CN101601378B - 高效快速的膀胱癌尿检试剂盒及尿液细胞活性保存液 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种“高效快速的膀胱癌尿检试剂盒及尿液细胞活性保存液”，属于生物医学领域。一种高效快速的膀胱癌尿检试剂盒，其包含有尿液细胞活性保存液与用于检测端粒酶活性的特异性荧光标记引物，使用本试剂盒能够对取自尿液的细胞进行端粒酶活性检测从而高效准确地检测出患者是否发生了与端粒酶活性相关的疾病，如膀胱癌，本试剂盒中的尿液保存液是一个关键的因素，由于早期癌症患者的端粒酶活性表达量较低，少量供试细胞难以检测出其中的酶活性，该尿液保存液能够使收集到的尿液细胞保存良好的活性，从而为收集足够多的活性细胞提供了充足的时间，这对于准确检测出早期膀胱及无创性监测膀胱癌的发生提供了一条确实可行的途径。

Description

高效快速的膀胱癌尿检试剂盒及尿液细胞活性保存液

技术领域

本发明涉及到生物医学领域，特别是涉及到一种高效快速的膀胱癌尿检试剂盒及尿液细胞活性保存液。

背景技术

尿样品中含有生理性代谢废弃物质包括含有机、无机类成分以及含微量元素的电解质成分，一些尿液中会含有蛋白类及糖类物质，属于病理性代谢产物；由于尿液排出前会经过一系列组织如膀胱，因此尿液中还会含有少量的组织脱落细胞，鉴于尿液与人体代谢的密切关系，因此用于很多分析实验或临床检测。然而也正是由于尿样中丰富的成分，使细菌能够快速地繁殖于其中，当尿样不能及时进入检测程序时，细菌与其中的一些成分会使尿液中反映病理状况的成分失活或者变态，导致后续检测结果不能准确反映患者的生理状况。

目前监测早期恶性肿瘤的检测化验大多还需有创伤地取待检器官的活组织或细胞，随着癌症等恶性疾病高频发生，人们的健康危机意识明显提高，越来越多的人按期体检、提前预症，希望能清楚自己的身体状况，找安心的同时也能早发现早治疗，但有创性检测为癌症早期监测带来了障碍，幸运的是，近年来人们对于端粒酶活性与癌症发生发展关系的研究成果证明，端粒酶活性与大多数癌症的发生有密切关系。如2007年，许宁等的《膀胱癌组织端粒酶活性表达及其与临床病理特征关系的研究》报道：“实验组中端粒酶活性表达率为96％，对照组无表达，实验组端粒酶活性高于对照组(P＜0.001)；端粒酶活性临床病理分期T2高于T1、T3高于T2(P＜001)，晚期组高于早期组(P＜0.001)；端粒酶活性病理分级G2高于G1、G3高于G2(P＜0.01)。结论是：端粒酶活性高表达并与膀胱癌临床病理分期、病理分级呈正相关，端粒酶激活可能在膀胱癌的发生及发展过程中起重要作用，端粒酶可作为膀胱癌早期诊断及判定预后的分子生物学标记”，如2004年，范德厚等人(范德厚[1]陈仕平[2]，尿液端粒酶活性检测对膀胱癌的诊断价值《福建医科大学学报》2004年第38卷第2期)，研究结果显示：72例膀胱癌患者尿液中66例检出端粒酶，活性阳性率为91.5％(P＜0.01，X^2＝17.17)；因此尿液脱落细胞中的端粒酶活性检测就是一种无创性检测手段，尿液细胞中超过正常水平的端粒酶活性表示可能发生了与端粒酶活性相关疾病，如膀胱癌，检测结果可提醒患者尽早进行更为可靠的鉴别诊断，从而赢得治疗时机，同时对于已确诊的病人的临床治疗效果定期随访也是一种方便可行的检测手段，即无论对于排除性检测还是跟踪检测，对尿液的端粒酶活性检测这种无创检测方式都易于被接受，成本低而且无心理负担，这对于预防膀胱癌，提高膀胱癌存活率的关键一环，膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国占男性恶性肿瘤的第七位，死亡率在男性居肺、肝、胃、食管、结直肠、血病、鼻咽癌之后，居第八位，女性居第10位，发病率约为7.4/10万；膀胱癌早期诊治的五年存活率为93％，但若不能及时发现确诊治疗，晚期病人的五年存活率仅为6％，死亡率远远大于恶性度高于膀胱癌的其它肿瘤。膀胱癌的一个显著临床特点是容易复发，术后五年内的复发率高达70％，且有10％-20％发展为浸润性膀胱癌，因此，定期随访并早期发现复发在膀胱癌的治疗中占有重要地位。

