CN106596936B

CN106596936B - 体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN106596936B
Application number: CN201611176211.6A
Authority: CN
Inventors: 林毅然; 王季武; 黄海燕
Original assignee: Wujiang Huayouth Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Wujiang Huayouth Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-19
Also published as: CN106596936A

Abstract

本发明涉及体外定量测定vWF‑CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法；方法包括试纸条制备、反应液制备、显色反应、酶活性计算等步骤，检测试剂盒包括试纸条、标准品1、标准品2、vWF‑CP底物、工作液和终止液，试纸条上的金标抗体为胶体金标记的抗vWF‑CP底物抗体，T线抗体为抗vWF‑CP底物抗体，C线抗体为抗金标抗体抗体，金标抗体与T线抗体结合vWF‑CP底物上不同的位点；标准品1和标准品2分别为高vWF‑CP酶相对活性和低vWF‑CP酶相对活性的制品；工作液为含二价金属离子的缓冲液，终止液为含能络合二价金属离子的缓冲液；检测试剂盒的制备方法包括试纸条制备、标准品制备、vWF‑CP底物制备、工作液和终止液制备等步骤；本发明的方法、检测试剂盒，检测快捷、灵敏度高、准确性好。

Description

体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法。

背景技术

血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)是一种严重的弥散性血栓性微血管病，以微血管病性溶血性贫血、血小板聚集消耗性减少，以及微血栓形成造成器官损害(如肾脏、中枢神经系统等)为特征。早期报道，TTP发病率为0.2～1/10万，随着临床上对于此疾病的逐渐认知，近年来TTP的发病率有上升的趋势。目前，国内尚未见到相关的流行病学统计。病人以女性为多，任何年龄均可发病，但最常见的发病年龄多为20～60岁，没有地域或种族的差异。在临床中具备典型“五联征”(微血管病性溶血性贫血、血小板聚集消耗性减少、微血栓形成造成器官损害、神经系统异常和发热)的患者，常因其表现的多样性和非典型而导致误诊，TTP早期明确诊断并及时治疗，病死率可从90％降为20％～30％，整体生存率提高为70％～85％。目前，血浆置换是TTP首选和有效的治疗方法，并且发病后越早治疗救活率越好。同时因为血浆置换的治疗费用昂贵，血制品稀缺，并且有感染病毒性疾病和引起并发症的风险，一旦误诊后果严重。因此是否能够早期迅速诊断及应用血浆置换治疗是影响TTP预后的重要因素。因此，TTP的早期发现至关重要。

目前对TTP的诊断主要依靠临床表现，尚无特异的诊断性实验室检查，缺乏客观性与可靠性。研究发现，血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一种大分子多聚体糖蛋白，在止血和血栓形成中起着重要作用。vWF多聚体的结构组成主要受血管性血友病因子裂解酶(von Willebrand factor cleaving protease,vWF-CP)调节，vWF-CP又名为ADAMTS-13(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin 13repeatsfamily of metalloproteases)，正常人血浆中存在能够裂解uL-vWF('unusually large'vWF)的蛋白酶。该酶在正常机体内可以特异性地裂解vWF的A2区的第1605位酪氨酸—1606位蛋氨酸(Y1605-M1606)之间的肽，从而使vWF裂解，保持正常的止血和血循环功能。当体内vWF-CP基因缺陷或者血浆中产生针对该酶的自身抗体时，vWF-CP的活性下降，uL-vWF在微血管中诱发血小板聚集形成微血栓，导致TTP的发生。临床研究发现，正常人vWF-CP的活性水平下限大多大于正常人平均值的50％，上限因测量方法不同而有所区别。遗传性TTP患者，其活性都低于正常活性的5％～10％，甚至几乎为零。获得性TTP患者大部分也有重度降低，仅少数患者只是轻度和中度下降。

