CN102718873A - 一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用，属结核病医学免疫学诊断技术领域。本发明的融合蛋白由38kDa、Rv0577、Rv1271c三种蛋白的抗原表位依次连接构成，38kDa蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv0577蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示；Rv1271c蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列3所示。与目前商品化的抗体检测试剂盒相比，本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在结核病血清学诊断方面均具有敏度高、特异性强、并与其它抗原具有互补性的优点，可用于检测血清、胸水等体液标本中特异的抗结核抗体。

Description

一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白及其制备和应用，具体涉及应用基因工程技术制备的一种结核分枝杆菌特异性的多抗原表位的融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c及其制备方法，属于结核病医学免疫学检测技术领域。

背景技术

在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题、与人免疫缺陷病毒（HIV）合并感染使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约200万。

中国的结核病疫情相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查初步结果表明，15岁及以上人群肺结核的患病率为459/10万，其中传染性肺结核患病率为66/10万。结核病死亡在传染病中居第一位。结核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根据1996年WHO统计每3个死亡的AIDS患者中就有一例死于合并结核，45-85%HIV死亡者是由于结核病诊断延误所致。

早期诊断、发现病人、选择敏感的抗结核药物进行有效治疗是控制结核病的关键。虽然结核病细菌学检查是目前发现传染源的主要途径和手段，是结核病诊断的“金标准”，但临床标本涂片、镜检的灵敏度低，需10⁴－10⁵个菌/ml痰才能检出，阳性率只有20-30%；传统的分枝杆菌培养阳性率低（只有30％左右），需4-8周时间。显然目前临床上常规应用的诊断方法不能满足结核病早期诊断、鉴别诊断的需要。因此，结核病的快速诊断、鉴别诊断是目前亟待解决的重要课题之一。尤其是菌阴肺结核、肺外结核和儿童结核的诊断十分困难，而免疫学检查标本来源方便、简便、快速、灵敏、特异，成为结核病重要的辅助检查手段。

结核病患者大都处于免疫紊乱状态，机体未能诱导有效的免疫应答而导致发病。在疾病的早、中期，机体的免疫功能亢进，Th1型免疫应答逐渐减弱，Th2型免疫应答增强，使Th1型免疫向Th2型免疫转移，表现为Th1型细胞因子和血清抗体逐渐增高，皮肤变态反应增强。而在疾病的中后期，细胞免疫功能低下，机体产生各种抗病因子的功能下降，体液免疫功能增强，结核病病情恶化，表现为血清抗体增高。因此，抗结核抗体检测成为临床上应用较广泛的一种简便、快速、价廉的结核病辅助诊断手段，尤其是对于那些诊断困难的菌阴肺结核、儿童结核病或肺外结核病具有实用价值。但目前尚不完全清楚结核分枝杆菌哪些抗原主要引起细胞免疫反应，而哪些抗原主要引起体液免疫反应；结核潜伏感染者、结核病患者对结核菌的不同抗原是如何反应的。目前已发现不同结核病患者对不同结核分枝杆菌抗原产生不同水平的抗体，而同一个患者在疾病的不同阶段对不同抗原的免疫反应也不同，使得每一位患者血清识别抗原的种类、数目和水平都有很大的差异，抗原识别的个体差异是人类结核病体液免疫的主要特性。此外，其他细菌感染也可能产生假阳性反应，导致目前商业化的结核抗体检测试剂盒存在灵敏度和特异性不高的问题，目前任何一种单一的抗原进行结核病血清学诊断时的灵敏度均未超过70％，尚无确切的抗原或成套的抗原可被所有的或大多数的患者所识别。抗原的筛选、评价对抗结核抗体的检测至关重要，筛选灵敏度高、特异性强、具有互补性的抗原构建融合蛋白，不仅可提高检测的灵敏度和特异性，还可降低成本，从而弥补目前诊断方法的不足。

发明内容

本发明的目的是为克服已有技术的不足，提供一种新型结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c及其制备方法，作为结核病抗体检测抗原，可提高结核抗体检测的灵敏度和特异性，应用于结核病的快速诊断。

一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由38kDa、Rv0577、Rv1271c三种蛋白抗原的关键表位依次连接构成，称为38kDa-Rv0577-Rv1271c；38kDa蛋白抗原表位的核苷酸序列（DNA序列）如序列表中序列1所示；Rv0577蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示；Rv1271c蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。

38kDa抗原是一种磷酸盐结合蛋白，参与磷酸盐代谢，是分枝杆菌增殖期积极分泌的抗原，卡介苗表达38kDa蛋白的量只是结核分枝杆菌的1/10，它有两个B细胞抗原决定簇，已成为涂阳肺结核的主要免疫抗原和筛选传染性结核病的血清学诊断试剂，它具有很高的特异性（痰菌阳性结核病人为86-92％），但对于不同人群的灵敏度为45-80%。抗38kDa抗体主要存在于进展性、复发性、慢性、空洞性结核病人中，约60%空洞性结核病人有抗38kDa抗体，该抗体主要被发现于涂阳结核病人，而非空洞性结核病人、涂阴结核病人和结核接触者阳性率低。根据全国第五次结核病流行病学抽样调查结果显示，菌阴肺结核病人占85.6%，而限制了38kDa抗原在诊断试验中的价值。

