CN110760563A - 测定酶活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于酶检测技术领域，提供了一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；S2：对酶彻底物进行酶切反应；S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算。借此，本发明灵敏度、准确性好，操作简便，价格便宜，应用范围广泛。

Description

测定酶活性的方法
技术领域
本发明涉及酶检测技术领域，尤其涉及一种测定酶活性的方法。
背景技术
血栓性微血管病主要包括四类疾病：血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、恶性高血压肾损害、先兆子痫肾损害。
血栓性微血管病临床上主要表现为血小板减少、溶血性贫血和微循环中血小板血栓造成的器官受累，其临床表现与血栓性微血管病的病变范围和累及不同器官造成的功能障碍有关。
该病涉及的临床科室非常广泛，患者往往可能在不同的科室，如肾脏内科、血液科、神经内科、妇产科、皮肤科、心血管内科和呼吸科等就诊，如接诊医生缺乏对该病的认识，往往会造成严重的误漏诊，故提高对该类疾病的认知度已成为目前国内外相关专业领域内的关注热点。
血栓性微血管病临床表现非常相似，但是治病机理则完全不同，其中血栓性血小板减少性紫癜有一个最大的区别就是金属蛋白酶的酶活性有显著性差异。不管是遗传性还是获得性血栓性血小板减少性紫癜病人的金属蛋白酶的酶活性一般都小于5％，而其他类型的血栓性血小板减少性紫癜的发病跟金属蛋白酶的酶活性缺失没有关系，所以其他类型的血栓性血小板减少性紫癜病人的金属蛋白酶的酶活性正常。。
早期的检测技术包括免疫放射测定、胶原结合法、瑞斯托霉素辅因子，底物为全片段长瑞斯托霉素辅因子，多聚体，需要添加变性剂进行解折叠，但是人体内并无变性剂，不符合生理学条件，反应时间较长，1-2天左右时常导致病人因无法及时诊断、治疗而丧失生命。
荧光共振能量转移法：化学合成底物FRETS-vWF73，底物被特异性裂解后会减轻荧光淬灭作用，即正常人血浆和底物作用后会使荧光增强，金属蛋白酶活性缺失的患者无影响或荧光减弱。此技术需要实验室配制价格不菲的多功能酶标仪，带荧光检测功能，并且化学合成底物的成本昂贵，导致多数病人因无法负担而放弃检测。
利用酶联免疫吸附测定金属蛋白酶的酶活性是最近几年流行起来的方法，基于双抗夹心法技术，预先包被对底物具特异性抗体的酶标板孔，先后加入底物和血浆样本混合孵育，再加入酶标抗体和显色液，当底物和含有金属蛋白酶的血浆样本混合孵育后，底物被金属蛋白酶所裂解，酶标仪的吸光度值就较低。如果血浆样本中的金属蛋白酶活性较低或者存在先天性金属蛋白酶缺陷，则吸光度值较高。此重组蛋白分子量较大，测试技术过程复杂且耗时较长，难以迎合大规模血栓性血小板减少性紫癜筛查的需求，也不适用于急诊室病人紧急诊断、治疗的临床需求。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种测定酶活性的方法，其可以快速有效的实现对酶活性的检测，降低治疗成本，提高治愈率。
为了实现上述目的，本发明提供一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：
S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；
将氨基酸片段以及其末端的组氨酸插入到细菌表达载体上并进行克隆，然后对细菌进行收集后对其进行裂解，裂解完成后进行离心处理，并对离心处理后的细菌进行上清收集，然后加入等体积的缓冲液进行稀释，利用还原性离子柱对稀释后的液体进行洗脱，进而得到所需的酶彻底物；
S2：对酶彻底物进行酶切反应；
将酶彻底物用反应缓冲液进行稀释，然后取其血清标准物，与所测血清样本进行稀释后的底物溶液进行混合，将混合后的液体进行孵育，对孵育后的溶液加热至预设温度后终止反应；
S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算；
取所需要的富集有酶切产物的金属靶板，加入激活缓冲液后震荡孵育，然后对金属靶板冲洗后，加入结合缓冲液首次震荡孵育，吸去靶板上的残留液后，在靶板上加入步骤S2中的样本，然后再次震荡孵育并进行冲洗，最后取出靶板吸干残留溶液后，加入基质并利用仪器进行靶板读取，利用读取的峰面积对酶切活性进行计算。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述氨基酸片段为瑞斯托霉素辅因子中73个氨基酸片段的D1596～R1668，所述组氨酸为瑞斯托霉素辅因子末端的6个组氨酸。