膀胱癌预测依赖的尿样品，保存尿液中细胞活性是获得可靠数据的关键。由于尿液中脱落细胞浓度非常低，而端粒酶由三个亚基组成：一个RNA组分(hTR)可作为DNA复制的模板；一个功能未知的端粒末端转移酶关联蛋白(TP1)；一个具催化活性的端粒末端转移酶反转录酶(hTERT)。其中RNA组分和反转录酶组分就极不稳定，特别是早期癌变细胞的端粒酶活性表达量非常低，稍微存放，就容易被尿液中的其他成分和繁殖的细菌破坏失活或者降解，最终导致检测的假阴性或检测值偏低，因此急需一种保存液能保持尿液中的物质不发生结构和功能的变化，特别是其中的端粒酶活性，这对于无创性、准确监测膀胱癌早期发生或病情发展有极大的促进作用。目前未见到有效的类似保存液。

检测端粒酶活性的方法是目前医学生物学研究的热点，并报道了很多高特异性高灵敏度的检测方式，特别是传统的端粒扩增法(TRAP)与实时定量PCR结合的检测方法，如专利号为200380107388.5，名称为“检测端粒酶活性的方法和组合物”的专利申请。结合添加内标的方式如专利号为00111629.0，名称为“端粒酶活性的定量测定方法”的专利申请，其技术方案中提供了非常理想的引物、内参引物及内标模板，能够很好地避免假阴性结果和引物二聚体引起的非特异性扩增等缺陷，由于当时还没有发展荧光定量PCR技术，因此，无法精确定量检测底物，而结合现代的PCR荧光技术，将能够灵敏特异地检测定量细胞中的端粒酶活性。

发明内容

本发明针对上述领域的缺陷及需求提供一种高效快速的膀胱癌尿检试剂盒及尿液细胞活性保存液，该试剂盒包括尿液细胞活性保存液，同时，结合传统的端粒扩展法与实时定量PCR的原理检测尿液中端粒酶的活性，可准确地、无创性地监测膀胱癌早期的发生或后期的发展。该试剂盒中的尿液细胞活性保存液可保证待测尿液中膀胱脱落细胞中端粒酶活性稳定，并收集到足够多的活性细胞以保证获得准确的检测数据。

一种尿液细胞活性保存液，包含下列含量的组分：每毫升保存液中0.02ng～0.4ng表皮生长因子、0.08～0.17ng糖类物质、0.00085～0.0018μmol磷酸根、0.8×10^-4～1.67×10^-4μmol氯化钙、0.45×10^-4～0.92×10^-4μmol氯化镁；占保存液总重量0.01％-25％的白蛋白和0.1％-50％的二甲基亚飒，PH7.2-7.4，溶剂为双蒸水。

所述保存液，包含有下列含量的组分：每毫升保存液中含0.08ng表皮生长因子，0.1～0.2mg 1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲液；占保存液总重量0.5％的白蛋白和3％的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水；所述1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲液的配方为：磷酸二氢钾1.47mM和磷酸氢二钠8.06mM，氯化钙0.901mM，氯化镁0.493mM，氯化钾2.67mM，氯化钠137.93mM，D-葡萄糖5.1mM，pH7.2～7.4。

所述1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲液的加入量为每毫升保存液中含0.18mg.

