JP6419576B2

JP6419576B2 - プロテアーゼａｄａｍｔｓ１３を切断するフォン・ヴィレブランド因子の検出用ポリペプチド基体

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Publication number: JP6419576B2
Application number: JP2014541350A
Authority: JP
Inventors: パオロヴィセンティン，ジャン; シー．チャンス，シュゼット; ウィトシック，エリザベス
Original assignee: イムコアジーティーアイダイアグノスティクスインコーポレイテッド
Priority date: 2011-11-11
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2018-11-07
Anticipated expiration: 2032-11-09
Also published as: US20190185905A1; EP2776461B1; US10202633B2; US9513290B2; WO2013071168A1; US10538802B2; JP2014533115A; US20170145471A1; EP2776461A1; US20150147764A1; CA2855498A1; AU2012335087A1; AU2012335087B2

Description

[関連出願のクロスリファレンス]
本出願は、２０１１年１１月１１日に出願した米国暫定出願第６１／５５８，９２７号の利益を請求する。この出願は全内容が引用により本明細書に組み込まれている。

フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）は、血液凝固系において抗血友病因子キャリアとしておよび血小板−血管壁メディエータとして機能すること、主に、血管損傷部位で循環する血小板の結合と付着を媒介することによる、止血の維持に極めて重要な大きな多重結合プラズマ糖たんぱく質である。この遺伝子の突然変異体あるいはこのたんぱく質の欠陥によって、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）が引き起こされる。

ＶＷＦは、内皮細胞と巨核球によって発現する。これは、２５０−ｋＤａのモノマーとして合成され、細胞間処理、グリコシル化、多量体化、成熟ＶＷＦマルチマーの形成につながるプロペプチド除去を経る。

ＶＷＦ多重結合サイズは、プラズマメタロペプチダーゼＡＤＡＭＴＳ１３（トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するジスインテングリン及びメタロペプチダーゼメンバー１３、「切断プロテアーゼ」）によって調節される。これは、ＶＷＦＡ２ドメイン（ＡＡ１４９８−１６６５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏデータベース；登録：Ｐ０４２７５、配列番号：２）の単一部位において、Ｙ１６０５とＭ１６０６の間を切断する。

ＡＤＡＭＴＳ１３は、バリウムとその他の金属イオンの存在下で活性化するプロテアーゼである。ＡＤＡＭＴＳ１３は、完全多量体ＶＷＦをより小さいサイズのマルチマーと、分子量がより小さいポリペプチド又はペプチドに分解することが証明されている。このため、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼは、ＶＷＦ−切断プロテアーゼ又は「ＡＴＳプロテアーゼ」と呼ばれている。血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）患者ではプロテアーゼの活性が減少することが証明されている。

重度のプロテアーゼ欠乏は、遺伝的な、又は自己免疫機序によって生じるＴＴＰを慢性的に再発する患者に見られる。

これまでは、ＡＤＡＭＴＳ１３の存在又は欠如を調べるアッセイは、患者からの血漿を、１．５モルの尿素を含むバッファに浮遊させたメンブレン表面の塩化バリウム存在下で、外因性多重結合ｖＷＦを用いてインキュベートするといった、面倒な技術を用いていた。より近年は、Ｋｏｋａｍｅｅｔａｌ．によって代替の方法が開発された（Ｋｏｋａｍｅ，Ｋ．，Ｙ．Ｎｏｂｅ，Ｙ．Ｋｏｋｕｂｏ，Ａ．Ｏｋａｙａｍａ，ａｎｄＴ．Ｍｉｙａｔａ．２００５．ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３，ａｆｉｒｓｔｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒＡＤＡＭＴＳ１３ａｓｓａｙ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２９：９３−１００．また、ＷｕＪＪ，ＦｕｊｉｋａｗａＫ，ＭｃＭｕｌｌｅｎＢＡ，ＣｈｕｎｇＤｗ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｏｒｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｆｏｒＡＤＡＭＴＳ１３ｉｎｔｈｅＡ２ｄｏｍａｉｎｏｆｖｏｌＷｉｌｌｅｂｒａｎｄｆａｃｔｏｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００６；１０３：１８４７０−４も参照）。Ｋｏｋａｍｅの方法は、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性にポリペプチド基体を使用しており、この基体ＶＷＦのＡ２ドメイン中の７３アミノ酸残基であり、ＶＷＦ７３と呼ばれる。ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３がこのドメイン内にあり、７３−アミノ酸ポリペプチド配列は、ＶＷＦのＤ１５９６からＲ１６６８の領域（明細書中の配列番号：６を参照）に対応しており、Ａ２ｐｒ（Ｎｍａ）とＡ２ｐｒ（Ｄｎｐ）で置換されている場合は、Ｑ１５９９とＮ１６１０にそれぞれ対応する。配列番号：６を用いていくつかのアッセイが開発されている。ＶＷＦ７３ベースのＡＤＡＭＴＳ１３アッセイは、臨床治療の改善に寄与する可能性がある。

しかしながら、配列番号：６のデノボ合成は困難であり、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体は、ＵＶスペクトル付近で機能する。したがって、生成された信号は、アッセイが同質である、すなわち、自己蛍光ノイズの主たる原因の一つである、血漿を洗浄することなく単一ステップで行われるということによって悪化することがある自己蛍光の大きな影響を受ける。自己蛍光の影響を受けやすいため、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体をベースにしたアッセイは、ダスト微粒子に非常に反応して、潜在的に、複製力が弱く異常な結果となる。更に、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体アッセイによると、通常、非線形校正曲線となり、ＡＤＡＭＴＳ１３活性が１０％以下と、精度が低くなることがある。これは、０−１０％のＡＤＡＭＴＳ１３の溶解度は、医師がＴＴＰ診断を確認し、治療的介入（血漿交換など）を監視して微調整するのに重要であるため、問題である。更に、配列番号：６のポリペプチドを用いたＡＤＡＭＴＳ１３活性アッセイは、感度が低いという問題がある。

この結果、改善したＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、この分野で求められている。本発明は、この必要性に対する取り組みを探すものである。

［発明の態様及び実施例］
第１の態様では、トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するディスインテグリン様及びメタロペプチダーゼ１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）用の単離されたポリペプチド基体が提供されている。これは、４５乃至７０アミノ酸長であり、配列番号：２に記載されているフォン・ヴィレブランド因子Ａ２ドメイン配列の部分とほぼ同じであり、以下の一またはそれ以上の修飾を伴う：（ｉ）配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸がＱからＫに変異；（ｉｉ）配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸がＮからＣに変異；及び（ｉｉｉ）配列番号：２のＱ１６２４乃至Ｒ１６４１に対応するアミノ酸が欠如している。

