CN1732271A - 检测端粒酶活性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测端粒酶活性的方法，该方法使用引物延伸，随后进行实时PCR定量。本发明的方法提供了快速、灵敏和准确测定生物样品中的端粒酶活性的方法。一实施方案中，该方法包括如下步骤：将生物样品加入反应管中，该反应管含有包括第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物，包括第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物，和分隔第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层；用第一反应混合物培养生物样品；将延伸产物和第二反应混合物混合；使用实时PCR和对照模板扩增和定量延伸产物。另一实施方案中，检测方法包括原位引物延伸步骤，使延伸产物在完整细胞中产生。该实施方案中，在合适的条件下可以在完成定量步骤之前将延伸产物保存延长的时间。

Description

检测端粒酶活性的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2002年11月12日提交的美国临时专利申请系列No.60/425,620的权益，其所公开内容在此引入作为参考。
技术领域
本发明涉及医学诊断和预后技术。具体而言，本发明涉及检测端粒酶活性的方法。
背景技术
端粒酶是合成染色体末端上端粒的酶。端粒是发现于真核生物染色体末端的DNA序列，其在复制过程中保持基因信息的保真度。在正常情况下，端粒随着细胞分裂的每个循环变得越来越短。认为足够短的端粒是细胞停止分裂的信号。
端粒酶属于使用RNA作为生产DNA的模板的称为逆转录酶的一类酶。端粒酶含有RNA和蛋白质成分。酶的RNA部分和端粒中的DNA结合，而蛋白质成分吸引DNA亚基进入区域并将它们连接至染色体末端。然后通过加入端粒重复部分(telomeric repeats)延伸染色体末端富含G的链。通过含有和端粒重复部分互补序列的部分端粒酶RNA成分的逆转录来产生该延伸。端粒酶催化的富含G的链的延伸之后，推定通过更多常规方法复制端粒的互补DNA链。在真核生物的情况中，端粒酶由重复的限定的核苷酸序列(重复部分)累积组成，例如，在人中含有TTAGGG序列。
在正常组织中是检测不到端粒酶活性的，除了种系细胞。必须通过重复循环的DNA复制保持其染色体末端的种系细胞可假定由于端粒酶的活性而随着时间不缩短它们端粒的长度。再生组织的干细胞表达非常低水平的端粒酶且它们的端粒随着多次细胞分裂而缩短。偶尔在邻近肿瘤的组织中检测到端粒酶活性，该组织可能反映隐藏的微小转移(micrometastases)存在。
认为端粒酶在细胞衰老过程中起作用。抑制体细胞中端粒酶的活性可能在控制它们分裂次数中是重要的。实际上，初级成纤维细胞中端粒的长度和这些细胞在衰老之前经受的分裂次数密切相关。端粒DNA的丢失是细胞复制潜力结束的信号，作为全部机理的部分，通过这种方式多细胞生物限制其细胞的增生。
由于其在控制复制中的作用，最近端粒酶还涉及肿瘤发生。已经在大多数肿瘤细胞中检测到端粒酶活性。已经提出端粒酶是形成人癌细胞无限制生长的原因。不同于正常细胞，癌细胞中的端粒酶通过保持端粒长度显示使细胞不灭以致细胞从不接受停止分裂的信号。端粒酶对于化学疗法是理想的靶子，因为该酶在约90％的人癌细胞中是有活性的，但是在大多数正常细胞中没有活性。医药公司已经筛选了上千种化合物来发现能够阻断端粒酶的试剂。
已经发展称为端粒重复扩增法(telomeric repeat amplificationprotocol)(TRAP)的方法来测定端粒酶活性。TRAP是基于酶活性的体外检测。简短地说，源自端粒序列的合成寡核苷酸用作底物。该底物通过测试样品中的端粒酶延伸，然后将延伸产物扩增和定量。TRAP方法的详述可以发现于，例如，Harley等的美国专利No.5,891,639(此后称为Harley)，和Emrich等的美国专利No.6,221,584(此后称为Emrich)中。最近，许多研究组已经报道了使用实时聚合酶链式反应(PCR)技术的改良TRAP方法(参见例如，Hou等，Clin.Chem.47：519-524，2001；Elmore等，Diagn.Mol.Pathol.，11，177-185，2002；和Wege等，Nucleic Acid Res.，31：E3-3，2003)。特别地，实时PCR技术已经用于提供更快和更灵敏的端粒酶延伸产物定量。
目前TRAP通常包括多个培养步骤并在每个培养步骤后将样品从一个试管转移至另一个。转移处理耗时并易于污染和操作失误(例如，将样品加入错误的试管或加样孔中)。目前TRAP通常从细胞或组织提取物开始。由于同时含有RNA和蛋白质成分的端粒酶受到提取物中的蛋白酶和RNA酶的消化，经常需要蛋白酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂来防止端粒酶的降解。向提取物中添加蛋白酶抑制剂和/或RNA酶抑制剂增加了分析成本。因此，需要更灵活、容易操作且快速而低成本的端粒酶试验。
发明概述
本发明公开了检测端粒酶活性的方法，该方法使用引物延伸然后实时PCR定量。该方法提供了快速、灵敏和精确地测定生物样品中的端粒酶活性的方法。
