CN106568940B - 一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物、方法及试剂盒 - Google Patents
一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物领域，尤其是一种体外定量测定vWF‑CP酶活性的底物、方法及试剂盒，其中，底物包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列；方法包括以下步骤：酶标板孔预先包被抗体，然后依次加入底物、待测样本、酶标抗体、显色剂后，酶标仪下测定酶标板孔中液体的吸光度；试剂盒包括酶标板、底物、稀释液、洗涤液、缓冲液、酶标抗体、显色液和终止液，或者包括酶标板、抗体、底物、稀释液、洗涤液、缓冲液、酶标抗体、显色液和终止液。本发明的体外定量测定vWF‑CP酶活性的底物、方法及试剂盒，灵敏度高、准确性好，操作简便，价钱便宜，适用于广泛病人筛查。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物、方法及试剂盒。
背景技术
血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)是一种严重的弥散性血栓性微血管病，以微血管病性溶血性贫血、血小板聚集消耗性减少，以及微血栓形成造成器官损害(如肾脏、中枢神经系统等)为特征。早期报道，TTP发病率为0.2～1/10万，随着临床上对于此疾病的逐渐认知，近年来TTP的发病率有上升的趋势。目前，国内尚未见到相关的流行病学统计。病人以女性为多，任何年龄均可发病，但最常见的发病年龄多为20～60岁，没有地域或种族的差异。在临床中具备典型“五联征”的患者，常因其表现的多样性和非典型而导致误诊，TTP早期明确诊断并及时治疗，病死率可从90％降为20％～30％，整体生存率提高为70％～85％。目前，血浆置换是TTP首选和有效的治疗方法，并且发病后越早治疗救活率越好。同时因为血浆置换的治疗费用昂贵，血制品稀缺，并且有感染病毒性疾病和引起并发症的风险，一旦误诊后果严重。因此是否能够早期迅速诊断及应用血浆置换治疗是影响TTP预后的重要因素。因此，TTP的早期发现至关重要。
目前对TTP的诊断主要依靠临床表现，尚无特异的诊断性实验室检查，缺乏客观性与可靠性。研究发现，血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF) 是一种大分子多聚体糖蛋白，在止血和血栓形成中起着重要作用。vWF多聚体的结构组成主要受血管性血友病因子裂解酶(von Willebrand factor cleaving protease,vWF-CP)调节，vWF-CP又名为ADAMTS-13(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin 13 repeatsfamily of metalloproteases)，正常人血浆中存在能够裂解uL-vWF('unusually large'vWF)的蛋白酶。该酶在正常机体内可以特异性地裂解vWF的A2区的第1605位酪氨酸—1606位蛋氨酸 (Y1605-M1606)之间的肽，从而使vWF裂解，保持正常的止血和血循环功能。当体内vWF-CP基因缺陷或者血浆中产生针对该酶的自身抗体时，vWF-CP的活性下降，uL-vWF在微血管中诱发血小板聚集形成微血栓，导致TTP的发生。临床研究发现，正常人vWF-CP的活性水平下限大多大于正常人平均值的50％，上限因测量方法不同而有所区别。遗传性TTP患者，其活性都低于正常活性的 5％～10％，甚至几乎为零。获得性TTP患者大部分也有重度降低，仅少数患者只是轻度和中度下降。
判断vWF-CP酶活性水平，对此类疾病的诊断和预后判断具有重要价值。早期的检测技术包括免疫放射测定、胶原结合法、瑞斯托霉素辅因子(vWF)，底物为全片段长vWF，多聚物，需要添加变性剂进行解折叠，但是人体内并无变性剂，不符合生理学条件，反应时间较长，16-48小时左右，时常导致病人因无法及时诊断、治疗而丧失生命。
荧光共振能量转移法：化学合成底物FRETS-vWF73，底物被特异性裂解后会减轻荧光淬灭作用，即正常人血浆和底物作用后会使荧光增强，vWF-CP活性缺乏的患者无影响或荧光减弱。参考文献：Kokame K,Nobe Y,Kokubo Y,et al. FRETS-vWF73,a firstfluorogenic substrate for ADAMTS13assay.Br J Haematol 2005；129:93–100，此技术需要实验室配置价值不菲的多功能酶标仪，带荧光检测功能，并且化学合成底物的成本昂贵，导致多数病人因无法负担而放弃检测。