Rv0577抗原是一种功能未知的醛酮变位酶，仅在结核分枝杆菌复合群中分泌表达，而环境中的分枝杆菌不存在。该蛋白可在结核病患者的肺部表达，存在于多数活动性结核患者的痰液中，并可刺激机体产生体液免疫反应，是已知的可与结核患者血清反应的抗原之一，可提高38kDa抗体阴性患者的阳性检出率。

Rv1271c抗原是结核分枝杆菌复合群中一种功能未知的保守的分泌蛋白，可刺激结核病患者产生体液免疫反应。它作为血清学诊断抗原具有较好的特异性，检测的灵敏度为36%，但与38kDa蛋白联合应用可使诊断肺结核的灵敏度由56%提高至68%，而特异性不变。

将上述38kDa、Rv0577和Rv1271c三种结核分枝杆菌蛋白关键的抗原表位依次连接，并删除无抗原表位区域，从而提高结核抗体检测的灵敏度和特异性，实现结核病患者的早期发现。

本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c，是选择结核分枝杆菌三种蛋白38kDa、Rv0577和Rv1271c关键的抗原表位，并将其依次连接，通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。

本发明提出上述融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c的制备（构建）方法，包括如下步骤：

(1）多抗原表位融合蛋白的设计：应用分子生物学软件分析结核分枝杆菌38kDa、Rv0577、Rv1271c的基因序列和蛋白质结构，确定三个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将38kDa、Rv0577和Rv1271c蛋白抗原表位连接，形成融合蛋白；38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。

（2）三个蛋白融合的克隆：通过基因工程技术进行克隆。

①在38kDa上游引物添加Xba I酶切位点和编码3个疏水性氨基酸的DNA序列，在38kDa下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

②在Rv0577上游引物添加Xba I酶切位点，在Rv0577下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Xba I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0577/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。

③在Rv1271c上游引物添加Nhe I酶切位点和编码1个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rv1271c下游引物添加Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和HindIII双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv1271c/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列6所示。

④用Spe I和Hind III双酶切38kDa/pET30aSETB质粒作为载体；用Xba I和Hind III双酶切Rv0577/pET30aSETB质粒，获得的Rv0577片段插入38kDa/pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。经过质粒提取，分别以38kDa和Rv0577上游和下游引物进行PCR扩增鉴定，阳性重组质粒命名为38kDa-Rv0577/pET30aSETB。

⑤再用Spe I和Hind III双酶切38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和Hand III双酶切Rv1271c/pET30aSETB质粒，获得的Rv1271c片段插入38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒载体。转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB，其核苷酸序列如序列表中序列7所示，并使38kDa蛋白抗原表位与Rv0577蛋白抗原表位之间以及Rv0577蛋白抗原表位与Rv1271c蛋白抗原表位之间通过连接臂相连接，表明已成功构建了具有多抗原表位的融合蛋白重组表达质粒。

(3)多抗原表位融合蛋白的鉴定：38kDa-Rv0577-Rv1271c大肠杆菌基因工程株经过诱导、表达、纯化，SDS-PAGE电泳、鉴定，及Westhern免疫印迹反应和ELISA分析，表明获得的纯化的融合蛋白与实际设计的大小相符，并具有很好的抗原性。

本发明的结核分枝杆菌特异性融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c可应用于制备结核抗体诊断试剂盒，对结核病具有较高的抗原检测灵敏度和特异性。本发明将38kDa、Rv0577和Rv1271c蛋白的抗原表位依次通过连接臂连接而构建了多抗原表位的融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c。研究结果表明，与目前商品化的抗体检测试剂盒相比，本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在结核病血清学诊断方面均具有敏度高、特异性强、并与其它抗原具有互补性的优点，可用于检测血清、胸水等体液标本中特异的抗结核抗体。

本发明的特点及技术效果：

本发明通过基因工程技术克隆、表达、纯化结核分枝杆菌38kDa-Rv0577-Rv1271c重组融合蛋白，通过多种不同的联合作为结核病抗体检测的抗原，融合蛋白能用于检测结核病患者的抗体水平。

本发明人研究证明应用结核分枝杆菌38kDa-Rv0577-Rv1271c重组融合蛋白抗原检测结核病人的灵敏度和特异性分别为70.9%、91.8%。

本发明结核分枝杆菌重组38kDa-Rv0577-Rv1271c融合蛋白抗原可大规模生产，且成本相对较低。

本发明的融合蛋白可作为新型结核抗体检测的联合抗原之一，用于检测血清、胸水等体液样品中特异的抗结核抗体，可用于结核病临床血清学诊断。

附图说明

图1为38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后SDS-PAGE结果。

图2为38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB大肠杆菌工程菌的表达形式和纯化的SDS-PAGE结果。