一实施方案中，该方法包括步骤：(1)将生物样品加入反应管中，该反应管中含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物，具有第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物，以及分隔第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层；(2)在适于端粒酶从第一引物产生延伸产物的条件下用第一反应混合物培养生物样品；(3)混合延伸产物和第二反应混合物；(4)在可以从单个293T细胞检测端粒酶活性的条件下使用实时PCR扩增延伸产物；和(5)使用步骤(4)条件下扩增的对照模板定量扩增的延伸产物。该实施方案的单管设计简化了实验程序并减少了实验误差。
另一实施方案中，检测方法包括如下步骤：(1)将第一引物和核苷三磷酸引入样品细胞中；(2)在适于端粒酶从细胞内的第一引物产生延伸产物的条件下培养样品细胞(原位引物延伸)；(3)使用实时PCR扩增延伸产物(extension product)；和(4)使用步骤(3)条件下扩增的对照模板定量扩增的延伸产物。在该实施方案中，延伸产物是在完整的样品细胞内产生的并在完成定量步骤之前在合适的条件下可以保存一段延长的时间。
本发明还公开了实施该方法和诊断端粒酶相关疾病的试剂盒。一实施方案中，试剂盒包括(1)反应管，其含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物，具有第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物，以及分隔第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层；和(2)对照管或加样孔(well)，含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物，具有第二引物、DNA聚合酶和对照模板的第二反应混合物，以及分隔第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层。
附图简述
将参考以下附图详细地说明，其中相同数字所指的是相同要素，且其中：
图1是示意图，描绘了检测端粒酶活性方法的实施方案。
图2是示意图，描绘了检测端粒酶活性方法中另外的延伸步骤。
图3是示意图，描绘了检测端粒酶活性方法的另一个实施方案。
图4A和图4B各自是荧光/PCR循环曲线和阈值循环数(thresholdcycle)/细胞数量曲线，证明了检测方法的灵敏性。
图5A和图5B各自是荧光/PCR循环曲线和阈值循环数/模板分子数量(template molecule number)曲线，使用对照模板通过实时PCR产生。
图6是曲线，显示了样品细胞数量和阈值循环数之间或模板分子数量和阈值循环数之间的线性回归。
图7是柱状图，显示了各种细胞系和组织中的端粒酶活性。
图8是荧光/PCR循环曲线，显示了注射器处理后接受原位引物延伸的细胞中的端粒酶活性检测。
图9是荧光/PCR循环曲线，显示了磷酸钙沉淀后接受原位引物延伸的细胞中的端粒酶活性检测。
发明详述
图1显示了用于检测和定量生物样品中端粒酶活性的方法100。首先，将生物样品加入反应管中，该反应管含有具有第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物以及具有第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物(步骤102)。通过高温熔化的蜡层将第一反应混合物和第二反应混合物分隔。将生物样品和第一反应混合物混合，其占据在反应管的上部，并在适于端粒酶从第一引物产生延伸产物的条件下培养(步骤104)。然后通过熔化蜡层将延伸产物和第二反应混合物混合(步骤108)，并通过实时PCR扩增(步骤110)。第一反应混合物中未延伸的第一引物和第二反应混合物中的第二引物形成用于PCR扩增的引物对。然后通过比较反应管中的PCR产物量和具有已知量的对照模板的对照管中的PCR产物量来定量生物样品中的端粒酶活性(步骤112)。该实施方案中，已经最佳化第一引物延伸和PCR反应的实验条件以致可以检测单个293T细胞的端粒酶活性。
生物样品包括从受检者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受检者内部的组织、细胞和生物流体。生物样品还包括初级细胞、转化细胞，和任何其它的培养细胞。由于本发明的方法检测端粒酶活性，端粒酶是RNA酶敏感的核糖核蛋白，不仅仅是端粒酶的RNA或蛋白质成分的存在，该方法需要酶活性细胞或组织样品。一实施方案中，生物样品是通过常规方法从受检者如活体解剖分离的组织样品。优选生物样品是细胞或组织提取物，尤其是来自人细胞或组织的提取物。通过重复融/冻细胞、将细胞或组织均化，或在含有非离子或/和两性离子去污剂的溶解缓冲剂(lysis buffer)中溶解(lysing)细胞或组织来产生提取物。非离子去污剂的实例包括但不限制于，吐温20、曲通(Triton)X-100、曲通X-114、polydocanol(Thesit)、NP-40、n-辛基糖苷、n-十二烷基糖苷、n-十二烷基-β-D-麦芽苷(-maltoside)、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(-glucamide)(MEGA-8)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10)，和异十三烷基-聚(乙烯二醇醚)n。两性离子去污剂的实例包括但不限制于，CHAPS(3-[(3-胆胺(-cholamido)丙基)二甲基铵基(ammonio)]-1-丙烷-磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷-磺酸盐)、N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷-磺酸盐，和毛地黄皂甙。溶解缓冲剂中去污剂的量可以为约0.1重量％至约2重量％。一实施方案中，溶解缓冲剂含有约0.5重量％的去污剂。
