CN102533937A

CN102533937A - 一种检测adamts13酶活性的荧光底物及检测方法

Info

Publication number: CN102533937A
Application number: CN2012100244350A
Authority: CN
Inventors: 苏健; 白霞; 阮长耿
Original assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Suzhou University
Priority date: 2012-02-03
Filing date: 2012-02-03
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法。一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物，包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巯基结合有荧光素-5-马来酰亚胺。本发明所述荧光底物的Q1599C与N1611C修饰位点更为接近，同时所述荧光底物N端序列不含额外氨基酸GS，可更有效的被ADAMTS13所酶解。因此可提高检测ADAMTS13酶活性的灵敏度。本发明所述检测ADAMTS13酶活性的方法，操作简便，检测结果准确，灵敏度高，适用于各级医院、卫生部门和医学科研单位快速检测血浆中ADAMTS13酶活性。

Description

一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法。

背景技术

血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)是一类微血管血栓-出血综合症，主要是由于微循环中形成了血小板血栓，血小板数因大量消耗而减少所形成的紫癜。该病典型临床表现为五联征：发热、微血管病性溶血性贫血、血小板减少、中枢神经系统损害和肾脏受累。由于小动脉与微血管的栓死，导致器官缺血性功能障碍乃至梗死，对微循环依赖性强的器官(脑、肾等)也易出现症状。由于TTP起病急，患者一旦出现症状需要及时进行血浆置换，若患者未及时进行血浆置换或输注等有效的治疗，病死率可达90％以上，TTP缓解后复发率为30％～60％。

临床研究表明，在TTP的发病进程中，金属蛋白酶ADAMTS13与底物VWF因子扮演着极为重要的角色。VWF基因，Gene Bank ID：7450，位于第12对常染色体的短臂末端12p13.3，基因全长约180kb，有52个外显子和51个内含子。外显子大小差别很大，从40个碱基到1379个碱基(外显子28)。外显子28特别大，编码VWF中全部A1和A2同源区。VWF cDNA 5’区启动子前有250核苷酸的非翻译区，1-2289位碱基编码763个氨基酸的前-原肽，从2290碱基开始编码血浆中存在的成熟VWF。成熟VWF单体相对分子量为250×10³道尔顿，共包含有2050个氨基酸，在血浆中以多聚体的形式存在，是一个具有多功能域的大分子糖蛋白，具有高凝血活性。在VWF的A2区包含了金属蛋白酶ADAMTS13的酶切位点(Y1605-M1606)，在正常机体中，血浆中的ADAMTS13会将VWF多聚体裂解为粘附活性较低的小分子量多聚体，由于有ADAMTS13酶解VWF，从而使VWF分子大小处于动态的生理平衡状态。然而如果由于ADAMTS13酶基因的变异或存在针对抑制ADAMTS13酶活性的抗体，使机体内ADAMTS13活性出现先天性或获得性缺陷，ADAMTS13酶活性下降，导致超大分子量VWF的出现，而超大分子量VWF可在正常血流情况下网罗血小板，引起血小板自发性聚集，在全身微血管部位形成富含血小板血栓，VWF多聚体越大，网罗血小板的能力越强，形成血栓的能力也就越大，就会从而造成TTP的发生。因此快速检测ADAMTS13酶活性对于临床预防和治疗TTP起着极其重要的作用。

目前为止，已有多种检测ADAMTS13酶活性的方法，主要归结为两类：第一类为流体动态条件下的检测方法，如mini-vortex涡流所产生的高剪切率条件下的检测方法。第二类为静态条件下检测，包括：尿素或盐酸胍变性条件下酶解全长VWF底物检测方法；各种带GST或His尾巴的VWFA2区短肽作为底物检测方法，如GST-VWF115-His、GST-VWF73-His等；荧光标记VWF73检测方法等。其中荧光标记VWF73检测方法由于具有实时、快速、高通量的特点，已在欧美国家临床普及化。