第２の態様では、アミノ酸長５０乃至７５で、配列番号：２に記載されているフォン・ヴィレブランド因子Ａ２ドメイン配列の部分とほぼ同じアミノ酸配列を有するＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が提供されており、これは以下の一またはそれ以上の修飾を伴う：（ｉ）配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸がＱからＫに変異；（ｉｉ）配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸がＮからＣに変異；（ｉｉｉ））配列番号：２の位置１６２９に対応するアミノ酸がＧからＥに変異；及び（ｉｖ）配列番号：２のＧ１６３１乃至Ｒ１６４１に対応するアミノ酸が欠如している。

好ましくは、ポリペプチド基体のＮ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＤ１５９６に対応している。

好ましくは、ポリペプチド基体のＣ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＲ１６６８に対応している。

好ましくは、このポリペプチドが、検出可能なラベルを含む合成ポリぺプチドである。

好ましくは、この検出可能なラベルが蛍光色素分子と消光剤である。

好ましくは、蛍光色素分子の付着部位が、配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸にある、及び／又は消光剤の付着部位が配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸にある、あるいは、消光剤の付着部位が配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸にある、及び／又は蛍光色素分子の付着位置が配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸にある。

好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、配列番号：７に記載の配列を含む、あるいはこの配列からなる、あるいは、ほぼこの配列からなる。

好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３のポリペプチド基体が、配列番号：１に記載の配列を含む、あるいはこの配列からなる、あるいは、ほぼこの配列からなる。

好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３のポリペプチド基体が凍結乾燥されている。

更なる態様では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体を切断する方法が提供されており、これは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体をＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼに接触させるステップを具える。

更なる態様では、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法であって、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の使用を具える方法が提供されている。

好ましくは、この方法は：（ａ）ＡＤＡＭＴＳ１３を含む又は含むと疑われるサンプルを提供するステップと；（ｂ）そのサンプルをＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体と接触させるステップと；及び（ｃ）ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の断片化を測定するステップと；を具え、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の断片化を選択的に、一またはそれ以上の対照及び／又は校正器と比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定を行う。

好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の切断を、蛍光の変化をモニタすることで測定する。

好ましくは、ステップ（ａ）におけるサンプルが血漿サンプルである、あるいは、血漿サンプル由来のものである。

好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、接触ステップ（ｂ）の間に溶液中にある。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、プロテアーゼによる切断時に溶液中にある。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼによる切断時に溶液中にある。

好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、接触ステップ（ｂ）の間に固体サポートに付着する。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、プロテアーゼによる切断時に固体サポートに付着する。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼによる分解時に固体サポートに付着する。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、接触ステップ（ｂ）の間にウエルに付着する。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、接触ステップ（ｂ）の間に、マイクロウエルストリップの２又はそれ以上のウエルに付着する。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、接触ステップ（ｂ）の間に、ビーズに付着する。

好ましくは、ステップ（ｄ）が、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の断片化の定量測定である。

更なる態様では、対象中のＡＤＡＭＴＳ１３活性のインビトロ試験用キットが提供されており、このキットは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体、既知の濃度のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む一またはそれ以上の校正器、及び／又は、ＡＤＡＭＴＳ１３活性用の一またはそれ以上の陽性対照を含み、選択的に試料希釈剤及び／又は基体バッファを伴う。

更なる態様では、サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼの活性を測定するためのＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の使用を提供する。

ここで述べるＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体は、いくつもの利点を有する。

一例として、ポリペプチド基体は確実に合成できる。ポリペプチド基体を化学合成により合成する場合、組み換え合成及び７３−ｍｅｒ合成に比較して、低いコストで生成できる。

更なる例として、既存のＡＤＡＭＴＳ１３活性ベースのアッセイに比べて、より高い解像度、より高い感度、及びより高い精度で、リニア校正曲線を達成できる。

更なる例として、ＡＤＡＭＴＳ１３アッセイでは低い信号対ノイズ比が得られる。

更なる例として、ＡＤＡＭＴＳ１３アッセイではより迅速な反応時間（１５分又はそれより少ない反応時間に対して、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３ベースのアッセイによる３０分）が得られる。

更なる例として、検出可能なラベルを使用した時に、最も広く使用した波長で励起と発光が生じ、検出をより簡単にする。

更なる例として、アッセイのより高いダイナミックレンジが達成でき、その結果ＡＤＡＭＴＳ１３を、既存の活性ベースのアッセイでは効率よく解像できない範囲である、約０−２０％の活性範囲で正確に測定することができる。したがって、類似の臨床症候群を呈する溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を含むその他の疾患からのＴＴＰ鑑別診断における改善がなされる。ＴＴＰの予後管理における改善も達成できる。

図１は、Ａ２ドメイン（ＡＡ１４９８−１６６５）に亘るＶＷＦの一部（ＡＡ１４９８−１６６８）のタンパク質配列を示す。図２は、配列番号：１のアミノ酸配列を示す。図３は、従来技術のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３を用いて取得した一連の校正曲線を示す。図４は、「ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４」配列番号：１と表す、出願人が合成した６２アミノ酸長ポリペプチド配列を用いて取得した一連の校正曲線を示す。図５は、「ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ５」配列番号：７と表す、出願人が合成した５５アミノ酸長ポリペプチド配列を用いて取得した一連の校正曲線を示す図であり、時間経過に伴う蛍光の変化を表す。

定義
以下の説明において、多くの用語が広範囲にわたって使用されている。以下の定義により、本発明の理解が容易になる。本出願の範囲内で使用した技術用語と表現は、一般的に、この分野の技術用語と表現に共通している意味を持つ。以下の用語のすべての定義は、本出願の全内容に適用される。用語「具える」は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞は複数の排除するものではない。所定の数値または範囲のコンテキストにおける用語「実質的に」、「約」、「およそ」、その他は、所定の値又は範囲の２０％以内、１０％以内、あるいは５％以内の値又は範囲を意味する。標準的な分析法の不正確さによって、分子量及びポリマ超は、およその値であると解される。このような値が「約」Ｘあるいは「およそ」Ｘと表現されている場合は、記載した値Ｘは±１０％まで正確であると解される。

ここで用いられているように、「核酸」又は「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、増幅生成物、連鎖反応、切断、エンドヌクレアーゼ活性、ゲノムＤＮＡ、遺伝子組み換えベクトル、及び化学的合成分子のいずれかによって生じた断片といった、ポリヌクレオチドを意味する。核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα鏡状異性型）、又はこれらの組み合わせであるモノマーでできていてもよい。核酸は、単鎖又は二重鎖のいずれでもよい。

用語「核酸分子の相補性」とは、基準となる核酸配列と比較して、相補的核酸配列及び逆の方向性を有する核酸分子を意味する。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は、５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’と相補である。