由于端粒酶同时含有RNA和蛋白质组分，可以将蛋白酶和/或RNA酶抑制剂加入提取物中来防止提取物中的端粒酶通过其它细胞蛋白酶破坏。蛋白酶抑制剂的实例包括但不限制于，氨肽酶抑制剂(amastain)、4-脒基苯基甲烷磺酰基氟化物(AMPSF)、抗蛋白酶、抑酶肽、苯丁抑制素、胰凝乳蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、3，4-二氯异香豆精、抑脂酶免疫酮A和B、弹性酶抑制剂、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑制剂A、苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)、膦酰二肽、甲苯磺酰基赖氨酰氯甲基酮(TLCK)、甲苯磺酰基苯基丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)，和胰蛋白酶抑制剂。RNA酶抑制剂的实例包括但不限制于，胰型RNA酶抑制剂、人胎盘RNA酶抑制剂，和二乙基焦碳酸酯(DEPC)。
反应管可以是适于方法特定应用需要的任何形状和大小的容器。通常，反应管是如本领域技术人员公知的PCR管或PCR加样孔。
第一反应混合物中的第一引物是适于作为端粒酶底物的寡脱氧核糖核苷。第一引物起两个作用：其作为端粒酶底物来产生延伸产物，其还作为随后的PCR反应中的引物。一实施方案中，第一引物的长度为10-60个核苷酸。另一实施方案中，第一引物的长度为12-30个核苷酸。优选作为端粒酶底物的第一引物不含有利用第一引物作为底物的特定端粒酶的完全端粒重复序列。例如，人端粒酶添加了端粒重复序列5’-TTAGGG-3’(SEQ ID NO：1)。因此，如果使用本发明方法来测定人端粒酶活性，端粒酶底物应该是缺失完全重复序列5’-TTAGGG-3’的人端粒酶底物。原因是端粒酶只通过添加端粒重复部分来延伸端粒酶底物。因此，在PCR反应中和第一引物形成引物对的第二引物必需含有和端粒重复部分互补的序列。如果在端粒酶延伸反应中使用的第一引物(即，端粒酶底物)含有完全端粒重复部分，则PCR反应中使用的第二引物将容易地和未延伸的第一引物杂交并形成可能导致负面PCR结果的引物二聚物。
反应混合物中的核苷三磷酸包括但不限制于，脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)。一实施方案中，反应混合物中含有等摩尔比的dATP、dGTP、dCTP以及dUTP和dTTP之一。核苷三磷酸总称为dNTPs。
除了第一引物和核苷三磷酸，第一反应混合物还可以含有维持端粒酶引物延伸反应最佳pH的缓冲系统。缓冲系统的实例包括但不限制于，磷酸盐缓冲系统、柠檬酸盐缓冲系统、硼酸盐缓冲系统，三-(羟甲基)氨基甲烷、3-[(3-胆胺丙基)二甲基铵基(-ammoniol)]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-2-[乙烷磺酸](HEPES)，和3-[N-吗啉代]丙烷磺酸(MOPS)。
适于端粒酶从第一引物产生延伸产物的条件是本领域公知的。通常，端粒延伸反应是在约20-30℃下进行约10-60分钟，优选约25℃或约30℃下约15-30分钟，最优选为约25℃下约20分钟。
步骤104的延伸产物可以接受另外的不依赖模板的延伸(步骤106)。优选通过酶反应方式来完成该延伸，如通过使用末端转移酶连接核苷酸或通过使用DNA连接酶连接短DNA片段。一实施方案中，通过末端转移酶将聚脲苷酸尾加至延伸产物的3’端。另一实施方案中，将10-20个核苷酸的短DNA寡聚物连接至延伸产物的3’端。这些修饰产生了第二引物的单一序列并因此包括了第一引物中的全部端粒重复序列。如图2所示，含有人端粒重复TTAGGG的第一引物用作人端粒酶底物。端粒酶媒介的延伸后，延伸产物具有3’序列(TTAGGG)nTTAGGGTTAGGG-3’，其中n是等于或大于零的整数。另外的将至少10个核苷酸的聚脲苷酸尾加至延伸产物的3’端的不依赖模板的延伸后，延长的延伸产物具有3’序列(TTAGGG)nTTAGGGTTAGGGAAAAAAAAAAAm-3’，其中n是等于或大于零的整数。然后可以将第二引物设计成具有与端粒重复序列和延长的延伸产物3’端的聚脲苷酸序列的连接互补的序列。如图2所示，与端粒重复部分和附加核苷酸的连接互补的第二引物应该能够从延伸产物中分辩出未延伸的第一引物，只要第一引物在其3’端不具有完全端粒重复序列。
不存在另外的延伸步骤106时，第二反应混合物中的第二引物通常含有多个不完全的端粒重复序列和至少一个完全的端粒重复序列来最小化非特异性PCR产物如引物-二聚物的形成。