目前已有两种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物，其原理各不同。一种是由日本人Kokame于2005年建立，基于不同荧光基团之间的供体-受体(donor-acceptor)法，另外一种是由美国人John Owen于2006年建立，基于相同荧光基团之间的自猝灭(self-quenching)法，但这两种方法都是基于VWF73片段。VWF73片段是Kokame等人发现的ADAMTS13酶在体外的最小底物片段，位于VWF的A2区域，包括D1596至R1668的73个氨基酸，VWF73片段具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

Kokame建立的供体-受体法荧光底物由化学合成，其修饰位点选为VWF蛋白的Q1599与N1611，其原理是在VWF蛋白Q1599位点引入一供体荧光基团Nma，在N1611位点引入一受体荧光基团Dnp，当一定波长激光照射该荧光底物时，在Q1599位供体荧光基团Nma所发射的荧光能量被临近的N1611位受体荧光基团Dnp所吸收。而当该荧光底物被ADAMTS13所酶解后，Q1599位供体荧光基团Nma所发射的荧光能量无法被临近的N1611位受体荧光基团Dnp所吸收，从而导致Q1599位供体荧光基团Nma所发射的荧光能量得以在检测仪器上测出。然而由于该法荧光底物是化学合成，成本高。同时由于该底物需类似DMSO之类的有机溶剂溶解，往往溶解不完全，从而影响检测结果的准确性。

John Owen建立的自猝灭法荧光底物是由原核细菌M15所表达，经后期纯化修饰后用于检测ADAMTS13酶活性。该法荧光底物修饰位点选为VWF蛋白的Q1599与P1612位，其原理是在Q1599位与P1612位均突变为半胱氨酸C，并在半胱氨酸自由巯基处通过马来酰亚胺(maleimide)共价结合荧光基团5-fluorescein，当一定波长激光照射该荧光底物时，Q1599位与P1612位荧光基团同时发射能量，但此发射能量又由于彼此位点的接近而被彼此所吸收，从而使此能量无法发射出来。而当该荧光底物被ADAMTS13酶酶解后，由于Q1599位与P1612位相互分离，从而使荧光基团发射的能量得以发射，ADAMTS13酶被检测出来。然而由于该法灵敏度较低，不适合于临床检测ADAMTS13酶活性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、准确性好的检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物，包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巯基结合有荧光基团。

现有技术中John Owen建立的自猝灭法缺点是该荧光底物的检测灵敏度低，导致的原因可能是由于该荧光底物所选择的修饰位点未在理想位置，从而导致两修饰位点距离偏远，同时又由于在该荧光底物N端过多的引入了额外的氨基酸序列组成，可能会导致酶切效率的降低。

本发明所述荧光底物选择将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列N末端第4位的谷氨酰胺和第15位天冬酰胺，即VWF73的Q1599与N1611位，分别突变为半胱氨酸，即Q1599C与N1611C，得到如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并在其N末端第4位和第15位的半胱氨酸，即Q1599C与N1611C，修饰有荧光基团。当一定波长激光照射该荧光底物时，Q1599C与N1611C位荧光基团同时发射能量，但此发射能量又由于彼此位点的接近而被彼此所吸收，从而使此能量无法发射出来。而当该荧光底物被ADAMTS13所酶解后，由于Q1599C与N1611C位相互分离，从而使荧光基团发射的能量得以发射，可被检测出来。

相邻两荧光基团之间能量转移检测的效率对于两相邻荧光基团的距离选择非常苛刻，其值的大小与两荧光基团距离的10⁶成反比。本发明所述荧光底物所选择的位点为VWF73的Q1599与N1611位点，两修饰位点比John Owen法选择的Q1599与P1612更为接近。同时本发明所述荧光底物N端序列不含Bam HI酶切位点序列所编码的额外氨基酸GS，可更有效的被ADAMTS13所酶解。因此可提高检测ADAMTS13酶活性的灵敏度。