用語「縮重核酸」は、ポリペプチドをエンコードする基準核酸分子に比較して、一またはそれ以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列を意味する。縮重コドンは、核酸の異なる三連塩基を含むが、同じアミノ酸残基をエンコードする（すなわち、ＧＡＵとＧＡＣ三連塩基は、各々Ａｓｐをエンコードする）。

「単離した核酸分子」は、器官のゲノム核酸に一体化されていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノム核酸から分離されている核酸分子は、単離した核酸分子である。単離した核酸分子のもう一つの例は、器官のゲノムに一体化されていない、化学的に合成した核酸分子である。特定の種から単離した核酸分子は、その種からのクロモソームの完全な核酸分子より小さい。

「ポリペプチド」は、ペプチド結合で結合したアミノ酸残基のポリマーであり、天然あるいは合成に生成される。１０アミノ酸残基より少ないポリペプチドが、通常、「ペプチド」と呼ばれる。

「タンパク質」は、一またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、また端子化物群、経口検出部分及び／又はリンカなどの、非ペプチド成分を含んでいてもよい。これらの非ペプチド成分は、そのタンパク質が生成される細胞ごとにタンパク質に加えることができ、細胞のタイプで変化する。タンパク質は、ここでは、そのアミノ酸の骨格構造で規定され；非ペプチド成分は、一般的にアミノ酸配列を意味する場合、特定されないが、存在することがある。

非宿主ＤＮＡ分子によってエンコードされたペプチド又はポリペプチドは、「異種」ペプチド又は「異種」ポリペプチドである。

「単離ポリペプチド」又は「単離ペプチド」は、基本的に、炭水化物、脂質、あるいは天然のポリペプチドに付着するその他のタンパク質性不純物、といった細胞成分のコンタミネートがない。通常は、単離ポリペプチド又は単離ペプチドの作成は、少なくとも純度８０％、少なくとも純度９０％、少なくとも純度９５％、又は純度９９％以上と、非常に純化された形のポリペプチド又はペプチドを含む。特定のタンパク質作成が、単離したポリペプチド又はペプチドを含むことを示す一つの方法は、そのタンパク質作成の、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びそのゲルのクマシーブリリアントブルー染色の後に、単帯域が現れることによる。しかしながら、用語「単離した」は、ダイマーや、代替的にグリコシル化した又は誘導体といった、代替の物理的フォームにおける同じポリペプチド又はペプチドの存在を排除するものではない。上述した通り、用語「少なくとも純度８０％」は、純度８０％から純度１００％までのすべての又は一部の数を含む。同じことが、「少なくとも純度９０％」、「少なくとも純度９５％」にも言える。上述した通り用語「純度９５％より高い」とは、９５．０１％から１００％の純度を意味し、その間の全数字又は部分的な数字を含む。

用語「アミノ末端基」及び「カルボキシル末端基」は、ここでは、ポリペプチド又はペプチド内の位置を表示するのに用いられている。このコンテキストでは、これらの用語は、ポリペプチド又はペプチドの特定配列又は部分に関連して用いられており、近接位置又は関連位置を表示する。例えば、ポリペプチド又はペプチド内の基準配列に対してカルボキシル末端基に位置する所定の配列は、基準配列のカルボキシル末端基に近接して配置されているが、必ずしも完全なポリペプチド又はペプチドのカルボキシル末端基でなくともよい。

用語「発現」は、遺伝子産物の整合性を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、発現には構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写と、ｍＲＮＡの一またはそれ以上のポリペプチドへの翻訳を意味する。

「検出可能なラベル」は、ポリペプチドに結合、付着、あるいは組み込こんで、診断に有用な分子を生成できる分子又は原子である。このラベルは、ポリペプチドに付着させたあるいは組み込んだ時に、ポリペプチドを検出可能にするあらゆるタイプのラベルであってもよい。検出可能なラベルは、一またはそれ以上の以下の特徴を有する：蛍光、色、放射線感受性、又は光感受性。検出可能なラベルの例には、キレータ、光活性剤、放射線アイソトープ、経口剤、常磁性イオン、あるいは蛍光共鳴エネルギィ転写（ＦＲＥＴ）ドナー及び／又はアクセプタなどのその他のマーカー部分が挙げられる。

用語「親和性タグ」は、ここでは、第２のポリペプチド又はペプチドに付着して第２のポリペプチド又はペプチドの精製又は検出を提供する、あるいは、第２のポリペプチド又はペプチドを基体に付着させる部位を提供する、ポリペプチド又はペプチドのセグメントを記載するのに使用されている。原理的には、抗体又はその他の特定結合剤が入手可能であるポリペプチド又はペプチドを親和性タグとして使用することができる。親和性タグは、ポリヒスチジン配列、タンパク質Ａ（Ｎｉｌｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．４：１０７５（１９８５）；Ｎｉｌｓｓｏｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９８：３（１９９１））、グルタチオンＳ転移酵素（ＳｍｉｔｈａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ６７：３１（１９８８））、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性タグ（Ｇｒｕｓｓｅｎｍｅｙｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：７９５２（１９８５））、物質Ｐ、ＦＬＡＧペプチド（Ｈｏｐｐｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：１２０４（１９８８））、ストレプタビジン結合ペプチド、あるいはその他の抗原エピトープ又は結合ドメインを含む。一般的に、Ｆｏｒｄｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ２：９５（１９９１）を参照。ＤＮＡ分子コード化親和性タグは、業者（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能である。

ポリペプチド又はペプチドの配列又はポリヌクレオチド配列を記載するのにここで使用している用語「ほぼ同様」は、対応する範囲にわたって二つの配列が少なくとも７０％あるいは７５％の同一性を共有していることを意味する。より好ましくは、同一性パーセンテージが少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の同一性である。同一性における差異は、第２の配列に比べて第１の配列における残基の追加、欠如、あるいは置換によるものであってもよい。この分野の当業者は、ポリペプチド又はペプチド配列又はポリヌクレオチド配列と基準配列との間の同一性パーセンテージを容易に計算するであろう。例えば、二つのポリヌクレオチド配列の同一性パーセンテージは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘｅｔａｌ．によって書かれた、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能な、ＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７，１９８４）を使用して配列情報を比較することで決定することができる。ＧＡＰプログラムの典型的なデフォルトパラメータには：（１）ヌクレオチド用単項比較マトリックス（同一に対して値１、非同一に対して値０を含む）と、Ｓｃｈｗａｒｔｚａｎｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ，，ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３−３５８，１９７９に記載されているＧｒｉｂｓｋｏｖａｎｄＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１４：６７４５，１９８６の重みづけ比較マトリックス；（２）各ギャップにつき３．０のペナルティと、各ギャップの各シンボルに付き追加の０．１０ペナルティ；及び（３）エンドギャップについてはペナルティなし；が含まれる。配列比較の分野における当業者に知られている様々なプログラムを代替的に利用できる。