所述自蛋白指牛血清白蛋白。

所述的尿液保存液在保存待测端粒酶活性的细胞中的应用。

一种高效快速的膀胱癌尿检试剂盒，其特征在于包含所述的尿液细胞活性保存液和如下引物序列：

延伸引物FP：5’FAM-ATTGCCAATCCGTCGAGCAGAGTT-DABSYL，

反向引物RP：5’GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC，

内标对照引物CP：5’ROX-ATCGCTTCTCGGCCTTT-DABSYL，

内标序列ITC：5’AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT；

所述延伸引物FP的5’端偶联有荧光基团FAM，3’端偶联有卒灭基团DABSYL

所述对照引物CP的5’端偶联有荧光基团ROX，3’端偶联有卒灭基团DABSYL。

所述的试剂盒，还包括如下试剂：核苷三磷酸，Taq聚合酶，与Taq聚合酶配套使用的缓冲液，双蒸水，阳性对照标准品。

所述阳性对照标准品指293细胞提取物。

所述试剂指：10X Taq聚合酶缓冲液，50X dNTP Mix，FP 100ng/ul，RP 100ng/ul，CP 100ng/ul，ICT 0.01amol/ul，Taq聚合酶2 Units/ul，双蒸水，阳性对照标准品250cells/ul。

本发明提供的尿液细胞活性保存液，主要作用在于收集早期膀胱癌患者的尿液中的膀胱脱落细胞，由于早期癌细胞在端粒酶活性表达量非常低，一次尿液以及普通条件下保存的尿液很难保证检测出其中仅存的少量端粒酶活性，为了给膀胱癌检测提供性质稳定，足量的检测底物，本发明提供了本保存液，其含有表皮生长因子，磷酸根，糖类物质，氯化钙、氯化镁、白蛋白和二甲基亚飒等成分。

本该保存液中表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种小肽，由53个氨基酸残基组成，是类EGF大家族的一个成员，是一种多功能的生长因子，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用，有研究发现表皮生长因子EGF是一种刺激皮肤癌形成的蛋白质，端粒酶是一种与癌症发生正相关的复合大分子，因此推测EGF对于刺激端粒酶活性和维持端粒酶活性方面起作用。

二甲基亚飒，是一种表面活性物质，能够很快透过细胞膜，将溶于其中的化学物质代入细胞深部提高各种成分的作用。选自常用的市售产品，关于浓度，二甲基亚飒浓度低于0.1％(W/W)将起不到表面活性的作用，导致细胞保存能力降低；相反，如果浓度超过保存液总量的50％(w/w)，则作用不再改变，从性价比的角度考虑，二甲基亚飒的浓度确定为3％(w/w)。

白蛋白是由动物肝实质细胞合成，在血浆中含量最多的蛋白，是含有585个氨基酸残基的单链多肽，具有维持血浆胶体渗透压的作用，并与小分子有机物和无机离子非专一性地结合，作为这些物质的运输载体，白蛋白的减少会引起很多物质的代谢失衡，在本发明中，起着维持尿液细胞生理活性和提供细胞代谢所需营养的作用；本发明中的白蛋白优选采用牛血清白蛋白BSA，BSA易于获得，经济实用。也可以使用任何种类的纯度相当于片段V的精制白蛋白。关于保存液中白蛋白的浓度，低于0.001％(W/W)的白蛋白无效，而且如果白蛋白浓度超过25％(w/w)，其作用不再改变。因此，考虑经济效率和操作性质，优选0.5％(w/w)的白蛋白性价比最高。

钙、镁离子在维持细胞膜渗透平衡、维持蛋白构象与活性方面起着重要作用，使冻存的细胞从低温复原时细胞膜迅速恢复活性从而提高细胞存活率(有效细胞率)。

糖成分能够防止细胞在冻融过程中临界温度附件产生冰晶，冰晶会破坏细胞内细胞器、大分子物质发生不可逆转的结构性改变，细胞内稍高含量的糖成分能够避免冰晶的产生，从而具有使保存的细胞复原时提高活细胞率(有效细胞率)的功能。

本保存液采用Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水提供磷酸根、糖类物质、氯化钾、氯化钠、氯化钙、氯化镁等成分，该缓冲液中还含有有利于细胞生理活性的钠盐、钾盐等物质，是目前采用的细胞保存液，可直接购买，简化了配制程序。其配比为：磷酸二氢钾PotassiumPhosphate monobasic(KH2PO4)，1.47mM和磷酸氢二钠Sodium Phosphate dibasic(Na2HPO4-7H2O)，8.06mM，氯化钙Calcium Chloride(CaCl2)，0.901mM，氯化镁Magnesium Chloride(MgCl2-6H2O)，0.493mM，氯化钾Potassium Chloride(KCl)，2.67mM，氯化钠Sodium Chloride(NaCI)，137.93mM，D-葡萄糖D-Glucose，5.1mM，PH 7.2～7.4。

