンαと同様に、生体における滞留時間が短く、例えば、静脈経路などにより生体へ投与すると、血液中のプロテアーゼによって速やかに分解されたり、ごく短時間で尿中に排泄されてしまい、所期の血中レベルを長く維持することができない。さりとて、血中レベルを高めるべく投与量を上げすぎると、インターフェロンα特有の副作用が現れ、それによって患者を苦しめる結果となる。

インターフェロンαの副作用としては、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞とともに、正常細胞に対して作用することにより、正常細胞の機能及び増殖を阻害することによって引き起こされる。とりわけ、インターフェロンαは、細胞増殖が盛んな組織である骨髄細胞に作用して、赤血球、白血球及び血小板などの血球を減少させたり、また、発熱、疲労感、頭痛、悪寒、めまい、消化管障害などの症状を発生させる。したがって、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞に対する作用が大きく、かつ、副作用が少ない、生体内で安定なインターフェロンαが求められている。

インターフェロンαの生体内での安定性を高め、副作用を減じる試みとしては、国際特許公開ＷＯ９５／１３０９０号明細書には、分子量１２，０００ダルトン又は５，０００ダルトンのポリエチレングリコールをインターフェロンαのサブタイプα２ａ又はα２ｂに化学的に付加することにより、それらの血中持続性を大幅に改善する方法を開示しており、さらに、それらを使用して、特表２００１−５２４１１０号公報には慢性Ｃ型肝炎の、特開２０００−３１９１９６号公報には腎臓癌の、特開２０００−３０９５４１号公報には慢性骨髄性白血病の、特開２０００−３１９１９５号公報には黒色腫の治療方法を開示している。しかしながら、これら文献に開示されたサブタイプα２ａ又は２ｂのインターフェロンαとポリエチレングリコールとの複合体を用いたインターフェロンα製剤は、生体内での安定性を向上させ、副作用を減じることには効果的ではあるものの、抗ウイルス活性及び抗腫瘍活性について充分とはいえず、さらに優れたインターフェロンα製剤が望まれている。

斯かる状況に鑑み、この発明は、体内安定性が改善され、抗ウイルス作用及び抗腫瘍作用がより高くかつ副作用が減じられた、インターフェロンαと水溶性の高分子からなる生理活性複合体とそれを有効成分とする感受性疾患剤を提供することを課題とするものである。

本発明者が鋭意研究したところ、本質的に、インターフェロンα８又はその変異体からなる蛋白質部分と、その蛋白質部分へ人為的に結合せしめたポリエチレングリコールなどの水溶性の高分子部分とからなる生理活性複合体は、インターフェロンα８と比較して、安定で、生体における滞留時間が有意に長く、少用量を投与しても、血中で高濃度の状態がより長く持続し、さらに、抗腫瘍活性が増強されることを見出し、本発明を完成するにいたった。

すなわち、この発明は、インターフェロンα８又はその変異体からなる蛋白質部分と、その蛋白質部分へ人為的に結合せしめた水溶性の高分子部分とからなる生理活性複合体、並びに斯かる生理活性複合体を有効成分とする感受性疾患剤を提供することによって前記課題を解決するものである。

図１は、組換え型インターフェロンα８及び１分子のポリエチレングリコール又は２分子のポリエチレングリコールが結合した組換え型インターフェロンαによるＵ９３７細胞の生細胞率を示すグラフである。

