CN104415325A - 一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104415325A
CN104415325A CN201310377609.6A CN201310377609A CN104415325A CN 104415325 A CN104415325 A CN 104415325A CN 201310377609 A CN201310377609 A CN 201310377609A CN 104415325 A CN104415325 A CN 104415325A
Authority
CN
China
Prior art keywords
preparation
interferon
desalination
concentration
sds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201310377609.6A
Other languages
English (en)
Inventor
曹小丹
李静
徐立华
范宝庆
张玲
张学况
薛雯
李剑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tian Shi Li Biological Medicine Ltd By Share Ltd
Original Assignee
Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd filed Critical Tasly Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority to CN201310377609.6A priority Critical patent/CN104415325A/zh
Publication of CN104415325A publication Critical patent/CN104415325A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种稳定的重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法。所述冻干制剂由重组人干扰素β-1b、人血白蛋白、磷酸盐缓冲液等按一定的比例配置而成，经过真空冷冻干燥技术得到冻干制剂，同时制剂制备方法能够保证该制剂复溶后具有良好的稳定性和活性。

Description

一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术制药领域，更具体的涉及一种稳定的重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法。
背景技术
干扰素（interferons，IFN）是一类具有抗病毒活性、抑制细胞增殖、抗肿瘤和免疫调节功能的细胞因子，根据与受体结合的原则不同被分为两个亚型，其中I型目前包括IFN-а、IFN-β、IFN-τ、IFN-ω，Ⅱ型干扰素只有IFN-γ一种，根据制备方法的不同分为天然干扰素和基因工程重组干扰素。
干扰素作用机制研究表明，它并非直接作为反式作用因子对其效应分子的基因进行调控，而是借助受体介导的信号转导系统，引发一系列特异的生化反应而调控效应分子。IFN通过诱生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞中的复制，以增强NK细胞活性及其免疫调节能力，有效遏制病毒侵袭和感染的发生，抑制肿瘤细胞生长，清除早期恶变细胞。
自干扰素被发现以来，人们对其临床应用给予极大的希望。早期干扰素是用病毒和诱生剂诱导人体细胞产生自然干扰素，近年来，随着基因工程技术的不断发展，大量高效价的重组干扰素基因工程产品越来越多。以1980年干扰素基因的首次克隆为转折点，干扰素生产进入了基因工程时代。利用DNA重组技术将特定类型的干扰素基因整合到特定的生物载体上，通过诱导表达，分离提取纯化等复杂步骤，可以得到特定的干扰素单体，通过制剂工艺得到不同剂型的制剂，其中部分已在临床上得到广泛的应用，且疗效显著。