判断vWF-CP酶活性水平，对此类疾病的诊断和预后判断具有重要价值。早期的检测技术包括免疫放射测定、胶原结合法、瑞斯托霉素辅因子(vWF)，底物为全片段长vWF，多聚物，需要添加变性剂进行解折叠，但是人体内并无变性剂，不符合生理学条件，反应时间较长，16-48小时左右，时常导致病人因无法及时诊断、治疗而丧失生命。

荧光共振能量转移法：化学合成底物FRETS-vWF73，底物被特异性裂解后会减轻荧光淬灭作用，即正常人血浆和底物作用后会使荧光增强，vWF-CP活性缺乏的患者无影响或荧光减弱。参考文献：Kokame K,Nobe Y,Kokubo Y,et al.FRETS-vWF73,a firstfluorogenic substrate for ADAMTS13assay.Br J Haematol 2005；129:93–100，此技术需要实验室配置价值不菲的多功能酶标仪，带荧光检测功能，并且化学合成底物的成本昂贵，导致多数病人因无法负担而放弃检测。

利用酶联免疫吸附测定vWF-CP活性是最近几年流行起来的方法，基于双抗夹心法ELISA技术，预先包被对底物具特异性抗体的酶标板孔，先后加入底物和血浆样本混合孵育，再加入酶标抗体和显色液，当底物和含有vWF-CP的血浆样本混合孵育后，底物被vWF-CP所裂解，酶标仪的吸光度值就较低。如果血浆样本中的vWF-CP活性较低或者存在先天性vWF-CP缺陷，则吸光度值较高。之前报道的文献中大多是采用GST-vWF73-His作为底物，(Zhou W,Tsai HM.An enzyme immunoassay of ADAMTS13distinguishes patients withthrombotic thrombocytopenic purpura fromnormal individuals and carriers ofADAMTS13 mutations.Thromb)或者A2区域的片段作为底物(Haemost 2004；91:806–11Whitelock JL,Nolasco L,Bernardo A,Moake J,Dong JF,Cruz MA.ADAMTS-13activityin plasma is rapidly measured by a new ELISAmethod that uses recombinant vWF-A2domain as substrate.JThromb Haemost 2004；2:485–91.),此重组蛋白分子量较大，测试技术过程复杂且耗时长，难以迎合大规模TTP筛查的需求，也不适用于急诊室病人紧急诊断、治疗的临床需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种检测快捷、灵敏度高、准确性好的体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法。

本发明的第一方面提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病诊断和治疗的方法，包括以下步骤：

S1、试纸条制备：将样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫依次组装，所述NC膜上设置有检测线和质控线，所述金标垫、检测线和质控线上分别包被有金标抗体、T线抗体和C线抗体；

S2、反应液制备：将标准品1、标准品2、待测样品分别与vWF-CP底物混合反应一段时间后终止反应；

S3、显色反应：将各反应液分别加入至试纸条的样品垫，一段时间后扫描各试纸条的检测线读数值；

S4、酶活性计算：将待测样品显色反应后的检测线读数值与标准品1和标准品2显色反应后的检测线读数值进行比较，计算得到待测样品中vWF-CP酶活性；

其中，所述金标抗体为胶体金标记的抗vWF-CP底物抗体，所述T线抗体为抗vWF-CP底物抗体，所述C线抗体为抗金标抗体抗体，所述金标抗体与T线抗体结合vWF-CP底物上不同的位点；

所述标准品1和标准品2分别为高vWF-CP酶相对活性和低vWF-CP酶相对活性的制品。

进一步的，所述标准品1和标准品2为vWF-CP酶相对活性分别为0％和100％的制品。

应当说明的是，所述待测样本应当包括但不限于血浆、血清、全血，凡是包含待测酶活性vWF-CP的样本，均应落入本发明的保护范围。

进一步的，所述vWF-CP底物包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有不同的标签氨基酸序列，所述vWF功能区氨基酸序列为包含vWF-CP对vWF的酶切位点Y1605至M1606的序列，所述金标抗体与T线抗体分别结合vWF-CP底物N端和C端的标签氨基酸序列。