第二反应混合物中的DNA聚合酶可以是适于标准PCR条件的任何DNA聚合酶。这样的酶是本领域技术人员公知的。一实施方案中，第二反应混合物还包括镁盐，其提供了延伸产物PCR扩增的最佳镁。另一实施方案中，第二反应混合物还含有第一引物，或dNTP，或两者。
分隔第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层具有约50-90℃的熔化温度，优选约60-80℃。一实施方案中，可以将痕量的染料加入第一反应混合物和第二反应混合物之一中来监控PCR扩增之前可能通过蜡层的泄漏。另一实施方案中，将第二反应混合物和蜡预混并在蜡固化时限制在蜡层范围内。当蜡层在较高温度下熔化时第二反应混合物内含物得到释放。
通过实时PCR扩增定量延伸产物(有或无另外的延伸)。如本领域技术人员所知的，通常通过将热稳定酶和一对引物加入含有模板的反应混合物中并通过多个热循环来完成PCR扩增。方法100中，第一反应混合物中未延伸的第一引物作为5’PCR引物，第二反应混合物中的第二引物作为3’PCR引物。
使用荧光共振能量转移(FRET)技术来检测实时PCR反应中的PCR产物。通过将每个扩增的线性部分和使用已知模板产生的标准曲线相比较来测量特定PCR产物的累积。
一实施方案中，正常进行PCR反应，但是添加与两个侧翼PCR引物之间的序列结合的荧光标记探针寡核苷酸。该方法依赖于Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性从探针的5’端分裂荧光标记的核苷酸。该探针寡核苷酸在3’端还具有抑制全部荧光的荧光淬灭剂，因此，当除去5’标记的核苷酸时就失去淬灭作用，因为两个荧光团之间的距离太远以致不能相互影响。每个循环产生更多的荧光使整个PCR反应被实时跟随。可以通过将指数式扩增的线性部分和标准曲线相比较来计算存在于反应中的模板量。这样的检测系统实例包括但不限制于，TaqMan系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)。
另一实施方案中，通过使用单标记的荧光引物来检测PCR产物，如LUX引物(Invitrogen，Carlsbad，CA)和Amplifluor RP引物(Chemicon，Temecula，CA)。当荧光引物并入双链PCR产物中时引物产生增加量的荧光发射。然后基于关闭的反应管中每个PCR循环的扩增步骤中产生的荧光来测定PCR产物量。
仍然另一实施方案中，使用择优与双链DNA结合的荧光染料来检测PCR产物。因此如SYBR绿的染料可以准确地定量在单链寡核苷酸引物存在下产生的双链产物量。
通过将反应管中增加的荧光与含有已知量对照模板的对照管中增加的荧光相比较来定量端粒酶活性(步骤110)。通常，使用含有不同稀释度对照模板的一套对照管或加样孔进行实时PCR来产生标准曲线。然后在同一PCR条件下扩增测试管或加样孔中的延伸产物并基于标准曲线定量测试管或加样孔中的端粒酶活性。端粒酶活性通常以某个时间段内合成的端粒重复量部分的量来表示。人端粒酶优选的对照模板是TSR9，其具有序列5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3’(SEQ ID NO：2)。
另一实施方案中，将细胞或组织提取物加入含有第一引物、第二引物、dNTPs、DNA聚合酶，和择优结合双链DNA的荧光染料的总反应混合物中。在相同的反应管中连续进行端粒酶媒介的延伸和PCR扩增。
图3显示了检测端粒酶活性的另一方法300。该实施方案中，在完整细胞中进行引物延伸步骤。特别地，将第一引物和核苷三磷酸引入完整样品细胞中(步骤302)；然后在适于端粒酶在细胞内从第一引物产生延伸产物而保持细胞结构完整性的条件下培养样品细胞(步骤304)。步骤304也指的是如“原位引物延伸步骤”，因为延伸产物是在样品细胞内部产生的。然后扩增延伸产物并使用实时PCR和对照模板来定量(步骤308)。一实施方案中，将样品细胞和第二反应混合物混合并接受PCR扩增。另一实施方案中，在溶解缓冲剂中溶解样品细胞并将溶解产物用于实时PCR反应中。
或者，在完成端粒酶媒介的引物延伸后将样品细胞保存(步骤306)。该实施方案中，由于延伸产物仍然在完整的样品细胞内部，比细胞/组织提取物产生的延伸产物可以更好地保存延伸产物。因此方法300使操作者可以在接受样品后立即进行端粒酶媒介的引物延伸步骤，并保存中间体产物即引物延伸步骤304之后的样品细胞，用于较后时间的定量。
可以在悬浮液中或作为单层培养样品细胞。可以使用本领域技术人员公知的方法将第一引物和dNTPs引入细胞中。实例包括但不限制于，磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染、脂转染/脂转染胺(lipofectamin)转染、电穿孔、微注射、超声处理、机械剪切(例如，迫使细胞通过注射器针头)，和破坏细胞膜或提高细胞膜渗透性的其它化学或物理方法。一实施方案中，将细胞悬浮并迫使其通过25-规格的针头至少一次，优选2-5次。然后将细胞接种于反应管或加样孔中含有第一引物和dNTPs的培养基中。通过针头的剪切作用破坏了细胞膜并使第一引物进入细胞中。然后将注射器处理的细胞与第一引物和dNTPs一起培养，通过细胞中的端粒酶产生延伸产物。
另一实施方案中，将第一引物和dNTPs引入使用磷酸钙沉淀的细胞中。磷酸钙沉淀是在第一引物和dNTP存在下形成的，并将其加入细胞中。然后在37℃培养细胞约10-120分钟，通过细胞中的端粒酶产生延伸产物。