IFN-β为分子量约为20kD的糖蛋白，由166个氨基酸组成的单链蛋白。据报道重组人β-干扰素在大肠杆菌和仓鼠细胞中都有表达。已知重组β-干扰素能够有效的延缓多发性硬化症状患者多发性硬化的发展，减轻病人痛苦，同时在免疫调节和抗肿瘤方面也有一定效果。目前可以从商业上获得的重组β-干扰素的商品名有：Betaseron，Avonex，Rebif。其中Betaseron—注射用重组人干扰素β-1b是第一个被批准用于多发性硬化疾病的治疗性生物药，主要通过抑制神经中枢系统的免疫反应治疗多发性硬化疾病。
大肠杆菌中表达的IFN-β，纯化后表达产物活性低且很不稳定。其原因可能与第17位的Cys可在分子间形成二硫键有关。1984年，Mark等报道可用任何氨基酸替代第17位的Cys，从而获得一系列IFN-β的同系物。1993年美国FDA批准上市的Betaseron(IFN-β-1b)即为此类。大肠杆菌表达的重组IFN-β存在一个很重要的问题，就是由于不含有糖基，分子具有很强的疏水性，使其在水中的溶解度降低。为解决这一问题，在纯化过程中需引入一定量的表面活性剂（如0.1%SDS）。SDS是一种强阴离子去垢剂，对多种细胞膜蛋白及疏水蛋白具有很好的溶解效果，已用于多种重组蛋白质包涵体的溶解，但SDS对许多蛋白的构象可产生不可逆的破坏作用导致活性丧失。IFN-β与其它蛋白质不同，被SDS溶解后，活性未见明显降低，其在体外的稳定性反而增加。加入SDS后重组人干扰素β-1b可以很好地溶解，溶解度在1～5mg/ml，有利于纯化过程中的操作。通常在中性环境下，SDS会与蛋白结合，SDS会影响内毒素western blot等质检方法的检测，并有一定的毒性，影响制剂品质，而干扰素具有较强的疏水性，脱离SDS助溶环境后，会沉淀析出。如何有效去除所引入的表面活性剂，同时又要保证干扰素冻干制剂活性不变，成为一项重要的技术问题。
应用吖啶橙分光光度法来检测原液和成品中的十二烷基硫酸(sodium dodecyl sulfate,SDS)残留量：吖啶橙可以与SDS定量结合，形成橙色的SDS-吖啶橙复合物，该复合物可以用有机溶剂如甲苯从水溶液中抽提出来，可以据此计算水溶液中SDS的含量。
干扰素制剂在临床上具有广泛的应用前景，但是在实际生产中，液体制剂的干扰素制剂存在热稳定性差、不宜长时间保存和远距离运输等问题，而冻干后则可解决一些问题并具有一定的优势，所以干扰素冻干制剂越来越受青睐。常见的蛋白质药物干燥技术有冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾-冷冻干燥、超临界干燥等。干扰素对热比较敏感，常用真空冷冻干燥方法干燥。
美国专利US6994847公开了一种IFN-β制剂，其中除含有人血白蛋白外，还含有甘露醇可以作为稳定剂，能够增加干扰素的结合力，但同时增加了该制剂的添加成分，增加了不良反应风险。
中国专利CN200580025725.5公开了一种干扰素液体制剂，该专利发明制剂在2-8℃储存条件下能够保存12-24个月，但是干扰素活性会有部分丧失。
美国专利US5702699公开了一种IFN-β的制剂及纯化制备方法，但是在纯化过程中用到了2-丁醇及2-甲基-2-丁醇等有机溶剂，增加了溶剂残留的风险。
和所有蛋白类药物一样，如何保证药物制剂的稳定性和有效性是一个关键问题，在药物制剂中，导致多肽失活和功效降低的性质包括变性、溶解性、水解、氧化等，这些物理和化学性质的改变有些会导致蛋白质药效的丧失或降低，因此良好的制剂工艺和冻干工艺也是稳定其活性重要因素。
对制剂的稳定性检测不仅进行外观形态、效价、内毒素、水分等检测项目，同时也进行了稳定性Dot blotting鉴别和稳定性活性检测。制剂的体外生物学活性的测定主要依据其抗病毒细胞病变能力，采用细胞病变抑制法（CPE）计算IFN-β的生物学活性。依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素的生物学活性。