具体实施方式

本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位融合蛋白及其制备方法和应用结合实施例及附图详细说明如下。

结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c，是选择结核分枝杆菌三种蛋白38kDa、Rv0577和Rv1271c关键的抗原表位，并将其依次连接，通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。

所述的融合蛋白38kDa-Rv0577-Rv1271c的制备方法，包括：

(1）三个蛋白抗原表位融合的设计：应用分子生物学软件分析结核分枝杆菌38kDa、Rv0577和Rv1271c的基因序列和蛋白质结构，确定三个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将38kDa、Rv0577和Rv1271c蛋白抗原表位连接，而形成融合蛋白。38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。融合蛋白中38kDa、Rv0577和Rv1271c的抗原表位的DNA序列分别由序列表中的序列1、2和3所示。

（2）三个蛋白融合的克隆：通过基因工程技术进行克隆。

①在38kDa上游引物添加Xba I酶切位点和编码3个疏水性氨基酸的的DNA序列，在38kDa下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa/pET30aSETB。

②在Rv0577上游引物添加Xba I酶切位点，在Rv0577下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Xba I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0577/pET30aSETB。

③在Rv1271c上游引物添加Nhe I酶切位点和编码1个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rv1271c下游引物添加Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和HindIII双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中。经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv1271c/pET30aSETB。

④用Spe I和Hind III双酶切38kDa/pET30aSETB质粒作为载体；用Xba I和Hind III双酶切Rv0577/pET30aSETB质粒，获得的Rv0577片段插入38kDa/pET30aSETB质粒载体中。转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中。经过质粒提取，分别以38kDa和Rv0577上游和下游引物进行PCR扩增鉴定，阳性重组质粒命名为38kDa-Rv0577/pET30aSETB。

⑤再用Spe I和Hind III双酶切38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和Hand III双酶切Rv1271c/pET30aSETB质粒，获得的Rv1271c片段插入38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒载体。转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB，通过连接臂使38kDa抗原表位与Rv0577抗原表位之间以及Rv0577抗原表位与Rv1271c抗原表位之间相连接，表明已成功构建了具有多抗原表位的融合蛋白重组表达质粒。

实施例1

一、通过基因工程技术克隆38kDa抗原表位编码基因：

1、依据序列表中的序列1设计与合成扩增38kDa抗原表位的一对引物

上游引物（含限制性内切酶Xba I位点）

5'－TGCTCTAGAGGCGGTGGCTCGAAACCACCGAGC－3'

下游引物（含限制性内切酶Hind III和Spe I位点）

5’－

CCCAAGCTTCATCATTAACTAGTGCCACCGCTGGAAATCGTCGCGATCAA－3'

扩增片段：1094bp

2、PCR扩增38kDa基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增38kDa基因。PCR反应程序：95℃5min；94℃1min，66℃1min，72℃2min，循环30次；最后72℃延伸7min。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定1094bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于-20℃备用。

4.重组质粒的构建：

用限制性内切酶Xba I和Hind III双酶切纯化后的PCR产物，用Nhe I和Hind III双酶切表达载体pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取38kDa基因片段和pET30aSETB质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，38kDa基因片段与pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：

混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备：

挑取大肠杆菌DH5α（或BL21）单菌落接种于5ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm培养过夜；次晨按1/100转种于100ml LB培养液中，置37℃振荡培养箱中于200rpm继续培养2-3h，待菌浓度OD₆₀₀为0.6~0.8时，放入用冰预冷的大离心管中,4℃、4000rpm、离心10min，弃上清；20ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌沉淀，冰浴30min；于4℃、6000rpm、离心10min，弃上清；用4ml0.1mol/LCaCl2重悬菌沉淀，置4℃冰箱放置过夜；次晨加入1ml无菌甘油，吹打混合均匀，每100μl分装于一个1.5ml的离心管中，置-70℃保存备用。

6.连接产物的转化：

次日取目的基因片段与载体pET30aSETB连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

7.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

（1）质粒小量提取试剂的配制

溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖

25mmol/L Tris·CL(pH8.0)

10mmol/L EDTA(pH8.0)

在101bf/in²(6.895×10⁴Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟；储存于4℃备用。

