JPH03236400A - 化学修飾ポリペプチド及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトインターロイキン３活性を有するポリペ
プチド（以下、ＩＬ−３と略す）に関し、ポリペプチド
分子中の少なくとも１個のアミノ酸を化学修飾して得ら
れる化学修飾蛋白質及びその医薬用途に関する。

ＩＬ−３は、造血細胞の共通の幹細胞や各種白血球（顆
粒球、好酸球、マクロファージ、血小板、肥満細胞）の
前駆細胞に作用し分化及び増殖を促す生理活性物質であ
る（三浦恭定、蛋白質核酸酵素ｖｏ１．３２．ｐ、１２
０　（１９８７）。小安重夫、細胞工学ｖｏｌ。

６　（１９８７）。医薬品としての用途としては、次の
２つが考えられる。すなわち、造血細胞の共通幹細胞お
よび各種白１ｉｌ１球の前駆細胞を増殖することから骨
髄移植時の補助薬と１−で、他の１つは、臨床約要望の
強い匍小板増殖薬と１．ての用途である８骨髄移植は、
白血病治症のための放躬綿障害、悪性リンパ腫、抗癌剤
投与ｔ；二よる各種障害の治療法として有用な方法であ
るが、移植する骨髄細胞が大量に必要な為、ドナーの負
担が大きい。そのため１度採取した骨髄細胞を生体夕）
で大壷に増やしたり、あるいは移植時に１７シビ工ント
体内で急速に増殖させて血球の回復を早めることが可能
となれば、医薬−に丙朋的な方法となる（医薬のあゆみ
、　Ｖｏｌ、１４６（Ｎｏ、５）　（１９８Ｂ））。

一方、血小板は、抗癌剤を人髪１１−投与された担癌患
者において極度に低下し、この様な！悲者においては、
手術時に血小板減少による出血過多が起こる。ＩＬ−３
は、血小板の増殖を促進させることにより、これらの副
作用を軽減させることが期待される（Ｓ、Ｃ，Ｃ１ａｒ
ｋ　ａｎｄ　ＲＪａｍｅｎ、　５ＣＩＥＮＣＥ、　Ｖｏ
ｌ、２３６゜ｐ、１２２９　（１９Ｂ？））。

本発明の化学修飾ポリペプチドは、既知の１１．−３よ
り侵れた機能を有（７て、ｌり医薬品と１−２での利用
が期待される。

〔従来の技術〕

ＩＬ−３の遺伝子＆ｌｌｌ換え＃による製造技術につい
ては、すでに報告（Ｙ、Ｃ，Ｙａｎｇら；Ｃｅ１１．４
７．　ｐ、３　　（１９８６）及び！１．１１１ｏｒｓ
ｓｅ＋ｒ　ら−；Ｇｅｎｅ９ｉ、ｐ、１１５−１２４．
（１９８７））があり、Ｉ　Ｌ　−３を、゛コードする
遺伝子の塩基配列ならびにそれによって生産されるポリ
ペブチｔ′のア週ノ酸配列は、共に公知である。なお、
（Ｌ−３は、１５４個のアミノ酸残基からなるポリペプ
チドを含む糖蛋白質と考えられている（＋ｆ、Ｃ，Ｙａ
ｒ＋ｇら；Ｃｅ１ｌ。

４ユ、　ｐ、３　　（１９Ｂ６））。

このようにして得られるＩｆ−３は、生体内でのクリア
ランスが速く、効用的投与のためには、連続抄部する必
要があると考えられる、また−船釣に高分子ｄブチドを
連続的に投与すると抗原性が問題となることが知られて
いる（「食品栄養薬学のためのタンパク賞の修飾」Ｒ，
Ｉｌ！、Ｆｒｅｅｎｅｙ　ａｖｉｄ　Ｊ、Ｒ０Ｗｈｉｔ
ａｋｅｒ著、荒井綜−監修、■学会出版センター；　「
蛋白質の機能変換」斉藤、稲田、゛プロティンエンジニ
アリング”ｐ、２３４．■シーエムシー　１９８５．６
．２８、）。