ここで用いられているように、用語「少なくとも７０％同一」又は「少なくとも７０％の同一性」とは、ポリペプチド又はペプチド配列、又はポリヌクレオチド配列が、基準配列と７０％−１００％の配列同一性を共有していることを意味する。この同一性の範囲は、すべての整数（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、）９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）又、列挙した範囲、したがってこの明細書の一部を形成している数に受け入れられる端数（例えば、７２．１５％、８７．２７％、９２．８３％、９８．１１％有効桁数２桁）を含む。例えば、基準配列と８５％の同一性を共有している２００の残基を伴うアミノ酸配列は、１７０の同一残基と３０の非同一残基を有するであろう。同様に、２３５残基を伴うアミノ酸配列は、基準配列に同一である２００の残基を有しており、したがって、この舞の酸配列は基準配列に対して８５．１１％同一である。同様に、用語「少なくとも８０％」、「少なくとも９０％」、「少なくとも９５％」及び「少なくとも９９％」などは、列挙した範囲内の整数又は端数のすべてを含む。ここで使用しているように、用語「９５％以上同一」又は「９５％の以上の同一性」とは、配列が基準配列と９５．０１％−１００％の配列同一性を共有していることを意味する。この配列は包括的である。同一性における差異は、第２の配列に比べて第１の配列における残基の追加、欠如、あるいは置換によるものであってもよい。

ここで使用されている用語「サンプル」は、対象の血液、血漿、あるいは組織など、体液を含む。このサンプルは、ヒト対象など、ＡＤＡＭＴＳ１３に関連する疾患があると疑われるヒトから取得できる又は取得可能である。

一実施例はＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体に関する。好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体は、４５乃至７２アミノ酸長、あるいは４５乃至７０アミノ酸長、あるいは５０乃至７５アミノ酸長といった、４５乃至７５アミノ酸長である。より好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体は、４５乃至６５アミノ酸長、５０乃至６５アミノ酸長、５０乃至６０アミノ酸長、５１乃至５９アミノ酸長、５２乃至５８アミノ酸長、５３乃至５７アミノ酸長、５４乃至５６アミノ酸長、５０乃至７０アミノ酸長、５５乃至７０アミノ酸長、５５乃至６５アミノ酸長、６０乃至６５アミノ酸長、６１乃至６４アミノ酸長、又は６１乃至６３アミノ酸長、である。一の実施例では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が５５乃至６２アミノ酸長である。一実施例では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が５５アミノ酸長である。一の実施例では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が６２アミノ酸長である。一実施例では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５アミノ酸長であり、ここに記載した特徴を有する。

ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体は、ＶＷＦＡ２ドメインの部分に亘る単離したキメラ又は突然変異アミノ酸構造である。

一の態様では、単離したポリペプチド基体は、４５乃至７０アミノ酸長であり、配列番号：２に記載のＶＷＦＡ２ドメイン配列の部分に実質的に類似したアミノ酸配列を有しており、以下の修飾の一またはそれ以上を伴う：（ｉ）配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸がＱからＫに変異している；（２）配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸がＮからＣに変異している；及び（ｉｉｉ）配列番号：２のＱ１６２４からＩ１６４２に対応するアミノ酸が欠如している。

別の態様では、単離したポリペプチド基体は、５０乃至７５アミノ酸長であり、配列番号：２に記載のＶＷＦＡ２ドメイン配列の部分に実質的に類似したアミノ酸配列を有しており、以下の修飾の一またはそれ以上を伴う：（ｉ）配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸がＱからＫに変異している；（２）配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸がＮからＣに変異している；及び（ｉｉｉ）配列番号：２の位置１６２９に対応するアミノ酸がＧからＥに変異している；及び（ｉｖ）配列番号：２のＧ１６３１乃至Ｒ１６４１に対応するアミノ酸が欠如している。

好ましくは、このポリペプチド基体のＮ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＤ１５９６に対応する。好ましくは、このポリペプチドのＣ末端のアミノ酸が配列番号：２のＲ１６６８に対応する。好ましくは、このポリペプチド基体のＮ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＤ１５９６に対応し、このポリペプチド基体のＣ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＲ１６６８に対応する。

配列番号：２は、ホモサピエンス由来のＶＷＦのＡ２ドメインの断片；受け入れ番号Ｐ０４２７５−１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏ）；ＵＰＩ０００１ＢＢＥ４２Ｆ（ＵｎｉＰａｒｅ）；ＩＰＩ０００２３０１４．２（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｒｏｔｅｉｎＩｎｄｅｘ）に対応する。

一実施例では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、配列番号：７又は配列番号：１に記載の配列、又は、これらに実質的に同一である配列を含む、これらの配列からなる、あるいは実質的にこれらの配列からなる。これらの配列のイソマーも意図されている。更なる実施例では、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体が、そのポリペプチド基体のＮ末端、又はＣ末端、あるいはＮ末端とＣ末端に、一またはそれ以上の更なるアミノ酸を含むものでもよい。

配列番号：１又は配列番号：７のポリペプチド基体の分解産物も開示されており、特にこれらの分解産物は、ＡＤＡＭＴＳ１３を伴う以下の断片を生成する。特に、Ｃ末端断片が開示されている。したがって、更なる態様では、トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するディスインテグリン様及びメタロペプチダーゼ１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）用の単離したポリペプチドが提供されており、これは少なくとも５２アミノ酸長で、配列番号：２に記載されたフォン・ヴィレブランド因子Ａ２ドメイン配列の部分と実質的に同じであり、以下の一またはそれ以上の修飾を伴う、アミノ酸配列を有する：（ｉ）配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸がＮからＣに変異している；及び（ｉｉ）配列番号：２のＱ１６２４からＲ１６４１に対応するアミノ酸が欠如している。好ましくは、このポリペプチド基体のＮ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＭ１６０６に対応する。好ましくは、このポリペプチド基体のＣ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＲ１６６８に対応する。好ましくは、このポリペプチドは、合成ポリペプチドであり、検出可能なラベルの少なくとも一部分を含む。好ましくは、検出可能なラベルの少なくとも一部分が、蛍光又は消光剤である。好ましくは、蛍光色素分子又は消光剤の付着部位が、配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸である。別の態様では、トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するディスインテグリン様及びメタロペプチダーゼ１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）用の単離したポリペプチド基体が提供されており、これは、４５アミノ酸長であるか、あるいは少なくとも４５アミノ酸長であり、配列番号：２に記載のフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）Ａ２ドメイン配列の部分と実質的に同じであり、以下の一またはそれ以上の修飾を伴う、アミノ酸配列を有する：（ｉ）配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸がＮからＣに変異している；及び（ｉｉ）配列番号：２の位置１６２９に対応するアミノ酸がＧからＥに変異している；及び（ｉｉｉ）配列番号：２のＧ１６３１からＲ１６４１に対応するアミノ酸が欠如している。好ましくは、このポリペプチド基体のＮ末端のアミノ酸が、配列番号：２のＭ１６０６に対応する。好ましくは、このポリペプチド基体のＣ末端のアミノ酸は、配列番号：２のＲ１６６８に対応する。好ましくは、このポリペプチドは、合成ポリペプチドであり、検出可能なラベルの少なくとも一部分を含む。好ましくは、検出可能なラベルの少なくとも一部分が、蛍光又は消光剤である。好ましくは、蛍光色素分子又は消光剤の付着部位が、配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸である。