本发明的方法可以用作诊断试验来测定端粒酶相关疾病如霍奇森病(Hodgkin’s disease)的进展和严重程度。端粒酶活性的定量也可用于，例如，测定端粒酶相关疾病治疗后的严重程度。
在此所述的检测方法可以通过例如利用预先包装的诊断试剂盒来进行，该试剂盒含有包括第一引物和核苷三磷酸的延伸组合物，和含有第二引物、核苷三磷酸、双链DNA结合染料，以及DNA聚合酶的检测组合物。当和端粒酶混合时延伸组合物能够从第一引物产生延伸产物；而检测组合物能够在PCR反应中扩增延伸产物并产生用于定量的标记扩增产物。诊断试剂盒可以方便地用于例如临床装置中来诊断呈现端粒酶相关疾病如霍奇森病症状或家族史的患者。其中表达端粒酶的任何细胞类型或组织可以用于在此所述的预后或诊断试验中。
一实施方案中，检测生物样品中的端粒酶活性，超过预测定的正常水平的提高的端粒酶活性象征端粒酶相关疾病如霍奇森病。
在此所述的检测方法也可以用作预后试验来鉴定具有端粒酶相关疾病如霍奇森病或具有产生端粒酶相关疾病风险的患者，其和异常的端粒酶活性相关。
此外，在此所述的预后试验可用来检测是否患者可以给药药物候补物质来治疗或防止异常端粒酶活性相关的疾病。因此，本发明提供了确定使用异常端粒酶活性相关的试剂来检测患者是否可以得到有效治疗的方法。可以设计预后试验来测定是否接受端粒酶相关疾病治疗的患者对于长期存活或疾病进展具有不良前景(poor outlook)。通过建立疾病不同阶段端粒酶活性的分布图，从开始至以后的阶段，活性模式可以呈现相关的特定活性分布图来增强不良预后(poor prognosis)的可能性。然后使用预后来设计更积极的治疗方案和提高长期存活和保持良好状态的可能性。相似地，本发明的检测方法可以用于基础药物筛选或监控试剂(例如，药物、小分子、蛋白质、核苷酸)对端粒酶活性影响的临床试验。例如，通过筛选试验测定的试剂降低端粒酶活性的有效性，可以在呈现端粒酶活性增强患者的临床试验中得到监控。这样的临床试验中，端粒酶活性可以用作特定组织表型的“读出(read out)”。
一实施方案中，本发明提供了监控试剂对患者的治疗有效性的方法，包括步骤(i)在试剂给药之前从患者获得给药前样品；(ii)测定给药前样品中的端粒酶活性水平；(iii)从患者获得一个或多个给药后的样品；(iv)测定给药后样品中的端粒酶活性水平；(v)比较给药前样品中的端粒酶活性水平和给药后样品中的端粒酶活性水平；和(vi)据此改变将试剂给药于患者。例如，将端粒酶活性提高至高于检测到的水平即降低试剂的有效性，减少试剂给药是理想的。根据这样的实施方案，端粒酶活性可以用作试剂有效性的指示剂，甚至在不存在可观察表型反应时。
如在此所述，端粒酶检测方法可以用于各种应用中，包括但不限制于，评价端粒酶抑制剂的有效性，测定端粒酶活性和细胞培养条件之间的相关性，测定端粒酶活性和时效(aging)之间、或端粒酶活性和肿瘤生成之间的相关性，诊断端粒酶相关疾病，和监控这样疾病的治疗。
实施例
实施例1.引物比例的确定
在Dulbecco改良的Eagle培养基中(DMEM)用10％胎牛血清(FBS)在用5％CO2湿润的培养箱中37℃培养293T细胞系(用剪切的人5型腺病毒(Ad5)DNA和SV40T-抗原转化的初级人胚胎肾脏，从美国典型培养物中心(American Type Culture Collection)获得)。在70-85％融合(confluency)收集细胞、计数，并使用含有10mM Tris-HCl，pH7.5、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.1mM苯甲脒、5mM b-巯基乙醇、0.5％w/v CHAPS，和10％w/v丙三醇的溶解缓冲剂(CHAPS溶解缓冲剂)在冰上溶解30分钟。使用BCA蛋白质试验试剂盒(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。将细胞提取物保存于-70℃。
从Integrated DNA Technologies，Inc(Coralville，IA)定制寡核苷酸引物。第一引物(FP)具有序列5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’(SEQID NO：3)并命名为TS，第二引物(SP)具有序列5’-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3’(SEQ ID NO：4)并命名为ACX。为了检测第一引物和第二引物的引物比例的影响，使用不同的比例(FP∶SP＝1∶1、1∶0.8、1∶0.5，和1∶0.2)。简短地说，将1μl不同稀释度细胞提取物和1μl引物混合物(0.5μg不同比例TS/ACX)、11.5μl水，和12.5μl PCR预混缓冲剂混合，预混缓冲剂含有0.25单位DNA聚合酶，2.5mM dATP、dUTP、dCTP和dGTP以及SYBR绿(1∶2000稀释SYBR绿1储液(S-7563)，从Molecular Probes Inc.，Eugene，OR购买)，首先在25℃培养20分钟，然后在95℃10分钟，并通过定量实时PCR扩增(95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环)。结果显示了1/1(w/w)的比例给出了最佳结果(表1)。
表1.引物比例对定量实时PCR反应的影响
  细胞提取物(μg)   阈值循环数(CT)