荧光素染料的应用非常广泛，包括荧光显微镜，流式细胞技术和基于免疫荧光的分析等。本发明所述荧光底物其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巯基结合有荧光基团，激光照射时荧光底物中的荧光基团发射能量，用以荧光检测。其中，能够与半胱氨酸的自由巯基结合的荧光基团包括荧光素-5-马来酰亚胺(Fluorescein-5-maleimide)和5-吲哚乙酰氨基荧光素(5-IAF)。作为优选，本发明所述荧光底物所述荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。

本发明还提供了上述荧光底物的制备方法。

一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物的制备方法，为制备具有如SEQID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，然后用能与巯基结合的荧光基团修饰蛋白即得。

优选的，所述制备具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白的方法具体包括：

步骤1：制备编码VWF73的核苷酸序列，与T载体连接，获得重组T载体；

步骤2：双酶切步骤1所得的重组T载体，收集VWF73片段，与pQE30表达载体双酶切所得的大片段重组，获得pQE30-VWF73重组载体；

步骤3：将步骤2所得的pQE30-VWF73重组载体中的VWF73片段N端第4位和第15位的氨基酸定点突变为半胱氨酸，然后再删除pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端额外氨基酸序列GS，获得pQE30-VWF73突变重组载体；

步骤4：将获得的pQE30-VWF73突变重组载体转化宿主细胞，诱导蛋白表达，分离纯化表达的蛋白即得。

目前利用基因工程技术获得DNA分子的方法有很多种，包括利用限制性内切酶酶切具有编码所述VWF73的DNA分子的载体或以具有编码所述VWF73多肽的DNA分子的cDNA为模板PCR扩增。

在一个具体实施方案中，本发明所述制备具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白步骤1所述获取编码VWF73片段的核苷酸序列具体为用具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的下游引物扩增。

扩增所得的VWF73片段与T载体连接，获得重组T载体。然后利用工程技术，所酶切获得VWF73片段，与pQE30表达载体双酶切所得的大片段重组，获得pQE30-VWF73重组载体。

在一个具体实施方案中，本发明所述制备方法，步骤3所述点突变具体包括以下步骤：

A：以pQE30-VWF73重组载体为模板，用具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的下游引物扩增，甲基酶消化模板，获得pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端的第4位突变为半胱氨酸的质粒；

B：以pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端的第4位突变为半胱氨酸的质粒为模板，用具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列的下游引物扩增，甲基酶消化模板，获得pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端第4位和第15位突变为半胱氨酸的质粒；

C：以pQE30-VWF73重组载体中VWF73片段N端第4位和第15位突变为半胱氨酸的质粒为模板，用具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列的下游引物扩增，甲基酶消化模板，获得删除VWF73片段N端额外氨基酸序列GS的pQE30-VWF73-突变重组载体。

优选的，步骤2所述双酶切为Bam HI和HindIII双酶切。

本发明所述转化宿主细胞为大肠杆菌表达菌株，包括M15系列、Rosetta系列和BL21系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌M15菌株。

优选的，所述能与巯基结合的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。

优选的，本发明所述荧光底物的制备方法所述用能与巯基结合的荧光基团修饰蛋白为取具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，加入3倍摩尔量的磷酸三(β-氯乙基)酯和10倍摩尔量的荧光素-5-马来酰亚胺，4℃暗室反应过夜，之后装入透析袋，用pH7.5 20mmol/L Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇-20000浓缩蛋白即得。

本发明所述荧光底物的制备方法利用基因工程技术将VWF73的Q1599与N1611位突变为半胱氨酸，即Q1599C与N1611C，修饰位点更为接近，并在Q1599C与N1611C进行荧光基团修饰，同时所述荧光底物N端序列不含Bam HI酶切位点序列所编码的额外氨基酸GS，可更有效的被ADAMTS13所酶解。实验表明本发明荧光底物检测ADAMTS13酶活性的灵敏度比现有的John Owen的建立的荧光底物提高约两倍。因此本发明还提供了上述荧光底物在检测ADAMTS13酶活性中的应用。