本发明的保存液用于保存尿样品，使其中的细胞端粒酶活性保存良好，从实验数据可以看出使用本发明尿液细胞活性保存液的尿样本在-75℃储存条件下端粒酶活性保持至少一年没有明显降解(one way ANOVA，p＞0.5)，而直接使用1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲保存的尿液样本保存至3个月时，已出现显著的端粒酶活性下降，6个月时已降至几乎为零(one way ANOVA，p＜0.0001)如图1所示。

本发明获得的尿液细胞活性保存液目的在于使尿液中的膀胱脱落细胞中端粒酶活性得以稳定保存，但不限于保存尿液中的细胞，其他用来做端粒酶活性检测的细胞一样可以采用本保存液进行保存待检测。所述的尿液细胞活性保存液在保存待测端粒酶活性的细胞中的应用。

本发明的一个很主要目的在于还提供一种膀胱癌尿检试剂盒。该试剂盒包含上述尿液细胞活性保存液，能够无创地采集到疑似早期膀胱癌患者的尿液细胞，并积攒到足够多，由于保存液的作用，积攒过程中细胞内含物不易变性，然后用于后续检测实验，能准确检测到细胞中少量存在的端粒酶活性。由于本试剂盒主要通过检测尿液细胞端粒酶活性来监测早期膀胱癌的发生，因此其中还包含检测端粒酶活性所需的引物；本发明的试剂盒检测端粒酶活性的方法采用前人发表过的传统的端粒扩展法(TRAP)，如专利申请号00111629.0中的检测方法，并结合了荧光定量pcr的方法；引物设计上略作改动，在延伸引物FP的5’端加上一个发夹结构并偶联了荧光团，3’端偶联DABSYL淬灭团(4-二甲胺-偶氮苯磺酸)，反应前发卡结构使荧光基团与淬灭团非常靠近，因此不发光，当该引物参与PCR反应生成双链PGR反应物时，发夹展开使两个基团远离，于是荧光团不再受淬灭团的控制而发出荧光。内标引物CP偶联了与延伸引物发不同光色的荧光团，内标荧光的应用可以提示人们检测结果是否存在假阴性可能，内标模板还可与延伸引物严格配对，因此能竞争性地抑制非特异性反应，因此本试剂盒中的荧光定量pcr反应的敏感性和特异性非常高，能够精确定量待测样品中的端粒酶活性状况，如图3所示。本发明的试剂盒的PCR检测原理如图2所示。

为了提供更为高效、实用的试剂盒，本发明优选在试剂盒中加入pcr反应所需的试剂：核苷三磷酸、Taq聚合酶，与Taq聚合酶缓冲液，双蒸水，阳性对照标准品等成分，并经过多次试验得出特异性敏感性的最佳的pcr反应体系和程序。

本发明的试剂盒的检测试验步骤如下：

(1)取晨首次尿液，按尿液∶保存液为100∶1的比例第一次加入尿液细胞活性保存液，室温下2000g，离心30min沉淀尿样细胞；弃清液，然后加入尿液细胞活性保存液重悬尿样细胞，加入量为第一次加入量的10倍，进入下一检测或者-75℃贮存；

(2)将上一步得到的尿样于4℃8000g离心5min，尽量弃上清；

(3)在RNA酶抑制剂为100-200units/mL的常规细胞裂解液中裂解细胞；

(4)在一个PCR管中，加入上步获得的细胞裂解液或阳性对照标准品2μL，和如下成份：10XTaq聚合酶缓冲液5.0μL，50X dNTP Mix^＊1.0μL，FP 100ng，RP 100ng，CP，100ng，ICT 0.01amol，Taq聚合酶2Units，添加dH₂O至50μL，混匀PCR程序：30℃，30分钟；94℃/30秒，59℃/30秒，and 72℃/1分钟，30-33个循环。

(5)PCR产物进行光度测量，荧光激发光/压制光波长设定：

fluorescein：495nm/516nm，sulforhodamine：600nm/620nm。

综上所述：使用本试剂盒能够对取自尿液的细胞进行端粒酶活性检测从而高效准确地检测出患者是否发生了与端粒酶活性相关的疾病，如膀胱癌，本试剂盒中的尿液保存液是一个关键的因素，由于早期癌症患者的端粒酶活性表达量较低，少量供试细胞难以检测出其中的酶活性，该尿液保存液能够使收集到的尿液细胞保存良好的活性，从而为收集足够多的活性细胞提供了充足的时间，这对于准确检测出早期膀胱癌症患者非常有意义，同时该试剂盒及其尿液保存液为无创性监测膀胱癌的发生提供了一条确实可行的途径。