この発明でいう生理活性複合体とは、インターフェロンα８からなる蛋白質部分と、その蛋白質部分へ人為的に結合せしめた水溶性の高分子部分とからなるものである。周知のとおり、インターフェロンαは約１５０乃至１６０個のアミノ酸から構成され、起源及びサブタイプ間でアミノ酸配列が若干異なる。前述のとおりサブタイプα８が、抗ウイルス作用及び抗腫瘍作用において最も強い活性を有していると報告されている。したがって、後述する感受性疾患剤へ配合する本発明の生理活性複合体の具体例としては、蛋白質部分として、インターフェロンα８からなるものである。インターフェロンα８は、インターフェロンα８ａ（配列表における配列番号１に併記されるアミノ酸配列）、インターフェロンα８ｂ（配列表における配列番号２に併記されるアミノ酸配列）及びインターフェロンα８ｃ（配列表における配列番号３に併記されるアミノ酸配列）の３種類の配列のものが知られ、本発明においては、そのいずれをも用いることができる。又は、それらアミノ酸残基の１又は２以上を、置換、付加、もしくは欠失させ、インターフェロンα８活性を実質的に消失しない変異体蛋白質を用いることができる。本発明に用いられるインターフェロンα８及びその変異体蛋白質は、用いる常法の遺伝子組換え技術により、それをコードするＤＮＡを動物細胞、植物細胞又は微生物などの適宜の宿主に導入して産生される。また、ヒトから採取した血液細胞やヒト由来株化細胞などを培養し、適宜のインデューサーを添加して得られるインターフェロンαには、サブタイプα８を含んでいることがあり、これを適宜の方法により分離して本発明の生理活性複合体の蛋白質部分とすることもできる。

インターフェロンα８の変異体蛋白質は、既述のとおり、蛋白質を構成するアミノ酸の１又は複数を所望のアミノ酸で置換する蛋白質工学の手法により得られる。例えば、インターフェロンα８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、アミノ酸をランダムにコードするＮＮＳ配列を任意のアミノ酸残基に適用し、常法のオリゴＤＮＡ合成技術、ＰＣＲ技術、ＤＮＡライゲーション技術などを駆使して、所望のアミノ酸残基がランダムなアミノ酸で置換された蛋白質をコードするＤＮＡのライブラリーを得る。その後、ファージディスプレー法などにより、このライブラリーのＤＮＡがコードする蛋白質を発現させた後、通常のシーケンス解析とともに、例えば、インターフェロンαに対する抗体を用いる固相酵素免疫法、インターフェロンαに対する抗体若しくは受容体蛋白質を用いるパニング法、さらには、インターフェロンαの標的細胞を用いるバイオアッセイなどを組み合わせて適用することによって、インターフェロンα８活性を保持しつつ、インターフェロンα８の変異体蛋白質をコードするＤＮＡを得る。インターフェロンα８の変異体蛋白質をコードするＤＮＡの選別に当たっては、ファージディスプレー法は極めて有用であり、この方法と上述の方法の１又は複数を併用することにより、インターフェロンα８の望ましい生理活性を高レベルで保持する一群の蛋白質を迅速にして網羅的に選別できる。

この発明の生理活性複合体を構成する蛋白質部分は、斯くして得られたＤＮＡを、必要に応じて、ＰＣＲ反応によって増幅した後、プラスミドベクターなどを介して大腸菌などの宿主へ導入して形質転換し、得られる形質転換体から目的とする蛋白質を産生するクローンを選別し、それを培養することによって所望量得ることができる。形質転換体の培養物から蛋白質を採取するには、培養物へ、例えば、透析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの蛋白質を精製するための汎用の方法を適用すればよく、必要に応じて、これらの方法は適宜組み合わせて用いられる。

この発明の生理活性複合体は、斯くして得られたインターフェロンα８又はその変異体蛋白質へ水溶性の高分子を人為的に結合せしめることによって得ることができる。この発明で用いる水溶性の高分子は、実質的に水溶性であって、とりわけ、生体にとって無害かつ抗原となり難い非蛋白質性のものが好ましい。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの単独重合体、エチレングリコールとビニルアルコール、プロピレングリコールなどとの共重合体又はそれらの誘導体などの合成高分子や、エルシナン、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、プルラン、メチルセルロースなどの天然高分子が挙げられ、このうち、分子量が揃った調製物を入手し易い点で、ポリエチレングリコールの単独重合体、ポリエチレングリコールと他の水溶性の高分子との共重合体及びそれらの誘導体が好ましい。なお、水溶性の高分子の分子量は、平均分子量として、通常、５００乃至５０，０００ダルトン、好ましくは、１，０００乃至２５，０００ダルトンの範囲で加減し、分子量が不均一である場合には、蛋白質への結合反応に先だって、例えば、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの汎用の方法によって分画する。また、水溶性の高分子の形状が直鎖状構造のものは、本発明の生理活性複合体が標的細胞膜上のインターフェロンα受容体に結合するのを阻害することがあるので、本発明の生理活性複合体における水溶性の高分子の形状は、分岐状構造のものが好ましい。水溶性の高分子の種類や生理活性複合体の最終用途にもよるけれども、水溶性の高分子の分子量が上記範囲を下回ると体内動態を改善し難くなり、逆に、上記範囲を上回ると、複合体の生理活性が低下しすぎて、医薬品として使用できなくなることがある。

