CN108918891A

CN108918891A - 与人类蛋白nrf1相互作用的结核蛋白及其应用

Info

Publication number: CN108918891A
Application number: CN201810813030.2A
Authority: CN
Inventors: 曹廷明; 吕翎娜; 张宗德
Original assignee: Beijing Chest Hospital
Current assignee: Beijing Chest Hospital
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2018-11-30
Anticipated expiration: 2038-07-23
Also published as: CN108918891B

Abstract

本发明公开了与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白及其应用。本发明提供了人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：(A1)诊断结核病；(A2)制备用于诊断结核病的产品。本发明利用基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白‑蛋白互作实验进行筛选和鉴定，获得与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白Rv2239c、Rv0577、Rv2499c。本发明可用于结核诊断或调节人类蛋白NRF1活性。

Description

与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白及其应用。

背景技术

目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺乏快速敏感的实验室技术，使得难以及时筛选出结核病的潜伏感染病例和早期病例，也难以及时进行结核病鉴别诊断，造成结核病人漏诊、诊断时间延长或误诊，为结核病的各期诊断与治疗带来困难。结核病诊断领域面临的主要问题是诊断方法特异性低、时间长，急需结核病诊断的快速技术和方法。现有的诊断方法很多只能作为诊断的参考指标，使得大多数结核病人不能获得早期诊断，现有的诊断方法不能满足结核病预防、控制的需要，因此迫切需要开发研制出新型快速、灵敏、特异的结核病诊断方法和技术。细菌学是诊断结核的金标准，但结核分枝杆菌生长极为缓慢其培养鉴定需要约两个月的时间，且阳性率取决于采集标本中细菌的数量，检测的灵敏度低，不利于结核病的诊断与治疗。而结核蛋白Rv2239c、Rv0577、Rv2499c是结核分枝杆菌的固有蛋白，通过检测这些结核蛋白可以鉴定结核分枝杆菌的存在，因此可以借助此来实现对结核感染或结核病的快速诊断。

NRF1即NF-E2相关因子1，它属于CNC碱性亮氨酸拉链(basic—leueine-zipper，bZIP)调节蛋白家族成员。碱性亮氨酸拉链家族是体内广泛存在的高度保守的转录因子家族，其参与调节下游多种抗氧化基因的表达，也是机体最强的抗氧化应激调控转录因子家族。研究表明NRF1在抗氧化应激反应中发挥重要作用；新近的研究还发现，NRF1在细胞组织分化发育、炎症及肝脏成瘤等方面发挥重要功能；在肝细胞内，NRF1功能的缺失可导致脂肪肝和肝瘤形成；蛋白酶体抑制剂是非常有潜力的抗肿瘤治疗模式，在人类癌细胞中，NRF1的沉默增加了蛋白酶体抑制剂的杀伤作用。当NRF1过表达的时候，能加快蛋白酶体抑制剂引起的蛋白酶体反馈回路，并抑制由蛋白酶体抑制剂引起的癌细胞的凋亡。因此，调节NRF1的活性将会对机体产生重要的影响，还可能在某些疾病的预防或治疗中发挥重要作用。调节NRF1活性的一个重要途径可以依靠通过能够与NRF1发生直接相互作用的蛋白质来实现。因此，能够与NRF1发生直接相互作用的蛋白质，将具有重要的药用价值，可开发为某些疾病预防或治疗的蛋白药物。

发明内容

本发明的目的是提供与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白及其应用。

第一方面，本发明要求保护人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：

(A1)诊断结核病；

(A2)制备用于诊断结核病的产品。

第二方面，本发明要求保护人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：

(B1)检测结核分枝杆菌；

(B2)制备用于检测结核分枝杆菌的产品。

其中，(B1)中所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。

第三方面，本发明要求保护人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：

(C1)检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c；

(C2)制备用于检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c的产品。

其中，(C1)中所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。

进一步地，在上述第一方面中，具体可通过检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c实现对结核病的诊断。同样的，在上述第二方面中，具体可通过检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c实现对结核分枝杆菌的检测。