溶液Ⅱ：0.2mmol/L NaOH，1% SDS临用前配制

溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾   60ml

        冰乙酸        11.5ml

        去离子水      28.5ml

        贮存于4℃，备用。

（2）小量提取质粒

分别取约3.0ml菌液置离心管中，于12,000rpm离心1min，弃上清；细菌沉淀重悬于200μl溶液Ⅰ中，冰浴10min；加400μl新配制的溶液Ⅱ，冰浴5min；加300μl溶液Ⅲ，冰浴10min；于4℃ 12,000rpm离心10min；上清液移入干净的离心管中，加等体积酚、氯仿及氯仿各抽提一次；加2倍体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2h沉淀DNA；于4℃ 12,000rpm离心10min，弃上清；用1ml 70%乙醇洗涤沉淀一次，室温充分干燥；将沉淀溶于20μl TE缓冲液中，加入无DNA酶的胰RNA酶，使其终浓度为20μg/ml，于37℃水浴30min，消化RNA；取2μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测、定量，置－20℃储存备用。

8.鉴定重组质粒：

（1）PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为38kDa/pET30aSETB。

（2）序列测定：直接挑选一个克隆送公司进行T7和T7t双向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列4所示，其中，GGCGGTGGC编码3个甘氨酸，作为连接臂，ACTAGT为Spe I，AAGCTT为Hind III。

GGTTGGCGTCATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGAGGCGGTGGCTCGAAACCACCGAGCGGTTCGCCTGAAACGGGCGCCGGCGCCGGTACTGTCGCGACTACCCCCGCGTCGTCGCCGGTGACGTTGGCGGAGACCGGTAGCACGCTGCTCTACCCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACGATCACCGCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGACGGTCAACATTGGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAAGGGGCTGATGAACATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACCTGCCCGGAGTGAGCGAGCACCTCAAGCTGAACGGAAAAGTCCTGGCGGCCATGTACCAGGGCACCATCAAAACCTGGGACGACCCGCAGATCGCTGCGCTCAACCCCGGCGTGAACCTGCCCGGCACCGCGGTAGTTCCGCTGCACCGCTCCGACGGGTCCGGTGACACCTTCTTGTTCACCCAGTACCTGTCCAAGCAAGATCCCGAGGGCTGGGGCAAGTCGCCCGGCTTCGGCACCACCGTCGACTTCCCGGCGGTGCCGGGTGCGCTGGGTGAGAACGGCAACGGCGGCATGGTGACCGGTTGCGCCGAGACACCGGGCTGCGTGGCCTATATCGGCATCAGCTTCCTCGACCAGGCCAGTCAACGGGGACTCGGCGAGGCCCAACTAGGCAATAGCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAGGCCGCGGCGGCTGGCTTCGCATCGAAAACCCCGGCGAACCAGGCGATTTCGATGATCGACGGGCCCGCCCCGGACGGCTACCCGATCATCAACTACGAGTACGCCATCGTCAACAACCGGCAAAAGGACGCCGCCACCGCGCAGACCTTGCAGGCATTTCTGCACTGGGCGATCACCGACGGCAACAAGGCCTCGTTCCTCGACCAGGTTCATTTCCAGCCGCTGCCGCCCGCGGTGGTGAAGTTGTCTGACGCGTTGATCGCGACGATTTCCAGCGGTGGCACTAGTTAATGATGAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAGCTATCCAC

二、通过基因工程技术克隆Rv0577抗原表位编码基因：

1、依据序列表中的序列2设计与合成扩增Rv0577抗原表位的一对引物

上游引物（5’端含限制性内切酶Xba I）

5’－TGCTCTAGAATGCCGAAGCGTAGCGAATACA－3'

下游引物（5’端含限制性内切酶Hind III和Spe I）

5'－

CCCAAGCTTACCTTATTAACTAGTACCGCCACCTTGCTGCGGTGCTGGCTTCA－3'

扩增片段：825bp

2、PCR扩增Rv0577基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增Rv0577基因。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定825bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于-20℃备用。

4.重组质粒的构建：

用限制性内切酶Xba I和Hind III双酶切纯化后的PCR产物，用Xba I和Hind III双酶切表达载体pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取Rv0577基因片段和pET30aSETB质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rv0577基因片段与pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：

混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.连接产物的转化：

次日取目的基因片段与载体pET30aSETB连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

6.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，定量后，置－20℃储存备用。

7.鉴定重组质粒：

（1）PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为Rv0577/pET30aSETB。

（2）序列测定：直接挑选一个克隆送公司进行T7和T7t双向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列5所示，其中，TCTAGA为Xba I酶切位点，CCG编码Pro，CGT编码Arg，CCA编码Pro脯氨酸，ACTAGT为Spe I，AAGCTT为Hind III。