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述瑞斯托霉素辅因子的正义链和反义链分别为5_-cgggatccGAGGCACAGTCCAAAGGGGACA-3_和5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述细菌表达载体为N端带有GST蛋白的pGEX6p-1，且所述细菌表达载体克隆完成后，转染BL21表达细菌。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述裂解采用超声裂解，且所述缓冲稀释液为与上清等体积的PBS缓冲液稀释，所述还原性离子柱为还原性镍离子柱。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述S2中酶彻底物稀释度为0.1ug/ul，所述反应缓冲液包括5mM氯化钠和1mM氯化钡，且PH值为7.5。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述S2中孵育时间为1h，且采用水浴锅孵育，所述水浴锅温度为37℃，所述S2中预设温度为95℃。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述激活缓冲液包括100mM硫酸铜，所述结合缓冲液包括洗脱缓冲液和平衡缓冲液，且所述洗脱缓冲液为1XPBS，所述平衡缓冲液为1mMHEPES，且PH值为7.0，所述基质为芥子酸。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述首次震荡孵育为5min震荡孵育两次，所述再次震荡孵育时间为30min，所述再次震荡孵育后采用洗脱缓冲液洗脱3次，每次5分钟，最后用水洗两次。
根据本发明的测定酶活性的方法，所述基质点加量为1ul，且点加完后进行风干后再添加一次，所述仪器型号为Ebio ReaderTM 3700，且仪器内软件分析目的峰以及内参照峰面积，以目的峰除以内参照峰面积的值作为X轴，以标准血清浓度为Y轴做一次曲线，根据样本的峰面积计算其酶切活性。
本发明提供了一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：
S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；
将氨基酸片段以及其末端的组氨酸插入到细菌表达载体上并进行克隆，然后对细菌进行收集后对其进行裂解，裂解完成后进行离心处理，并对离心处理后的细菌进行上清收集，然后加入等体积的缓冲液进行稀释，利用还原性离子柱对稀释后的液体进行洗脱，进而得到所需的酶彻底物；
S2：对酶彻底物进行酶切反应；
将酶彻底物用反应缓冲液进行稀释，然后取其血清标准物，与所测血清样本进行稀释后的底物溶液进行混合，将混合后的液体进行孵育，对孵育后的溶液加热至预设温度后终止反应；
S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算；
取所需要的富集有酶切产物的金属靶板，加入激活缓冲液后震荡孵育，然后对金属靶板冲洗后，加入结合缓冲液首次震荡孵育，吸去靶板上的残留液后，在靶板上加入步骤S2中的样本，然后再次震荡孵育并进行冲洗，最后取出靶板吸干残留溶液后，加入基质并利用仪器进行靶板读取，利用读取的峰面积对酶切活性进行计算。
本发明的有益效果：
1、该检测方法迅速有效，检测精确。
2、检测所有血栓性微血管病疑似病例，筛选出所有金属蛋白酶活性小于5％的病例，这些病人将作为血栓性血小板减少性紫癜进行治疗。对于酶活性大于5％的病例将进行其他进一步的诊断，并开始完全不一样的治疗。
3、对于所有血栓性血小板减少性紫癜病例在治疗过程中以及出院以后的长期监控中，都需定期检测金属蛋白酶的酶活性，从而更好的对病人进行正确的治疗，降低治疗成本，有效地提高病人的生存率以及生活质量。
附图说明
图1是本发明中仪器的结构示意图；
图2是本发明中仪器所读取的酶活性数值图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
参见图1，本发明提供了一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：
S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；
将氨基酸片段以及其末端的组氨酸插入到细菌表达载体上并进行克隆，然后对细菌进行收集后对其进行裂解，裂解完成后进行离心处理，并对离心处理后的细菌进行上清收集，然后加入等体积的缓冲液进行稀释，利用还原性离子柱对稀释后的液体进行洗脱，进而得到所需的酶彻底物；
S2：对酶彻底物进行酶切反应；
将酶彻底物用反应缓冲液进行稀释，然后取其血清标准物，与所测血清样本进行稀释后的底物溶液进行混合，将混合后的液体进行孵育，对孵育后的溶液加热至预设温度后终止反应；
S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算；