本专利的制剂配方与制备方法同上述文献公开的内容有所不同，经实验证明本专利所述方法，能够拥有比市售产品更长稳定性，且所有理化、活性等指标均符合药典要求。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种稳定的重组人干扰素β-1b冻干制剂。本发明提供的重组人干扰素β-1b冻干制剂，不含有甘露醇，在不影响产品质量的前提下，本制剂配方拥有更少的制剂添加剂，因此减少不良反应风险，使产品更安全。
本发明的另一个目的在于提供上述重组人干扰素β-1b冻干制剂的制备方法。该方法可以使干扰素温和地脱除SDS，并在没有SDS助溶的情况下，使目标蛋白稳定溶解，并不影响干扰素的活性、纯度，且工艺稳定可靠。
本发明提供的重组人干扰素β-1b冻干制剂，含有浓度为0.1～0.5mg/mL的干扰素β-1b，1%～3%的人血白蛋白，该冻干制剂用磷酸盐缓冲液配制。该制剂的缓冲体系浓度范围为10～30mM，pH范围为6.5-8.0。
所述磷酸盐缓冲液，为现有技术，本发明中所使用的磷酸盐缓冲液配制方法如下：
母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4·12H2O，用注射水充分溶解并定容至1000ml。
0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4·2H2O，用注射水充分溶解并定容至1000ml。
各种浓度、各种pH的磷酸缓冲液的配置，可将上述两种母液按照一定比例混合稀释后即得。
本发明采用了下述技术方案，将重组的人β-1b干扰素与稳定剂结合进行真空冷冻干燥得到稳定的制剂：
a、通过大肠杆菌发酵，发酵液经提取分离、变性复性、精细纯化等工艺得到重组人β-1b干扰素溶液；
b、将纯化得到的重组人β-1b干扰素溶液去除SDS，得到干扰素制剂原液；
c、将重组人β-1b干扰素制剂原液，按一定的比例加入稳定剂，定溶至一定的体积后制成半成品；
d、半成品进行无菌过滤分装，冻干得到其冻干制剂。
其中，步骤a中所述重组人β-1b干扰素溶液，是由大肠杆菌表达，经纯化之后得到的蛋白溶液，所述干扰素溶液的缓冲体系为pH7.0-7.4、浓度为10～100mM磷酸盐缓冲液，其中含有0.1%的SDS、浓度为3-5mg/mL的重组人β-1b干扰素。
其中，步骤b中去除β-1b溶液体系中的SDS方法，选自下列之一：透析、超滤、SEC色谱脱盐法，优选SEC色谱脱盐及超滤法。
所述超滤方法中，超滤膜的截留分子量选自下列之一：5KD，10KD，20KD，30KD或50KD，超滤换液过程，膜的平衡体系为浓度为10～100mM pH11.5的NaOH，并进行至少5倍体系洗虑。
所述SEC色谱脱盐所使用的介质选自下列之一：Sephacryl S200，S100，Sephadex G75，G50，Sephadex G-25，SEC色谱脱盐流动相为1～10mM的NaOH，pH11.0～11.5。
其中SEC色谱脱盐所使用的介质优选Sephadex G-25，脱盐流动相优选2.5mM pH11.5的NaOH。
其中选用Sephadex G-25介质进行SEC色谱脱盐时，清洗准操作方法为：（1）上样管、buffer管和柱尾收集管路均浸泡在0.5MNaOH中；（2）色谱柱经0.5M NaOH处理时间大于10h，处理体积大于8L；（3）样管和buffer管路用注射用水冲洗至中性；（4）色谱柱用注射用水冲洗至中性。
选用Sephadex G-25SEC色谱脱盐时，上样前平衡至少2个柱体积，样品上样浓度2.0-2.5mg/mL，上样体积为0.5-1%。
选用Sephadex G-25SEC色谱脱盐，其中样品收集方式为UV280起峰5mAu～峰尾5mAu，收集样品混合均匀用0.22μm膜过滤除菌。
其中，步骤c所述稳定剂为人血白蛋白，半成品的配置过程为在干扰素制剂原液中，加入一定量的人血白蛋白和磷酸盐缓冲液，使半成品缓冲体系浓度范围为10～30mM，pH为6.5～8.0，其中以20mM，pH7.0时效果最佳。干扰素β-1b浓度为0.1～0.5mg/mL，白蛋白含量为1%～3%。