应当说明的是，标签氨基酸序列又称蛋白标签(proteintag)，是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等，所述标签氨基酸序列应当包括但不限于MyC、His、GST、HA、FLAG、HAS。

应当说明的是，vWF是由第12号染色体的短臂所编码的糖蛋白，52个外显子长178kb，其cDNA全长8900，包含一个编码2813个氨基酸残基的阅读框，其产物是309kD的vWF前体；由于vWF分子量较大，为了提高临床检测效率，现有技术中对保持被vWF-CP酶切活性的vWF功能区氨基酸序列做了一定研究，该vWF功能区氨基酸序列应当满足以下要求：1)包含vWF的A2区的vWF酶切位点Y1605至M1606的序列；2)不包含任何半胱氨酸残基，以免影响蛋白质的正常折叠。

研究表明，满足这一要求的vWF功能区氨基酸序列最长为vWF的D1459至R1668的序列，即vWF功能区氨基酸序列优选为选自vWF的D1459至R1668中且包含酶切位点Y1605至M1606的一段序列。例如，vWF功能区氨基酸序列可选自vWF的D1459至R1668、或E1554至R1668、或D1587至R1668、或D1596至R1668的序列，研究表明这些序列均可以满足被vWF-CP酶切。

应当说明的是，vWF-CP酶切底物的大小直接影响到酶切效率，而能够被vWF-CP特异性裂解的最小功能序列为vWF73，即vWF序列中D1596至R1668的序列，共73个氨基酸残基(vWF73,a region from D1596to R1668of von Willebrand factor,provides a minimalsubstrate for ADAMTS-13，Koichi Kokame，Masanori Matsumoto，Yoshihiro Fujimura，Toshiyuki Miyata，Blood 2004 103:607-612；doi:10.1182/blood-2003-08-2861)，即，vWF功能区氨基酸序列最优为vWF73，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列。vWF功能区氨基酸序列的N端和C端结合不同的标签，直接影响着vWF-CP酶切效率，以vWF功能区氨基酸序列选用vWF73进一步实验，并结合不同的标签，如HAS、GST、HIS等，结果表明几组标签中酶切效率HIS-vWF73-FLAG>HIS-HAS-vWF73-FLAG>GST-vWF73–HIS，换言之，vWF功能区氨基酸序列的N端和C端标记HIS和FLAG标签氨基酸序列，作为最优的vWF-CP底物设计方案。

优选的，所述vWF-CP底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示

进一步的，所述T线抗体为抗FLAG标签鼠单克隆抗体，所述C线抗体为二抗羊抗鼠IgG，所述金标抗体为胶体金标记抗HIS标签鼠单克隆抗体。

进一步的，所述步骤S4中酶活性按下列公式进行计算：

本发明的第二方面提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒，包括试纸条、标准品1、标准品2、vWF-CP底物、工作液和终止液，其中，

所述试纸条包括依次组装的样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫，所述NC膜上设置有检测线和质控线，所述金标垫、检测线和质控线上分别包被有金标抗体、T线抗体和C线抗体，所述金标抗体为胶体金标记的抗vWF-CP底物抗体，所述T线抗体为抗vWF-CP底物抗体，所述C线抗体为抗金标抗体抗体，所述金标抗体与T线抗体结合vWF-CP底物上不同的位点；

所述标准品1和标准品2分别为高vWF-CP酶相对活性和低vWF-CP酶相对活性的制品；

所述工作液为含二价金属离子的缓冲液，所述终止液为含能络合二价金属离子的缓冲液。

进一步的，所述vWF功能区氨基酸序列优选为选自vWF的D1459至R1668中且包含酶切位点Y1605至M1606的一段序列。

优选的，所述vWF功能区氨基酸序列选自vWF的D1459至R1668、或E1554至R1668、或D1587至R1668、或D1596至R1668的序列。

优选的，所述vWF功能区氨基酸序列为vWF73，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列。

优选的，所述vWF-CP底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示

本发明的第三方面提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

S1、试纸条制备：将T线抗体和C线抗体分别稀释后，分别用胶体金喷膜仪在NC膜上划线得到检测线和质控线，烘干处理；将金标抗体稀释后，用胶体金喷膜仪喷涂在金标垫上，烘干处理；然后将样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫依次组装、裁剪得到试纸条；