利用酶联免疫吸附测定vWF-CP活性是最近几年流行起来的方法，基于双抗夹心法ELISA技术，预先包被对底物具特异性抗体的酶标板孔，先后加入底物和血浆样本混合孵育，再加入酶标抗体和显色液，当底物和含有vWF-CP的血浆样本混合孵育后，底物被vWF-CP所裂解，酶标仪的吸光度值就较低。如果血浆样本中的vWF-CP活性较低或者存在先天性vWF-CP缺陷，则吸光度值较高。之前报道的文献中大多是采用GST-vWF73-His作为底物，(Zhou W,Tsai HM.An enzyme immunoassay of ADAMTS13 distinguishes patients withthrombotic thrombocytopenic purpura fromnormal individuals and carriers ofADAMTS13 mutations.Thromb)或者A2区域的片段作为底物(Haemost 2004；91: 806–11Whitelock JL,Nolasco L,Bernardo A,Moake J,Dong JF,Cruz MA.ADAMTS-13activity in plasma is rapidly measured by a new ELISAmethod that usesrecombinant vWF-A2 domain as substrate.JThromb Haemost 2004；2: 485–91.),此重组蛋白分子量较大，测试技术过程复杂且耗时长，难以迎合大规模TTP筛查的需求，也不适用于急诊室病人紧急诊断、治疗的临床需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确性好的体外定量测定vWF-CP酶活性的底物、方法及试剂盒。
本发明第一方面提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物，包括vWF 功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS 标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列，所述vWF功能区氨基酸序列为包含 vWF-CP对vWF的酶切位点Y1605至M1606的序列。
应当说明的是，vWF是由第12号染色体的短臂所编码的糖蛋白，52个外显子长178kb，其cDNA全长8900，包含一个编码2813个氨基酸残基的阅读框，其产物是309kD的vWF前体；由于vWF分子量较大，为了提高临床检测效率，现有技术中对保持被vWF-CP酶切活性的vWF功能区氨基酸序列做了一定研究，该vWF功能区氨基酸序列应当满足以下要求：1)包含vWF的A2区的vWF 酶切位点Y1605至M1606的序列；2)不包含任何半胱氨酸残基，以免影响蛋白质的正常折叠。
研究表明，满足这一要求的vWF功能区氨基酸序列最长为vWF的D1459 至R1668的序列，即vWF功能区氨基酸序列优选为选自vWF的D1459至R1668 中且包含酶切位点Y1605至M1606的一段序列。例如，vWF功能区氨基酸序列可选自vWF的D1459至R1668、或E1554至R1668、或D1587至R1668、或 D1596至R1668的序列，研究表明这些序列均可以满足被vWF-CP酶切。
应当说明的是，vWF-CP酶切底物的大小直接影响到酶切效率，而能够被 vWF-CP特异性裂解的最小功能序列为vWF73，即vWF序列中D1596至R1668 的序列，共73个氨基酸残基(vWF73,a region from D1596to R1668of von Willebrand factor,provides a minimalsubstrate for ADAMTS-13， Koichi Kokame，Masanori Matsumoto，Yoshihiro Fujimura，Toshiyuki Miyata，Blood 2004 103:607-612；doi:10.1182/blood-2003-08-2861)，即，vWF功能区氨基酸序列最优为vWF73，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第二方面提供一种采用前述底物的体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病的诊断和治疗的方法，包括以下步骤：
S1、将酶标板孔预先包被对底物具有特异性的抗体；
S2、在酶标板孔中加入底物，孵育一段时间后洗涤；
S3、在酶标板孔中加入待测样本，孵育一段时间后洗涤；
S4、在酶标板孔中加入对底物具有特异性的酶标抗体，孵育一段时间后洗涤；
S5、在酶标板孔中加入显色剂，孵育一段时间加入终止液终止显色反应；
S6、酶标仪下测定酶标板孔中液体的吸光度。
应当说明的是，所述步骤S3中在酶标板孔中加入待测样本应当包括但不限于血浆、血清、全血，凡是包含待测酶活性vWF-CP的样本，均应落入本发明的保护范围。
进一步的，所述步骤S3中在酶标板孔中加入待测样本与缓冲液的混合液，然后孵育一段时间后洗涤。
进一步的，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
本发明第三方面提供一种采用前述底物的体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒，包括包被有对底物具有特异性的抗体的酶标板、底物、稀释液、洗涤液、缓冲液、对底物具有特异性的酶标抗体、显色液和终止液，或者包括酶标板、对底物具有特异性的抗体、底物、稀释液、洗涤液、缓冲液、对底物具有特异性的酶标抗体、显色液和终止液。
进一步的，所述试剂盒还包括标准品1和标准品2，所述标准品1包括含正常酶活性vWF-CP的标准液与终止液的混合液，所述标准品2为含正常酶活性vWF-CP的标准液。在本发明的其中一个实施例中，标准品1为正常人混合血浆和EDTA的混合液，标准品2为正常人混合血浆。
进一步的，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