第四方面，本发明要求保护结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c在与人类蛋白NRF1互作中的应用。

所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。

第五方面，本发明要求保护结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c在如下任一中的应用：

(a1)调节人类蛋白NRF1活性；

(a2)制备能够调节人类蛋白NRF1活性的产品。

其中，(a1)中所述应用既可为非疾病诊断治疗中的应用(如纯粹用于科学研究)，也可为疾病诊断治疗中的应用。

第六方面，本发明要求保护结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c在如下任一中的应用：

(b1)预防和/或治疗与人类蛋白NRF1相关疾病；

(b2)制备用于预防和/或治疗与人类蛋白NRF1相关疾病的产品。

在上述各方面所述的应用中，结核蛋白Rv2239c的氨基酸序列均具体可如SEQ IDNo.1所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv0577的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.2所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。结核蛋白Rv2499c的氨基酸序列均具体可如SEQ ID No.3所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

在上述各方面所述的应用中，所述人类蛋白NRF1的氨基酸序列均具体可如SEQ IDNo.4所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明利用基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验进行筛选和鉴定，获得与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白Rv2239c、Rv0577、Rv2499c。本发明可用于结核诊断或调节人类蛋白NRF1活性。

附图说明

图1为本发明于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验研究与人类蛋白NRF1互作的结核蛋白的技术流程图。

图2为透析后蛋白浓度通过SDS-PAGE检测结果。

图3为芯片杂交结果。其中，箭头1为阳性对照点，箭头2为阴性对照点，箭头3为阳性蛋白。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的结核蛋白Rv2239c的氨基酸序列具体如SEQ ID No.1所示；结核蛋白Rv0577的氨基酸序列具体如SEQ ID No.2所示；结核蛋白Rv2499c的氨基酸序列具体如SEQ ID No.3所示；人类蛋白NRF1的氨基酸序列具体如SEQ ID No.4所示。

实施例1、基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验研究与人类蛋白NRF1互作的结核蛋白

MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片：广州博翀生物科技有限公司公司产品，货号为TB-10001-102987。

MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白质，是目前世界上第一张结核分枝杆菌蛋白质组芯片。该芯片适用于全局性地进行蛋白-蛋白互作、蛋白-核酸互作、蛋白-小分子互作以及蛋白翻译后修饰研究，同时适用于系统性地发现血清中自身抗体并用于诊断或其它表征的标志物的研究。

1、技术路线

每一个样品使用1张MTB蛋白质芯片进行检测。样品与固定于芯片上的蛋白进行结合，并通过清洗去除未结合的样本。由于样本标记Cy3(CyDye Protein LabellingCY3MONO5-PACK，GE，PA23001)，故可以直接通过芯片扫描仪进行信号解读。信号的强弱与亲和力、数量呈正相关，技术路线流程图如图1所示。

2、样本基本信息

如表1所示。

表1样本基本信息

3、实验过程及步骤

(1)蛋白QC

根据样本信息，先通过SDS-PAGE对蛋白浓度、纯度进行初步检测。

(2)蛋白标记及标记效率检测

根据定量结果，对目的蛋白进行透析脱盐，然后标记荧光Cy3(CyDye ProteinLabellingCY3MONO 5-PACK，GE，PA23001)，标记终止后在经过透析处理去除游离的甘氨酸等成分，然后将NRF1蛋白样本梯度点样于NC膜，Cy3-BSA为阳性对照，BSA为阴性对照。通过Dot blot定性评价荧光标记效率。