S2、标准品制备：将高相对活性和低相对活性的vWF-CP酶分别稀释后得到标准品1和标准品2；

S3、vWF-CP底物制备：将可被vWF-CP酶切的底物在缓冲液中保存；

S4、工作液和终止液制备：分别配置含二价金属离子的缓冲液和含能络合二价金属离子的缓冲液，即分别为工作液和终止液。

优选的，所述vWF-CP底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示

进一步的，所述步骤S1中，将T线抗体和C线抗体分别用PBS稀释至1.5ug/ul和2ug/ul，分别用胶体金喷膜仪在NC膜上划线得到检测线和质控线。

进一步的，所述步骤S1中，将T线抗体和C线抗体分别稀释后，分别用胶体金喷膜仪按1ul/cm在NC膜上划线得到检测线和质控线，37度2小时烘干。

进一步的，所述步骤S1中，将金标抗体与金标抗体稀释液按1：3稀释后，用胶体金喷膜仪喷涂在金标垫上，37度2小时烘干。

进一步的，所述步骤S1中，将样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫依次在底板上组装，按3mm/条规格裁切成试纸条；试纸条与塑料卡组装成胶体金检测试纸卡，加入干燥剂，放入铝箔袋中封装。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：采用胶体金免疫层析技术及胶体金检测仪来测定血清或血浆样本中的vWF-CP酶相对活性；标准品、样本与重组蛋白经酶切反应后加入胶体金检测试纸卡，样本中重组蛋白与胶体金标记抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿纸条向前移动，经过检测线时：只有完整的重组蛋白与金标抗体结合形成的复合物可与预包被的抗体结合形成夹心物而聚集显色；而已被酶切的重组蛋白与金标抗体结合形成的复合物、游离的金标记抗体则与对照线处预包被抗体结合而富集显色，检测线显色强弱与样本中vWF-CP酶相对活性成负相关，将完成显色的试纸卡经胶体金检测仪读取检测线显色值，经仪器自动处理显示样本vWF-CP酶相对活性。

POCT(即时检验，point-of-care testing)，指在病人旁边进行的临床检测(床边检测bed side testing)，通常不一定是临床检验师来进行，是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法；本发明的体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒，符合POCT的要求，检测过程快捷、灵敏度高、准确性好。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是本发明第一实施例中底物经SDS-PAGE检测的表达纯化结果图；

图2是本发明第五实施例中标准品和待测样品的试纸条检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一vWF-CP底物的准备

本发明一较佳实施例提供一种vWF-CP底物的制备方法，包括以下步骤：

S1、目的基因片段的获得，该目的基因片段可编码vWF-CP底物，该底物包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有标签氨基酸序列，vWF功能区氨基酸序列为包含vWF-CP对vWF的酶切位点Y1605至M1606的序列。

根据现有研究，vWF功能区氨基酸序列可选自vWF的D1459至R1668中且包含酶切位点Y1605至M1606的一段序列，如vWF的D1459至R1668、或E1554至R1668、或D1587至R1668、或D1596至R1668的序列，其中能够被vWF-CP特异性裂解的最小功能序列为vWF73，即D1596至R1668的序列，共73个氨基酸残基，序列如SEQ ID NO：1所示。由于这些序列均可以满足被vWF-CP酶切，本实施例选择vWF73作为后续实验中的vWF功能区氨基酸序列。

应当说明的是，本公司在先申请申请号为201610943066.3的发明专利中已指出，vWF功能区氨基酸序列的N端和C端结合不同的标签，直接影响着vWF-CP酶切效率，以vWF功能区氨基酸序列选用vWF73进一步实验，并结合不同的标签，如HAS、GST、HIS等，结果表明几组标签中酶切效率HIS-vWF73-FLAG>HIS-HAS-vWF73-FLAG>GST-vWF73–HIS，换言之，vWF功能区氨基酸序列的N端和C端标记HIS和FLAG标签氨基酸序列，作为最优的vWF-CP底物设计方案。