附图说明

图1：尿液细胞活性保存液与对照普通磷酸缓冲液保存的尿样中端粒酶活性比较纵坐标为端粒酶浓度，横坐标表示尿液的保存时间，黑色柱代表使用尿液细胞活性保存液的样品，黑白方格代表对照。

图2.端粒酶活性检测原理

虚线框外横线表示30摄氏度条件下端粒酶延伸产物。

虚线框内表示端粒酶活性的实时定量PCR反应系统，第一条以端粒酶延伸产物为模板的扩增用于定量端粒酶活性，第二条为内标ITC以CP为引物的扩增，用于监测实时定量pcr的有效性，第三条，显示内标参与竞争实时定量PCR的引物FP，因此能够抑制非特异性扩增。

图3.群体样品端粒酶活性检测的ROC曲线。

横坐标表示特异性，即假阳性率；纵坐标表示敏感度，即真阳性率。

图4.重点荧光值与阳性细胞数相关标准曲线。

纵坐标：ΔFAM/ΔROX的比率来表示重点荧光值，ΔFAM是在FAM反应管测出的重点荧光值减去相应的阳性对照值；ΔROX是在ROX反应管测出的荧光值减去无Taq酶的阴性对照值。横坐标为细胞活性细胞数

图5.重点荧光值与酶活性单位相关标准曲线。

纵坐标：同图5，横坐标表示相应活性细胞数对于的酶活性。

图6.聚丙烯酰胺凝胶电泳验证分析部分结果。

1-7泳道从左至右依次为：1.阳性对照293细胞(1000个)提取液2.引物二聚体/PCR污染对照。3.阳性对照293细胞(50个)提取液。4.阳性对照293细胞(125个)提取液

5.阳性对照293细胞(250个)提取液。

6.阳性对照293细胞(500个)提取液。

7.DNA marker。

具体实施方式

实施例1.配制尿液细胞活性保存液及应用试验

步骤1：配制保存液，按表1所列成分，溶剂为双蒸水，PH7.2-7.4。

获得的保存液命名为：Cellock液。

表1

成分	配比	成分来源
			表皮生长因子	0.08ng/mL	市售，Sigma/E9644
BSA白蛋白	0.5％(w/w)	市售
			二甲基亚飒	3％(w/w)	市售
Dulbecco氏磷酸盐缓冲液(DPBS)	0.18mg/mL	商购于Sigma，pH7.2-7.4，包括磷酸二氢钾Potassium Phosphate monobasic(KH2PO4)，1.47mM和磷酸氢二钠SodiumPhosphate dibasic(Na2HPO4-7H2O)，8.06mM，氯化钙Calcium Chloride(CaCl2)，0.901mM，氯化镁Magnesium Chloride(MgCl2-6H2O)，0.493mM，氯化钾Potassium Chloride(KCl)，2.67mM，氯化钠Sodium Chloride(NaCl)，137.93mM，D-葡萄糖D-Glucose，5.1mM。

步骤.2尿样细胞处理，

2.1每个病例取晨首次尿200mL于尿杯中，

10例为实验组，每个尿样中立即加入2mLCellock；在室温下2000g离心30min沉淀尿样细胞，弃掉上清液，将实验组沉淀的尿样细胞重悬于10ml Cellock液中，将每例细胞混合液分成5份，每份2mL转至2.5mL的冷冻管中。各留取一管样品立即进行端粒酶活性测量，其余的4管置于-75℃储存。冻存的样品每三个月各取出一管将细胞解冻后进行端粒酶活性检测。

另外10例为对照组，每个尿样中立即加入1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水2mL。都在室温下2000g离心30min沉淀尿样细胞，弃掉上清液，将沉淀的尿样细胞重悬于10ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水液中，将每例细胞混合液分成5份，每份2mL转至2.5mL的冷冻管中。各留取一管样品立即进行端粒酶活性测量，其余的每例4管置于-75℃储存。冻存的样品每三个月各取出一管将细胞解冻后进行端粒酶活性检测。