进一步的，所述稀释液为5×PBS溶液，所述洗涤液为10×TBST溶液。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：原核表达的重组蛋白作为底物能够在静态、非变性条件下被vWF-CP酶切，从而定量检测vWF-CP活性，避免实验过程的繁琐，耗时和变性剂对酶活性的影响，并且生产成本低，与血浆孵育只需少于45分钟即可完成测定vWF-CP酶活性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中3种底物经SDS-PAGE检测的表达结果图；
图2是本发明体外定量测定vWF-CP酶活性的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一 底物筛选
本发明提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物的筛选方法以及结果，其中实验过程包括以下步骤：
1、底物的准备
S1、目的基因片段的获得，该目的基因片段可编码vWF-CP底物，该底物包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有标签氨基酸序列，vWF功能区氨基酸序列为包含vWF-CP对vWF的酶切位点Y1605至M1606的序列。
根据现有研究，vWF功能区氨基酸序列可选自vWF的D1459至R1668中且包含酶切位点Y1605至M1606的一段序列，如vWF的D1459至R1668、或E1554至R1668、或D1587至R1668、或D1596至R1668的序列，其中能够被 vWF-CP特异性裂解的最小功能序列为vWF73，即D1596至R1668的序列，共 73个氨基酸残基。由于这些序列均可以满足被vWF-CP酶切，本实施例选择vWF73作为后续实验中的vWF功能区氨基酸序列。
在vWF73序列的基础上，本实施例通过在其N端和C端标记不同的标签氨基酸序列，以验证标签氨基酸序列对酶切效率的影响。本实施例提供3种底物，分别标记为HIS-vWF73-FLAG、HIS-HAS-vWF73-FLAG和GST-vWF73-HIS；其中：
底物1(HIS-vWF73-FLAG)为vWF73的N端和C端分别标记HIS和FLAG 标签氨基酸序列，其包括88个氨基酸，序列如SEQ ID NO：2所示；其编码的基因片段可通过一组分别如SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示的上游引物和下游引物实现PCR的扩增，其PCR扩增产物核酸序列可以设计为如SEQ ID NO： 5所示。
底物2(HIS-HAS-vWF73-FLAG)为vWF73的N端和C端分别标记HIS-HAS 和FLAG标签氨基酸序列，其包括159个氨基酸，序列如SEQ ID NO：6所示；其可通过一组分别如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示的上游引物和下游引物实现PCR的扩增，其PCR扩增产物核酸序列可以设计为如SEQ ID NO：9所示。
底物3(GST-vWF73-HIS)为vWF73的N端和C端分别标记GST和HIS 标签氨基酸序列，其包括301个氨基酸序列，序列如SEQ ID NO：10所示；其可通过一组分别如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的上游引物和下游引物实现PCR的扩增，其PCR扩增产物核酸序列可以设计为如SEQ ID NO：13 所示。
S2、将目的基因片段与表达载体PET-30(a)重组，可通过NdeI与XhoI双酶切pET-30a载体和PCR扩增产物核酸序列；
NdeI/XhoI分别双酶切PET-30(a)和编码HIS-vWF73-FLAG、 HIS-HAS-vWF73-FLAG、GST-vWF73-HIS的目的基因片段，回收载体和片段。
用限制性内切酶NdeI/XhoI消化质粒，反应体系如表1所示。
表1 限制性内切酶反应体系
| 质粒DNA | 1μg |
| FastDigest@NdeI(1FDU) | 1μl |
| FastDigest@XhoI(1FDU) | 1μl |
| 10*FastDigest@Buffer | 2μl |
加入灭菌蒸馏水补足体系总量至20μl。在37℃恒温水浴中消化15min，然后加入2μlDNA上样缓冲液终止酶切反应
回收的载体和片段用T4连接酶连接。
DNA片断的连接反应体系表2所示：
表2 DNA连接反应体系
| DNA载体 | 6μl |
| DNA片段 | 2μl |
| T4DNA连接酶 | 1μl |
| 10*T4连接酶Buffer | 1μl |
连接体系总量是10μl，在16℃恒温水浴连接2h或4℃连接8～12h。
S3、PET-30(a)-vWF73在大肠杆菌中的表达、纯化。
经过测序鉴定的重组蛋白表达载体进转化BL21(DE3)感受态细胞，37℃过夜培养，挑取单个菌落于4ml含有相应抗体的培养基中震荡培养8小时左右，将表达菌液1:100扩增到新鲜含抗生素培养基中，振荡培养至OD值为0.6～0.7 时加入诱导剂IPTG，浓度为0.5mmol/L，诱导表达6小时，离心收集菌体。超声波破碎，离心，收集上清液。
蛋白纯化主要采用Ni柱纯化，将Ni-NTA Agarose充填柱子，用5倍柱体积的裂解液平衡Ni-NTA Agarose，调节A280值至零线。将适量上清液上样到 Ni-NTA Agarose柱子中，并用裂解液冲洗至A280值低于0.01。分别用5～10倍柱体积的清洗液清洗柱子，直至A280值低于0.01。用洗脱液洗脱重组蛋白质，在A280值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。