其中，步骤d冻干方法为真空冷冻干燥；制剂冷冻干燥前进行0.22μm滤膜过滤除菌、分装至2ml西林瓶，分装规格为1.1mL/瓶。
整个冻干过程是在搁架温度保持在－40℃～30℃下进行的。
冻干方法为－40℃预冻2～3小时，抽真空，保持4～6小时，然后在保持真空下升温，每小时升高5～10℃，温度升高到30℃后，保持温度与真空3～5小时，最后，通入氮气，进行容器封口。
本发明提供的稳定的重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法，不仅含有安全有效的重组人干扰素β-1b，经实验证明本专利所述方法，能够拥有比市售产品更长稳定性，且所有理化、活性等指标均符合药典要求。
本发明的配方和制备方法和现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的制剂，不含甘露醇，在不影响产品质量的前提下，本制剂配方拥有更少的制剂添加剂，因此减少不良反应风险，使产品更安全。
2、本发明的纯化方法，可以使干扰素温和地脱除SDS，并在没有SDS助溶的情况下，使目标蛋白稳定溶解，并不影响干扰素的活性、纯度，且工艺稳定可靠。
3、本发明的冻干方法，可使冻干后的制剂具有良好的稳定性和活性特性，在常温条件下能够储存6-18个月，且能够保持很好的制剂活性。
以下实验用于说明本发明的有益效果。
实验一：Sephadex G-25色谱脱盐实验及SDS残留检测，具体方法详见实施例2。
实验二：制剂活性稳定性实验：采用细胞病变抑制法（CPE）计算IFN-β的生物学活性；干扰素稳定性效价检测；dot-blotting检测干扰素稳定性实验等，具体方法详见实施例5、6。
附图说明
图1、重组人β-1b干扰素G25置换缓冲液图
图2、SDS-PAGE电泳检测重组人β-1b干扰素制剂原液纯度结果图
（1：脱盐前2：脱盐后3：脱盐前(H)4：脱盐后(H)M：蛋白标准marker）
图3、稳定性Dot blotting鉴别结果图
图4、121230批干扰素稳定活性检测结果图
（A-E分别为25℃条件下不同时间段活性检测结果。A:3个月：3.24E+07；B:6个月：3.31E+07；C:9个月：3.37E+07；D:12个月：3.10E+07；E:18个月：1.78E+07）
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步说明本发明。
实施例1：制剂原液制备
SEC色谱脱盐制备制剂原液
收集大肠杆菌发酵液，经纯化得到重组人β-1b干扰素溶液。此时的溶液体系为0.1%（w/v）SDS+10～100mM磷酸缓冲溶液，pH7.0～7.4，因此需要采用缓冲液置换的方法将干扰素原缓冲体系更换为制剂原液体系，同时将原体系中的相关物质残留量降低到药典规定水平以下。采用SEC色谱脱盐的方法进行换液。SEC色谱脱盐选用Sephadex G-25Superfine，尺寸：5.0×40cm，流速：10mL/min，流动相为2.5Mm pH11.5的NaOH。样品收集从UV280起峰5mAu～峰尾5mAu的蛋白。收集样品混合均匀用0.22μm膜过滤除菌。脱盐结果见图1，电泳结果见图2。
超滤法脱盐制备制剂原液
收集大肠杆菌发酵液，经纯化得到重组人β-1b干扰素溶液。此时的溶液体系为0.1%（w/v）SDS+10～100mM磷酸缓冲溶液，pH7.0～7.4，因此需要采用缓冲液置换的方法将干扰素原缓冲体系更换为制剂原液体系，同时将原体系中的相关物质残留量降低到药典规定水平以下。本实施例采用超滤的方法进行换液。超滤选用10KD膜包，膜的平衡体系为3mM pH11.5的NaOH，并进行8倍体系洗滤。
相关物质残留检测选用吖啶橙-分光光度计法检测制剂原液制品中SDS含量。该方法可以有效地将目标蛋白与原缓冲体系分离，收率大于85％，相关物质残留量：SDS小于0.002%。
实施例2：吖啶橙-分光光度法检测SDS残留
