CN111983003A - 一种用maldi-tof-ms测定adamts-13酶活性的底物、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于医学分子生物学，蛋白多肽检测技术领域，尤其涉及一种能够利用MALDI‑TOF‑MS来检测金属蛋白酶ADAMTS‑13酶活性的底物、方法及试剂盒。包括以下步骤：(1)ADAMTS‑13酶切底物GST‑vWF82‑6XHis重组蛋白的表达纯化；(2)酶切反应；(3)ADAMTS‑13酶切产物被金属螯合芯片富集以后被MALDI‑TOF‑MS识别检测，并由分析软件得到血清样本中ADAMTS‑13的酶切活性。本发明的体外定量测定ADAMTS‑13酶活性的底物、方法及试剂盒，灵敏度、准确性好，操作简便，价格便宜，适用于广泛病人筛查。

Description

一种用MALDI-TOF-MS测定ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试 剂盒

技术领域

本发明属于医学分子生物学，蛋白多肽检测技术领域，尤其涉及一种能够利用MALDI-TOF-MS来检测金属蛋白酶ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒。

背景技术

MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱)主要有三部分组成：第一部分是金属载片，可以定向选择为金属螯合芯片，第二部分是飞行时间质谱仪，也可以称做质谱阅读器，第三部分是系统专用分析软件。

本检测方法将采用金属螯合芯片载片，金属螯合芯片表面可以螯合正二价金属离子Ni，可以特异性的捕获带有组氨酸基团的蛋白质多肽。

质谱阅读器，就是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪。其通过激光脉冲辐射将样品转化为运动的气态离子并按质荷(M/Z)大小进行分离，根据不同质荷比在电场中飞行时间长短不一，从而绘制出一张质谱图。

系统专用分析软件用来处理实验所得的数据。通过对获取数据进行计算分析，从而定量导出计算 ADAMTS-13酶活性的准确数值。

MALDI-TOF-MS技术操作步骤可以分为以下几步：

1、被分析的样品直接点样到芯片阵列进行反应，样品中的蛋白多肽特异性结合到芯片上进行反应；

2、芯片冲洗，把未结合和非特异性结合的小分子物质洗脱掉，从而除去样品中的“噪声”，降低背景；

3、在芯片上加基质，当激光照射芯片时，它能把激光的能量转化为热能；

4、样品中的蛋白多肽吸收能量后，被解吸而发生离子化，通过真空管飞到离子检测器，这样质荷比不同其飞行时间不同，所以不同的蛋白多肽即可根据质荷比而被分离。

血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)是一组具有共同病理特征的急性临床病理综合征，分为遗传性和获得性，主要表现为内皮细胞肿胀脱落、内皮下绒毛状物质沉积和血管腔内血小板聚集形成微血栓、血管腔内栓塞及红细胞碎裂等微血管系统异常。

TMA临床上主要表现为血小板减少、溶血性贫血和微循环中血小板血栓造成的器官受累，其临床表现与TMA的病变范围和累及不同器官造成的功能障碍有关。

该病涉及的临床科室非常广泛，患者往往可能在不同的科室，如肾脏内科、血液科、神经内科、妇产科、皮肤科、心血管内科和呼吸科等就诊，如接诊医生缺乏对该病的认识，往往会造成严重的误漏诊，故提高对该类疾病的认知度已成为目前国内外相关专业领域内的关注热点。

TMA主要包括两类疾病：血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic throm-bocytopenic purpura，TTP)，溶血性尿毒症综合征(hemolytic uremlc syndrome，HUS)。这两种疾病的临床表现非常相似，但是两者有一个最大的区别就是金属蛋白酶(ADAMTS-13)的酶活性有显著性差异。不管是遗传性还是获得性TTP 病人的ADAMTS-13酶活性一般都小于10％，而HUS的发病跟ADAMTS-13酶活性缺失没有关系，所以HUS病人的ADAMTS-13酶活性正常。所以判断ADAMTS-13酶活性水平对此类疾病的诊断和预后判断具有重要价值。早期的检测技术包括免疫放射测定、胶原结合法、瑞斯托霉素辅因子(vWF)，底物为全片段长vWF，多聚体，需要添加变性剂进行解折叠，但是人体内并无变性剂，不符合生理学条件，反应时间较长，1-2天左右时常导致病人因无法及时诊断、治疗而丧失生命。

荧光共振能量转移法：化学合成底物FRETS-vWF73，底物被特异性裂解后会减轻荧光淬灭作用，即正常人血浆和底物作用后会使荧光增强，ADAMTS-13活性缺失的患者无影响或荧光减弱。此技术需要实验室配制价格不菲的多功能酶标仪，带荧光检测功能，并且化学合成底物的成本昂贵，导致多数病人因无法负担而放弃检测。