インターフェロンα８又はその変異体からなる蛋白質部分へ斯かる水溶性の高分子を結合せしめるには、遊離のアミノ基へ特異的に反応して共有結合を形成する試薬により別途活性化させておいた水溶性の高分子を蛋白質部分に反応させるか、あるいは、遊離のアミノ基へ特異的に反応する官能基を有する多官能試薬により、蛋白質部分と水溶性の高分子とを架橋すればよい。反応方法としては、特許文献１に記載されている方法に準じて行うことができる。また、斯界において汎用される方法、例えば、特開昭６２−２８９５２２号公報などに記載されたエステル結合法、アミド結合法などを用いてもよい。蛋白質部分と水溶性の高分子との間に形成される結合は、安定な共有結合が形成されるアミド結合法によるものが好ましい。

反応方法にもよるけれども、反応開始時における蛋白質部分と水溶性の高分子との割合は、モル比で１：０．１乃至１：１００、好ましくは、１：０．５乃至１：５０、最も好ましくは、１：１乃至１：１０の範囲で加減する。一般に、この範囲を下回ると蛋白質部分同士の結合が顕著となり、反対に、この範囲を上回ると水溶性の高分子同士の結合が顕著となる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率を低下させることとなり、通常、上記の範囲で加減するのが望ましい。反応の際の温度、ｐＨ及び反応時間は、蛋白質部分としてのインターフェロンα８又はその変異体が失活したり分解し難く、かつ、望ましくない副反応が最小になるように設定され、具体的には、反応温度を０乃至１００℃、好ましくは、２０乃至４０℃、ｐＨを０．１乃至１２、好ましくは、ｐＨ５乃至９とし、０．１乃至５０時間、好ましくは、１０時間以内に反応が完結するように設定する。斯くして得られた生理活性複合体は、インターフェロンα８又はその変異体を精製する場合と同様の方法によって精製することができ、最終使用形態に応じて、例えば、濃縮、塩析、遠心分離、凍結乾燥などの方法により液状又は固状とする。

また、インターフェロンα８に結合させる水溶性の高分子の分子数は、１分子のインターフェロンα８又はその変異体に、１乃至５分子、好ましくは、１乃至２分子、最も好ましいのは１分子である。また、本発明の生理活性複合体の比活性は、１×１０^７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、好ましくは６×１０^７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、さらに好ましくは１×１０^８ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上である。

この発明の生理活性複合体は、感受性疾患を治療又は予防するための薬剤として極めて有用である。この発明でいう感受性疾患とは、生理活性複合体を単独で投与するか、あるいは、他の薬剤とともに投与することによって治療又は予防し得る疾患全般を意味し、個々の疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、胃癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、副腎腫、甲状腺腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症などの固形腫瘍、白血病、リンパ腫などの血液系腫瘍、さらには、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳなどのウイルス性疾患、クラミジアなどの細菌感染症、アレルギー、リューマチなどの免疫疾患などが挙げられる。したがって、この発明の感受性疾患剤は、斯かる疾患を治療・予防するための、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様な用途を有することとなる。

適用対象となる感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、この発明による感受性疾患剤は、投与経路に応じて、１回当たりの用量として、生理活性複合体を０．２５ｎｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは、２．５ｎｇ乃至４００μｇ／ｋｇ体重を投与し、用途に応じて、エキス剤、エリキシル剤、下気道吸入剤、カプセル剤、顆粒剤、眼科用徐放剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シロップ剤、浸漬剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などの形態のものに調製することができる。

この発明の感受性疾患剤は、いわゆる、投薬単位形態の薬剤をも包含するものとし、その投薬単位形態の薬剤とは、生理活性複合体を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくは約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、例えば、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、座剤、散剤、錠剤、注射剤、パップ剤などが挙げられる。