  稀释度   FP/SP比例   1/1   1/0.8   1/0.5   1/0.2
  ABCDEF空白   0.400.080.0160.00320.000640.00013--   20.722.525.127.429.632.433.0   25.427.027.830.032.033.833.5   28.226.928.432.331.235.634.3   27.527.930.132.735.435.4--
实施例2.试验灵敏度的检测
为了检测端粒酶活性试验方法的灵敏度，使用不同量(或细胞数量)的293T细胞提取物在实施例1中所述的条件下进行试验，且FP/SP比例为1/1。如表2和图4所示，该方法能够检测单个293T细胞的端粒酶活性。
表2.293T细胞中端粒酶活性的检测
    细胞提取物(每个反应)   阈值循环数(CT)
  稀释度     μg     细胞     数目
    ABCDEFGH空白     2.8000.820.160.0320.00640.00320.00160.00033--     85002500500100201051--     18.019.721.123.125.426.627.528.833.0
实施例3.标准曲线的产生
为了定量实时PCR反应的结果，在实施例2所述条件下使用对照模板分子来产生标准曲线，使端粒酶活性与通过阈值循环数的每个反应的模板分子数量相关。如表3和图5所示，使用标准反应条件和对照模板TSR9下实时PCR阈值(CT)读数产生标准曲线。图6显示了293T细胞数量和阈值循环数之间的线性回归以及对照模板TSR9分子数量和阈值循环数之间的线性回归。
表3.使用TSR9模板对照的标准曲线的产生
    稀释度    TSR9浓度          阈值循环数(CT)
          μg/μl     分子/反应
    S1    0.5         300000    18.3S2    0.1         60000     20.8S3    0.02        12000     22.6S4    0.004       2400      25.2S5    0.0008      480       27.3S6    0.00016     96        29.8S7    0.000032    20        32.0S8    0.0000064   4         32.5空白  -           -         33.0
实施例4.端粒酶试验方法的特异性
为了检测端粒酶试验方法的特异性，使用数个肿瘤细胞系进行试验，细胞系包括MCF7(乳房胸腔积液腺癌)、ZR-75-1(乳房腹水导管癌)和海拉细胞(颈腺癌)、各种鼠组织(从成年C57BL/6鼠采集)包括脑、肾脏、肝脏、心脏、睾丸，和血液，以及293T细胞的热钝化(95℃10分钟)提取物。如表4和图7所示，在增殖细胞、癌细胞系，(293T、海拉、MCF7和ZR-75-1)中检测到端粒酶活性，但在热钝化的293T细胞提取物和空白对照中没有检测到。结果还显示了正常成年鼠组织中具有低端粒酶活性，显示了正常组织中的增殖细胞(例如，干细胞)是可检测的。
表4.各种细胞系和鼠组织中的端粒酶活性
  样品   细胞提取物(每个反应)μg   循环阈值(CT)平均±SD
  对照脑肾脏肝脏心脏睾丸血液MCF7ZR75海拉293T293T(热钝化)   --0.010.010.010.010.010.010.010.010.010.010.01   34.3±0.229.6±0.229.6±0.229.4±0.228.6±0.228.2±0.231.3±0.123.3±0.524.2±0.424.6±0.424.3±0.534.7±0.2
实施例5.反应混合物的稳定性
为了测试端粒酶试验中所用试剂的稳定性，制备含有第一引物TS、DNA聚合酶、dNTPs和SYBR绿的反应混合物。反应混合物的等分试样在室温下保持0、24、48或72小时，并在端粒酶试验中测试。如表5所示，反应混合物在室温下保持稳定至少可达72小时。
表5.室温下反应混合物的稳定性
   细胞提取物(μg)             阈值循环数(CT）
 稀释度    暴露于室温下(小时) 0    24   48   72
  A    2.0                    18.0 16.7 18.2 16.4B    0.40                   21.6 22.4 21.9 20.9C    0.08                   22.3 21.8 21.9 21.4D    0.016                  24.3 24.2 23.9 24.2F    0.0032                 26.1 25.7 25.6 25.2G    0.00064                27.9 27.7 28.2 27.6H    0.00013                28.3 28.4 28.6 31.5空白 --                     34.3 32.1 33.932.9
实施例6.完整细胞中的引物延伸
在生长培养基中(Dulbecco改良的Eagle养基(DMEM)用10％胎牛血清(FBS)，在37℃，用5％CO2湿润的培养箱)培养293T细胞。将细胞胰蛋白酶消化，用生长培养基洗涤，以1×106个细胞/ml的密度悬浮于生长培养基中，并接受以下之一的处理：