利用酶联免疫吸附测定ADAMTS-13酶活性是最近几年流行起来的方法，基于双抗夹心法ELISA技术，预先包被对底物具特异性抗体的酶标板孔，先后加入底物和血浆样本混合孵育，再加入酶标抗体和显色液，当底物和含有ADAMTS-13的血浆样本混合孵育后，底物被ADAMTS-13所裂解，酶标仪的吸光度值就较低。如果血浆样本中的ADAMTS-13活性较低或者存在先天性ADAMTS-13缺陷，则吸光度值较高。此重组蛋白分子量较大，测试技术过程复杂且耗时较长，难以迎合大规模TTP筛查的需求，也不适用于急诊室病人紧急诊断、治疗的临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、分辨率高、准确性好的MALDI-TOF-MS检测血清中ADAMTS-13酶活性的底物、方法及试剂盒。

本发明第一方面提供一种体外定量测定ADAMTS-13酶活性的底物获得，包括PCR引物扩增蛋白重组。

应当说明的是，ADAMTS-13包含了1427个氨基酸残端，包括一个疏水的信号肽，一个前肽，一个金属蛋白酶区域，一个去整合素区域，一个凝血酶敏感蛋白重复基序区(TSP1)，一个富含半胱氨酸区域，一个间隔区以及两个CUB区。

研究表明，vWf功能区氨基酸序列中D1587-R1668由82个氨基酸残基构成的功能序列能够有效的被 ADAMTS-13酶切，且尚未有人报道。

vWF82 DNA片段的获得：以人脐静脉内皮细胞为质粒模板分别进行PCR扩增vWF82的DNA片段。设计引物序列如下：

正义链：

5_-cgggatccGACCACAGCTTCTTGGTCAGCC-3_，

反义链：

5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_.

两条引物分别引入BamHI和Hind m的酶切位点(小写英文字母部分)，并于C末端各插入一个6 X His Tag(下划线部分)。

本发明的第二方面提供一种采用前述底物的体外定量测定ADAMTS-13酶活性的非疾病的诊断和治疗的方法，具体如下：(1)ADAMTS-13酶切底物GST-vWF82-6XHis重组蛋白的表达纯化：(2)酶切反应；(3) ADAMTS-13酶切产物被金属螯合芯片富集以后被MALDI-TOF-MS识别检测，并由分析软件得到血清样本中 ADAMTS-13的酶切活性。

如图1所示：本技术在细菌BL21中大量表达带有6个组氨酸(6XHis)标记的vWF82蛋白片段，该片段带有ADAMTS-13特异性剪切位点。将纯化以后的蛋白片段跟病人血清孵育一段时间以后，带有6XHis的 ADAMTS-13酶切产物将被金属螯合蛋白芯片捕捉富集，进而被MALDI-TOF-MS仪器检测识别。跟正常人血清进行对比以后，可以计算出该病人的ADAMTS-13的酶切活性。

本发明第三方面提供一种前述底物的体外测定ADAMTS-13酶活性试剂盒，包括底物、内标物、稀释液、缓冲液、结合液、洗脱液、基质。

成分组成具体如下：

(1)、去离子水

(2)、反应缓冲液(5mM Tris-HCl，5mM NaCl，pH 7.5，containing 1mM BaCl2)

(3)、激活缓冲液(50mM nickel sulfate)

(4)、洗脱缓冲液(1XPBS，0.8M sodium chloride，with 0.1％Triton X-100)

(5)、平衡缓冲液(1mMHEPES，pH 7.0)

(6)、结合缓冲液(1XPBS)

(7)、基质(SPA：5mg/100μl ACN，100μl 1％TFA)

(8)、底物

(9)、内标多肽

(10)、PNP正常混合血浆浓度曲线(S1-S7)

采用上述技术方案后，本发明具有如下优点：

1、该检测方法迅速有效，检测精确。

2、检测所有血栓性微血管病(TMA)疑似病例，筛选出所有ADAMTS-13酶活性小于10％的病例，这些病人将作为血栓性血小板减少性紫癜(TTP)进行治疗。对于酶活性大于10％的病例将进行其他进一步的诊断，并开始完全不一样的治疗。

3、对于所有TTP病例在治疗过程中以及出院以后的长期监控中，都需定期检测ADAMTS-13的酶活性，从而更好的对病人进行正确的治疗，降低治疗成本，有效地提高病人的生存率以及生活质量。