このよ・うなことから抗原性を低下させ命中の停滞時間
を延長させるための方法としては、Ｉ’ｌＵＧ化、デキ
ストラン修飾、グルタ電ン酸とリジンのポリマー（Ｆ、
Ｔ、Ｉ、ｉｕ、　Ｍ。Ｚｉｎｎｅｃｈｅｖ、　Ｔ、Ｉ（
ａｎａｏｋａ、　ｌ）、Ｈ。

Ｋａｔｚ、　Ｂｉｏｃｈｅｉｉｉｓｔｒｙ、　１８．６
９０（１９７９））、プルラン、ガンマグロブリン、ポ
リアスパラギン酸ｇＲ＝体（Ｍ、０ｋａｄａ、　Ａ、Ｍ
ａｔｓｕｈｉｉａ、　Ａ、Ｋａｔｓｕｈａｔａ、　Ｔ、
Ａｏｙａｍａ。

Ｔ、Ａｎｄｏ、　　Ｙ、Ｉｎａｄａ、　　　頁ｎｔ、Ａ
ｒｃｈｓ、Ａ１１ｅｒｇｙ　　Ａｐｐｌ、Ｉｍｍｕｎ、
。

６６、１８９　（１９８１）　、スマンクス（ｌ（、Ｍ
ａｅｄａ、　Ｔ、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｔ、Ｋａｎｎ
ｏ、　Ｍ、Ｉｗａｉ、　Ｍ、Ｕｅｄａ、　Ｊｏｕｒ、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎＣｈｅｉ、＋　３　＋　１８Ｎ１９８４Ｌ
　Ｈ，Ｍａｅｄａ＋　ｌ’１．Ｕｅｄａ、　Ｔ、Ｍｏｒ
ｉｎａｇａ、　Ｔ、Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｊｏｕｒ、
Ｍｅｄ、（ｊｖｅｍ、、（１９８５）＋前田浩、今野俊
光、岩井顕、殻稈二部、田代征記、。

癌と化学療法１上、　１８１４　（１９８４））、脂肪
Ｈ（Ａ、Ｓａｇａ１１１ａ＋　　Ｍ、Ｂｏｒｇｅｓ、　
　Ｙ、Ｖｏｋｏｔ、ａ、　　Ａ、Ｍａｔｓｕｂｉａｍａ
、　　Ｙ、Ｉｎａｄａ、　Ｉｎｔ、、Ａｒｃｈｓ、Ａｌ
ｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、Ｉｍ問ｎ、、　７６、７９（１
９８５））などが知られている。また、アスパラギナー
ゼ、ウリカナーイどなどの人以外由来の酵素類（。二つ
いてポリエチレングリコールで化学修飾を行うことによ
り抗原性の滅弱が認められている。

〔発明が解決しようとする課題］ 遺伝子組み換え技術によって大腸菌で生産される霊長類
インターロイキン３活性を有するポリペプチド（ＩＩ、
−３）は、安価に大量に得ることができるが、人体に連
続的に投与した場合、抗原性を示すことが懸念される。

そこで副作用の少ないＩＩ、−３を医薬品として用いる
必要姓から１、その抗原性が認められない形態を取るこ
とが望ましい。また、命中の停滞時間を延長させ、投与
業を少なくすることが望ましい。

しかしながら、そのような性質を有するＩＬ−３は、本
発明が完成するまで開発されていなかった。

ＥＲＲを解決するための手段〕 本発明者らは、ＩＣ−３のポリペプチド分子中の少な（
とも１個のア泉）酸を化学修飾することにより未修飾の
ＩＬ−３と比較してみたところ、抗原性が消失すること
を見いだし、これを基礎として本発明を完成するに至っ
た。