ここに記載したポリペプチド基体をコード化する単離したヌクレオチド配列も開示されている。更に、ＶＷＦ遺伝子の機能断片が開示されている。この開示のコンテキストにおいて、ＶＷＦ遺伝子の「機能断片」又は「断片」は、ここに記載されているドメイン、又は、少なくともＡＤＡＭＴＳ１３切断活性の基体としてＡＤＡＭＴＳ１３と特異的に相互作用するドメインであるＶＷＦポリペプチドの部分をコードする核酸分子である。ＶＷＦ遺伝子の機能断片は、機能断片が対応するＶＷＦの部分の各連続アミノ酸残基を含むポリペプチドをコード化する必要はない。換言すれば、機能断片がＡＤＡＭＴＳ１３切断活性の基体である限り、ＶＷＦの機能断片は、天然ＶＷＦの部分に整列でき、そして、挿入、欠失あるいは置換のうちの一またはそれ以上を含むことができる。

ＶＷＦは、血液凝固システムにおいて抗血友病因子キャリアと血小板−血管壁伝達物質の両方として機能すること、主に、血管損傷部位における血漿のテザーリング及び付着を媒介することによって、止血維持に重要な、大きい多重結合血漿糖たんぱく質である。この遺伝子またはこのたんぱく質の欠陥は、フォン・ヴィレブランド病（ＶＷＤ）となる。

ＶＷＦは、上皮細胞と巨核球によって発現する。これは、細胞間処理を行う２５０−ｋＤａのモノマ、グリコシル化、多量体化、及び、成熟したＶＷＦマルチマーの形成を引き起こすプロペプチドの除去によって合成される。

ＶＷＦ多重結合サイズは、血漿メタロペプチダーゼＡＤＡＭＴＳ１３（ａｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎａｎｄｍｅｔｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｗｉｔｈｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎｔｙｐｅＩｍｏｔｉｆ，ｍｅｍｂｅｒ１３）によって調整される。これは、ＶＷＦＡ２ドメインの単一部位（ＡＡ１４９８−１６６５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｄａｔａｂａｓｅ；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：Ｐ０４２７５；Ｆｉｇ．１）において、Ｙ１６０５とＭ１６０６の間を切断する（図２）。

ここに述べたように、「ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ５」配列番号：７と表す、合成５５アミノ酸（ＡＡ）長ポリペプチド配列が開示されており、選択的に、消光剤と、ＡＤＡＭＴＳ１３によって認識され切断すると、蛍光を放射する蛍光色素分子などの検出可能なラベルの挿入により修飾される。「ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４」配列番号：１と表す、合成６２アミノ酸（ＡＡ）長のポリペプチド配列も開示されており、選択的に、消光剤と、ＡＤＡＭＴＳ１３によって認識され切断すると、蛍光を放射する蛍光色素分子などの検出可能なラベルの挿入により修飾される。

好ましくは、このポリペプチドは、この分野で知られている化学合成技術を用いて作成される。この合成は固相あるいは液相ペプチド合成を利用することができる。アミノ酸残基の修飾が必要な場合は、修飾したアミノ酸を適宜ペプチドシンセサイザに導入できる。

遺伝子組み換えプロセスによってもポリペプチド基体を作成することができる。遺伝子組み換えプロセスによるポリペプチドの作成は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が記載した方法など、この分野の当業者によく知られている方法で行うことができる。

好ましくは、ポリペプチドは、凍結乾燥ポリペプチドであってもよい。凍結乾燥は、米国特許第５，５５６，７７１号に記載されており、ここに引用されている方法など、この分野の当業者に知られているプロセスに従って行うことができる。

対象におけるＡＤＡＭＴＳ１３の活性は、ＡＤＡＭＴＳ１３用のポリペプチド基体を用いて測定することができる。例えば、このポリペプチド基体を、血漿などの対象からのサンプルに接触させ、結果物であるポリペプチド基体のポリペプチド断片を分析する。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の使用を含め、この分野の様々な方法を用いて、結果物であるポリペプチド断片を分析できる。タンパク質を、クマシー・ブルー又は銀染色などを用いて染色し、作成した断片を分析する。代替的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて、ウエスタンブロット法を行うようにしてもよい。好ましくは、その結果を対照サンプル及び／又は校正サンプルと比較する。対照サンプルは、ＡＤＡＭＴＳ１３の「正常」活性を有することが知られている対象から抽出して、異常な活性の診断を行うことができる。

検出可能なラベルは、ポリペプチドのアミノ酸残基に直接付着させてもよいが、検出可能なラベルを、例えば、ポリペプチドのアミノ酸残基に付着している（例えば、共有結合を介したリンク又は間接的なリンクによって）キレート基に複合させることによって、間接的に付着させることもできる。特定の実施例では、「検出可能なラベル」は、ポリペプチド基体が切断したら、実質的に検出可能な信号を放出するものであれば、どのようなタイプのラベルでもよい。このように、検出可能なラベルは、蛍光共鳴エネルギィ転移（ＦＲＥＴ）ドナー及び／又はアクセプタを具えていてもよい。一実施例では、ポリペプチド基体が、少なくとも一の消光剤と少なくとも一の蛍光色素分子を組み入れる又は挿入することによって修飾されており、ＡＤＡＭＴＳ１３によって認識され切断した時に、蛍光を発する。好ましくは、基体が合成ポリペプチド（遺伝子組み換えポリペプチドと対照的に）である。これによって、消光剤と蛍光色素分子を直接組み込むことができるからである。非切断基体では、消光剤と蛍光色素分子との間の蛍光共鳴エネルギィの転移によって、蛍光が小さく（例えば、実質的に蛍光がない）なる。ＡＤＡＭＴＳ１３による基体の切断が生じると、消光剤と蛍光色素分子が分離し、その結果蛍光が検出可能に大きくなり、測定できる。

したがって、一実施例では、ポリペプチド基体が検出可能なラベル具えており、ポリペプチド基体の断片化を行って直接測定できるようにする。一の特定の実施例では、検出可能なベルが蛍光色素分子と消光剤であり、断片化が生じると蛍光色素分子の消光が小さくなる。したがって、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基体の断片化によって、蛍光信号が増加する。基体が切断されるときの蛍光の読みによって、基体の切断が検出される。本発明のこの実施例によれば、当業者はポリペプチド基体が、化学合成技術によって合成する必要があることを認識するであろう。なぜなら、遺伝子組み換えのアプローチは通常、検出可能なラベルの組み入れを行わないからである。