附图说明

图1为本发明的步骤示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明公开了利用MALDI-TOF-MS检测血清中ADAMTS-13酶活性的方法，包括以下步骤：

包括以下步骤：

(1)ADAMTS-13酶切底物GST-vWF82-6XHis重组蛋白的表达纯化：

1.1.vWF的82个氨基酸片段D1587～R1668以及C末端6个组氨酸(6XHis)被插入到N端带有GST 蛋白的细菌表达载体pGEX6p-1上；

1.2.挑选阳性克隆，并转染BL21表达细菌；

所述BL21菌种可以高效表达目的重组蛋白，并且该蛋白是可溶性蛋白，易于纯化，同时GST标签容易被剪切。

1.3.大量培养细菌，收集菌体，利用超声进行细菌裂解，高速离心以后收集上清，并加入等体积PBS 缓冲液稀释；

1.4.通过GST亲和柱纯化蛋白，利用还原性谷胱甘肽进行洗脱，从而得到纯化的重组蛋白GST-vWF82-6XHis作为本技术需要用到的酶切底物；

1.5.取一定量的GST-vWF82-6XHis和切割蛋白酶Prescission Protease孵育，得到本技术在检测阶段需要用到的内参照(internal control，IC)；

(2)酶切反应：

需要用到以下试剂和仪器：一组血清标准物，混合正常人血浆(pooled normalplasma，PNP)被系列稀释成100％，50％，20％，10％，5％以及2.5％，用来稀释的溶液配方如下：150mM NaCl，0.1％BSA，1XPBS；

高低对照，将PNP稀释成50％以及5％分别作为高低对照；

反应缓冲液：50mM Tris-Cl pH8.0，1mM BaCl₂，50mM NaCl；

芯片激活缓冲液：50mM NiSO₄；

芯片结合缓冲液：1XPBS；

芯片洗脱缓冲液：1XPBS，300mM NaCl，0.1％Tween20；所述重生缓冲液可以有效的洗脱掉结合在金属螯合芯片上的蛋白多肽，并且不影响芯片的结合能力。

能量吸收物质(EAM)：SPA(5mg溶于200ul 50％ACN，200ul 0.5％TFA)。

金属螯合芯片重生缓冲液：50mM EDTA，50％ACN，0.5％TFA。

纯净水；

震荡仪器；

各种型号加液枪。

2.1将酶切底物GST-vWF82-6XHis用反应缓冲液稀释到0.1ug/ul，取10ul血清标准物，高低对照以及病人血清样本同25ul稀释后的底物溶液混合；

2.2在37度水浴锅孵育1小时以后，加热到95度终止反应。与此同时配置内参照，将内参照用PBS 稀释到0.01ug/ul；

(3)ADAMTS-13酶切产物被金属螯合芯片富集以后被MALDI-TOF-MS识别检测，并由分析软件得到血清样本中ADAMTS-13的酶切活性：

3.1金属螯合芯片激活，取需要的金属螯合芯片，加入100ul激活缓冲液，振荡孵育5分钟两次；

3.2纯净水洗芯片两次以后加入结合缓冲液，振荡孵育5分钟两次；

3.3吸去芯片上残留液体；

3.4混合35ul内参照到酶切反应体系，振荡混匀，取60ul加到芯片上，振荡孵育30分钟；

3.5洗脱缓冲液洗脱3次，每次5分钟，最后用水洗两次；

3.6取出芯片，小心吸干残留溶液，每个芯片点加1ulSPA，风干以后再点一次；

3.7送入MALDI-TOF-MS仪器进行芯片读取；

3.8软件分析目的峰以及内参照峰面积，以目的峰除以内参照峰面积的值作为X轴，以标准血清浓度为Y轴做一次曲线，根据病人的峰面积计算其酶切活性。

3.9用过的金属螯合芯片用重生缓冲液处理30分钟，然后用纯净水反复冲洗，晾干以后备用。

所述金属亲和吸附芯片金属螯合表面可以螯合正二价金属离子Ni，可以特异性的捕获带有组氨酸His 基团的蛋白质多肽。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种体外定量测定ADAMTS-13酶活性的底物获得，其特征在于：包括vWF82 DNA片段的获得，以人脐静脉内皮细胞为质粒模板分别进行PCR扩增vWF82的DNA片段。设计引物序列如下：

正义链：

5_-cgggatccGACCACAGCTTCTTGGTCAGCC-3_，

反义链：

5_-cggaattcTCAGTGATGGTGATGGTGATGTCGGGGGAGCGTCTCAAAGTCC-3_.