すなわち、本発明は、霊長類、特にヒト及びサルにおけ
るインターロイキン３活性を有する糖蛋白質またはポリ
ペプチドにポリエチレングリコールを結合してなる化学
修飾蛋白質ならびにその血小板増殖促進剤及び骨髄細胞
増殖促進剤としての用途に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明において、ＩＬ−３としては、ヒトインターロイ
キン３活性を有する分子で大腸菌において生産されたポ
リペプチドが好ましい、そして、このＩＬ−３は本発明
者らが既に出願している特願昭６３−３２５３１３号（
特開平２−４８２号）に記載した方法に従い調製できる
。

本発明において、ＩＬ−３とポリエチレングリコールと
は、ポリペプチドのアミノ酸残基を介して互いに共有結
合している。該アミノ酸残基は遊離アミノ基あるいは遊
離カルボキシル基等を有する任意の反応性アミノ酸であ
り、活性化されたポリエチレングリコールの反応性基が
これら遊離アミノ基あるいは遊離カルボキシル基等に連
結される。

遊離アミノ基を有する７５ノ酸残蟇としてはリジンある
いはＮ末端アミノ酸残基である。遊離カルボキシル基を
有するアミノ酸残基としてはアスパラギン酸、グルタミ
ン酸あるいはＣ末端アミノ酸残基である。

使用するポリエチレングリコールの分子量は特定のもの
に限定される必要はないが、通常的５００〜３０．００
０、好ましくは約４．０００〜２０，０００のもので市
販のものが用いられる。

ポリエチレングリコールは、末端反応性基（スペーサー
）を介してヒトＩＬ−３上に結合される。スペーサーを
有するポリエチレングリコールを、活性型ポリエチレン
グリコールと称する。スペーサーは、例えば遊離ア逅ノ
基とポリエチレングリコールとの結合を仲介するもの、
あるいは遊離カルボキシル基とポリエチレングリコール
との結合を介するもの等が挙げられる。遊離アミノ基と
結合する活性型ポリエチレングリコールとして例えば次
式で表されるものがある。

ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをＮ−ヒド
ロキシスクシニルイミドにより活性化したＮ−ヒドロキ
シスクシニルイ逅ドポリエチレングリコールが使われる
。また遊離カルボキシル基と結合する活性型ポリエチレ
ングリコールとして例えば次式で表されるポリオキシエ
チレンシア主ンがある。

ＨＪＣＨｚＣＨｔＣＨｔＯ（Ｃ２Ｈ３Ｏ）　、ＣＩＩＣ
ＨＩＣＩ２ＮＨ！共有結合修飾反応は、生物学的に活性
な材料を活性化ポリエチレングリコールと反応せしめる
ために一般的に使用される適当な任意の方法により実施
しうる。　ＩＬ−３上の反応性アミノ酸が遊離アミノ基
を有するアミノ酸である場合にはｐＨ４，０〜１０．０
において行われる。この反応は例えば、リン酸塩、ホウ
酸塩等の緩衝液中ｐｉ（４，０〜１０．０、温度０°Ｃ
〜６０℃で１〜７２時間行う、ＩＬ−３の遊離アミノ基
に対し、活性型ポリエチレングリコールを１〜２０００
倍モル量、好ましくは、５〜５００倍モル量用いる。な
お、アミノ酸残基の修飾率は、上記の活性型ポリエチレ
ングリコールの使用量の及び反応時間の範囲を変化させ
ることにより、自由に変動させることができる。必要に
応じて、反応液の反応は酢酸等によりｐＨを低下させる
ことにより反応を停止し、透析、塩析、限外濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動なと、
通常の蛋白質の精製法で精製し、目的とするポリエチレ
ングリコール修飾ＩＬ−３、即ち本発明の化学修飾蛋白
質を得ることができる。必要に応じて上記の方法により
修飾率の均一なポリエチレングリコール修飾ＩＬ−３を
精製し取得することができる。

このようにして得られた霊長類インターロイキン３活性
を有するポリペプチドにポリエチレングリコールを結合
してなる化学修飾蛋白質（以下、ＰＥＧ　ＩＬ−３とす
る）は、サルに投与したとき、もとの未修飾ＮＬ−３と
同様の献小板増加活性を有する。