取所需要的富集有酶切产物的金属靶板，加入激活缓冲液后震荡孵育，然后对金属靶板冲洗后，加入结合缓冲液首次震荡孵育，吸去靶板上的残留液后，在靶板上加入步骤S2中的样本，然后再次震荡孵育并进行冲洗，最后取出靶板吸干残留溶液后，加入基质并利用仪器进行靶板读取，利用读取的峰面积对酶切活性进行计算。
优选的是，本发明的氨基酸片段为瑞斯托霉素辅因子中73个氨基酸片段的D1596～R1668，所述组氨酸为瑞斯托霉素辅因子末端的6个组氨酸。
另外，本发明的瑞斯托霉素辅因子的正义链和反义链分别为5_-cgggatccGAGGCACAGTCCAAAGGGGACA-3_和5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_。
进一步的，本发明的细菌表达载体为N端带有GST蛋白的pGEX6p-1，且所述细菌表达载体克隆完成后，转染BL21表达细菌。
更好的，本发明的裂解采用超声裂解，且所述缓冲稀释液为与上清等体积的PBS缓冲液稀释，所述还原性离子柱为还原性镍离子柱。
Ebio ReaderTM 3700系统操作步骤可以分为以下几步：
1、被分析的样品直接点样到靶板阵列进行反应，样品中的蛋白多肽特异性结合到靶板上进行反应；
2、靶板冲洗，把未结合和非特异性结合的小分子物质洗脱掉；
3、在靶板上加基质，当激光照射靶板时，把激光的能量转化为热能，使样品电离；
4、样品中的蛋白多肽吸收能量后，被解吸而发生离子化，通过真空管飞到离子检测器，由于质荷比不同的离子在飞行管内飞行的时间不同，将不同的蛋白多肽根据质荷比德不同而被分离。根据到达检测器飞行时间的不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间(t)成正比，公式是：
Figure BDA0002227335280000071
式中：
m——离子质量数；
z——离子所带电荷；
e——元电荷；
U——加速电场电压，V；
L——飞行管道长度，m；
t——飞行时间，s。
如图1所示，Ebio ReaderTM 3700仪器由主机、计算机和打印机组成，主机由激光器、靶板、靶板传输机构、离子源、飞行管、检测器、信号线、数据采集卡、真空泵组等组成。
金属蛋白酶(ADAMTS13)包含了1427个氨基酸残端，包括一个疏水的信号肽，一个前肽，一个金属蛋白酶区域，一个去整合素区域，一个凝血酶敏感蛋白重复基序区(TSP1)，一个富含半胱氨酸区域，一个间隔区以及两个CUB区。
研究表明，瑞斯托霉素辅因子(vWF)功能区氨基酸序列中D1596-R1668由73个氨基酸残基构成的功能序列能够有效的被ADAMTS13酶切。
瑞斯托霉素辅因子(vWF73)DNA片段的获得：以人脐静脉内皮细胞为质粒模板分别进行PCR扩增vWF73的DNA片段。设计引物序列如下：
正义链：
5_-cgggatccGAGGCACAGTCCAAAGGGGACA-3_，
反义链：
5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_.
两条引物分别引入BamHI和Hind m的酶切位点(小写英文字母部分)，并于C末端各插入一个6X His Tag(下划线部分)。
具体如下：(1)ADAMTS13酶切底物GST-vWF73-6XHis重组蛋白的表达纯化；(2)酶切反应；(3)ADAMTS13酶切产物被金属靶板富集以后被Ebio ReaderTM 3700识别检测，并由分析软件计算样本中ADAMTS13的酶切活性。通过对获取的数据进行计算分析，从而定量导出计算ADAMTS13酶活性的准确数值，如图2所示。
步骤S3中包括一试剂盒，所述试剂盒包括底物、内标物、稀释液、缓冲液、结合液、洗脱液、基质。
成分组成具体如下：
(1)去离子水
(2)反应缓冲液(5mM氯化钠,pH 7.5,1mM氯化钡)
(3)激活缓冲液(100mM硫酸铜)
(4)洗脱缓冲液(1XPBS)
(5)平衡缓冲液(1mMHEPES,pH 7.0)
(6)基质(芥子酸)
(7)底物(GST-vWF73-6XHis重组蛋白)
本发明具有如下优点：
1、该检测方法迅速有效，检测精确。
2、检测所有血栓性微血管病疑似病例，筛选出所有ADAMTS13酶活性小于5％的病例，这些病人将作为血栓性血小板减少性紫癜(TTP)进行治疗。对于酶活性大于5％的病例将进行其他进一步的诊断，并开始完全不一样的治疗。
3、对于所有TTP病例在治疗过程中以及出院以后的长期监控中，都需定期检测ADAMTS13的酶活性，从而更好的对病人进行正确的治疗，降低治疗成本，有效地提高病人的生存率以及生活质量。
综上所述，本发明提供了一种测定酶活性的方法，包括以下步骤：
S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；