本发明还提供了一种检测ADAMTS13酶活性的方法，为取待测血浆样品与过量的上述荧光底物在反应缓冲液中混合，然后在所述荧光底物所结合荧光基团相应的激发光波长和发射光波长下，检测反应体系的荧光强度，按照标准曲线法计算待测血浆样品中ADAMTS13酶活性。

本发明所述检测方法是利用两个相邻荧光基团能量转移检测待测血浆样品中ADAMTS13酶活性，用一定波长激光照射含有待测血浆样品和荧光底物时，如果血浆样品中ADAMTS13酶活性很低，无法酶解荧光底物，荧光底物Q1599C与N1611C位荧光基团同时发射能量，但此发射能量又由于彼此位点的接近而被彼此所吸收，从而使此能量无法发射出来。而当血浆样品中ADAMTS13酶活性很强时，荧光底物被ADAMTS13所酶解，其Q1599C与N1611C位相互分离，从而使荧光基团发射的能量得以发射，ADAMTS13酶活性被检测出来。

ADAMTS13酶在正常血浆中的浓度约为1μg/mL，其分子量约为200kD，即ADAMTS13酶在血浆中的摩尔浓度约为5nmol/L。为了保证检测结果的准确性，本发明所述检测ADAMTS13酶活性的方法中加入过量的荧光底物，以保证待测血浆样品中ADAMTS13酶充分反应。在具体实施方案中，所述荧光底物的用量为2.1μmol，远远大于ADAMTS13酶用量。

本发明所述检测ADAMTS13酶活性的方法，操作简便，检测结果准确，灵敏度高。

在一个具体实施方案中，本发明所述荧光底物所结合荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺，所述激发光波长为485nm，发射光波长为530nm。

优选的，所述反应缓冲液包括pH6.3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl2和0.005v/v％Tween20。

本发明所述检测方法计算待测血浆样品中ADAMTS13酶活性的方法为根据不同体积量正常血浆检测结果描绘出标准曲线，并计算不同体积量正常血浆酶解底物时的速率，即斜率，然后将不同体积量正常血浆不同的体积以及相应的斜率换算成对应的以10为底的对数，根据以上的对数描出曲线，得出标准对数曲线；根据待测血浆样品检测结果，计算出待测血浆样品酶解底物的速率，即斜率，并将该斜率进行对数化；以标准对数曲线为依据，将待测血浆样品对数化的斜率通过对数曲线进行计算，将所得结果为幂、10为底得出待测血浆样品中ADAMTS13酶活性。

本发明还提供了一种检测ADAMTS13酶的试剂盒，包括上述荧光底物。

优选的，本发明所述试剂盒还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括pH6.3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl₂和0.005v/v％Tween20。

本发明所述试剂盒稳定性好、保存期长，检测ADAMTS13酶活性结果准确性高、灵敏度高，便于推广使用，可应用于各级医院、卫生部门和医学生物科研单位快速检测血浆中ADAMTS13酶活性。

附图说明

图1示本发明所述检测ADAMTS13酶活性的荧光底物的结构示意图；

图2示本发明实施例3制备的质粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)的测序结果图；

图3示本发明实施例4pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)在大肠杆菌中表达所得蛋白以及纯化修饰后所得蛋白的Western Blot检测结果图，其中，泳道1为pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)未诱导产物，泳道2为pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)在大肠杆菌中诱导表达所得蛋白，泳道3为John Owen所建未修饰荧光底物，泳道4为pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)在大肠杆菌中诱导表达后纯化修饰的蛋白，泳道5为John Owen所建修饰后的荧光底物；