蛍光色素分子と消光剤の付着部位は、通常、ポリペプチド基体の中にある。好ましくは、蛍光色素分子と消光剤が互いに分離されており、ポリペプチド基体が無傷である場合蛍光色素分子からの蛍光がほぼ消光され、ポリペプチド基体が分離すると蛍光色素分子からの蛍光が消光されないようにする。一実施例では、蛍光色素分子と消光剤が８、９、１０、１１又は１２のアミノ酸によって、好ましくは、蛍光色素分子と消光剤が９、１０、又は１１のアミノ酸によって、より好ましくは、蛍光色素分子と消光剤が１０のアミノ酸によって分離される。一実施例では、蛍光色素分子の付着部位が、配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸であり、及び／又は、消光剤の付着位置が、配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸である。蛍光色素分子と消光剤の位置が逆になって、消光剤の付着部位が、配列番号：２の位置１６１０に対応するアミノ酸であり、及び／又は、蛍光色素分子の付着位置が、配列番号：２の位置１５９９に対応するアミノ酸であることも意図している。

もう一つの態様はサンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性を測定する方法に関するものであり、上述のポリペプチド基体を、対称由来のサンプルと接触させ、断片化生成物を分析するステップを具える。

対象中のＡＤＡＭＴＳ１３の活性（例えば、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性の疾患又は欠陥）したがって、ＴＴＰの存在又はＴＴＰ体質をインビトロで試験するあるいは、ＴＴＰの決定的な診断とＴＴＰとＨＵＳの間の区別を行う、キット又は診断用組成物が開示されている。その他の疾患状態あるいは条件ＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルの穏やかなあるいはゆっくりとした下降も、その他の疾患状態あるいは条件（例えば、Ｋｏｋａｍｅｅｔａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２００４）１０３，６０７；及びＫｏｋａｍｅｅｔａｌ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ（２００５）１２９，９３）に関連している。このキット又は組成物は、ここに述べたＡＤＡＭＴＳ１３のポリペプチド基体を具える。通常は、キットは、一またはそれ以上の陽性対照、及び／又は一またはそれ以上のキャリブレータを具える。典型的には、キットも、検体希釈剤及び／又は基体バッファ（例えば、提供されたポリペプチド基体のインビトロでの試験に適している）５．８乃至６．７のｐＨ範囲にｐＨが対応するバッファ溶液を含む。指示書セットを提供することもできる。対象中のＡＤＡＭＴＳ１３活性のインビトロでの試験を行う方法は、この分野で知られている（例えば、Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．Ｋ．Ｋｏｋａｍｅ，ＦＢａｎｎｏＹ．Ｓｈｉｎ，ａｎｄＭ．Ａｋｉｙａｍａ，２００７．ＡＤＡＭＴＳ１３ａｓｓａｙｓａｎｄＡＤＡＭＴＳ１３−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１４：２７７−２８３参照）。多くの売主が、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性を検出し及び／又は決定するキットを販売している（例えば、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＵＳＡ．Ｃａｔ＃ＳＦＲ−３２２４−ｓ）ＴＥＣＨＮＯＺＹＭ（Ｒ）ＡＤＡＭＴＳ１３ＩＮＨＥＬＩＳＡ（Ｋｏｒｄｉａ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，Ｃａｔ＃ＴＣ５４５０４０１），ＨｕｍａｎＡＤＡＭＴＳ１３ＥＬＩＳＡＫｉｔ及び固定化したＡＤＡＭＴＳ１３抗体アガロース（両社とも、ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ．Ｃａｔ＃ｓＥ８８−５００ａｎｄＳ３００−３９１から入手可能）、及びＩＭＵＢＩＮＤ（Ｒ）ＡＤＡＭＴＳ１３ＥＬＩＳＡ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａｔ＃８１３参照）。凝固試験及び凝固アッセイの一般的性能を調べるための血液検体を回収、搬送及び処理する方法は、この分野で知られている（例えば、ＡｐｐｒｏｖｅｄＧｕｉｄｅｌｉｎｅＨ２１−Ａ４ＮＣＣＬＳ，Ｖｏｌｕｍｅ２３，Ｎｕｍｂｅｒ３５，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００３；Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２９：９３−１００ａｎｄＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２００６；１０３：１８４７０−４参照）。キットは、二価の金属イオンなど、ＡＤＡＭＴＳ１３の活性化剤を具えていてもよい。

ポリペプチド基体は、基体のＮ末端及び／又はＣ末端に付着したタグ配列を有していてもよい。タグ配列は、分離生成物の検出、定量化、あるいは切断に使用できる。また、タグ配列は、ポリペプチド基体を固相に固定するのに有用である。従って、本発明は、このようなタグ配列を用いて固相に固定化したポリペプチド基体にも及ぶ。タグ配列には、限定するものではないが、タンパク質（例えば、グルタチオン転移酵素、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）、ペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ）、結合剤（例えば、カルボジイミド試薬）、様々な種類のラベル（例えば、放射性ラベル、発色団、及び酵素）が挙げられる。

更なる実施例では、本発明は、上述した診断用組成物又はキットを製造するためのポリペプチド基体の使用に関する。

本開示は、更に、以下の実施例に記載されており、本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を実行するのに現に意図している好ましいモードで書かれており、本発明を説明するためのものであって、限定するものではない。

実施例１：ＡＤＡＭＴＳ１３基体としての、配列番号：１のポリペプチド基体（ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４）の評価

目的：
この実験の目的は、第２世代のＡＤＡＭＴＳ１３アッセイにおけるＡＤＡＭＴＳ１３基体として使用する、配列番号：１（ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４；６２ＡＡ；ＭＷ７８５５．９；ポリペプチド純度９５．５％）のポリペプチドを評価することであった。

手順の概要：
実施例の手順は、Ｋｏｋａｍｅ，Ｋ．，Ｙ．Ｎｏｂｅ，Ｙ．Ｋｏｋｕｂｏ，Ａ．Ｏｋａｙａｍａ，ａｎｄＴ．Ｍｉｙａｔａ．２００５，ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３，ａｆｉｒｓｔｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｆｏｒＡＤＡＭＴＳ１３ａｓｓａｙ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１２９：９３−１００に記載されている手順のとおり行ったが、この文献に記載されている７３アミノ酸基体に代えて、配列番号：１を用いた。ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３溶液を、２５％のジメチルスルフォオキシド／水に溶かして、１００μＭのストック溶液を作成した。ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４配列番号：１を、１００％のＤＭＳＯに溶かした。両基体を、ＡＴＳ−１３基体バッファ（Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＧＴＩＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｃａｔ＃ＡＴＳ−１３）を用いて、等濃度に希釈した。