GCCTGACGTCATTACCTCTAGAATGCCGAAGCGTAGCGAATACAGGCAAGGCACGCCGAACTGGGTCGACCTTCAGACCACCGATCAGTCCGCCGCCAAAAAGTTCTACACATCGTTGTTCGGCTGGGGTTACGACGACAACCCGGTCCCCGGAGGCGGTGGGGTCTATTCCATGGCCACGCTGAACGGCGAAGCCGTGGCCGCCATCGCACCGATGCCCCCGGGTGCACCGGAGGGGATGCCGCCGATCTGGAACACCTATATCGCGGTGGACGACGTCGATGCGGTGGTGGACAAGGTGGTGCCCGGGGGCGGGCAGGTGATGATGCCGGCCTTCGACATCGGCGATGCCGGCCGGATGTCGTTCATCACCGATCCGACCGGCGCTGCCGTGGGCCTATGGCAGGCCAATCGGCACATCGGAGCGACGTTGGTCAACGAGACGGGCACGCTCATCTGGAACGAACTGCTCACGGACAAGCCGGATTTGGCGCTAGCGTTCTACGAGGCTGTGGTTGGCCTCACCCACTCGAGCATGGAGATAGCTGCGGGCCAGAACTATCGGGTGCTCAAGGCCGGCGACGCGGAAGTCGGCGGCTGTATGGAACCGCCGATGCCCGGCGTGCCGAATCATTGGCACGTCTACTTTGCGGTGGATGACGCCGACGCCACGGCGGCCAAAGCCGCCGCAGCGGGCGGCCAGGTCATTGCGGAACCGGCTGACATTCCGTCGGTGGGCCGGTTCGCCGTGTTGTCCGATCCGCAGGGCGCGATCTTCAGTGTGTTGAAGCCAGCACCGCAGCAAGGTGGCGGTA CTAGTTAATAAGGTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGCGGGTGTGGGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCTAGCGCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCACGATCGCGGCTTTCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCTCCTTAAGGTTCCGAATTAATGCTTACGGAACTCCGACCCAAAACCTGGAATTAGGGTGTCGTATGGCAATCGCTTATAGACGATTTTTGCTCCTTTGACAGCTTTAAGTCCACCAGCCGTCC

三、通过基因工程技术克隆Rv1271c抗原表位编码基因：

1、依据序列表中的序列3设计与合成扩增Rv1271c抗原表位的一对引物上游引物（5’端含限制性内切酶Nhe I）

5’－CTAGCTAGCGGTGCCAACACCAAAGACGA－3'

下游引物（5’端含限制性内切酶Hind III）

5'－CCCAAGCTTAGGTGAGCTGGCTGGCGTAT－3'

扩增片段：267bp

2、PCR扩增Rv1271c基因

用上下游引物，在Taq plus I DNA聚合酶的作用下，以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，扩增Rv1271c基因。于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定267bp的扩增DNA片段。

3、回收目的基因片段：

琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于-20℃备用。

4.重组质粒的构建：

分别用限制性内切酶Nhe I和Hind III双酶切纯化后的PCR产物和表达载体pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取Rv1271c基因片段和pET30aSETB质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rv1271c基因片段与pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：

混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

5.连接产物的转化：

次日取目的基因片段与载体pET30aSETB连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

6.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，定量后，置－20℃储存备用。

7.鉴定重组质粒：

（1）PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，以上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为Rv1271c/pET30aSETB。

（2）序列测定：直接挑选一个克隆送公司进行T7正向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列6所示，其中，GCTAGC为Nhe I，AAGCTT为Hind III。

GCTGACGTCGTTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGCGGTGCCAACACCAAAGACGAAGCCTTCATTGCTCAGATGGAGTCCATTGGCGTCACCTTCTCCTCACCGCAGGTGGCCACCCAGCAAGCCCAGCTGGTCTGCAAGAAGCTGGCCAGCGGCGAAACCGGCACCGAGATCGCCGAGGAGGTCCTCAGCCAAACCAACCTGACCACTAAGCAGGCAGCCTACTTCGTCGTCGACGCAACCAAGGCCTACTGCCCGCAATACGCCAGCCAGCTCACCTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCTATTTGTTATTTTCTAAATACATTCAATATGTATCCGCTCATGAATTAATCTAGAAAACTCATCGAGCATCAATGAACTGCAATTTATCATATCAGATATCATACATATTTTTGAAAAGCGTTTCTGTATGAGGAAAAACTCACGAGCCAGTCATAGATGCAAGAATCCTGATCGACTGCAATTCGAACTGTCACTCAATCAAACCTAATTAAATTCCCTCTGCGTCAAAAATAAGGGG

四、通过基因工程技术克隆38kDa-Rv0577融合编码基因：

1.重组质粒的构建：

用限制性内切酶Spe I和Hind III双酶切38kDa/pET30aSETB质粒DNA，用XbaI和Hind III双酶切Rv0577/pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取38kDa/pET30aSETB质粒片段和Rv0577基因片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rv0577基因片段与38kDa/pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：

混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

2.连接产物的转化：

次日取Rv0577基因片段与38kDa/pET30aSETB DNA片段连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

3.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

4.PCR扩增鉴定重组质粒：

以挑选的菌落质粒DNA为模板，分别以38kDa和Rv0577上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为38kDa-Rv0577/pET30aSETB。