本发明技术方案中，酶切效率并非为所要解决的主要的技术问题，因而，在后续实施例中，vWF-CP底物选用vWF73，并在其N端和C端分别标记HIS和FLAG标签氨基酸序列，其包括88个氨基酸，序列如SEQ ID NO：2所示；其编码的基因片段可通过一组分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的上游引物和下游引物实现PCR的扩增，其PCR扩增产物核酸序列可以设计为如SEQ ID NO：5所示。

S2、将目的基因片段与表达载体PET-30(a)重组，可通过NdeI与XhoI双酶切pET-30a载体和PCR扩增产物核酸序列；

NdeI/XhoI分别双酶切PET-30(a)和编码重组蛋白(Re-vWF73)目的基因片段，回收载体和片段。

用限制性内切酶NdeI/XhoI消化质粒，反应体系如表1所示。

表1限制性内切酶反应体系

加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μl。在37℃恒温水浴中消化15min，然后加入2μlDNA上样缓冲液终止酶切反应

回收的载体和片段用T4连接酶连接。

DNA片断的连接反应体系表2所示：

表2DNA连接反应体系

DNA载体	6μl
		DNA片段	2μl
T4DNA连接酶	1μl
		10*T4连接酶Buffer	1μl

体系总量是10μl，在16℃恒温水浴连接2h或4℃连接8～12h。

S3、PET-30(a)-vWF73在大肠杆菌中的表达、纯化。

经过测序鉴定的重组蛋白表达载体进转化BL21(DE3)感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单个菌落于4ml含有相应抗体的培养基中震荡培养8小时左右，将表达菌液1:100扩增到新鲜含抗生素培养基中，振荡培养至OD值为0.6～0.7时加入诱导剂IPTG，浓度为0.5mmol/L，诱导表达6小时，离心收集菌体。超声波破碎，离心，收集上清液。

蛋白纯化主要采用Ni柱纯化，将Ni-NTA Agarose充填柱子，用5倍柱体积的裂解液平衡Ni-NTA Agarose，调节A280值至零线。将适量上清液上样到Ni-NTA Agarose柱子中，并用裂解液冲洗至A280值低于0.01。分别用5～10倍柱体积的清洗液清洗柱子，直至A280值低于0.01。用洗脱液洗脱重组蛋白质，在A280值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

纯化后的vWF-CP底物经SDS-PAGE检测的表达纯化结果如图1所示：泳道M为蛋白质分子量标准；泳道1为纯化后vWF-CP底物。

实施例二试纸条制备

本实施例提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的试纸条的制备方法，试纸条包括依次组装的样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫，NC膜上设置有检测线和质控线，金标垫、检测线和质控线上分别包被有金标抗体、T线抗体和C线抗体，其中，

T线抗体：抗FLAG标签鼠单克隆抗体；

C线抗体：二抗羊抗鼠IgG；

金标抗体：胶体金标记抗HIS标签鼠单克隆抗体；

金标抗体稀释液：含3％蔗糖、1％BSA的PBS溶液(PH7.4)。

S1、T线抗体划线液配制：将T线抗体用PBS稀释至1.5ug/ul；C线抗体划线液配制：将C线抗体用PBS稀释至2ug/ul。

S2、将配制好的T线抗体划线液与T线抗体划线液用胶体金喷膜仪按1ul/cm在NC膜上划线，37度2小时烘干。

S3、喷金溶液配制：金标抗体与金标抗体稀释液按1：3稀释，混匀即可。用胶体金喷金仪将喷金溶液按要求喷涂金标垫，37度2小时烘干。

S4、将上述NC膜、金标垫、样品垫、吸水垫按要求在底板上组装，按3mm/条规格裁切成试纸条；试纸条与塑料卡组装成胶体金检测试纸卡，加入干燥剂，放入铝箔袋中，封装即可。