(3)蛋白透析并定量

透析完成后，通过SDS-PAGE，并设置标准品BSA浓度梯度，等体积上样，检测透析后蛋白浓度。

(4)芯片实验

根据所测得的蛋白浓度，将所有样本稀释芯片杂交所需浓度(4μg/ml)，并杂交芯片。芯片具体步骤如下：

A.准备以下溶液：

封闭液：3ml 10％(10g/100ml)BSA，加入7ml 1×PBS溶液；

孵育液：1ml 10％(10g/100ml)BSA，加入9ml 1×PBST溶液；

清洗液：1×PBST。

B.操作步骤：

a)封闭：使用芯片孵育盒，加入5ml封闭液，将芯片从-80℃取出，正面朝上置于孵育盒中；再横向放在侧摆摇床上，50-60rpm，4℃，3h；

b)样本孵育：倒弃封闭液，迅速加入预先准备好的样本孵育液(样本终浓度为4μg/ml，体积3ml)，侧摆摇床20-30rpm，4℃过夜孵育；

c)清洗：将芯片取出，置于加入有清洗液的芯片清洗盒，至于水平摇床上，60-70rpm，5min每次，清洗4次，此时注意避光操作；

d)完成后用ddH₂O清洗2次，每次5min，注意避光操作；

e)干燥。将芯片置于芯片干燥机，离心干燥；

f)扫描，并提取数据。

4、实验结果

(1)蛋白QC；

样本于4℃冰箱冻融，离心，通过SDS-page检测，并设置相关BSA标准品浓度梯度，等体积上样，结果如下：

NRF1蛋白浓度介于25～50ng/μl之间；

通过灰度值大致估算可得NRF1浓度为30ng/μl，纯度>90％。

初步结果可知，NRF1蛋白浓度符合标示浓度。

(2)透析后标记效率检测；

蛋白应该标记后，NRF1蛋白样本灵敏度均小于1ng，表明蛋白标记效率较好。

(3)透析后蛋白浓度检测；

透析后蛋白浓度通过SDS-PAGE检测结果如图2所示。由图可知：

NRF1蛋白样本标记透析后浓度介于6.25～12.5ng/μl之间；

通过灰度值估算，NRF1蛋白样本标记透析后浓度为12ng/μl，

考虑到后续蛋白杂交芯片所需浓度及总量，蛋白符合实验要求。

(4)芯片实验：

结果如图3所示。由图可知：除阴性对照和阳性对照点外，NRF1与结核分枝杆菌蛋白质组芯片杂交后有阳性信号点，表明筛查到对应的互作蛋白。

5、数据分析

对所提取出的芯片数据通过以下逻辑进行分析：

(1)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，故通过背景归一化方法进行处理。实现方式为每个蛋白的前景值与背景值比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值；

(2)对于不同芯片，为消除不同实验样本及实验操作带来的系统性误差，故在数据比对前对SNR进行Z-score标准化处理；

(3)对归一化后数据，设置阳性cutoff阈值，通过阈值分别计算NRF1芯片上的阳性点个数；定义cutoff＝2，即归一化后mean+2SD(此值是根据芯片结果设定，非标准值)。在此标准下，筛选潜在的阳性蛋白，其中NRF1芯片上阳性点个数3个，即结核蛋白Rv2239c、Rv0577、Rv2499c。

其中重要的参数解释如下：

Block,column,Row：分别指阵列，列，行的编号，即位置。

Name,ID：蛋白质名称或基因名称。

F532Median：532nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。

B532Median：532nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。

<110> 首都医科大学附属北京胸科医院

<120> 与人类蛋白NRF1相互作用的结核蛋白及其应用

<130> GNCLN181581

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 158

<212> PRT

<213> M. tuberculosis

<400> 1

Met Pro Ile Ala Thr Val Cys Thr Trp Pro Ala Glu Thr Glu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Thr Val Val Ala Ala Asp His Ala Ser Asn Tyr Ala Arg Lys Leu

20 25 30

Gly Ile Gln Arg Asp Gln Leu Ile Gln Glu Trp Gly Trp Asp Glu Asp

35 40 45

Thr Asp Asp Asp Ile Arg Ala Ala Ile Glu Glu Ala Cys Gly Gly Glu

50 55 60

Leu Leu Asp Glu Asp Thr Asp Glu Val Ile Asp Val Val Leu Leu Trp

65 70 75 80

Trp Arg Asp Gly Asp Gly Asp Leu Val Asp Thr Leu Met Asp Ala Ile

85 90 95

Gly Pro Leu Ala Glu Asp Gly Val Ile Trp Val Val Thr Pro Lys Thr

100 105 110

Gly Gln Pro Gly His Val Leu Pro Ala Glu Ile Ala Glu Ala Ala Pro

115 120 125

Thr Ala Gly Leu Met Pro Thr Ser Ser Val Asn Leu Gly Asn Trp Ser

130 135 140

Ala Ser Arg Leu Val Gln Pro Lys Ser Arg Ala Gly Lys Arg

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<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> M. tuberculosis