血漿サンプルを、ＡＴＳ−１３方向挿入に従って、ＡＴＳ−１３検体希釈剤（Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＧＴＩＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｃａｔ＃ＡＴＳ−１３）を用いて希釈した。希釈した血漿サンプルを、希釈した基体と混合して、０、５、１０、１５、２０、３０、４５分後に、ＢｉｏｔｅｋＦＬＸ８００を用いて、各基体について適宜の励起及び発光波長で、蛍光を読み取った。蛍光値を表１に示す。

配列番号：１ポリペプチド基体中の蛍光色素分子−消光剤対は、ＦＡＭ−５／ＴＱ＿２（登録商標）（Ｅｘ４８５±２０；Ｅｍ５２８±２０；ＡＡＴＢｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡＵＳＡ）である。Ｋｏｋａｍｅに記載されているＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３の蛍光色素分子と消光剤対（Ｎｍａ／Ｄｎｐ）を、ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４配列番号：１において、それぞれＦＡＭ−５とＴＱ＿２で置換した。更に、配列番号：１ポリペプチド中で、蛍光色素分子（ＦＡＭ−５）と消光剤（ＴＱ＿２）の位置を、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３構成の蛍光色素分子と消光剤の位置に対して交換した。したがって、ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４配列番号：１については、蛍光色素分子（ＦＡＭ−５）の付着が、位置１５においてアスパラジンをシスチンで置換することによって生じる。消光剤（ＴＱ＿２）は、位置４において、グルタミンをリシンで置換することによって付着した（図２及び表４）。

結果：
この実験の結果は、配列番号：１ポリペプチド基体を使用することによって、従来技術のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体を用いた場合と比べて、より大きなダイナミックレンジが得られることを示している。この実験では、３０分経過時点で、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体の約１５００乃至２０００ＲＦＵの差異にくらべて、校正器Ａ（ＡＤＡＭＴＳ１３活性０％と同等）と校正器Ｅ（ＡＤＡＭＴＳ１３活性１００％と同等）との間に約３４，０００相対蛍光単位（ＲＦＵ）の差異があった。すべての時点においての蛍光の変化について表１、図３及び図４を参照。

校正曲線によると、ポリノミナル傾向のラインを要する校正曲線（図３）ができるＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３アッセイに比べて直線傾向のラインとなった（図４）。配列番号：１ポリペプチド基体の校正曲線は、４５分経過するまで、直線でありつづけた。

各時点で校正曲線から観察された直線傾向ラインを用いて、正常％活性（％Ｎ）（表２参照）を計算する。３０分経過時に、％ＮのＡＤＡＭＴＳ１３活性を各サンプルプラトーについて計算したところ、１５分後のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３に比較できる結果を示している。

実施例２：
配列番号：１ポリペプチド基体（ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４）と、従来技術のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３ポリペプチド基体（ＰｅｐｔｉｄｅｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）との直接比較

目的：
この実験の目的は、配列番号：１ポリペプチド基体をＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３（配列番号：６）と比較することである。

手順の概要
この実験では、以前の実験で測定した基体濃度と蛍光読取設定値を用いた。試験を行った検体（表３に列挙）は、ＡＴＳ−１３（Ｇｅｎ−ＰｒｏｂｅＧＴＩＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ，Ｃａｔ＃ＡＴＳ−１３）用に調整した成熟サンプルのパネルを含む。これは、正常な又は欠陥のあるＡＤＡＭＴＳ１３活性レベルのサンプルを含む。更に、６つのＦａｃｔｏｒＡｓｓａｙＣｏｎＴｒｏｌ血漿を使用した（２−ＦＡＣＴ、２Ａ−ＦＡＣＴ及び２Ｂ−ＦＡＣＴ、ＧｅｏｒｇｅＫｉｎｇＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｃ．，Ｋａｎｓａｓ，ＵＳＡ）。配列番号：１基体と従来技術のＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３のアッセイを、実施例１で述べた手順におおよそしたがって、実行した。基体は、そのアッセイで使用した配列番号：１のポリペプチド基体のモル量が、従来技術で使用したＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３のモル量に同様になるように調整した、基体の初期テストに用いた条件に従って調整した。ＥＬＩＳＡアッセイは、０、５、１０、１５、２０、３０、４５分で読み取る。

結果：
これらの実験結果により、配列番号：１ポリペプチド基体が、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体に比べてより大きいダイナミックレンジを提供することが確認された。３０分経過時点で、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３で観察された２５００ＲＦＵに比べて、校正器ＡとＥの差異が、約３５０００ＲＦＵである（図３−４）。より大きいダイナミックレンジによって、ＡＤＡＭＴＳ１３活性が低いサンプルにより良好な感度が提供される。更に、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３基体と同じ濃度で使用する場合、反応時間がより速くなる。％Ｎ活性値の一致が、１５分経過後の読みで観察された（表２）。校正曲線は、リニアであり、ユーザへの複雑な分析結果を取り除く。

実施例３：配列番号：７ポリペプチド基体（ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ５）の切断についての評価

この実験の目的は、配列番号：７ポリペプチド基体を、配列番号：１ポリペプチド基体と比較することである。

手順の概要
ＡＤＡＭＴＳ１３による切断性についての基体のテストを、ほぼ実施例１に述べたとおり、測定した。

結果：
時間に伴う蛍光の変化を図５に示し、配列番号：７ポリペプチド基体の切断が生じることを示す。

実施例４：配列番号：７ポリペプチド基体の溶解性評価とアッセイ分析。

この実験の目的は、配列番号：７ポリペプチド基体の溶解性を評価し、その性能を、配列番号：１ポリペプチド基体と比較することである。

上述した通り、２５０μＬの希釈標準溶液を作成した。この溶液を、強くボルテックスして、溶液中に見えるようにする。溶液を、〜１２，０００ｇで約２分遠心分離にかける。遠心分離後、試験管の底に極小のピンクの沈殿物がみられる。このことは、少なくともいくらかの量の材料が沈殿することを示している。別の試験管を上述の通り準備して、基体バッファに代えて水をいれた。この試験管も遠心分離に掛けた。再び、ピンクの沈殿物が試験管の底に観察された。水溶液中で観察された沈殿物は、基体バッファ溶液中に見られた沈殿物より目に見えて大きい。このことは、ポリペプチドが、バッファより水に溶けにくいことを示唆している。

この実験の目的は、配列番号７ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ５ポリペプチド基体を、ＧＴＩ＿ＦＲＥＴ４（配列番号：１）と比較することである。ＡＤＡＭＴＳ１３による切断性についての基体の試験を、実施例１に記載したものとほぼ同様に行ったが、ＦＲＥＴＳ−ＶＷＦ７３に代えてＧＴＩ＿ＦＲＥＴ５を用いた。