2.2待检尿样放入4℃8000g离心5min，尽量弃上清，立即重悬细胞于20μL的1X细胞裂解液中。在1X细胞裂解液中加入RNA酶抑制剂，使其终浓度达100-200units/mL。1X细胞裂解液配方：10mM Tris-HCl，pH 7.5；1mM MgCl₂(氯化镁)；1mM EGTA(乙二醇双四乙酸)；0.1mM Benzamidine(苯甲脒)；5mMβ-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)；0.5％CHAPS；10％Glycerol(丙三醇)

2.3使用本发明实施例2中的试剂盒检测端粒术端转移酶的活性，以任意酶浓度(AEU)作为单位。结果证明，使用本发明尿液细胞保存液的样本在-75℃储存

条件下端粒酶活性保持至少一年没有明显降解(one way ANOVA，p＞0.5)，而使用一般PBS的尿液样本保存至3个月时，已出现显著的端粒酶活性下降，6个月时已降至几乎为零(one way ANOVA，p＜0.0001)，见图1。

实施例2组配试剂盒

所用试剂Taq聚合酶及10XTaq聚合酶缓冲液、50X dNTP Mix^＊、trypsin-versene(EDTA)以及配置PBS缓冲液的化学药品都在市场上可买到。

表2

试剂盒成份：
	1.Cellock液(由实施例1获得)
2.反应混合液FP引物100ng/μLRP引物100ng/μLCP引物100ng/μLICT模板0.01amol/μL50X dNTP Mix＊Taq聚合酶2Units/μL10XTaq聚合酶缓冲液PCR级别水
	3.阳性对照标准品：250cells/μL

1.引物序列如下，由生物公司合成：

FP：5’[FAM]ATTGCCAATCCGTCGAGCAGAGTT[-DABSYL]

RP：5’GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC

CP：5’[ROX]ATCGCTTCTCGGCCTTT[-DABSYL]

ITC：5’AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT

2.PCR级别水：去离子水，无蛋白酶、无DNA酶和RNA酶污染。

3.Taq聚合酶及10XTaq聚合酶缓冲液、50X dNTP Mix^＊为普通PCR反应中所用，在市场上可以购买到。

4.阳性标准品：制备293细胞提取物作为阳性标准品对照。

将293细胞在常规标准条件下使用培养至单层铺满培养皿的80-90％时，弃去培养液，用PBS洗盘后加入室温状态的细胞消化液trypsin-versene(EDTA)(5mL)孵育3.5分钟使细胞浮起，收集全部细胞混悬液立即加入5mL293细胞培养液中和消化液的作用，离心(2000g离心30min)、然后用PBS洗涤沉淀，细胞重悬于1ml PBS中，倒置显微镜下进行293细胞计数，并用加入适量PBS将细胞数调至每微升250个细胞的浓度。

PBS缓冲液配方：137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO4_，1.8mM KH₂PO₄，pH＝7.4，4℃或室温保存。

293细胞培养液为DMEM(Dubelco’s Modified Eagles Medium)加10％胎牛血清(FBS)细胞培养液，4℃保存，使用前平衡至室温。

实施例3.本发明试剂盒使用方法

步骤1模板制备；

(1)分别取10个病理的晨首次尿液200mL，按尿液∶保存液为100∶1的比例第一次分别加入Cellock液2ml，室温下2000g，离心30min沉淀尿样细胞；弃清液，然后加入10ml，Cellock液重悬尿样细胞，重悬液进入下一步骤的检测或者-75℃贮存；

(2)取上一步得到的尿样细胞悬液2ml于4℃8000g离心5min，尽量弃上清；

(3)加入20ul 1X细胞裂解液(配方同实施例1中2.2)，分别获得10个病例的尿细胞样本。

步骤2.检测过程设计

检测10个(n)样品，那么每次检测将包括24个PCR反应(2n+4)。

试管1-20：10个PCR反应管中的模板为步骤1获得的待测尿细胞样本；

10个PCR反应管中的模板为以步骤1获得的待测尿细胞样本被加热

灭活后的产物

试管21：模板为阳性对照标准品

试管22：不加任何模板的阴性对照。

试管23：无Taq酶的阴性对照

试管24：引物二聚体/PCR污染对照。

步骤3.试样准备

(1)在一个2.5ml的无菌管中制备25个PCR反应混合液，每个PCR反应的成分如下：

10X Taq聚合酶缓冲液5.0μL

50X dNTP Mix^＊1.0μL

FP引物1.0μL(100ng)