图4示本发明实施例5本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物和JohnOwen建立的荧光底物检测灵敏度比较图，其中1、2和3分别代表利用4、2、1μL正常枸橼酸钠抗凝混合血浆酶解本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物，4、5和6分别代表利用4、2、1uL正常枸橼酸钠抗凝混合血浆酶解JohnOwen建立的荧光底物，横坐标为时间min，纵坐标为相对荧光单位ΔRFU。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物及检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品和方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品和方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中质粒pSVHVWF1由美国华盛顿大学医学院Sadler JE教授惠赠，包含人VWF的全长cDNA序列；pQE30质粒购自Qiagen公司；pREP4质粒来自M15大肠杆菌；大肠杆菌DH5a、M15和TG1购自Qiagen公司。荧光素-5-马来酰亚胺购自加拿大TRC公司，磷酸三(β-氯乙基)酯购自Sigma公司，透析袋(MWCO：1000)购自美国Spectrum Laboratories公司，限制性内切酶Bam HI和Hind III为Fermentas公司产品，Hot-start Phusion，DpnI酶购自NEB公司，鼠源性Anti-His-Tag及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP-GAM-IgG)均购自Beckman-Coulter公司，质粒抽提试剂盒和Ni-NTA琼脂糖购自Qiagen公司，硝酸纤维素膜为PALL公司产品，ECL显影试剂盒购自上海普飞生物技术有限公司。

实施例1：VWF73片段的获得：

以质粒pSVHVWF1为模板，具有SEQ ID NO：3示的核苷酸序列的上游引物V73F和具有SEQ ID NO：4示的核苷酸序列的下游引物V73B进行PCR扩增。两条引物分别带有Bam HI和HindIII的酶切位点。

PCR扩增反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体系总量25μL。

PCR反应程序为：

94℃预变性 5min

72℃延伸 7min

将PCR扩增产物凝胶电泳回收，用Bam HI和Hind III双酶切，将酶切后的片段与经Bam HI和Hind III双酶切的pMD19T(simple)载体连接，转化大肠杆菌TG1，挑选阳性克隆，抽提质粒后进行酶切鉴定，选取符合目的片段大小的克隆测序。

实施例2：VWF73片段与表达载体pQE30的重组：

经Bam HI和Hind III双酶切，将VWF73目的基因片段从DNA测序正确的克隆载体中切下，应用T4DNA连接酶连接到已用相同酶酶切的表达载体pQE30中，转化宿主菌TG1，酶切鉴定重组子，命名为pQE30-VWF73。

实施例3：表达载体pQE30-VWF73的改造：

1、含Q1599C突变的质粒pQE30-VWF73(Q1599C)的制备

以鉴定正确的pQE30-VWF73质粒为模板，用具有SEQ ID NO：5示的核苷酸序列的上游引物Q1599CF和具有SEQ ID NO：6示的核苷酸序列的下游引物Q1599CB进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体系总量20μL。

PCR反应程序为：

98℃预变性 40s

72℃延伸 7min

PCR反应结束后，加入10U甲基化酶DpnI消化模板。取消化后PCR产物转化DH5a菌(含pREP4质粒)，抽提质粒，测序鉴定，从而获得含Q1599C突变的质粒pQE30-VWF73(Q1599C)。

2、含N1611C突变的质粒pQE30-VWF73(N1611C)的制备

以pQE30-VWF73(Q1599C)质粒为模板，用具有SEQ ID NO：7示的核苷酸序列的上游引物N1611CF和具有SEQ ID NO：8示的核苷酸序列的下游引物N1611CB进行PCR扩增，PCR扩增反应体系及反应程序同前。PCR反应结束后，加入10U甲基化酶DpnI消化模板。取消化后PCR产物转化DH5a菌(含pREP4质粒)，抽提质粒，测序鉴定，获得同时含Q1599C、N1611C的质粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C)。