この発明の感受性疾患剤は、有効成分としての生理活性複合体以外の、例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤などの薬剤一般に汎用される適宜の調剤用薬を配合することを妨げない。また、この発明の目的を逸脱しない範囲で、生理活性複合体とともに、他の有効成分として、例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、消炎剤などの外皮用薬、ビタミンＡ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤などのビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤などの滋養強壮薬、クロロフィル製剤、色素製剤などの細胞賦活用薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤などの抗腫瘍薬、抗ヒスタミン剤などのアレルギー用薬、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウイルス剤などの化学療法剤、さらには、ホルモン剤、抗生物質製剤、生物学的製剤などの本発明の生理活性複合体以外の薬剤を１又は複数配合してもよい。

さらに、この発明の生理活性複合体は、免疫助成剤として、例えば、アクチノマイシンＤ、アセグラトン、イホスファミド、ウベニメクス、エトポシド、エノシタビン、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸エピルビシン、塩酸ゲムシタビン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、塩酸ニムスチン、塩酸ピラルビシン、塩酸ファドゾール水和物、塩酸ブレオマイシン、塩酸ブロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、クレスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ジノスタンチンスチマラマー、酒石酸ビノレルビン、ソブゾキサン、ダカルバジン、チオテパ、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム、ドキシフルリジン、ドセタキセル水和物、トレチノイン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バクリタキセル、ビカルタミド、ピシバニール、ヒドロキシカルバミド、ブスルファン、フルオロウラシル、フルタミド、ベントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシンＣ、ミトブリニトール、メトトレキセート、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ペプロマイシン、レンチナンなどの抗腫瘍薬と組み合わせて用いることができ、このように、この発明の生理活性複合体を免疫助成剤としても機能させるときには、いずれか一方のみでは容易に達成できない、相乗的に高い抗腫瘍効果が得られる。しかも、斯かる併用は、抗腫瘍薬の用量を低減でき、その結果として、抗腫瘍薬による副作用を著明に軽減し得る実益がある。

この発明の感受性疾患剤は、経口経路で適用しても非経口経路で適用しても感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、具体的には、例えば、患者の症状や適用後の経過を観察しながら、体重１ｋｇ当たり０．０１乃至１，０００μｇ／日、好ましくは、０．１乃至１００μｇ／日の生理活性複合体を、必要に応じて、複数回に分けて１乃至７回／週の頻度で１週間乃至１年間に亙って経口経路で適用するか、あるいは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、直腸内、腹腔内などの非経口経路により適用する。この発明の生理活性複合体は、安定であって、血液中のプロテアーゼなどによって分解され難く、しかも、生体における滞留時間がインターフェロンα８より有意に長く、投与経路によっては１０倍以上にも達することから、同一の感受性疾患に対して同一の経路で適用する場合、投与量を有意に少なくすることができ、その結果として、正常細胞に対する細胞障害性などに起因する副作用を最小限とする実益がある。