<400> 2

Met Pro Lys Arg Ser Glu Tyr Arg Gln Gly Thr Pro Asn Trp Val Asp

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Leu Gln Thr Thr Asp Gln Ser Ala Ala Lys Lys Phe Tyr Thr Ser Leu

20 25 30

Phe Gly Trp Gly Tyr Asp Asp Asn Pro Val Pro Gly Gly Gly Gly Val

35 40 45

Tyr Ser Met Ala Thr Leu Asn Gly Glu Ala Val Ala Ala Ile Ala Pro

50 55 60

Met Pro Pro Gly Ala Pro Glu Gly Met Pro Pro Ile Trp Asn Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Ala Val Asp Asp Val Asp Ala Val Val Asp Lys Val Val Pro Gly

85 90 95

Gly Gly Gln Val Met Met Pro Ala Phe Asp Ile Gly Asp Ala Gly Arg

100 105 110

Met Ser Phe Ile Thr Asp Pro Thr Gly Ala Ala Val Gly Leu Trp Gln

115 120 125

Ala Asn Arg His Ile Gly Ala Thr Leu Val Asn Glu Thr Gly Thr Leu

130 135 140

Ile Trp Asn Glu Leu Leu Thr Asp Lys Pro Asp Leu Ala Leu Ala Phe

145 150 155 160

Tyr Glu Ala Val Val Gly Leu Thr His Ser Ser Met Glu Ile Ala Ala

165 170 175

Gly Gln Asn Tyr Arg Val Leu Lys Ala Gly Asp Ala Glu Val Gly Gly

180 185 190

Cys Met Glu Pro Pro Met Pro Gly Val Pro Asn His Trp His Val Tyr

195 200 205

Phe Ala Val Asp Asp Ala Asp Ala Thr Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala

210 215 220

Gly Gly Gln Val Ile Ala Glu Pro Ala Asp Ile Pro Ser Val Gly Arg

225 230 235 240

Phe Ala Val Leu Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile Phe Ser Val Leu Lys

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260

<210> 3

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<212> PRT

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Val Thr Lys His Ala Gly Asp Arg Glu Ser Asp Asp Ala Val Ser Ala

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Cys Arg Val Ala Gly Ser Thr Val Gly Arg Arg Ile Leu Gln Arg Gly

20 25 30

Leu Trp Phe Glu Glu Phe Gln Ile Gly Thr Thr Tyr Leu His Arg Pro

35 40 45

Gly Arg Thr Val Thr Glu Ala Asp Asn Val Leu Phe Thr Thr Leu Thr

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Met Asn Thr Gln Ser Leu His Leu Asp Ala Ala Trp Ala Gly Gln Gln

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Pro Gly Phe Arg Gly Glu Arg Leu Val Asn Ser Met Phe Thr Leu Ser

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Thr Met Val Gly Leu Ser Val Ala Gln Leu Thr Leu Gly Thr Ile Val

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Ala Asn Leu Gly Phe Ser Glu Val Ser Phe Pro Lys Pro Val Phe His

115 120 125

Gly Asp Thr Leu Tyr Ala Glu Thr Val Cys Thr Gly Lys Arg Glu Ser

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Lys Ser Arg Pro Gly Glu Gly Ile Val Thr Leu Glu His Ile Ala Arg

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<210> 4

<211> 503

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Glu Glu His Gly Val Thr Gln Thr Glu His Met Ala Thr Ile Glu