五、通过基因工程技术克隆38kDa-Rv0577-Rv1271c融合编码基因：

1.重组质粒的构建：

用限制性内切酶Spe I和Hind III双酶切38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒DNA，用Nhe I和Hind III双酶切Rv1271c/pET30aSETB质粒DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳，切取38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒片段和Rv1271c基因片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，Rv1271c基因片段与38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：

混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。

2.连接产物的转化：

次日取Rv1271c基因片段与38kDa-Rv0577/pET30aSETB DNA片段连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。

3.质粒的提取：

根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。

4.鉴定重组质粒：

（1）PCR扩增鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，分别以38kDa、Rv0577和Rv1271c上游和下游引物进行PCR扩增鉴定。扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，阳性重组质粒命名为38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB。

（2）序列测定：直接挑选一个克隆送公司进行T7和T7t双向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列7所示，其中，AGA为Xba I酶切后插入Nhe I酶切位点，产生的新序列，GCTAGAGGCGGT作为连接臂，ACTAGA为Xba I插入Spe I产生的新序列，GGTGGCACTAGA为连接臂，ACTAGC为连接臂GlyGlyGlyThrSer，即GGGTS，3个甘氨酸+苏氨酸+丝氨酸，ACTAGC是Nhe I插入Spe I产生的新序列，GGT编码Gly，TAA为终止密码，AAGCTT为Hind III。

GTTTAACCGGTACATTCCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGGTATGGCTAGAGGCGGTGGCTCGAAACCACCGAGCGGTTCGCCTGAAACGGGCGCCGGCGCCGGTACTGTCGCGACTACCCCCGCGTCGTCGCCGGTGACGTTGGCGGAGACCGGTAGCACGCTGCTCTACCCGCTGTTCAACCTGTGGGGTCCGGCCTTTCACGAGAGGTATCCGAACGTCACGATCACCGCTCAGGGCACCGGTTCTGGTGCCGGGATCGCGCAGGCCGCCGCCGGGACGGTCAACATTGGGGCCTCCGACGCCTATCTGTCGGAAGGTGATATGGCCGCGCACAAGGGGCTGATGAACATCGCGCTAGCCATCTCCGCTCAGCAGGTCAACTACAACCTGCCCGGAGTGAGCGAGCACCTCAAGCTGAACGGAAAAGTCCTGGCGGCCATGTACCAGGGCACCATCAAAACCTGGGACGACCCGCAGATCGCTGCGCTCAACCCCGGCGTGAACCTGCCCGGCACCGCGGTAGTTCCGCTGCACCGCTCCGACGGGTCCGGTGACACCTTCTTGTTCACCCAGTACCTGTCCAAGCAAGATCCCGAGGGCTGGGGCAAGTCGCCCGGCTTCGGCACCACCGTCGACTTCCCGGCGGTGCCGGGTGCGCTGGGTGAGAACGGCAACGGCGGCATGGTGACCGGTTGCGCCGAGACACCGGGCTGCGTGGCCTATATCGGCATCAGCTTCCTCGACCAGGCCAGTCAACGGGGACTCGGCGAGGCCCAACTAGGCAATAGCTCTGGCAATTTCTTGTTGCCCGACGCGCAAAGCATTCAGGCCGCGGCGGCTGGCTTCGCATCGAAAACCCCGGCGAACCAGGCGATTTCGATGATCGACGGGCCCGCCCCGGACGGCTACCCGATCATCAACTACGAGTACGCCATCGTCAACAACCGGCAAAAGGACGCCGCCACCGCGCAGACCTTGCAGGCATTTCTGCACTGGGCGATCACCGACGGCAACAAGGCCTCGTTCCTCGACCAGGTTCATTTCCAGCCGCTGCCGCCCGCGGTGGTGAAGTTGTCTGACGCGTTGATCGCGACGATTTCCAGCGGTGGCACTAGAATGCCGAAGCGTAGCGAATAACAGGCAAGGCACGCGAACTGGGTCGACTTCAGACCACCGATCAGTCGCCGCCAAAAAGTTCTACACATCGTTGTTCGGCTGGGGTTACGACGACAACCCGGTCCCCGGAGGCGGTGGGGTCTATTCCATGGCCACGCTGAACGGCGAAGCCGTGGCCGCCATCGCACCGATGCCCCCGGGTGCACCGGAGGGGATGCCGCCGATCTGGAACACCTATATCGCGGTGGACGACGTCGATGCGGTGGTGGACAAGGTGGTGCCCGGGGGCGGGCAGGTGATGATGCCGGCCTTCGACATCGGCGATGCCGGCCGGATGTCGTTCATCACCGATCCGACCGGCGCTGCCGTGGGCCTATGGCAGGCCAATCGGCACATCGGAGCGACGTTGGTCAACGAGACGGGCACGCTCATCTGGAACGAACTGCTCACGGACAAGCCGGATTTGGCGCTAGCGTTCTACGAGGCTGTGGTTGGCCTCACCCACTCGAGCATGGAGATAGCTGCGGGCCAGAACTATCGGGTGCTCAAGGCCGGCGACGCGGAAGTCGGCGGCTGTATGGAACCGCCGATGCCCGGCGTGCCGAATCATTGGCACGTCTACTTTGCGGTGGATGACGCCGACGCCACGGCGGCCAAAGCCGCCGCAGCGGGCGGCCAGGTCATTGCGGAACCGGCTGACATTCCGTCGGTGGGCCGGTTCGCCGTGTTGTCCGATCCGCAGGGCGCGATCTTCAGTGTGTTGAAGCCAGCACC GCAGCAAGGTGGCGGTACTAGCGGTGCCAACACCAAAGACGAAGCCTTCATTGCTCAGATGGAGTCCATTGGCGTCACCTTCTCCTCACCGCAGGTGGCCACCCAGCAAGCCCAGCTGGTCTGCAAGAAGCTGGCCAGCGGCGAAACCGGCACCGAGATCGCCGAGGAGGTCCTCAGCCAAACCAACCTGACCACTAAGCAGGCAGCCTACTTCGTCGTCGACGCAACCAAGGCCTACTGCCCGCAATACGCCAGCCAGCTCACCTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAAGCTGAGGT

六、38kDa-Rv0577-Rv1271c工程菌的诱导表达及鉴定

将38kDa-Rv0577-Rv1271c大肠杆菌工程菌接种于5ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD₆₀₀为0.6－0.8时，加入IPTG，诱导3－4hr。

将1×载样缓冲液150μl加入来自1ml菌液的沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl进行13%SDS-PAGE，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰。38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB菌体在相对分子质量76kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3-4小时表达量最多，结果见图1。

图1为38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后SDS-PAGE结果，其中，

1：蛋白质分子量标准（TaKaRa-D530A,97.2,66.4,44.3,29.0,20.114.3kDa）；

2：基因工程菌诱导前；

3：基因工程菌诱导后1小时；

4：基因工程菌诱导后2小时；

5：基因工程菌诱导后3小时；

6：基因工程菌诱导后4小时。

七、38kDa-Rv0577-Rv1271c重组蛋白的纯化

将诱导菌超声破碎后，采用Novagen公司生产的His.Bind蛋白纯化试剂盒按试剂盒说明书纯化38kDa-Rv0577-Rv1271c融合蛋白，13%SDS-PAGE电泳可见纯化的76kDa蛋白呈一条带，结果见图2。

图2为38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB大肠杆菌工程菌的表达形式和纯化的SDS-PAGE结果，其中：

1：蛋白质分子量标准（TaKaRa-D530A,97.2,66.4,44.3,29.0,20.114.3kDa）；

2：基因工程菌诱导前；

3：基因工程菌诱导后；

4：基因工程菌表达菌体超声破碎后高速离心分离出的上清（可溶性部分）样品；

5：基因工程菌表达菌体超声破碎后高速离心分离出的沉淀（不可溶性部分）样品；

6：纯化后蛋白样品。

实施例2

将本发明实施例1所构建、纯化的38kDa-Rv0577-Rv1271c融合蛋白应用于结核病的血清学诊断。以其作为化学发光免疫实验的诊断抗原，应用于临床标本的试验，获得了较好的诊断效果，与目前商品化的三个结核抗体检测试剂盒比较，显著地提高了结核病诊断的灵敏度。ELISA检测程序如下所示：

1．实验标本：共选择103例血清标本，分为两组：

（1）结核病组：临床上经影像学、实验室检查及抗结核治疗而确诊的活动性结核病患者54例，其中男35例，女19例，平均年龄43.1±18.8岁。包括肺结核、结核性胸膜炎、结核性心包炎、结核性脑膜炎、泌尿系结核等。

（2）非结核对照组：临床上经影像学、实验室检查及治疗效果而确诊的非结核呼吸疾病患者49例，其中男25例，女24例，平均年龄61.3±20.8岁。包括肺炎、慢性支气管肺炎、支气管哮喘、肺癌、支气管扩张合并感染、呼吸道感染等。

2．实验仪器和试剂

仪器：化学发光分析仪KPS-KM为北京科美东雅科技发展有限公司公司产品。

试剂：38kDa-Rv0577-Rv1271c融合蛋白，3个商品化的结核抗体诊断试剂盒（包括韩国SD标准诊断公司、上海奥普生物医药有限公司、北京现代高达生物技术有限责任公司），包被缓冲液（0.05mol/L碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，pH9.6），封闭液(PBS-2%小牛血清），洗涤液(PBST，PBS-0.05%吐温,pH7.4)，样本稀释液(PBST-2%小牛血清，pH7.4)，酶标第二抗体（HPR标记的羊抗人IgG），化学发光底物液（用前15分钟将A与B试剂按1:1配制）。