将SDS标准品按不同浓度与吖啶橙混合作用后，经甲苯萃取，再测定甲苯萃取相在可见光499nm处的吸光光度值，得到标准曲线，根据待测样品的499nm吸光光度值，求出其SDS浓度。
精密配置浓度分别为0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04g/L的SDS溶液各10ml。0.5mol/L的NaHSO4溶液配置的0.4%的吖啶橙溶液50ml。
分别取100ul不同浓度的SDS溶液和待检品于带塞试管中，并加入100ul0.5mol/L的NaHSO4溶液配置的0.4mol/L的吖啶橙溶液混匀。加入3ml甲苯后塞紧试管，剧烈振荡3min，2000g/min离心5min，取上清测定499n m处光吸收值。
表1SDS残留检测标准曲线数据
样品名称 SDS浓度（g/L） A499（Au）
标曲0 0 0
标曲0.005 0.005 0.014
标曲0.01 0.01 0.033
标曲0.02 0.02 0.047
标曲0.03 0.03 0.062
标曲0.04 0.04 0.075
标准曲线为：C=0.3296A-0.002     R2=0.9982
样品SDS含量为：
表2SDS残留检测原液数据
样品名称 A499（Au） SDS浓度（g/L）
101227原液 0.039 0.0109
101230原液 0.041 0.0115
101231原液 0.029 0.0076
101227制剂 0.022 0.0053
101230制剂 0.029 0.0076
101231制剂 0.015 0.0029
结论：SDS浓度在0～0.004%的范围内，线性关系较好，相关系数r>0.98，检测结果稳定可靠。采用该方法对三批干扰素脱盐原液和待测样品三批制剂进行检测，结果显示SDS残留量均小于0.002%(0.02g/L)，表明所建立的干扰素制剂脱盐方法效果良好，制剂成品中的SDS残留量符合国家相关质量标准。
实施例3：半成品制备分装
经过脱盐后得到的干扰素制剂原液体系是氢氧化钠体系，干扰素只能在短期内保持活性稳定，此体系也不能作为送检原液，因此需要再一次更换缓冲液体系。按照下述处方组成及终浓度添加稳定剂和缓冲液，定溶至一定的体积后制成半成品：
重组人干扰素β-1b     0.1～0.5mg/ml
磷酸盐缓冲液          10～30mM
人血白蛋白（HSA）     1～3％
该浓度范围内的HSA适于维持冻干后重组人干扰素-β-1b剂型的溶解性及活性稳定性；而磷酸盐缓冲液更加有利于保持这种蛋白质的溶解状态及活性，在后续的冻干过程中，其中的磷酸氢二钠结晶所引起pH的改变更有助于重组人干扰素β-1b的溶解；半成品终浓度10～30mM，pH为6.5～8.0，其中以20mM，pH7.0时效果最佳。
添加人血白蛋白保护剂的半成品在中性条件下能够保持很好的溶解性，将该半成品进行质量检定合格后，进行无菌分装，分装所用西林瓶规格为2ml，分装规格1.1ml/瓶。
实施例4：制剂冻干曲线
将上述分装好的半成品制剂放入冻干机真空冷冻室进行－40℃预冻2～3小时，抽真空，保持4～6小时，然后在保持真空下升温，每小时升高5～10℃，温度升高到30℃后，保持温度与真空3～5小时。最后，通入氮气，进行容器封口。具体冻干参数如下表3所示。
表3冻干参数
研究结果表明，产品采用人血白蛋白（HSA）作为制剂的保护剂与赋形剂，利用上述冻干工艺，冻干产品外观合格，活性损失较低（在10％以内），与国外产品相比类似，而且稳定性实验表明，两者具有相似的样品稳定性。成品按照质检规程进行检定，结果表明质量基本符合国内重组人干扰素β-1b质量标准研究报道的要求。
实施例5：制剂活性比较
制剂工艺批间一致性活性数据比较，通过上述具体实施例方法得到的重组人干扰素β-1b制剂的体外生物学活性的测定主要依据其抗病毒细胞病变能力，采用细胞病变抑制法（CPE）计算IFN-β的生物学活性。
将检品1支溶于1.2ml无菌注射用水，得到0.25mg/ml的母液，稀释至检测浓度。将WISH细胞培养至第二代代时开始进行分到96孔板；加入检品，4倍梯度稀释；标准品4倍浓度梯度稀释；培养16-18小时加入病毒（VSV），培养30小时左右，结晶紫染色，进行检测，570nm扫描。