3种底物的基本性质如表3所示，经SDS-PAGE检测的表达结果如图1所示，图中laneM为蛋白质分子量标准；lane1-3分别为底物3、底物2和底物1。
表3 三种底物的基本性质
| 蛋白名称 | 氨基酸个数 | 分子量(KD) | 等电点 |
| HIS-V73-FLAG | 88 | 10 | 4.96 |
| HIS-HAS-V73-FLAG | 159 | 18.3 | 5.2 |
| GST-V73-HIS | 301 | 34.8 | 5.75 |
2、vWF-CP酶活性的检测
S1、洗涤：取出一次用量的酶标板条，用稀释后的洗涤液洗涤3次，200μl/ 孔，控干，洗涤液为10×TBST溶液。
S2、加底物：底物稀释后，加入板中，做复孔同时设置空白孔(除了洗涤、显色和终止液，其他均不加)，避光孵育后洗涤控干。
S3、加样：1)标准品Ⅰ孔：标准品Ⅰ与缓冲液混后加入板中，标准品Ⅰ为正常人混合血浆+10mM EDTA；2)标准品Ⅱ孔：标准品Ⅱ与缓冲液混后加入板中，标准品Ⅱ为正常人混合血浆；3)待测样品孔：待测样品与缓冲液混后加入板中；最后盖上封板膜，避光温育后洗涤控干。
S4、加抗体：酶标抗体稀释后，加入板中，避光孵育后洗涤控干。
S5、显色：加入显色液避光孵育。
S6、终止反应：显色完全后加终止液终止显色反应。
S7、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
上述实验流程如图2所示，vWF-CP酶活性的方法为根据正常人血浆和待测样品血浆反应后测得的吸光度值来计算。不添加血浆样品减去待测样品的吸光度值除以不添加样品和正常人血浆吸光度值的差值得到的即为待测血浆样品中 vWF-CP酶活性。具体公式如下：
上述3种底物的检测结果如表4所示，表中，标准品Ⅰ作为正常人混合血浆的对照组，在加样时即终止酶切反应，标准品Ⅱ由于为正常人混合血浆，其中含有活性较高的vWF-CP酶，同样的反应时间条件下，标准品Ⅱ的检测OD 值，直接反映着相同vWF-CP酶下不同底物的酶切效率，根据表中数据可知，酶切反应速度：HIS-vWF73-FLAG>HIS-HAS-vWF-FLAG>GST-vWF–HIS，换言之，vWF功能区氨基酸序列的N端和C端标记不同的标签氨基酸序列，对于酶切效率有着直接影响，而HIS和FLAG标签氨基酸序列，作为最优的底物设计方案。
表4 三种底物vWF-CP酶活性的检测
3、加样缓冲液对vWF-CP酶活性的影响
保持前述步骤2中S1至S7不变，仅调整步骤S3中的加样缓冲液为HEPES 缓冲液或Tris缓冲液，以HIS-vWF73-FLAG作为底物检测不同加样缓冲液对 vWF-CP酶活性的影响，试验三次取平均值，结果如表5所示，可见，对于相同的底物，HEPES缓冲液酶切的反应速度明显高于Tris缓冲液。
表5 不同加样缓冲液对vWF-CP酶活性的影响
实施例二体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒及使用方法
本发明提供一种体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒，其组分如表6所示。
表6 体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒
上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1、洗涤：取出一次用量的酶标板条，用稀释后的试剂C洗涤3次，200μl /孔，控干。
S2、加底物：试剂A和稀释后的试剂B 1:100稀释后，加入板中，100μl/ 孔，做复孔，同时设置空白孔(除了洗涤、显色和终止液，其它均不加)，37℃避光孵育1h后，试剂C洗涤3次，200μl/孔，控干。
S3、加样：
1)标准品Ⅰ孔：加入标准品Ⅰ25μl，再加试剂D 225μl混后加入板中，100μl /孔；
2)标准品Ⅱ孔：加入标准品Ⅱ25μl，再加试剂D 225μl，混后加入板中， 100μl/孔；
3)待测样品孔：加入样本25μl，再加试剂D 225μl，混后加入板中，100μl /孔，最后盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃避光温育45min，洗涤3次，200μl /孔，控干。
S4、加抗体：试剂E和试剂B 1:5000稀释后，加入板中，100μl/孔，37℃避光孵育1h，反应结束后洗涤3次，200μl/孔，控干。
S5、显色：加入试剂F，100μl/孔，室温避光孵育15min。
S6、终止反应：显色完全后加试剂G 50μl/孔，终止显色反应。
S7、测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定应在加终止液后15分钟以内进行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 吴江华药生物技术有限公司
<120> 一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物、方法及试剂盒
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115 120 125
Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
145 150 155
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggaattccat atgcaccatc atcatcatca taaccagtta tgtgtgttgc atgaga 56
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccgctcgagt ttacttatcg tcgtcatcct tgtaatccct ctgcagcacc aggtcagga 59
<210> 9
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggaattccat atgcaccatc atcatcatca taaccagtta tgtgtgttgc atgagaaaac 60
gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc ttggtgaaca ggcgaccatg 120
cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa gagtttaatg ctgaaacatt 180
caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag agacaaatca agaaacaaga 240
attcgaccgg gagcaggcgc ccaacctggt ctacatggtc accggaaatc ctgcctctga 300
tgagatcaag aggctgcctg gagacatcca ggtggtgccc attggagtgg gccctaatgc 360
caacgtgcag gagctggaga ggattggctg gcccaatgcc cctatcctca tccaggactt 420
tgagacgctc ccccgagagg ctcctgacct ggtgctgcag agggattaca aggatgacga 480
cgataagtaa actcgagcgg 500
<210> 10
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
20 25 30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
35 40 45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
50 55 60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65 70 75 80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
85 90 95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
100 105 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
115 120 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
130 135 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145 150 155 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
165 170 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
180 185 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Gly Ser Glu Phe Asp Arg
210 215 220
Glu Gln Ala Pro Asn Leu Val Tyr Met Val Thr Gly Asn Pro Ala Ser
225 230 235 240
Asp Glu Ile Lys Arg Leu Pro Gly Asp Ile Gln Val Val Pro Ile Gly
245 250 255
Val Gly Pro Asn Ala Asn Val Gln Glu Leu Glu Arg Ile Gly Trp Pro
260 265 270
Asn Ala Pro Ile Leu Ile Gln Asp Phe Glu Thr Leu Pro Arg Glu Ala
275 280 285
Pro Asp Leu Val Leu Gln Arg His His His His His His
290 295 300
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gggaattcca tatgtcccct atactaggtt attg 34
<210> 12
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgctcgagt tcaatggtga tggtgatggt gcctctgcag caccaggtca gga 53
<210> 13