3．实验方法

（1）抗原包被：用包被缓冲液将重组蛋白抗原稀释至10μg／ml，每孔加100μl。每板留1个孔，只加包被缓冲液，作为空白对照。置4℃过夜。次日用PBST洗板3次，3分钟/次。

（2）封闭：每孔加PBS-2%小牛血清200μl，置37℃孵育1小时。用PBST洗板3次，3分钟/次。

（3）加待检样品：用PBST-2%小牛血清稀释待检样品，充分混匀后，每孔加100μl，做2个平行孔；同时做空白、阴性及阳性孔对照，置37℃孵育40分钟。用PBST洗板3次，3分钟/次。

（4）加酶标二抗：用PBST-2%小牛血清新鲜稀释酶标第二抗体，充分混匀后，每孔加100μl，置37℃孵育40分钟。用PBST洗板6次，8分钟/次。

（5）加底物液：每孔加100μl新鲜配制的化学发光底物液，立即放入化学发光分析检测仪，5分钟读取发光强度。

4.结果

实验结果见表1，38kDa-Rv0577-Rv1271c融合蛋白用作抗原检测结核抗体的特异性（为91.8%）明显高于上海奥普生物医药有限公司（为66.7%）和北京现代高达生物技术有限责任公司（为84.8%）的结核抗体诊断试剂盒，略低于韩国SD标准诊断公司的结核抗体诊断试剂盒（为97.0%）。38kDa-Rv0577-Rv1271c融合蛋白的灵敏度（为70.4%）明显高于韩国SD标准诊断公司（为24.1%）、北京现代高达生物技术有限责任公司（为33.3%）的结核抗体诊断试剂盒和传统的涂片和培养（为20.4%），略低于上海奥普生物医药有限公司的结核抗体诊断试剂盒（为77.8%）。本发明的融合蛋白用作抗原检测结核抗体无论是菌阳还是菌阴的活动性结核病患者均具有较高的检出率。结果表明：与现有商品化的结核抗体检测试剂盒和传统的涂片、培养相比，本发明所构建的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，在对结核病诊断的灵敏度和特异性方面具有明显的优势。因此，本发明在结核病血清学快速诊断方面具有广泛的应用前景。

表1应用化学发光酶免疫方法检测结核和非结核血清中抗结核抗体

Claims (4)

1.一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其由38kDa、Rv0577、Rv1271c三种蛋白的抗原表位依次连接构成，38kDa蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列1所示；Rv0577蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示；Rv1271c蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白，其特征在于：所述的38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端。

3.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1）应用分子生物学软件分析结核分枝杆菌38kDa、Rv0577、Rv1271c的基因序列和蛋白质结构，确定三个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；依次将38kDa、Rv0577和Rv1271c蛋白抗原表位连接，形成融合蛋白；38kDa蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Rv1271c蛋白的抗原表位位于融合蛋白的梭基端；

（2）三个蛋白融合的克隆：

①在38kDa上游引物添加Xba I酶切位点和编码3个疏水性氨基酸的的DNA序列，在38kDa下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa/pET30aSETB；

②在Rv0577上游引物添加Xba I酶切位点，在Rv0577下游引物添加编码3个疏水性氨基酸的DNA序列和Spe I、Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Xba I和Hind III双酶切后，插入用Xba I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv0577/pET30aSETB；

③在Rv1271c上游引物添加Nhe I酶切位点和编码1个疏水性氨基酸的DNA序列，在Rv1271c下游引物添加Hind III酶切位点，将PCR扩增产物用Nhe I和HindIII双酶切后，插入用Nhe I和Hind III双酶切后的pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，经T7正向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒Rv1271c/pET30aSETB；

④用Spe I和Hind III双酶切38kDa/pET30aSETB质粒作为载体；用Xba I和Hind III双酶切Rv0577/pET30aSETB质粒，获得的Rv0577片段插入38kDa/pET30aSETB质粒载体中；转化到大肠杆菌DH5α受体菌中；经过质粒提取，分别以38kDa和Rv0577上游和下游引物进行PCR扩增鉴定，阳性重组质粒命名为38kDa-Rv0577/pET30aSETB；

⑤再用Spe I和Hind III双酶切38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒作为载体；用Nhe I和Hand III双酶切Rv1271c/pET30aSETB质粒，获得的Rv1271c片段插入38kDa-Rv0577/pET30aSETB质粒载体；转化到大肠杆菌BL21（DE3）受体菌中；经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒38kDa-Rv0577-Rv1271c/pET30aSETB；并使38kDa抗原表位与Rv0577抗原表位之间以及Rv0577抗原表位与Rv1271c抗原表位之间通过连接臂相连接。

4.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白在制备结核抗体诊断试剂盒中的应用。

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