以下、この発明の実施の形態につき、実施例に基づいて説明する。

＜インターフェロンα８の調製＞
常法にしたがって、ヒトリンパ芽球由来株化細胞ＢＡＬＬ−１（ＪＣＲＢ００７１：ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリゾーシス）から染色体ＤＮＡを採取し、これを鋳型として、配列表における配列番号４（制限酵素ＮｄｅＩ切断部位、開始コドン、及びインターフェロンα８の５´末端付近の塩基配列を有する）及び配列番号５（制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位、終止コドン、インターフェロンα８の３´末端付近の塩基配列を有する）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、常法のＰＣＲ法により、プライマー配列に特異的なＤＮＡを増幅した後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。これを、Ｔ７プロモーター領域、Ｔ７ターミネーター領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及びＣｏｌＥ１・Ｏｒｉ領域を有するプラスミドベクター（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、ノバジェン社製）へ、その上記制限酵素部位に導入した。インターフェロンα８をコードするＤＮＡ領域を常法のＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列表の配列番号２の塩基配列が解読され、インターフェロンα８ｂをコードするＤＮＡであることが判明した。さらに、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株へ導入し、組換え型インターフェロンα８産生用の大腸菌を得た。これを常法により、Ｔ−ブロス培地で培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）にて２回洗浄後、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）（２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸、及び０．５Ｍ塩化ナトリウム）に加え、常法にしたがい超音波処理し、遠心分離し、インターフェロンα８を含む残さを回収した。これを１％（ｗ／ｖ）トリトンエックス−１００を含むＴＥＳ緩衝液に加え、攪拌後に遠心分離して上清を除く操作を３回行い、得られた沈澱物を８Ｍグアニジン塩酸塩及び５０ｍＭジチオスレイトールを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、遮光下で室温で１６時間攪拌し、遠心分離して、上清を回収した。これに１００倍量の１Ｍトリス、０．９（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、０．４ＭＬ−アルギニン塩酸塩、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、０．０５（ｗ／ｖ）％ツイーン２０に少量ずつ徐々に攪拌しつつ加えた後、４℃で１６時間静置した。これを４倍量の０．１（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミンを含むリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に加え、ｐＨを６．５乃至７．５に調整した後、常法にしたがって、抗インターフェロンα抗体カラムクロマトグラフィーによりインターフェロンα活性を有するフラクションを採取した。これをさらに、ゲル濾過クロマトグラフィー（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５』、アマシャムバイオサイエンス社製）により脱塩処理を行い、組換え型インターフェロンα８を得た。そのＮ末端を、常法にしたがって、ペプチドシーケンサーにより解析したところ、「システイン−アスパラギン酸−ロイシン−プロリン−グルタミン−」であり、本実施例で製造した組換え型インターフェロンα８は、大腸菌発現のために付加した開始コドンがコードするメチオニン残基を有していないことが判明した。

＜生理活性複合体の調製＞
実施例１の方法により得たインターフェロンα８を燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に濃度０．１乃至１ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、水溶性の高分子としてモノメトキシＮ−サクシンイミジルプロピオネートにより活性化させたポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ−ＳＰＡ、平均分子量５，０００ダルトン）をモル比で蛋白質の３倍になるように加え、３７℃で３０分間反応させた。次いで、反応混合物へε−アミノカプロン酸をモル比で水溶性の高分子の１０倍量加え、暫時静置して反応を停止させた後、反応混合物を陰イオン交換クロマトカラム（商品名『ＭｏｎｏＳ』、アマシャムバイオサイエンス社製）によりＨＰＬＣ分画して蛋白質に結合していないポリエチレングリコールを除去した。さらにゲル濾過クロマトカラム（商品名『Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２』、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いてＨＰＬＣにより分画し、得られた分画からそれぞれ少量ずつ採取し、常法のＳＤＳ−電気泳動より、分子量約２８，０００ダルトンにバンドが出現する（１分子のインターフェロンα８当り１分子のポリエチレングリコールが結合してなる生理活性複合体を含む）画分、及び、分子量約３５，０００ダルトンにバンドが出現する（１分子のインターフェロンα８当り２分子のポリエチレングリコールが結合してなる生理活性複合体を含む）画分を選択した。

斯くして得られた２種類の生理活性複合体は、標準物質としてヒトインターフェロンα国際標準品を用い、かつ、ＦＬ細胞及びシンドビスウイルスを用いる常法のアッセイ系によりウイルス感染阻止活性を測定したところ、比活性は６．４６×１０^７ＩＵ／ｍｇ蛋白質であり、ポリエチレングリコールを結合していない組換え型インターフェロンα８の比活性である２．４９×１０^８ＩＵ／ｍｇ蛋白質と比べて、約４分の１の比活性を有していた。ちなみに、ポリエチレングリコール結合数が２分子である生理活性複合体の場合は、比活性が１．３８×１０^７ＩＵ／ｍｇであった。

＜細胞増殖抑制＞
腫瘍細胞として、ヒト羊膜由来株化細胞Ｕ９３７（ＪＣＲＢ９０２１）を標的細胞として用いて、細胞増殖抑制効果を調べた。１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に、１×１０^６個／ｍｌの濃度でＵ９３７細胞を播種し、これに、実施例２におけるウイルス感染阻止活性値を指標にして、２０乃至１０，０００ＩＵ／ｍｌの範囲で、サンプルとして、実施例１で得た組換え型インターフェロンα８、実施例２で得た組換え型インターフェロンα８に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体、又は、実施例２で得た組換え型インターフェロンα８に２分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体を段階希釈して加え、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で７２時間培養した。並行して、サンプルを添加しない系を設け、上記と同様に処理して対照とした。これらを常法に従い、酸化−還元インジケーター（商品名『アラマーブルー』、トレックダイアグノスティク社販売）を用いて、生細胞数を計測し、対照と比較して、生細胞率を下記数式１により算出することにより、細胞増殖抑制効果を調べた。結果を図１に示す。なお、図１中、「●」は組換え型インターフェロンα８、「▲」は１分子の組換え型インターフェロンα８に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体、及び「■」は１分子の組換え型インターフェロンα８に２分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体を示す。