このアッセイは、０、５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、及び９０分で読み取る。

結果：
この実験データは、配列番号：７ポリペプチド基体は、作成した希釈標準溶液に完全には溶解しないことを示している。しかし、結果として取得した校正曲線は、リニアであり（図５参照）、基体の切断が生じる。配列番号：１ポリペプチド基体又は配列番号：７ポリペプチド基体を用いて、基体の追加後３０分で観察された活性の比較を表５に示す。配列番号：７ポリペプチド基体の校正曲線は、６０分を通じて直線的に上がり続けている。

本明細書に記載した刊行物は、本出願の出願日以前に開示された関連情報を提供している。本明細書の記載は、発明者らがこの開示に先立って権利を与えられないとの証明であると解釈すべきでない。本明細書に記載したすべての刊行物は、引用により組み込まれている。この開示の様々な変形及び変更は、本発明の範囲と精神から離れることなくこの分野の当業者には自明である。本発明は、特定の好ましい実施例に関連して記載されているが、特許を請求する本発明が、これらの特定の実施例に不当に制限されると解するべきではない。実際、上述した本発明を実行するモードの当業者には明らかな様々な変形が、特許請求の範囲内であること意図している。

Claims

５０乃至７０アミノ酸長で、配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、トロンボスポンジンＩ型モチーフを有するジスインテングリン様及びメタロペプチダーゼメンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）用の単離したポリペプチド基質であって：
（ｉ）配列番号：７の位置４に対応するアミノ酸がリジン（Ｋ）であり；かつ
（ｉｉ）配列番号：７の位置１５に対応するアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり；
前記ポリペプチド基質がＡＤＡＭＴＳ１３切断活性の基質である
ことを特徴とするポリペプチド基質。
５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５アミノ酸長で、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質であって：
（ｉ）配列番号：１の位置４に対応するアミノ酸がリジン（Ｋ）であり；
（ｉｉ）配列番号：１の位置１５に対応するアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり；かつ
（ｉｉｉ）配列番号：１の位置３４に対応するアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）であり；
前記ポリペプチド基質がＡＤＡＭＴＳ１３切断活性の基質である
ことを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項１又は２に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質において、前記ポリペプチド基質のＮ末端におけるアミノ酸がアスパラギン酸（Ｄ）であることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項１乃至３のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質において、前記ポリペプチド基質のＣ末端におけるアミノ酸がアルギニン（Ｒ）であることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項１乃至４のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質において、前記ポリペプチドが、検出可能なラベルを含む合成ポリペプチドであることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項５に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質において、前記検出可能なラベルが蛍光色素分子と消光剤であることを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項６に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質において、前記蛍光色素分子の付着部位が、配列番号：１または配列番号：７の位置１５に対応するアミノ酸にあり、及び／又は、前記消光剤の付着部位が、配列番号：１または配列番号：７の位置４に対応するアミノ酸にあるか、あるいは、前記消光剤の付着部位が、配列番号：１または配列番号：７の位置１５に対応するアミノ酸にあり、及び／又は、前記蛍光色素分子の付着部位が、配列番号：１または配列番号：７の位置４に対応するアミノ酸にある、ことを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項１及び３乃至７のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質が、配列番号：７に記載の配列を含む、あるいはこの配列からなる、ことを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
請求項２乃至７のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質が、配列番号：１に記載の配列を含む、あるいはこの配列からなる、ことを特徴とするＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質。
凍結乾燥ポリペプチド基質であって、
前記基質が、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４又は７５アミノ酸長であり、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで：
（ｉ）配列番号：１の位置４に対応するアミノ酸がリジン（Ｋ）であり；
（ｉｉ）配列番号：１の位置１５に対応するアミノ酸がシステイン（Ｃ）であり；かつ
（ｉｉｉ）配列番号：１の位置３４に対応するアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）である基質であり、
または
前記基質が、５０乃至７０アミノ酸長であり、配列番号：７に記載のアミノ酸配列又は配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで：
（ｉ）配列番号：７の位置４に対応するアミノ酸がリジン（Ｋ）であり；かつ
（ｉｉ）配列番号：７の位置１５に対応するアミノ酸がシステイン（Ｃ）である基質であり、
前記ポリペプチド基質がＡＤＡＭＴＳ１３切断活性の基質である
ことを特徴とする凍結乾燥ポリペプチド基質。
請求項１乃至９のいずれか１項に記載のトロンボスポンジンＩ型モチーフを有するジスインテングリン様及びメタロペプチダーゼメンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ１３）用の凍結乾燥ポリペプチド基質。
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質を切断する方法において、当該ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質をＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼに接触させるステップを具えることを特徴とする方法。
サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定する方法において、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質を使用するステップを具えることを特徴とする方法。
請求項１３に記載の方法において：
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ１３を含む、又は含むと思われるサンプルを提供するステップと；
（ｂ）前記サンプルを、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質に接触させるステップと；
（ｃ）前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質の断片化を測定するステップと；
を具え、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質の断片化を、一またはそれ以上の対照及び／又は校正器と選択的に比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定を行うことを特徴とする方法。
請求項１４に記載の方法において、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質の切断が、蛍光の変化をモニタすることによって測定されることを特徴とする方法。
請求項１４に記載の方法において、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質がステップ（ｂ）において溶液中にあることを特徴とする方法。
請求項１４に記載の方法において、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質が固相サポートに付着することを特徴とする方法。
ＡＤＡＭＴＳ１３プロテアーゼ活性の定量測定を行う方法において：
（ａ）ＡＤＡＭＴＳ１３を含む、又は含むと思われるサンプルを提供するステップと；
（ｂ）前記サンプルを、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質に接触させるステップと；
（ｃ）前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質の断片化を測定するステップと；
を具え、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質の断片化を、一またはそれ以上の対照及び／又は校正器と選択的に比較して、ＡＤＡＭＴＳ１３活性の測定を行うことを特徴とする方法。
請求項１８に記載の方法において、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質がステップ（ｂ）において溶液中にあることを特徴とする方法。
請求項１８に記載の方法において、前記ＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質が固相サポートに付着することを特徴とする方法。
対象中のＡＤＡＭＴＳ１３活性をインビトロでテストするキットにおいて、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質、既知の濃度のＡＤＡＭＴＳ１３活性を含む一またはそれ以上の校正器、及び／又はＡＤＡＭＴＳ１３活性用の一またはそれ以上の陽性対照を具え、選択的に検体希釈剤及び／又は基質バッファを伴うことを特徴とするキット。
サンプル中のＡＤＡＭＴＳ１３活性を測定するための、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載のＡＤＡＭＴＳ１３ポリペプチド基質の使用。