RP引物1.0μL(100ng)

CP引物1.0μL(100ng)

ICT模板1.0μL(0.01amol)

Taq聚合酶1.0μL(2Units)

dH2O 37μL

(2)在2n+4个PCR管(无RNase)中，每管分装48μL“反应混合液”。

(3)在第1-10个PCR管(无RNase)中，每管加2μL步骤1获得的待测尿液细胞裂解液。

(4)阴性热灭活对照：取每一个样品的待测尿液细胞裂解液4-5μL，于85℃孵育10分钟制备成热灭活阴性对照液模板。分别加入2μL到第11-20μL管中，作为热灭活对照管。

(5)第21管：加入2μL阳性对照标准品，第22管不加任何模板，补加2μLdH₂O，第23管不加Taq酶。

(6)第24管，加入2μL1X细胞裂解液。

步骤4.PCR扩增

(1)将PCR管放入PCR仪中，30℃孵育30分钟。

(2)进行3步PCR，94℃/30秒，59℃/30秒，and 72℃/1分钟，30-33个循环。

步骤5.Spectrofluorometer荧光测量及电泳验证

(1)每个样本取20ul的反应混合液，用Tris缓冲液稀释到600uL，移入光度测量管中待测。

Tris缓冲液组成：10mM Tris-HCl pH7.4，0.15M NaCl，2mM MgCl₂。

荧光激发光/压制光波长设定：

fluorescein-495nm/516nm，

sulforhodamine-600nm/620nm

测定的数值在标准曲线上读取相应的细胞数和酶活性。

(2).聚丙烯酰胺凝胶电泳及数据分析

在每个反应管中加入5μL loading dye(在50％的丙三醇/50mM EDTA中，含0.25％溴酚蓝和二甲苯蓝)。加样25μL于10％或12.5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶(无尿素)上，使用0.5XTBE缓冲液进行电泳。要注意防止临近孔道样品的污染，这可能会产生假阳性结果。

电泳时间：10-12cm的竖直胶使用400伏电压需1.5小时或当二甲苯蓝跑至胶的70-75％长度时，停止电泳。最小的端粒末端转移酶产物带应为60bp，内参带为42bp。

(3)电泳完成后，采用EtBr或

Green按厂商说明书对胶进行染色。如果使用EtBr，将10mg/ml的储存液按1∶10,000比例，用去离子水稀释。室温下，染色30分钟，再使用去离子水脱色20-30分钟。

如图6所示，泳道1，3，4，6，均可扩增出大小一致的条带，且其大小约为40多bp，这符合我们实验方案中内参带的大小，这可以证明扩增体系没有问题，应可以确定阳性标准细胞是具备端粒酶活性的，并且，整个试验的操作过程(包括裂解、扩增、电泳等)是没有问题的。

步骤6：标准曲线的制作

预备6个PCR管，第一管加入阴性对照液，其余5个管则分别加入稀释成不同细胞数的阳性标准品，适用本发明的试剂盒测试，求出荧光值与细胞数相对应的标准曲线。

具体地，使用本发明实施例2中的阳性标准品，依次吸取2uL(含500个细胞)、5uL(含1250个细胞)、10uL(含2500个细胞)、20uL(含5000个细胞)和40uL(含10000个细胞)，分别立即重悬细胞于2mLDPBS中，于4℃8000g离心5min，尽量弃上清；加入20ul 1X细胞裂解液(配方同实施例1中2.2)，分别获得5个混合均匀的293细胞裂解液样本。各取2uL依次加入到反应管中，那么每管的293细胞浓度依次为50、125、250、500和1000个参与了的反应。按照步骤3的程序进行反应，获得终点荧光数据是以ΔFAM/ΔROX的比率来表示。ΔFAM是在FAM反应管测出的重点荧光值减去相应的阳性对照值(步骤2中第22管)；ΔROX是在ROX反应管测出的荧光值减去无Taq酶的阴性对照值(步骤2中第23管)。本试验所做出的重点荧光值与阳性细胞数相关标准曲线如图4表示：