ｆ’１ｌｉＧ　ＩＬ−３について抗体産生能の低下を調
べる実験を行ったとこる、ポリエチレングリコールで修
飾するこＬにより、もとの抗原性が消失し、未修飾のＩ
Ｌ−３よりも擾れた性質を示すことが認められた。

ＰＥＧ　ｆＬ−３は、未修飾のＩ　Ｌ　−３？ｖ、比較
して次の優れた作用及び効Ｒを有する。

１　、　ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて未修飾のＩＬ−３と同
じ作用を示すや　（未修飾のＫＬ−３と同じ匍小板増加
作用を示す、） ２、　ＰＥＧ　！Ｌ−３は、抗体産生誘導を示ざず抗原
性がほとんど認められない、 以上のようにＰＥＧ　Ｉ＋、−３は優れた作用を有し、
しかも毒性は低（２′１ので、骨髄細胞増殖促進剤（骨
髄移植補助剤）あるいは血小板増殖促進剤と１．て有効
に用いることかで永る。

本発明のｌ’ＨＧ　ＩＬ−３を骨髄移植補助剤あるいは
血小板増殖促進剤として用しするには５、例えば哺乳動
物の各種急性もしくは亜象、性の血球低下の治療を目的
として、経口的にまたは非経日的に投与する。

投与するにあたっては、ＰＥＧ　ＩＬ−３を薬理的に許
容Ｌ２得る担体、賦形剤、希釈剤などを混合し、それ目
体公知の方法で、経Ｏ剤として例えば錠剤、カプセル剤
として、非経Ｏ剤として例えば注射剤として、上記哺乳
動物に投与する。

Ｐ胚ＸＩ、−３の１口授り、景は、Ｐ肛ＩＣ−３中の蛋
白質量として約５μｇ”１１００Ｉ１／ヒト、更に好ま
しくは約２０μ８〜５０ｍｇ／ヒトとなるＰＥＧ　ＩＬ
−、’（の量である。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではな
い。

実施例１ 理炙ｌ頻−の一用づ一シ刈を戊 修飾に用いたヒ■Ｌ−３は、遺伝子組換え技術によって
発現させたもので、次のアミノ酸配列よりなるポリペプ
チドである。

？ｌＥＴ　ＡＬＡ　ＰＲＯ肝Ｔ　ＴＨＲＧＬＮ　Ｔ）Ｉ
ＲＴＩＩＲＳＢＲＬＥＩＩＬＹＳ　ＴＨＲＳＥＲＴＲＰ
　ＶＡＬ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　ＳＢＲＡＳＮ　ＭＥＴＩＬ
ＥＡＳＰ　ＧＬＵ　　ＩＬＢ　　ＩＬＢ　ＴＨＲＨＩＳ
　ＬＥ［Ｊ　ＬＹＳ　ＧＬＮＲＯ ＬＢＩＩ ＧＬｔｌ ＡＬＡ ５Ｎ ＰＲＯＬＢ［Ｉ　　ｌ’ＲＯ ＡＳＮ　　引Ｊ　　ＧＬｔｌ ＡＳＮ　　ＡＳＮ　　ＬＨ［Ｊ ＰＨＩ　　ＡＳＮ　　ＡＲＧ ＡＬＡ　　ＳＰＲＡＬＡ ＡＬＡ　　ＡＬＡ　　ＰＲＯＴ）ＩＲ ＬＥＩＩ　　ＬＨ［Ｊ ＡＳＰ　　ＧＬＮ ＡＲＧ　　ＡＲＧ ＡＬＡ　　ＶＡＬ ＩＬＢ　　ＧＬＵ ＡＳＰ　同化　ＡＳＮ　　ＡＳＮ ＡＳＰ　　ＩＬＢ　　ＬＢＩＩ　　ＭＥＴＰＲＯＡＳＮ
　　Ｉ、Ｅｌｌ　　ＧＬＵＬＹＳ　　ＳＥＲＬＥＩＪ　
ＧＪ、Ｎ ５ＥＲＩＬＥ　　ＬＥＵ　ＬＹＳ ＡＲＧ旧Ｓ　ＰＲＯＩＬＦＩ　ＨＩＳ　ＩＬＥボリエヂ
レングリコールは、平均分装置が約４゜５００のポリエ
チレングリコールのコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシ
スクシニルイ迅ドにより活性化したＮ−にドロキシスク
シニルイミドポリエチレングリコール（活性をＰＥＧ）
　（日本油脂製）を使用した。