处理A：将细胞悬浮液转移入无菌离心管中，在Beckman GS-6R离心机中以800rpm离心5分钟，重悬浮于磷酸缓冲盐水(PBS)中。将重悬浮细胞通过25-规格(25-gauge)针头引入无菌1ml注射器中，然后通过活塞的稳定压力排出。重复五次注射器操作。以1×104个细胞/管将细胞转移入无菌离心管中并加入转移基质(2.5mM dNTP和0.1％牛血清白蛋白(BSA))，用或不用TS引物。将细胞在37℃培养60分钟。将管在4℃离心20分钟，并收集悬浮液。使用Chaps缓冲剂在4℃溶解套膜(pallets)30分钟。溶解产物在4℃以14,000rpm离心20分钟。收集上清液，在95℃加热10分钟，并在使用前保存于-70℃。
或者，在注射器操作后以1×104个细胞/孔的密度将细胞放置于96孔平板上，并在用5％CO2湿润的培养箱中在37℃培养过夜。第二天，用PBS洗涤细胞并将所需量的转移缓冲剂(PBS和TS引物，0.5μg/孔，dNTP 2.5mM和0.1％BSA；或PBS和dNTP，2.5mM和0.1％BSA；或只有PBS)加入每个孔中。在37℃培养30分钟、60分钟，和过夜后，收集细胞并用CHAPS缓冲剂在4℃溶解30分钟。在14,000rpm离心溶解产物。收集上清液，在95℃加热10分钟，并在使用前保存于-70℃。
处理B：将细胞悬浮液直接接种于96孔平板中，培养过夜，并用所需量TS引物和dNTP使用磷酸钙沉淀转染。简短地说，293T细胞在生长培养基(DMEM和10％FBS)中生长过夜。在转染前3小时用新鲜生长培养基替换生长培养基。在TS引物和dNTP(HBS 100μl，磷酸盐(phospate)2μl，H2O 26μl，载体DNA 10μl，第一引物20μl，0.25mMdNTP，12μl钙)存在下形成磷酸钙沉淀(使用来自GIBCO的磷酸钙试剂盒)并加入细胞。细胞在37℃培养10、30，和60分钟，用CHAPS溶解缓冲剂在4℃溶解30分钟。将溶解产物在100℃加热10分钟并在14,000rpm离心20分钟。收集上清液并保存于-70℃。
将来自处理A或B的一微升溶解产物和11.5μl水以及12.5μl预混物混合，预混物含有dNTPs(每种核苷三磷酸2.5mM)、0.25单位DNA聚合酶、0.25μgACX引物，并接受定量实时PCR(95℃10分钟，95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，进行35-40个循环)。图8所示的结果表明了如所述处理A中用TS引物和dNTP培养一小时后293T细胞中的端粒酶活性是可检测的。图9所示的结果表明了如所述处理B中用含有TS引物和dNTP的磷酸钙沉淀物培养30分钟后293T细胞中的端粒酶活性是可检测的。没有使用TS引物的没有检测到端粒酶活性，这表明检测的产物是端粒酶特异性的。
尽管已经详细描述优选实施方案及其优势，在此还可以作出各种改变、替代和变更而不脱离权利要求限定的组合物和方法的范围，且它们等价的内容均类归于权利要求的范围内。
                             序列表
<110>联合生物技术公司
<120>检测端粒酶活性的方法和组合物
<130>150451
<160>4
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>6
<212>DNA
<213>同种(Homo sapiens)
<400>1
ttaggg                                                               6
<210>2
<211>68
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>人造对照模板
<400>2
aatccgtcga gcagagttag ggttagggtt agggttaggg ttagggttag ggttagggtt    60
agggttag                                                             68
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>端粒酶底物和PCR引物
<400>3
aatccgtcga gcagagtt                                                  18
<210>4
<211>30
<212>DNA
<213>人造的
<220>
<223>PCR引物
<400>4
gcgcggctta cccttaccct taccctaacc                                     30

Claims (20)

1.检测和定量生物样品中端粒酶活性的方法，该方法包括步骤：
将生物样品加入反应管中，所述反应管含有：
包括第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物；
包括第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物；和分隔反应管中第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层；