3、删除BamHI位点的质粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)的制备

以质粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C)为模板，用具有SEQ ID NO：9示的核苷酸序列的上游引物BamF和具有SEQ ID NO：10示的核苷酸序列的下游引物BamB进行PCR扩增，PCR扩增反应体系及反应程序同前。PCR反应结束后，加入10U甲基化酶DpnI消化模板。取消化后PCR产物转化DH5a菌(含pREP4质粒)，抽提质粒，测序鉴定，获得删除Bam HI酶切位点序列所编码的额外氨基酸GS的质粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)。测序结果见图2。

实施例4：pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)在大肠杆菌中的表达、纯化与修饰

将经鉴定的表达质粒pQE30-VWF73(Q1599C、N1611C、Bam HI Del)转化感受态细菌M15。取单个pQE系列菌落接种于含有氨苄青霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中。37℃振荡培养，培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，IPTG诱导浓度为1mmol/L，37℃诱导表达4h。收集菌体加入SDS-PAGE上样还原loading buffer，煮沸后离心，取上清进行SDS-PAGE电泳，电转硝酸纤维素(NC)膜，以鼠源性Anti-His单抗为一抗，HRP-GAM-IgG为二抗，ECL放射自显影，WesternBlot鉴定目的蛋白表达，结果见图3。

对于符合理论大小的表达蛋白进行大量扩增表达，收集菌体加入超声缓冲液(2％甘油，1×Protease inhibitor Cocktail(EDTA-free)，20mmol/L Tris-HCl，PH8.0，0.15mol/L NaCl)，超声裂解细菌后离心，取上清上样于Ni-NTA琼脂糖柱，用含不同浓度咪唑缓冲液(PH 8.0)从低至高浓度淋洗，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，收集目的蛋白所在缓冲液。BCA法初步定量，加入3倍目的蛋白摩尔量的磷酸三(β-氯乙基)酯(TCEP)以及10倍目的蛋白摩尔量的荧光素-5-马来酰亚胺(Fluorescein-5-Maleimide)，4℃暗室反应过夜。装入透析袋，用20mmol/L Tris-HCl(PH 7.5)缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇-20000浓缩蛋白，得到荧光基团修饰的蛋白。取纯化修饰蛋白进行SDS-PAGE电泳，按上述步骤进行Western blot鉴定，结果见图3。同时以Ellman法鉴定纯化修饰蛋白是否存在自由巯基。

由图3结果可见，经IPTG诱导表达、Western Blot鉴定，只存在单一目的条带。表达的蛋白以可溶性形式存在于M15菌中。经过一系列的纯化修饰后，最终所获得的修饰后的蛋白在整个操作过程中未发生降解，为单一目的条带。同时Ellman法鉴定纯化修饰蛋白肽段未发现存在自由巯基，说明最终所获得的修饰肽段巯基修饰率可达到100％。

实施例5：本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物的灵敏度的检测

取本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物和John Owen建立的荧光底物，分别加入4、2或1μL的正常枸橼酸钠抗凝混合血浆，然后加入反应缓冲液。本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物和John Owen建立的荧光底物的用量均为2.1μmol。在激发波长485nm和发射光波长530nm条件下，每隔3分钟速率法检测ADAMTS13酶解本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物和JohnOwen建立的荧光底物情况，结果见图4。其中，反应缓冲液包括pH6.3的5mMBis-Tris、25mMCaCl₂和0.005v/v％Tween20。

由图4结果可见，以一系列稀释的正常枸橼酸钠抗凝混合血浆酶解本发明所述检测ADAMTS13酶的荧光底物和John Owen建立的荧光底物，两种底物对相同酶量酶解反应存在差异，经过酶解后，本发明所述荧光底物所释放的激光能量ΔRFU约为John Owen所建荧光底物的两倍，从而导致本发明所述荧光底物检测灵敏度至少比John Owen建立的荧光底物提高约两倍。