ヒｔ−ＩＣ−３ヲ０．５Ｍ　ホウＭ　３−　）　’Ｊ　
’ｙ　ムＩｌ＆１’ｌ’Ｉ（ｐ　Ｈ８゜５）中で、活性
を叶Ｇと室温で２０時間反めさせ、酢酸を加える、二と
で、ｐＨを低下さ丑゛て反応を停止した。活性型ＰＥＧ
の使用量は、特に限定されないがヒトＩＬ−３の遊離ア
ミノ基に対して１〜５０倍量を用いることが好ましい。

生成物より予め２０−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
４）で平衡化させたＣＭイオン交換クロマトグラフィー
を用いて試薬及び必要に応じて未反めヒＨ１，−３から
種々の形のポリエチレングリコール修飾ヒ）−ＩＬ−３
を分離した。

カラムは、大きさが、１．ＯＸ７゜ＯｃｌのＣＭセファ
ロースＦＦ　（ファルマシア製）を用い、流速は、ｌｄ
／分にした。、０Ｍイオン交換り０７トグラフイーを行
った結果は、第１図に示す通りである。縦軸は、カラム
から溶出されてきた溶液の紫外吸収を横軸は溶出された
液の置を示している。この聞イオン交換クロマトグラフ
に−より溶出してきた溶液をそれぞれ画分に分けた。以
降この反めで得られたＰＥＧ修飾ヒ目１．−３をＰＥＧ
　（４５００）　１１、−３という。

実施例２ ７４５００ΣｕＪＩイＩＬ！ｔ− 実施例１で作成したＰＥＧ　（４５００）　ＩＬ−３の
特徴付けを５ＯＳ−ＰＡＧＥによる分子量の推定によっ
て行った。

反応物の分子量測定は、５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（１６％ゲ
ル）上で行った０反応生成物をＬａｅｓｌｉの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ。

ム舊、　ｐｐ６８０　（１９７０）に準じて５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥをを行った。

染色後、各ゲルの各レーンのスキャニングを行った。測
定には島津クロマトスキャナー（ｃｓ−９３０）を用い
た。

ＣＭイオン交換クロマトグラフィーからの溶出した画分
の５ＯＳ−ＰＡＧＥの結果を第２図に示す。画分３．４
には、主に、分子口約３４に、　４０にのバンドが、両
分１４．１５．１６には、主に、分子口約２８に、　３
４にのバンドが画分２１には、主に、分子口約２８にの
バンドが、画分２４には、主に、分子口約１５にの未修
飾ＩＬ−３のバンドが、検出された。

ヒトＩＬ−３のアミノ基に対する活性型ＰＥＧの比率及
び反応時間の増加につれて、修飾の程度は増加した０反
応生成物では、未修飾ＩＬ−３のバンド（１５Ｋ）のほ
かに、約２８に、　３４に、　４０にの見かけ分子量を
有するＰＥＧ修飾ヒトＩＬ−３のバンドが認められた。

また、イオン交換クロマトグラフィーから溶出された画
分の５ＯＳ−ＰＡＧＥのパターンにより、より修飾され
た分子種はど早く溶出し、最後に溶出された画分が未修
飾し）　ＩＬ−３であることがわかった。

実施例３ ＰＥＧ　　０ＩＬ−の 修飾に用いたヒトＩＬ−３は、実施例１に示したものと
同じである。ポリエチレングリコールは、ポリエチレン
グリコールモノメチルエーテルと塩化シアヌール酸より
合成された下式に示す平均分子口約ｉｏ、ｏｏｏの活性
型ポリエチレングリコール（活性型ＰＩ！Ｇ　２　）　
（生化学工業社製）を使用した。