分板：将wish细胞消化、计数后用分板培养基将细胞稀释至1.0x105～3.0x105个/ml，轻轻晃动装有细胞的瓶子，将连续加样器枪头伸入液体中部，吸出细胞液，在96孔板中，每孔加入100ul。
加样：超净台中，干扰素样品溶解在1.2ml无菌注射用水，然后用MEM分板培养基稀释至起始浓度。标准品按说明书溶解后，用MEM分板培养基稀释为起始浓度。
培养：样品和标准品4倍梯度稀释，共十个梯度（每次稀释都需要进行充分混匀）。37℃，5%CO2培养18-20小时，细胞生长至孔面积40-50%。
加病毒：轻轻吸出培养液，将保存的VSV病毒母液用攻毒培养基稀释到100-300CCID50，每孔加入100ul。37℃，5%CO2培养至负对照孔中细胞完全病变（约30小时）。
染色：完全吸去培养板中含有病毒的培养基，（吸出的培养基需经微波炉沸腾后倒掉）；每孔加入50ul染色液，室温放置30min。
洗板：将培养板轻轻浸入装满洁净自来水的盆中，洗去染色液，清洗3次后，吸干空中残留水分，37℃培养箱放置10分钟，使孔中的水分完全蒸发。
脱色：每孔加入脱色液100ul，室温放置30min。
检测：用酶标仪在570nm波长处测吸光值。
结果采用四参数回归计算法进行处理。
结论：干扰素制剂活性标准为3.20E+07IU/支，效价标示量(%)为80-150，测定结果符合质量标准。具体以121230批干扰素25℃条件下不同时间段稳定性活性检测结果为例，见图4。
表4采用同样制剂配方和工艺的制剂批间稳定性和25℃保存稳定性初步结果
批号 纯化来源 25℃比活IU/mg 25℃室温存放后复测IU/mg
080715 C4 3.3×107 2.2×107（5months）
080722 C4 2.3×107 3.0×107（4months）
081006 SOURCE15 3.9×107 3.1×107（1week）
081006 SOURCE30 4.3×107 3.1×107（1week）
081203 SOURCE15 3.1×107 2.7×107（1week）
081222 SOURCE15 28×107 29×107（1week）
以上6组制剂活性测定数据均在3×107左右。初步表明，该制剂工艺比较稳定，批间一致性较好。
实施例6：制剂稳定性检测
对制剂的稳定性检测不仅进行外观形态、效价、内毒素、水分等检测项目，同时也进行了稳定性Dot blotting鉴别和稳定性活性检测。
由于影响生物制品活性的主要因素是温度，故本实验中我们对本品的真空冷冻干燥的制剂在不同温度条件下的药品质量进行了考察，制剂活性长期稳定性试验已进行18个月，结果显示该制剂稳定性较好，外观形态呈白色疏松饼状固体，无裂纹；复溶为无色澄明无异物，效价、内毒素、水分等其它检测项目具体见表5。同时进行了稳定性Dot blotting鉴别和稳定性活性检测。
表5101230批制剂稳定性活性试验数据
40℃加速
检测项目 0月 1月 2月 3月 6月
效价 3.89E+07 3.17E+07 3.38E+07 3.28E+07 2.86E+07
鉴别 阳性 — — — 阳性
可见异物 合格 合格 合格 合格 合格
水分 1.260% 2.269% 2.642% 2.898% 1.600%
PH/外观 7.24 7.24 7.22 6.99 7.10
内毒素 合格 合格 合格 合格 合格
异常毒性 合格 — — —
多聚体/HPLC 2.249 2.321 2.250 2.198 1.261
我们同时做了101227、101230、101231三批样品，表5仅显示其中一批的数据，通过上述数据我们可以看出该制剂在18个月内具有较好的稳定性，且稳定性基本不受温度的影响。
我们又按照表6的上样顺序对重组人干扰素β-1b三批样品的纯度进行了Dot blotting鉴别，结果显示都成阳性，结果详细见图3。稳定性活性检测结果图详见图4，结果显示制剂的活性在12个月内基本不变。
表6三批样品Dot blotting鉴别