实施例三体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒组成

本实施例提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒，其组成包括：

vWF-CP酶相对活性胶体金检测试纸卡(30份/盒，实施例二中的试纸条)，室温保存；

标准品1(1ml)(vWF-CP酶相对活性为0的制品)，-20℃保存；

标准品2(1ml)(vWF-CP酶相对活性为100％的制品)，-20℃保存；

vWF-CP底物(实施例一中的重组蛋白)(1ml)，-20℃保存；

工作液(10ml)(含二价金属离子的缓冲液)，4℃保存；

终止液(2ml)(含能络合二价金属离子的缓冲液)，4℃保存；

实施例四体外定量测定vWF-CP酶活性的方法

本实施例提供实施例三中体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、使用前将试纸卡、工作液、终止液恢复至室温。

S2、工作混合液的的配制：按每毫升(1ml)工作液加入50ul底物进行轻轻混匀，瞬时离心，每管取200ul分装；

S3、按每份样品(注：包括标准品1、标准品2、待测样品)取20ul加入含200ul工作混合液的离心管(注：请各管做好标记)，轻轻混匀，瞬时离心，置于37℃恒温箱进行酶切反应20分钟；

S4、待反应结束后，取出离心管，每管加入30ul终止液，轻轻混匀，瞬时离心；

S5、从原包装袋中取出试纸卡，打开后请在一个小时内尽快地使用。取50ul反应混合液滴于加样孔中，加样后开始计时；

S6、在15～20分钟后，将标准品1、标准品2、待测样品依次在胶体金检测仪进行扫描读数，操作完成后，仪器将显示标准品1和标准品2的T线读数值、待测样品的T线读数值与vWF-CP酶相对活性。

其中，上述步骤S6中的胶体金检测仪(可采用深圳拓能达科技有限公司适配型号)，其具体操作步骤包括：

S1、接通电源，按下仪器左侧电源键；

S2、标准品1/2检测：

a)标准品1检测：依次点击显示界面【功能选项】，【样本图形】，【绘制图形】，插入标准品1，【绘制图形】，仪器显示标准品1读取T值，点击【0活性保存】；

b)标准品2检测：插入标准品2，点击【绘制图形】，仪器显示标准品2读取T值，点击【100％活性保存】，再依次点击【返回】，【返回】进到主界面；

S3、待测样品检测：

点击主界面【样品检测】，进入样品检测页面，插入待测样品，点击【即时检测】，样品检测结果将显示在页面左下侧【样品T线值】、【样品相对活性】处。继续按此步骤检测下一样品；

S4、在【功能选项】【查询结果】中可查看、打印多个样品检测结果。

实施例五体外定量测定枸橼酸钠抗凝血浆样品的vWF-CP酶相对活性

本实施例提供一种基于实施例四中的方法，以测定枸橼酸钠抗凝血浆样品的vWF-CP酶相对活性的具体实施过程，具体包括如下步骤：

S1、将5条试纸卡、工作液、终止液恢复至室温。

S2、工作混合液的的配制：取1.2ml工作液加入60ul底物，轻轻混匀，瞬时离心，每管取200ul，共分装5管；

S3、按每份样品(注：包括标准品1、标准品2、3个待测样品)取20ul加入含200ul工作混合液的离心管(注：请各管做好标记)，轻轻混匀，瞬时离心，置于37℃恒温箱进行酶切反应20分钟；

S4、到20分钟反应结束后，取出离心管，每管加入30ul终止液，轻轻混匀，瞬时离心后放置；

S5、从原包装袋中取出试纸卡，取50ul反应混合液滴于加样孔中，加样后开始计时；

S6、在15分钟后，将标准品1、标准品2、待测样品1、待测样品2、待测样品3(如图2所示)，依次在胶体金检测仪上扫描读数，样品扫描完成，仪器显示标准品1和标准品2的T线读数值，vWF-CP酶相对活性按下列公式进行计算：