ヒトＩＬ−３を０．２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０）中で、活性型ＰＥＧ　２と室温で１時間反
応させ、酢酸を加えることで、ｐＨを低下させて反応を
停止した。活性型ＰＥＧＯ量は、ヒトＩＬ−３の遊離ア
ミノ基に対して５倍量を用いた。実施例１と同様に、生
成物により予め１０■Ｈ酢酸ナトリウム緩衝液で平衡化
させた曲イオン交換クロマトグラフィーを用いて試薬及
び必要に応じて未反応ヒトＩＬ−３から種々の形のポリ
エチレングリコール修飾ヒトＩＬ−３を分離した。ある
いは、ＣＭイオン交換クロマトグラフィーを行う前に１
０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で反応生成物を希釈し、限
外濾過（３００００カツト）により濃縮を行いこれを繰
り返すことで、まずＰＥＧ修飾ヒトＩＬ−３を分離した
。

ＰＥＧ修飾ヒトＩＬ−３の分離条件は次のとおりである
。

カラム　　ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ流速　１Ｍ
１／ｗｉｎ 検　出　　紫外吸収２Ｂ０ｎｓ＋ 緩衝液　　１０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５，４実
施例２と同様に５Ｏ５−ＰＡＧＥ上にて分子量の推定を
行ったところその分子量は、約２８に、　３８に、　８
０にであった。以降この反応で得られたＰＥＧ修飾ヒト
ＩＬ−３をＰＥＧ（１０，０００）ＩＬ−３という。

実施例４ ＰＥＧ　　ＩＬ−の 実施例１で用いたＩＬ−３と、実施例１で作成したＰＥ
Ｇ（４５００）　ＩＬ−３について、モルモットにおけ
る抗体産生誘導能を調べた。モルモット（ハートレー系
、雄性、投与開始時に６週齢）を１群５匹として２群に
分け、１群（０群）には、ＩＬ−３１００μｇ／咄を、
他方の１群（■群）には、ＰＥＧ（４５００）ＩＬ−３
１００μｇ／ｋｇを、それぞれ週２回、３週間の計６回
にわたり皮下に感作投与した。感作投与終了の２週間後
にモルモットから心臓採血により血清を得て、同種受動
的皮膚アナフィラキシ−（ＰＣＡ）試験により血清中の
抗体価を測定した。　　ＰＣＡ試験は以下のようにして
実施した。感作投与を行ったモルモットの血清１検体に
ついて各１匹のモルモット（ハートレー系、雄性、８週
齢）を用意し、試験実施の前日に背部を剪毛した。生理
食塩液で１０゜２０、４０．８０．１６０及び３２０倍
希釈した血清と、生理食塩液をモルモットの剪毛した背
部の７か所に０．１＋＋ｄずつ皮肉注射した。皮肉注射
の４時間後に誘発抗原液を陰茎静脈内投与した。誘発抗
原液としては、０群のモルモットの血清を皮肉注射した
モルモットにはＩＬ−３１００μｇを、■群のモルモッ
トの血清を皮肉注射したモルモットにはＰＥＧ　（４５
００）ＩＬ−３１００μｇを、それぞれ含む１％Ｅｖａ
ｎｓ　ｂｌｕｅＰＢＳ　（ｐＨ６，５）溶液０．６ｄ／
ｂｏｄｙを用いた。誘発抗原液の静脈内投与から３０分
後にモルモットを頭部打撲、放血致死させ、背部皮膚を
剥離した。皮膚裏面の色素漏出斑の長・短径の平均が５
ｍ以上のものを陽性と判定し、陽性となる血清の最大希
釈倍率をＰＣＡ抗体価とした。結果を第１表に示す。