＜数式１＞
生細胞率（％）＝（インターフェロンα存在下での生細胞数／対照の生細胞数）×１００

図１に示すとおり、ポリエチレングリコールが結合した組換え型インターフェロンα８は、ポリエチレングリコールが結合していないものに比べて、生細胞率が低く、細胞増殖抑制活性が強いことが示された。特に、インターフェロンα８に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体は、他のサンプルでは効果が発揮されない約１００ＩＵ／ｍｌの濃度から、増殖抑制活性が強く発揮されていた。この結果は、インターフェロンα８に水溶性の高分子を結合させることにより、インターフェロンα８の腫瘍細胞に対する増殖抑制作用すなわち抗腫瘍作用を高めることができることを物語っている。

＜熱安定性＞
実施例１で得た組換え型インターフェロンα８及び実施例２で得たインターフェロンα８に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体をそれぞれ、５（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地で１０，０００ＩＵ／ｍｌの濃度に調製し、下記表１に示す温度で３０分間加熱処理を行った。遠心分離後、培地上清を回収し、それらをＦＬ細胞及びシンドビスウイルスを用いたアッセイ系に供し、残存するウイルス感染阻止活性を測定し、加熱前のウイルス感染阻止活性に対する百分率（残存活性率）を下記数式２により求めた。結果を表１に示す。（表中、「ＰＥＧ−ＩＦＮα８」は、１分子の組換え型インターフェロンα８に、１分子のポリエチレングリコールが結合した本発明の生理活性複合体を、「ＩＦＮα８」は、ポリエチレングリコールが結合していない組換え型インターフェロンα８を示す。）

＜数式２＞
残存活性率（％）＝（加熱後のウイルス感染阻止活性／加熱後のウイルス感染阻止活性）×１００

表１の結果が示すとおり、１分子のポリエチレングリコールが結合した組換え型インターフェロンα８は、ポリエチレングリコールが結合していない組換え型インターフェロンα８の大部分が失活する６０℃加熱処理によっても、４０％以上の活性が残存していた。このことは、インターフェロンα８に水溶性の高分子が結合したこの発明の生理活性複合体は、熱によって失活しにくく、水溶性の高分子が結合していないインターフェロンα８よりも安定であることを物語っている。

＜体内動態＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した血清と、生理食塩水により５μｇ／ｍｌに希釈した実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンα８に１分子のポリエチレングリコールが結合している生理活性複合体とを体積比４：１の割合で混合し、一定間隔を置いてサンプリングしながら、３７℃で９時間インキュベートした。採取したサンプルは、直ちにＦＬ細胞／シンドビスウイルスを用いる常法のバイオアッセイ系によりウイルス感染阻止活性を測定し、インキュベーション前のインターフェロンα活性に対する百分率（残存活性率）を下記数式３に求め、安定性の指標とした。併行して、生理活性複合体に代えて組換え型インターフェロンα８を投与する系をそれぞれ設け、これらを上記と同様に処置して対照とした。結果を表２に示す。

＜数式３＞
残存活性率（％）＝（インキュベーション後のインターフェロンα活性／インキュベーション前のインターフェロンα活性）×１００

表２の結果が示すとおり、対照においては、組換え型インターフェロンα８は容易に分解され、９時間インキュベートすると、残存活性率が５％にまで低下した。これに対して、この発明の生理活性複合体は、９時間インキュベートしても、なお７０％以上の残存活性率であった。このことは、この発明の生理活性複合体が血清中のプロテアーゼなどによって分解され難く、安定であることを物語っている。