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggaattcca tatgtcccct atactaggtt attggaaaat taagggcctt gtgcaaccca 60
ctcgacttct tttggaatat cttgaagaaa aatatgaaga gcatttgtat gagcgcgatg 120
aaggtgataa atggcgaaac aaaaagtttg aattgggttt ggagtttccc aatcttcctt 180
attatattga tggtgatgtt aaattaacac agtctatggc catcatacgt tatatagctg 240
acaagcacaa catgttgggt ggttgtccaa aagagcgtgc agagatttca atgcttgaag 300
gagcggtttt ggatattaga tacggtgttt cgagaattgc atatagtaaa gactttgaaa 360
ctctcaaagt tgattttctt agcaagctac ctgaaatgct gaaaatgttc gaagatcgtt 420
tatgtcataa aacatattta aatggtgatc atgtaaccca tcctgacttc atgttgtatg 480
acgctcttga tgttgtttta tacatggacc caatgtgcct ggatgcgttc ccaaaattag 540
tttgttttaa aaaacgtatt gaagctatcc cacaaattga taagtacttg aaatccagca 600
agtatatagc atggcctttg cagggctggc aagccacgtt tggtggtggc gaccatcctc 660
caaaaggatc cgaattcgac cgggagcagg cgcccaacct ggtctacatg gtcaccggaa 720
atcctgcctc tgatgagatc aagaggctgc ctggagacat ccaggtggtg cccattggag 780
tgggccctaa tgccaacgtg caggagctgg agaggattgg ctggcccaat gcccctatcc 840
tcatccagga ctttgagacg ctcccccgag aggctcctga cctggtgctg cagaggcacc 900
atcaccatca ccattgaact cgagcgg 927
Claims (7)
1.一种体外定量测定vWF-CP酶活性的底物，其特征在于：包括vWF功能区氨基酸序列，并在vWF功能区氨基酸序列的N端和C端分别结合有HIS标签氨基酸序列和FLAG标签氨基酸序列，所述vWF功能区氨基酸序列为vWF73，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述底物的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种采用根据权利要求1所述底物的体外定量测定vWF-CP酶活性的非疾病的诊断和治疗的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将酶标板孔预先包被对底物FLAG标签氨基酸序列具有特异性的抗体；
S2、在酶标板孔中加入底物，孵育一段时间后洗涤；
S3、在酶标板孔中加入待测样本，孵育一段时间后洗涤；
S4、在酶标板孔中加入对底物HIS氨基酸序列具有特异性的酶标抗体，孵育一段时间后洗涤；
S5、在酶标板孔中加入显色剂，孵育一段时间加入终止液终止显色反应；
S6、酶标仪下测定酶标板孔中液体的吸光度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中在酶标板孔中加入待测样本与缓冲液的混合液，然后孵育一段时间后洗涤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述缓冲液为HEPES缓冲液。
5.一种采用根据权利要求1所述底物的体外定量测定vWF-CP酶活性的试剂盒，其特征在于：包括包被有对底物FLAG标签氨基酸序列具有特异性的抗体的酶标板、底物、稀释液、洗涤液、缓冲液、对底物HIS标签氨基酸序列具有特异性的酶标抗体、显色液和终止液，或者包括酶标板、对底物FLAG标签氨基酸序列具有特异性的抗体、底物、稀释液、洗涤液、缓冲液、对底物HIS标签氨基酸序列具有特异性的酶标抗体、显色液和终止液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括标准品1和标准品2，所述标准品1包括含正常酶活性vWF-CP的标准液与终止液的混合液，所述标准品2为含正常酶活性vWF-CP的标准液。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为HEPES缓冲液。
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| 血管性血友病因子vWF73和vWFl14片段的表达及其在ADAMTSl3活性测定中的应用;张敬宇等;《中华血液学杂志》;20110531;第32卷(第5期);337-341 * |
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