将氨基酸片段以及其末端的组氨酸插入到细菌表达载体上并进行克隆，然后对细菌进行收集后对其进行裂解，裂解完成后进行离心处理，并对离心处理后的细菌进行上清收集，然后加入等体积的缓冲液进行稀释，利用还原性离子柱对稀释后的液体进行洗脱，进而得到所需的酶彻底物；
S2：对酶彻底物进行酶切反应；
将酶彻底物用反应缓冲液进行稀释，然后取其血清标准物，与所测血清样本进行稀释后的底物溶液进行混合，将混合后的液体进行孵育，对孵育后的溶液加热至预设温度后终止反应；
S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算；
取所需要的富集有酶切产物的金属靶板，加入激活缓冲液后震荡孵育，然后对金属靶板冲洗后，加入结合缓冲液首次震荡孵育，吸去靶板上的残留液后，在靶板上加入步骤S2中的样本，然后再次震荡孵育并进行冲洗，最后取出靶板吸干残留溶液后，加入基质并利用仪器进行靶板读取，利用读取的峰面积对酶切活性进行计算。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种测定酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：对金属蛋白酶的酶切底物进行重组蛋白纯化；
将氨基酸片段以及其末端的组氨酸插入到细菌表达载体上并进行克隆，然后对细菌进行收集后对其进行裂解，裂解完成后进行离心处理，并对离心处理后的细菌进行上清收集，然后加入等体积的缓冲液进行稀释，利用还原性离子柱对稀释后的液体进行洗脱，进而得到所需的酶彻底物；
S2：对酶彻底物进行酶切反应；
将酶彻底物用反应缓冲液进行稀释，然后取其血清标准物，与所测血清样本进行稀释后的底物溶液进行混合，将混合后的液体进行孵育，对孵育后的溶液加热至预设温度后终止反应；
S3：读取酶切反应后的金属靶板，并对样本内的酶切活性进行计算；
取所需要的富集有酶切产物的金属靶板，加入激活缓冲液后震荡孵育，然后对金属靶板冲洗后，加入结合缓冲液首次震荡孵育，吸去靶板上的残留液后，在靶板上加入步骤S2中的样本，然后再次震荡孵育并进行冲洗，最后取出靶板吸干残留溶液后，加入基质并利用仪器进行靶板读取，利用读取的峰面积对酶切活性进行计算。
2.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述氨基酸片段为瑞斯托霉素辅因子中73个氨基酸片段的D1596～R1668，所述组氨酸为瑞斯托霉素辅因子末端的6个组氨酸。
3.根据权利要求2所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述瑞斯托霉素辅因子的正义链和反义链分别为5_-cgggatccGAGGCACAGTCCAAAGGGGACA-3_和5_-cggaattcTCAGTGATG GTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_。
4.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述细菌表达载体为N端带有GST蛋白的pGEX6p-1，且所述细菌表达载体克隆完成后，转染BL21表达细菌。
5.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述裂解采用超声裂解，且所述缓冲稀释液为与上清等体积的PBS缓冲液稀释，所述还原性离子柱为还原性镍离子柱。
6.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述S2中酶彻底物稀释度为0.1ug/ul，所述反应缓冲液包括5mM氯化钠和1mM氯化钡，且PH值为7.5。
7.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述S2中孵育时间为1h，且采用水浴锅孵育，所述水浴锅温度为37℃，所述S2中预设温度为95℃。
8.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述激活缓冲液包括100mM硫酸铜，所述结合缓冲液包括洗脱缓冲液和平衡缓冲液，且所述洗脱缓冲液为1XPBS，所述平衡缓冲液为1mMHEPES，且PH值为7.0，所述基质为芥子酸。
9.根据权利要求1所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述首次震荡孵育为5min震荡孵育两次，所述再次震荡孵育时间为30min，所述再次震荡孵育后采用洗脱缓冲液洗脱3次，每次5分钟，最后用水洗两次。
10.根据权利要求9所述的测定酶活性的方法，其特征在于，所述基质点加量为1ul，且点加完后进行风干后再添加一次，所述仪器型号为Ebio ReaderTM3700，且仪器内软件分析目的峰以及内参照峰面积，以目的峰除以内参照峰面积的值作为X轴，以标准血清浓度为Y轴做一次曲线，根据样本的峰面积计算其酶切活性。
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