在适于端粒酶从第一引物产生延伸产物的条件下用第一反应混合物培养生物样品，所述延伸产物具有3’端；
通过熔化蜡层混合延伸产物和第二反应混合物；
在从单个293T细胞检测端粒酶活性的条件下使用实时聚合酶链式反应扩增延伸产物；和
使用对照模板定量扩增的延伸产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中以细胞或组织提取物的形式加入生物样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中实时聚合酶链式反应通过使用与第一和第二引物之间的序列结合的荧光标记探针寡核苷酸来定量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中实时聚合酶链式反应在择优结合双链DNA的荧光染料存在下进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其中第二引物是单标记的荧光引物，当该荧光引物引入双链聚合酶链式反应产物中时产生增加量的荧光发射。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
通过聚腺苷酸化和连接反应之一在3’端延长延伸产物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中对照模板具有SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。
8.检测和定量样品细胞中端粒酶活性的方法，该方法包括以下步骤：
将第一引物和核苷三磷酸引入样品细胞中；
在适于端粒酶从第一引物产生延伸产物的条件下培养样品细胞；
使用实时聚合酶链式反应扩增延伸产物；和
使用对照模板定量扩增的延伸产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其进一步包括：
用溶解缓冲剂溶解样品细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其中通过磷酸钙沉淀将第一引物和核苷三磷酸引入样品细胞中。
11.根据权利要求8所述的方法，其中通过以下操作将第一引物和核苷三磷酸引入样品细胞中，该操作包括：
将细胞穿过针头至少一次；和
在含有第一引物和核苷三磷酸的培养基中培养细胞。
12.根据权利要求8所述的方法，其中实时聚合酶链式反应在择优结合双链DNA的荧光染料存在下进行。
13.根据权利要求8所述的方法，其中实时聚合酶链式反应在第二引物存在下进行，其中第二引物是荧光引物，当将荧光引物引入双链聚合酶链式反应产物中时产生增加量的荧光发射。
14.根据权利要求8所述的方法，其中对照模板具有SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。
15.检测和定量生物样品中端粒酶活性的方法，该方法包括以下步骤：
将生物样品加入反应管中，该反应管含有：
包括第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物；
包括第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物；和
分隔反应管中第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层；
在适于端粒酶从第一引物产生延伸产物的条件下用第一反应混合物培养生物样品，所述延伸产物；
通过聚腺苷酸化和连接反应之一在3’端延长所述延伸产物；
通过熔化蜡层混合延伸产物和第二反应混合物；
在从单个293T细胞检测端粒酶活性的条件下使用实时聚合酶链式反应扩增延伸产物；和
使用对照模板定量扩增的延伸产物，
其中第二引物包括与延长的延伸产物3’端核苷酸序列互补的核苷酸序列。
16.用于检测端粒酶活性的试剂盒，该试剂盒包括：
反应管，其包括：
包括第一引物和核苷三磷酸的第一反应混合物；
包括第二引物和DNA聚合酶的第二反应混合物；和
分隔反应管中第一反应混合物和第二反应混合物的蜡层；和
对照管，其含有：
第一反应混合物；
包括第二引物、对照模板，和DNA聚合酶的第三反应混合物；和
分隔对照管中第一反应混合物和第三反应混合物的蜡层。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中对照模板具有SEQ IDNO：2所述的核苷酸序列。
18.根据权利要求16所述的试剂盒，其进一步含有
包括(a)DNA聚合酶或(b)连接酶和寡核苷酸的延长混合物。
19.用于检测端粒酶活性的试剂盒，该试剂盒包括：
用于溶解样品细胞的溶解缓冲剂；
反应缓冲剂，其包括：
第一引物；
核苷三磷酸；
第二引物；和
DNA聚合酶；和
对照模板，其包括SEQ ID NO：2所述核苷酸序列或与SEQ ID NO：2所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
20.监控用抑制端粒酶活性的试剂治疗患者的有效性的方法，所述方法包括：
在试剂给药之前从患者获得给药前的样品；
测定给药前样品中的端粒酶活性水平；
从患者获得一个或多个给药后的样品；
测定给药后样品中的端粒酶活性水平；和
比较给药前样品中的端粒酶活性水平与给药后样品中的端粒酶活性水平。
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