1 5 10 15

Ala His Ala Val Ala Gln Gln Val Gln Gln Val His Val Ala Thr Tyr

20 25 30

Thr Glu His Ser Met Leu Ser Ala Asp Glu Asp Ser Pro Ser Ser Pro

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145 150 155 160

Ser Met Ile Leu Glu Asp Leu Glu Ser Ala Leu Ala Glu His Ala Pro

165 170 175

Ala Pro Gln Glu Val Asn Ser Glu Leu Pro Pro Leu Thr Ile Asp Gly

180 185 190

Ile Pro Val Ser Val Asp Lys Met Thr Gln Ala Gln Leu Arg Ala Phe

195 200 205

Ile Pro Glu Met Leu Lys Tyr Ser Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Trp

210 215 220

Gly Lys Glu Ser Cys Lys Pro Ile Trp Trp Pro Glu Asp Ile Pro Trp

225 230 235 240

Ala Asn Val Arg Ser Asp Val Arg Thr Glu Glu Gln Lys Gln Arg Val

245 250 255

Ser Trp Thr Gln Ala Leu Arg Thr Ile Val Lys Asn Cys Tyr Lys Gln

260 265 270

His Gly Arg Glu Asp Leu Leu Tyr Ala Phe Glu Asp Gln Gln Thr Gln

275 280 285

Thr Gln Ala Thr Ala Thr His Ser Ile Ala His Leu Val Pro Ser Gln

290 295 300

Thr Val Val Gln Thr Phe Ser Asn Pro Asp Gly Thr Val Ser Leu Ile

305 310 315 320

Gln Val Gly Thr Gly Ala Thr Val Ala Thr Leu Ala Asp Ala Ser Glu

325 330 335

Leu Pro Thr Thr Val Thr Val Ala Gln Val Asn Tyr Ser Ala Val Ala

340 345 350

Asp Gly Glu Val Glu Gln Asn Trp Ala Thr Leu Gln Gly Gly Glu Met

355 360 365

Thr Ile Gln Thr Thr Gln Ala Ser Glu Ala Thr Gln Ala Val Ala Ser

370 375 380

Leu Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Ser Gln Glu Met Gln Gln Gly Ala

385 390 395 400

Thr Val Thr Met Ala Leu Asn Ser Glu Ala Ala Ala His Ala Val Ala

405 410 415

Thr Leu Ala Glu Ala Thr Leu Gln Gly Gly Gly Gln Ile Val Leu Ser

420 425 430

Gly Glu Thr Ala Ala Ala Val Gly Ala Leu Thr Gly Val Gln Asp Ala

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Asn Gly Leu Val Gln Ile Pro Val Ser Met Tyr Gln Thr Val Val Thr

450 455 460

Ser Leu Ala Gln Gly Asn Gly Pro Val Gln Val Ala Met Ala Pro Val

465 470 475 480

Thr Thr Arg Ile Ser Asp Ser Ala Val Thr Met Asp Gly Gln Ala Val

485 490 495

Glu Val Val Thr Leu Glu Gln

500

Claims

1.人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：

(A1)诊断结核病；

(A2)制备用于诊断结核病的产品。

2.人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：

(B1)检测结核分枝杆菌；

(B2)制备用于检测结核分枝杆菌的产品。

3.人类蛋白NRF1在如下任一中的应用：

(C1)检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c；

(C2)制备用于检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c的产品。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：权利要求1中，是通过检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c实现对结核病的诊断的；

权利要求2中，是通过检测结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c实现对结核分枝杆菌的检测的。

5.结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c在与人类蛋白NRF1互作中的应用。

6.结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c在如下任一中的应用：

(a1)调节人类蛋白NRF1活性；

(a2)制备能够调节人类蛋白NRF1活性的产品。

7.结核蛋白Rv2239c、Rv0577和/或Rv2499c在如下任一中的应用：

(b1)预防和/或治疗与人类蛋白NRF1相关疾病；

(b2)制备用于预防和/或治疗与人类蛋白NRF1相关疾病的产品。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：所述应用中，结核蛋白Rv2239c的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；结核蛋白Rv0577的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；结核蛋白Rv2499c的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述人类蛋白NRF1的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示，或该序列经缺失、替换或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。