ＩＬ−３を感作投与したモルモットの血清は５例全例で
ＩＬ−３に対するＰＣＡ陽性反応がみられたのに対し、
ＰＥＧ（４５００）　ＩＬ−３を感作投与したモルモッ
トの血清はＰＥＧ（４５００）　ＩＬ−３に対して１例
で非常に弱いＰＣＡ陽性反応がみられただけで４例で陰
性であり、ＩＬ−３に比較して、ＰＥＧ（４５００）　
ＩＬ−３のモルモットでの抗体産生誘導能が低下してい
ることが示唆された。

（本頁以下余白） 第１表　ＩＬ−３及びＰＥＧ　（４５００）　ＩＬ−３
の抗体産生誘導能実施例５ 実施例１で作成したＰＥＧ　（４５００）　ＩＬ−３の
ｉｎ　ｖｉｔｒ。

での活性を、増殖因子依存性細胞株ＴＦ〜１の増殖促進
能力を指標として測定した。ＴＦ−１は白血病患者の骨
髄由来で、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）またはＩＬ
−３に依存して増殖する細胞株である。　ＧＭ−ＣＳＦ
　２ｎｇ／ｄと１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ　１６
４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で継代維持したＴＦ−１細胞
を用いた。９６ウエル平底マイクロプレートの各ウェル
中に、ＧＭ−ＣＳＦを洗浄除去したＴＦ−１細胞ｌＸｌ
０’個、各種濃度のＰＥＧ（４５００）ＩＬ−３及び１
０％牛脂児血清を含む最終容量１００μｌのＲＰＭＩ　
１６４０培地を加え、３７°Ｃ５湿度１００％、５％Ｃ
Ｏｔ存在下に７２時間培養した。各ウェルに３−（４，
５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェ
ニルテトラゾリウム・プロミド（ＭＴＴ、　ＣＨＥＭＩ
ＣＯＮ）　５　Ｋ／１を１０μｌずつ加えて、更に４時
間培養した。生じた沈澱物を０．０４Ｎ　ＨＣＩを含む
イソプロパツール１００ｕＩｌを各ウェルに加えて良く
攪拌して溶解させ、１時間以内にマイクロプレートリー
ダーで６２００醜を対照として５７０ｎ−の吸光度を測
定した。その結果、第３図に示すように、ＰＥＧ（４５
００）　ＩＬ−３は濃度依存的に骨髄由来の細胞株を増
殖させることが確認された。

実施例６ 実施例１で作成したＰＥＧ（４５００）　ＩＬ−３のｉ
ｎ　ｖｉｔｒ。

での活性を、ヒト骨髄細胞由来のコロニー形成促進能力
を指標として測定した。骨髄細胞をα培地（Ｆｌｏｓ４
）に懸濁し、シリカ（ＩＢＬ）を加えて、３７°Ｃ５％
ＣＯｔ存在下で３０分間培養した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐ
ａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に重層した。室温で
３０分間４００×ｇで遠心分離し、中間層を採取し洗浄
した。更に、細胞をα培地に懸濁し、プラスチックデイ
ツシュ中で３７℃、５％ＣＯｔ存在下に１時間培養後、
浮遊細胞を採取した。

以上のように調製した非貧食性非付着性単核細胞２Ｘ１
０’個を、０．８％メチルセルロース（信越化学）、３
０％牛脂児血清（Ｂｏｃｋｎｅｃｋ　）、１％牛血清ア
ルブ藁ン（Ｓｉｇｍａ）、５　Ｘｌ０−’Ｍ　２−メル
カプトエタノール（Ｅａｓｔｍａｎ）及び各種濃度のＰ
ＥＧ　（４５００）　ＩＬ−３を含むα培地に加えｌｌ
ｌ１とし、３５閤径培養皿（１５２２１Ｒ，Ｍｉｌｅｓ
）に分注した。１条件について３プレートで培養した。

３７℃、湿度１００％、５％ＣＯｔ存在下に１４日間培
養後、コロニー数を算定した。その結果、第４図に示す
ように、ＰＥＧ　（４５００）　ＩＬ−３は濃度依存的
に骨髄由来細胞のコロニーを浴底することが確認された
。