我们设定250个293细胞(即1uL的293阳性标准液)为100AEU(平均酶单位)，根据上述标准曲线就可以换算出重点荧光值与AEU的换算标准曲线，如下图5所示

实施例4.本发明试剂盒临床应用

选取了200例尿样，其中79例为健康人的尿样，取自正常体检人员；121例膀胱癌病人尿样取自经病理证实且未经治疗的病人。尿样用本发明的试剂盒检测端粒末端转移酶的活性，以平均酶浓度(AEU)作为单位。最精确的截断值是分别在全体水平和单独对男性和女性亚组水平通过接收器工作(ROC)曲线计算获得的。在ROC曲线中，真阳性率(敏感度)对应假阳性率(1-特异性)进行作图，敏感度，特异性以及相对95％的置信区间均按照截断值判别式进行计算.

使用本发明的试剂盒对端粒末端转移酶活性检测诊断膀胱癌的准确性。通过ROG曲线进行分析，见图3，特异性的范围为72％-92％，敏感度的范围93％-75％。

附录：

SEQUENCE LISTING

<110>同昕生物技术(北京)有限公司

<120>高效快速的膀胱癌尿检试剂盒及尿液细胞活性保存液

<130>P09327/txs

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>延伸引物FP

<400>1

attgccaatc cgtcgagcag agtt                    24

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>反向引物rp

<400>2

gcgcggctta cccttaccct taccctaacc              30

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>内标对照引物CP

<400>3

atcgcttctc ggccttt                            17

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>内标序列ITC

<400>4

aatccgtcga gcagagttaa aaggccgaga agcgat       36

Claims (9)

1.一种尿液细胞活性保存液，包含下列含量的组分：每毫升保存液中0.02ng～0.4ng表皮生长因子、0.08～0.17ng糖类物质、0.00085～0.0018μmol磷酸根、0.8×10^-4～1.67×10^-4μmol氯化钙、0.45×10^-4～0.92×10^-4μmol氯化镁；占保存液总重量0.01％-25％的白蛋白和0.1％-50％的二甲基亚飒，pH7.2-7.4，溶剂为双蒸水。

2.根据权利要求1所述的尿液细胞活性保存液，包含下列含量的组分：每毫升保存液中0.08ng表皮生长因子，0.1～0.2mg 1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲液；占保存液总重量0.5％的白蛋白和3％的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水；所述1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲液的配方为：磷酸二氢钾1.47mM和磷酸氢二钠8.06mM，氯化钙0.901mM，氯化镁0.493mM，氯化钾2.67mM，氯化钠137.93mM，D-葡萄糖5.1mM，pH7.2-7.4。

3.根据权利要求2所述的尿液细胞活性保存液，所述1X Dulbecco氏磷酸盐缓冲液的加入量为每毫升保存液中含0.18mg。

4.根据权利要求1至3任一所述的尿液细胞活性保存液，所述白蛋白指牛血清白蛋白。

5.权利要求1至4任一所述的尿液细胞活性保存液在保存待测端粒酶活性的细胞中的应用。

6.一种膀胱癌尿检试剂盒，其特征在于包含权利要求1至4任一所述的尿液细胞活性保存液和如下引物序列：

延伸引物FP：5’FAM-ATTGCCAATCCGTCGAGCAGAGTT-DABSYL，

反向引物RP：5’GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC，

内标对照引物CP：5’ROX-ATCGCTTCTCGGCCTTT-DABSYL，

内标序列ITC：5’AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT；

所述延伸引物FP的5’端偶联有荧光基团FAM，3’端偶联有卒灭基团DABSYL

所述对照引物CP的5’端偶联有荧光基团ROX，3’端偶联有卒灭基团DABSYL。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，还包括如下试剂：核苷三磷酸，Taq聚合酶，与Taq聚合酶配套使用的缓冲液，双蒸水，阳性对照标准品。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述阳性对照标准品指293细胞提取物。

9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，所述试剂指：10X Taq聚合酶缓冲液，50X dNTP Mix，FP 100ng/ul，RP 100ng/ul，CP 100ng/ul，ICT 0.01amol/ul，Taq聚合酶2Units/ul，双蒸水，阳性对照标准品250cells/ul。

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