实施例6：血浆ADAMTS13酶活性的检测

取4份不同血浆样品，1号为遗传性TTP患者血浆，2～4号为非TTP患者血浆，各取每份血浆1μL，加入2.1μmol本发明所述荧光底物混合，然后加入反应缓冲液至100μL。在激发光波长485nm和发射光波长530nm条件下，检测反应体系的荧光强度，按照标准曲线法计算待测血浆中ADAMTS13酶活性；其中，所述反应缓冲液包括pH6.3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl₂和0.005v/v％Tween2。

检测方法为根据不同体积量正常血浆检测结果计算得出标准对数曲线；根据4份不同血浆样品荧光检测结果，每份血浆样品重复一次，计算出4份不同血浆样品酶解底物的速率，并将该速率进行对数化，然后以标准对数曲线为依据，将4份不同血浆样品对数化的斜率通过对数曲线进行计算，将所得结果为幂、10为底得出4份不同血浆样品相应斜率下所对应的标准血浆体积，每份不同血浆样品两次计算结果除以2得到平均值，即不同血浆样品中ADAMTS13酶活性，结果见表1。

表1待测血浆ADAMTS13酶活性的检测

待测血浆	1	2	3	4
					血浆ADAMTS13酶活性	3.56％	131.07％	93.97％	116.40％

由表1结果可见，本发明4份待测血浆样品的ADAMTS13酶活性分别为正常枸橼酸钠抗凝混合血浆的3.56％、131.07％、93.97％和116.40％，其中，1号血浆样品ADAMTS13酶活性明显低于正常枸橼酸钠抗凝混合血浆。表明本发明所述荧光底物可有效检测ADAMTS13活性，从而为临床实验诊断TTP提供有力的支持。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物，其特征在于，包括如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第4位和第15位的半胱氨酸的巯基结合有荧光基团。

2.根据权利要求1所述荧光底物，其特征在于，所述荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。

3.一种检测ADAMTS13酶活性的荧光底物的制备方法，其特征在于，制备具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，然后用能与巯基结合的荧光基团修饰蛋白即得。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述制备具有编码SEQID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白的方法具体包括：

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤1所述制备编码VWF73片段的核苷酸序列具体为用具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的下游引物扩增。

6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤3具体包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，步骤2所述双酶切为BamHI和Hind III双酶切。

8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤4所述宿主细胞为大肠杆菌M15菌株。

9.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述能与巯基结合的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。

10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述用能与巯基结合的荧光基团修饰蛋白为取具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，加入3倍摩尔量的磷酸三(β-氯乙基)酯和10倍摩尔量的荧光素-5-马来酰亚胺，4℃暗室反应过夜，之后装入透析袋，用pH7.520mmol/L Tris-HCl缓冲液透析过夜，然后用聚乙二醇-20000浓缩蛋白即得。

11.权利要求1所述荧光底物在检测ADAMTS13酶活性中的应用。

12.一种检测ADAMTS13酶活性的方法，其特征在于，取待测血浆样品与过量的权利要求1所述荧光底物在反应缓冲液中混合，然后在所述荧光底物所结合荧光基团相应的激发光波长和发射光波长下，检测反应体系的荧光强度，按照标准曲线法计算待测血浆样品中ADAMTS13酶活性。

13.根据权利要求12所述检测方法，其特征在于，所述荧光底物用量为2.1μmol。

14.根据权利要求12所述检测方法，其特征在于，所述荧光底物所结合荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺，所述激发光波长为485nm，发射光波长为530nm。

15.根据权利要求12所述检测方法，其特征在于，所述反应缓冲液包括pH6.3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl2和0.005v/v％Tween20。

16.一种检测ADAMTS13酶活性的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的荧光底物。

17.根据权利要求16所述试剂盒，其特征在于，还包括反应缓冲液，所述反应缓冲液包括pH6.3的5mM Bis-Tris、25mMCaCl₂和0.005v/v％Tween20。