実施例７ ＰＥＧ　４５００　ＩＬ−３のサルに　番る　ハ実施例
１で作成したＰＥＧ　（４５００）　ＩＬ−３について
、サルへの投与による血小板増加効果を調べた。カニク
イザル（ａ性、歯式推定年令３歳以上）１匹に、ＰＥＧ
　（４５００）　Ｉ　Ｌ−３を、１回にＩＬ−３蛋白量
として１００μｇ／ｋｇずつ、１日２回、１０日間連日
に静脈内投与し、経時的に採血して末梢血中の血小板を
計数した。その結果を第５図に示した。ＰＥＧ　（４５
００）　ＩＬ−３は、１０日間連続投与終了の５日後（
投与開始から１４日目）に、血小板数が投与前の１．７
倍程度になるような増加効果を示した。

実施例８ 日間連日に静脈内投与し、経時的に採血して得た血漿を
用いて、第２表に示す９項目について測定した。また、
投与あるいは採血の前後に体温を測定した。その結果、
９項目いずれにおいても異常な変化は観察されず、正常
値を示した。また第３表に示したように、投与期間中の
発熱も全くみとめられなかった。

（本頁以下余白） 実施例１で作成したＰＥＧ　（４５００）　Ｉ　Ｌ−３
について、サルへの投与による血液生化学値及び体温へ
の影響を調べた。カニクイザル（ｆｉ性、歯式推定年令
３歳以上）２匹に、ＰＥＧ（４５００）ＩＬ−３を、１
回にＩＬ−３蛋白量として１００μｓ／ｋｇずつ、１日
２回、１０第２表　血液生化学検査 項目　単位　　測定法 ＧＯＴ　　　　　ＩＵ／Ｉ　　　ＪＳＣＣ準拠処方グル
ゴース 総蛋白 アルブミン 尿素窒素 クレアチニン 総コレステロール 総ビリルビン −ｇ／ｄ　１ ｇ／ｄ　１ ｇ／ｄ ｇｅｇ／ｄ ｓｇ／ｄ ｓｇ／ｄ ｇｇｇ／ｄ グルコキナーゼ・Ｇ−６−ＰＤＨ法 Ｂｉｕｒｅｔ法 ＢＣＧ法 ウレアーゼ・ＧＩＤＨ法 Ｊａｆｆ６法 Ｃ０Ｄ−ＤＡＯＳ法 ７＊ｔＩす７ゾビリルビン法 （本頁以下余白） 〔発明の効果〕 本発明のＰＥＧ　ＩＬ−３は、ＩＬ−３に比し、抗原性
が著しく低く、血小板増殖促進剤及び骨髄細胞増殖促進
剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＣＭイオン交換クロマトグラフィーの結果を
示す図である。第２図は、５Ｏ３−ＰＡＧＥの結果を示
す図である。第３図及び第４図は、１ｎｖｉｔｒｏでの
細胞増殖に対する効果を示す図である。 第５図は、血小板増加効果を示す図である。 ２８０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、霊長類インターロイキン３活性を有する糖蛋白質ま
   たはポリペプチドにポリエチレングリコールを結合して
   なる化学修飾蛋白質。 ２、ポリエチレングリコールがポリペプチドのアミノ酸
   のアミノ基を介して結合する請求項１記載の化学修飾蛋
   白質。 ３、ポリエチレングリコールがポリペプチドのアミノ酸
   のカルボキシル基を介して結合する請求項１記載の化学
   修飾蛋白質。 ４、霊長類インターロイキン３活性を有する糖蛋白質ま
   たはポリペプチドがヒトインターロイキン３活性を有す
   る糖蛋白質またはポリペプチドである請求項１記載の化
   学修飾蛋白質。 ５、ヒトインターロイキン３活性を有する分子が大腸菌
   によって生産されたポリペプチドの化学修飾体である請
   求項４記載の化学修飾蛋白質。 ６、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化学修飾蛋白
   質を有効成分として含有する血小板増殖促進剤。 ７、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化学修飾蛋白
   質を有効成分として含有する骨髄細胞増殖促進剤。