さらに、実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンαに１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体を濃度５μｇ／ｍｌになるように生理食塩水で希釈し、ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に２００μｌ／匹の用量で注射投与した。投与後、直ちに採血し、次いで、２時間間隔で１０時間にわたり尾静脈から血液を採取し、インターフェロンα中和抗体を用いる酵素免疫分析により生理活性複合体の濃度を測定した。併行して、生理活性複合体に代えて実施例１で得た組換え型インターフェロンα８を投与する系を設け、これらを上記と同様に処置して対照とし、血中残存率を下記数式４により求めた。結果を表３に示す。

＜数式４＞
血中残存率（％）＝（各時間後の血中におけるインターフェロンα濃度／投与直後の血中におけるインターフェロンα濃度）×１００

表３の結果に見られるとおり、対照においては、投与直後からインターフェロンαの血清レベルは急激に低下し、４時間経過した時点では１０％未満にまで低下したのに対して、この発明の生理活性複合体は、６時間経過した時点でも、５０％以上であった。このことは、この発明の生理活性複合体が、水溶性の高分子と結合していない組換え型インターフェロンα８と比較して、血中安定性が有意に優れ、注射投与しても、生体内により長く滞留し得るものであることを物語っている。

＜急性毒性＞
常法にしたがって、８週齢の雄性マウス（体重２０乃至２５ｇ）に実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンαに１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体を経皮、経口又は腹腔経路で注射投与したところ、生理活性複合体のＬＤ_５０は、いずれの投与経路においても１ｍｇ／ｋｇ体重以上であった。このことは、この発明の生理活性複合体がヒトへの投与を前提とする医薬品として、又は医薬品に配合して用いることが安全であることを物語っている。

＜液剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｗ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンαに１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。

本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための注射剤、点眼剤及び点鼻剤などとして有用である。

＜乾燥注射剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｗ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンαに１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体を１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥させた後、密栓して乾燥注射剤を得た。

本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するため乾燥注射剤として有用である。

＜軟膏剤＞
滅菌蒸留水にカルボキシビニルポリマー（商品名『ハイビスワコー』、株式会社和光純薬工業販売）と、パイロジェンを除去した高純度トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売）とをそれぞれ濃度１．４％（ｗ／ｗ）及び２．０％（ｗ／ｗ）になるように溶解した後、実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンαに１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体の適量を均一に混合し、ｐＨ７．２に調製して、１ｇ当り生理活性複合体を約５μｇ含むペースト状物を得た。

延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための軟膏剤として有用である。

＜錠剤＞
無水結晶性α−マルトース粉末（登録商標『ファイントース』、株式会社林原商事販売）に実施例２の方法により得た１分子の組換え型インターフェロンαに１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体の適量を均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当り生理活性複合体を約１μｇ含む錠剤を得た。
摂取性、安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療・予防するための錠剤として有用である。

以上説明したとおり、インターフェロンα８からなる蛋白質部分と、その蛋白質部分に人為的に結合せしめた水溶性の高分子部分とからなるこの発明の生理活性複合体は、体内動態に優れ、注射投与しても、血中で高濃度状態が長時間持続する。したがって、斯かる生理活性複合体を有効成分とするこの発明の感受性疾患剤は、医薬品の分野において、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス疾患剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様の用途を有する。しかも、この発明の生理活性複合体は、インターフェロンαのサブタイプの中でも最も優れた生理活性を有するインターフェロンα８を蛋白質部分として有することから、生体に投与した場合、他のインターフェロンαサブタイプよりも投与量を少なくすることができる。よって、副作用が軽減できるので、患者の身体的苦痛を和らげることができる。

Claims

配列表における配列番号１、２又は３に併記されるアミノ酸配列を有する人のインターフェロン−αにおけるサブタイプα８の１分子当たり、モノメトキシＮ−サクシンイミジルプロピオネートにより活性化させた平均分子量１，０００乃至２５，０００ダルトンのポリエチレングリコールが１分子結合してなる、ＦＬ細胞／シンドビスウイルス系を用いて測定したときの比活性が６×１０^７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上である生理活性複合体。
請求項１に記載の生理活性複合体を有効成分とする感受性疾患剤。
抗腫瘍剤、抗ウイルス剤又は抗アレルギー剤としての請求項２に記載の感受性疾患剤。