Claims (13)

1.一种重组人干扰素β-1b冻干制剂，其特征在于，所述制剂含有浓度为0.1～0.5mg/mL的干扰素β-1b，1%～3%的人血白蛋白，该冻干制剂用磷酸盐缓冲液配制，所述制剂缓冲体系浓度范围为10～30mM，pH范围为6.5-8.0。
2.权利要求1的冻干制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
a、通过大肠杆菌发酵，发酵液经提取分离、变性复性、精细纯化等工艺得到重组人β-1b干扰素溶液；
b、将纯化得到的重组人β-1b干扰素溶液去除SDS，得到干扰素制剂原液；
c、将重组人β-1b干扰素制剂原液，按一定的比例加入稳定剂，定溶至一定的体积后制成半成品；
d、半成品进行无菌过滤分装，冻干得到其冻干制剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤a中所述重组人β-1b干扰素溶液，是由大肠杆菌表达，经纯化之后得到的蛋白溶液，所述干扰素溶液的缓冲体系为pH7.0-7.4、浓度为10～100mM磷酸盐缓冲液，其中含有0.1%的SDS、浓度为3-5mg/mL的重组人β-1b干扰素。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤b中所述去除β-1b溶液体系中的SDS方法，选自下列之一：透析、超滤、SEC色谱脱盐法，优选SEC色谱脱盐及超滤法。
5.如权利要求4所述的制备方法，其中所述超滤方法中，超滤膜的截留分子量选自下列之一：5KD，10KD，20KD，30KD或50KD，超滤换液过程，膜的平衡体系为浓度为10～100mM、pH11.5的NaOH，并进行至少5倍体系洗滤。
6.如权利要求4所述的制备方法，其中所述SEC色谱脱盐所使用的介质选自下列之一：Sephacryl S200，S100，Sephadex G75，G50，Sephadex G-25，SEC色谱脱盐流动相为1～10mM的NaOH pH11.0～11.5。
7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述SEC色谱脱盐所使用的介质优选SephadexG-25，SEC色谱脱盐流动相优选2.5mM pH11.5的NaOH。
8.如权利要求6或7任一所述的制备方法，其中选用Sephadex G-25介质进行SEC色谱脱盐时，清洗标准操作方法为：（1）上样管、buffer管和柱尾收集管路均浸泡在0.5MNaOH中；（2）色谱柱经0.5M NaOH处理时间大于10h，处理体积大于8L；（3）样管和buffer管路用注射用水冲洗至中性；（4）色谱柱用注射用水冲洗至中性。
9.如权利要求6或7任一所述的制备方法，其中选用Sephadex G-25介质进行SEC色谱脱盐时，上样前平衡至少2个柱体积，样品上样浓度为2.0-2.5mg/mL，上样体积为0.5-1%。
10.如权利要求6或7任一所述的制备方法，其中选用Sephadex G-25介质进行SEC色谱脱盐时，其样品收集方式为UV280起峰5mAu～峰尾5mAu，收集样品混合均匀用0.22μm膜过滤除菌。
11.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤c所述的稳定剂为人血白蛋白，半成品的配置过程为，在干扰素制剂原液中，加入一定比例的人血白蛋白和磷酸盐缓冲液，使半成品缓冲体系浓度范围为10～30mM，pH为6.5～8.0，干扰素β-1b浓度为0.1～0.5mg/mL，白蛋白含量为1%～3%。
12.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤d冻干方法为真空冷冻干燥；制剂冷冻干燥前进行0.22μm滤膜过滤除菌、分装至2ml西林瓶，分装规格为1.1mL/瓶。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，整个冻干过程是在搁架温度保持在－40℃～30℃下进行的；所述冻干方法为－40℃预冻2～3小时，抽真空，保持4～6小时，然后在保持真空下升温，每小时升高5～10℃，温度升高到30℃后，保持温度与真空3～5小时，最后，通入氮气，进行容器封口。
CN201310377609.6A 2013-08-27 2013-08-27 一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法 Pending CN104415325A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310377609.6A CN104415325A (zh) 2013-08-27 2013-08-27 一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310377609.6A CN104415325A (zh) 2013-08-27 2013-08-27 一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104415325A true CN104415325A (zh) 2015-03-18