两条引物分别引入BamHI和Hind m的酶切位点(小写英文字母部分)，并于C末端各插入一个6X His Tag(下划线部分)。

2.一种采用根据权利要求1所述底物的体外测定量测定ADAMTS-13酶活性的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)ADAMTS-13酶切底物GST-vWF82-6XHis重组蛋白的表达纯化：

1.1.vWF的82个氨基酸片段D1587～R1668以及C末端6个组氨酸(6XHis)被插入到N端带有GST蛋白的细菌表达载体pGEX6p-1上；

1.2.挑选阳性克隆，并转染BL21表达细菌；

1.3.大量培养细菌，收集菌体，利用超声进行细菌裂解，高速离心以后收集上清，并加入等体积PBS缓冲液稀释；

1.4.通过GST亲和柱纯化蛋白，利用还原性谷胱甘肽进行洗脱，从而得到纯化的重组蛋白GST-vWF82-6XHis作为本技术需要用到的酶切底物；

1.5.取一定量的GST-vWF82-6XHis和切割蛋白酶Prescission Protease孵育，得到本技术在检测阶段需要用到的内参照；

(2)酶切反应：

需要用到以下试剂和仪器：

一组血清标准物，混合正常人血浆被系列稀释成100％，50％，20％，10％，5％以及2.5％，用来稀释的溶液配方如下：150mM NaCl，0.1％BSA，1XPBS；

高低对照，将PNP稀释成50％以及5％分别作为高低对照；

反应缓冲液：50mM Tris-Cl pH8.0，1mM BaCl₂，50mM NaCl；

芯片激活缓冲液：50mM NiSO₄；

芯片结合缓冲液：1XPBS；

芯片洗脱缓冲液：1XPBS，300mM NaCl，0.1％ Tween20；

能量吸收物质EAM：SPA(5mg溶于200ul 50％ACN，200ul 0.5％ TFA)；

金属螯合芯片重生缓冲液：50mM EDTA，50％ACN，0.5％ TFA；

纯净水；

震荡仪器；

各种型号加液枪；

2.1将酶切底物GST-vWF82-6XHis用反应缓冲液稀释到0.1ug/ul，取10ul血清标准物，高低对照以及病人血清样本同25ul稀释后的底物溶液混合；

2.2在37度水浴锅孵育1小时以后，加热到95度终止反应；与此同时配置内参照，将内参照用PBS稀释到0.01ug/ul；

(3)ADAMTS-13酶切产物被金属螯合芯片富集以后被MALDI-TOF-MS识别检测，并由分析软件得到血清样本中ADAMTS-13的酶切活性：

3.1金属螯合芯片激活，取需要的金属螯合芯片，加入100ul激活缓冲液，振荡孵育5分钟两次；

3.2纯净水洗芯片两次以后加入结合缓冲液，振荡孵育5分钟两次；

3.3吸去芯片上残留液体；

3.4混合35ul内参照到酶切反应体系，振荡混匀，取60ul加到芯片上，振荡孵育30分钟；

3.5洗脱缓冲液洗脱3次，每次5分钟，最后用水洗两次；

3.6取出芯片，小心吸干残留溶液，每个芯片点加1ulSPA，风干以后再点一次；

3.7送入MALDI-TOF-MS仪器进行芯片读取；

3.8软件分析目的峰以及内参照峰面积，以目的峰除以内参照峰面积的值作为X轴，以标准血清浓度为Y轴做一次曲线，根据病人的峰面积计算其酶切活性；

3.9用过的金属螯合芯片用重生缓冲液处理30分钟，然后用纯净水反复冲洗，晾干以后备用。

3.一种采用根据权利要求1所述的底物的体外测定量测定ADAMTS-13酶活性的试剂盒，其特征在于：包括以下底物、内标物、稀释液、缓冲液、结合液、洗脱液、基质。

成分组成具体如下：

(1)、去离子水

(2)、反应缓冲液(5mM Tris-HCl，5mM NaCl，pH 7.5，containing 1mM BaCl2)

(3)、激活缓冲液(50mM nickel sulfate)

(4)、洗脱缓冲液(1XPBS，0.8M sodium chloride，with 0.1％Triton X-100)

(5)、平衡缓冲液(1mMHEPES，pH 7.0)

(6)、结合缓冲液(1XPBS)

(7)、基质(SPA：5mg/100μl ACN，100μl 1％ TFA)

(8)、底物

(9)、内标多肽

(10)、PNP正常混合血浆浓度曲线(S1-S7)。

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