样品1、样品2、样品3的T线读数值与vWF-CP酶相对活性，结果如下表3所示。

表3标准品与待测样品的检测线读数值和vWF-CP酶相对活性

类型	T线读数值	样品相对活性
			标准品1	126.542	——
标准品2	26.081	——
			样品1	121.584	4.9％
样品2	110.636	15.8％
			样品3	45.176	80.9％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 吴江华药生物技术有限公司

<120> 体外定量测定vWF-CP酶活性的方法、检测试剂盒及制备方法

<130> 2016

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 73

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro

1 5 10 15

Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro

20 25 30

Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly

35 40 45

Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg

50 55 60

Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

65 70

<210> 2

<211> 88

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His His His His His His Asp Arg Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val

1 5 10 15

Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro

20 25 30

Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly Val Gly Pro Asn Ala Asn Val

35 40 45

Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln

50 55 60

Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg

65 70 75 80

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

85

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaattccat atgcaccatc atcatcatca tgaccgggag caggcgccca acc 53

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgagt ttacttatcg tcgtcatcct tgtaatccct ctgcagcacc aggtcagga 59

<210> 5

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggaattccat atgcaccatc atcatcatca tgaccgggag caggcgccca acctggtcta 60

catggtcacc ggaaatcctg cctctgatga gatcaagagg ctgcctggag acatccaggt 120

ggtgcccatt ggagtgggcc ctaatgccaa cgtgcaggag ctggagagga ttggctggcc 180

caatgcccct atcctcatcc aggactttga gacgctcccc cgagaggctc ctgacctggt 240

gctgcagagg gattacaagg atgacgacga taagtaaact cgagcgg 287

Claims

1.一种体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病诊断和治疗的方法，其特征在于：包括以下步骤：

所述vWF-CP底物包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列，所述vWF功能区氨基酸序列为vWF73，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述vWF-CP底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病诊断和治疗的方法，其特征在于：所述标准品1和标准品2为vWF-CP酶相对活性分别为0％和100％的制品。

3.根据权利要求1所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病诊断和治疗的方法，其特征在于：所述T线抗体为抗FLAG标签鼠单克隆抗体，所述C线抗体为二抗羊抗鼠IgG，所述金标抗体为胶体金标记抗HIS标签鼠单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病诊断和治疗的方法，其特征在于：所述步骤S4中酶活性按下列公式进行计算：

5.一种体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒，其特征在于：包括试纸条、标准品1、标准品2、vWF-CP底物、工作液和终止液，其中，

所述工作液为含二价金属离子的缓冲液，所述终止液为含能络合二价金属离子的缓冲液；

所述vWF-CP底物包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列，所述vWF功能区氨基酸序列为vWF73、其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述vWF-CP底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求5所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒，其特征在于：所述标准品1和标准品2为vWF-CP酶相对活性分别为0％和100％的制品。

7.根据权利要求5所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒，其特征在于：所述T线抗体为抗FLAG标签鼠单克隆抗体，所述C线抗体为二抗羊抗鼠IgG，所述金标抗体为胶体金标记抗HIS标签鼠单克隆抗体。

8.一种根据权利要求5至7任一项所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，将T线抗体和C线抗体分别用PBS稀释至1.5ug/ul和2ug/ul，分别用胶体金喷膜仪在NC膜上划线得到检测线和质控线。

10.根据权利要求8所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，将T线抗体和C线抗体分别稀释后，分别用胶体金喷膜仪按1ul/cm在NC膜上划线得到检测线和质控线，37度2小时烘干。

11.根据权利要求8所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，将金标抗体与金标抗体稀释液按1：3稀释后，用胶体金喷膜仪喷涂在金标垫上，37度2小时烘干。

12.根据权利要求8所述的体外定量测定vWF-CP酶活性的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，将样品垫、金标垫、NC膜、吸水垫依次在底板上组装，按3mm/条规格裁切成试纸条；试纸条与塑料卡组装成胶体金检测试纸卡，加入干燥剂，放入铝箔袋中封装。