Family

ID=52966146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310377609.6A Pending CN104415325A (zh) 2013-08-27 2013-08-27 一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104415325A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105310988A (zh) * 2015-11-23 2016-02-10 哈药集团生物工程有限公司 一种含有重组人干扰素α2b的冻干药物组合物
CN107099569A (zh) * 2017-06-30 2017-08-29 北京北生研生物制品有限公司 一种规模化发酵生产重组人干扰素β1b蛋白的方法
CN110426513A (zh) * 2019-05-23 2019-11-08 武汉三鹰生物技术有限公司 一种无外源蛋白干扰的elisa标准品的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1579545A (zh) * 2003-08-13 2005-02-16 北京金赛狮生物制药技术开发有限公司 重组人干扰素β－1b用于制备预防、治疗SARS药物中的用途
EP2537527A2 (en) * 2005-03-09 2012-12-26 Guangwen Wei Uses of recombinant super-compound interferons

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1579545A (zh) * 2003-08-13 2005-02-16 北京金赛狮生物制药技术开发有限公司 重组人干扰素β－1b用于制备预防、治疗SARS药物中的用途
EP2537527A2 (en) * 2005-03-09 2012-12-26 Guangwen Wei Uses of recombinant super-compound interferons

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
魏双施等: "重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化", 《中国兽医科学》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105310988A (zh) * 2015-11-23 2016-02-10 哈药集团生物工程有限公司 一种含有重组人干扰素α2b的冻干药物组合物
CN105310988B (zh) * 2015-11-23 2018-05-04 哈药集团生物工程有限公司 一种含有重组人干扰素α2b的冻干药物组合物
CN107099569A (zh) * 2017-06-30 2017-08-29 北京北生研生物制品有限公司 一种规模化发酵生产重组人干扰素β1b蛋白的方法
CN110426513A (zh) * 2019-05-23 2019-11-08 武汉三鹰生物技术有限公司 一种无外源蛋白干扰的elisa标准品的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20090123424A1 (en) Methods of protein purification and recovery
JPH0533208B2 (zh)
CN101143894A (zh) 高效抑制血管生成多肽及其物理化学修饰方法和应用
CN108524929A (zh) 一种狂犬病疫苗的生产方法
CN104415325A (zh) 一种重组人干扰素β-1b冻干制剂及其制备方法
CN102925403A (zh) 一种能够表达金针菇免疫调节蛋白的重组菌株及其构建方法、蛋白表达纯化方法和蛋白应用
CN113117071B (zh) 一种无糖基化抗pd-1单克隆抗体的冻干制剂
CN1749274B (zh) 一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法
RU2054044C1 (ru) Способ получения рекомбинантного человеческого свободного от метионина на n-конце гамма-интерферона
CN101224296A (zh) 一种稳定的重组人血管内皮抑制素制剂及其制备工艺
CN102138908A (zh) 一种注射用胸腺五肽冻干粉针及其制备工艺
KR940010024B1 (ko) α-인터페론의 제조 및 정제 방법
CN116077649A (zh) 一种含抗Blys单克隆抗体冻干制剂及其制备工艺
JPH0725898A (ja) 均質ヒト免疫インターフェロンサブタイプ２６ｋ及びその製造法
EP0301314B1 (en) A method for the purification of interferon
CN100355784C (zh) 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法
CN103432569B (zh) 重组人血清白蛋白-干扰素α融合蛋白的水溶液及其制备方法
JP2002516087A (ja) 幾つかの重篤な疾患の治療のための医薬組成物を調製するための修飾されたリゾチームｃの使用
CN103408625A (zh) 一种纯化dna的方法
MIYATA et al. Pruification of Natural Human Interferon-Gamma by Antibody Affinity Chromatography: Analysis of Constituent Protein Species in the Dimers
CN102058546A (zh) 一种重组猪α-干扰素的冻干制剂及其制备方法和用途
CN109535247A (zh) 聚乙二醇修饰的藻蓝蛋白及其制备方法与制药应用
Johnston et al. Factors influencing production of interferon by human lymphoblastoid cells
Basso et al. Biopharmaceuticals and biosimilars
CN104056247B (zh) 一种含有促肝细胞生长素的药物组合物及其制剂

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 300410 Tianjin city Beichen District Huaihe road and road intersection Dingjiang tianzhijiao Park forensic Center for Intellectual Property Department

Applicant after: Tasly Pharmaceutical Group Limited by Share Ltd

Address before: 300410 Tianjin city Beichen District Huaihe road and road intersection Dingjiang tianzhijiao Park forensic Center for Intellectual Property Department

Applicant before: Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd.

CB02 Change of applicant information
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190505

Address after: 201203 No. 1 and No. 2 Juli Road, China (Shanghai) Free Trade Pilot Area, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Tian Shi Li biological medicine Limited by Share Ltd

Address before: 300410 Tianjin Beichen District Huaihe road and Ting Jiang West Road intersection heaven proud of the park Legal Center Intellectual Property Department

Applicant before: Tasly Pharmaceutical Group Limited by Share Ltd

TA01 Transfer of patent application right
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20150318

RJ01 Rejection of invention patent application after publication