KR20050086563A - 텔로머라제 활성 검출을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프라이머 확장에 이어서 실시간 PCR 정량을 이용하여 텔로머라제 활성을 측정하는 방법을 개시한다. 본 발명의 방법은 생물 시료의 텔로머라제 활성을 빠르고 민감하며 정확하게 측정한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 갖는 제2 반응 혼합물, 및 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 함유하는 반응 튜브에 생물 시료를 가하는 단계; 생물 시료와 제1 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 확장 생성물과 제2 반응 혼합물을 혼합하는 단계; 및 실시간 PCR 및 대조군 템플레이트를 이용하여 상기 확장 생성물을 증폭 및 정량하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 검출 방법은 원형 세포내에서 확장 생성물의 제조를 허용하는 원위치 프라이머 확장 단계를 포함한다. 이 실시양태에서, 정량 단계의 완료 전에 연장된 시간 동안 적절한 조건하에 확장 생성물을 보존할 수 있다.

Description

텔로머라제 활성 검출을 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTING TELOMERASE ACTIVITY}
본 발명은 일반적으로 의학 진단 및 예후 기술에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 텔로머라제 활성의 검출 방법에 관한 것이다.
텔로머라제는 염색체 말단상에서 텔로미어를 합성하는 효소이다. 텔로미어는 진핵생물 염색체의 말단에서 발견된 복제 동안 유전 정보의 정확도를 유지하는 DNA 서열이다. 정상 환경하에서, 텔로미어는 세포 분열의 각 사이클이 진행됨에 따라 점점 더 짧아진다. 충분하게 짧은 텔로미어는 세포에 분열 중지 신호를 전달하는 것으로 생각된다.
텔로머라제는 DNA 생성을 위한 템플레이트로서 RNA를 사용하는 역전사효소로 알려진 효소 종류에 속한다. 텔로머라제는 RNA 및 단백질 성분을 둘 다 함유한다. 이 효소의 RNA 부위는 텔로미어의 DNA에 결합하며, 단백질 성분은 DNA 서브유닛을 영역내로 유인하여 염색체 말단에 부착시킨다. 이후, 텔로머라제는 텔로미어 반복부를 부가함으로써 염색체 말단의 G-풍부 가닥을 연장한다. 이러한 연장은 텔로미어 반복부에 상보적인 서열을 함유하는 텔로머라제 RNA 성분의 일부가 역전사됨으로써 일어난다. 텔로머라제의 촉매작용에 의해 G-풍부 가닥을 연장한 다음, 보다 통상적인 방법에 의해 텔로미어의 상보적 DNA 가닥을 복제할 수 있을 것이다. 진핵 생물의 경우, 예를 들어 인간에서 서열 TTAGGG를 함유하는 반복 정의된 뉴클레오티드 서열(반복부)이 축적되어 텔로머라제를 구성한다.
텔로머라제 활성은 생식 세포를 제외한 정상 조직에서는 검출될 수 없다. DNA 복제가 반복되는 동안 염색체 말단을 유지해야 하는 생식 세포는 시간 경과에 따라 텔로미어 길이가 짧아지지 않는데, 이는 아마도 텔로머라제 활성으로 인한 것으로 보인다. 재생 조직의 줄기 세포는 텔로머라제를 매우 낮은 수준으로 발현하며, 상기 세포의 텔로미어는 다수회 세포 분열로 인해 길이가 짧아진다. 텔로머라제 활성은 종양에 인접한 조직에서 때때로 검출되는데, 이는 잠재적 미세전이의 존재를 반영하는 것일 수 있다.
텔로머라제는 세포 노화 프로세스에서 역할을 갖는 것으로 생각된다. 체세포의 텔로머라제 활성의 억제는 체세포의 분열 횟수를 조절하는데 있어서 중요할 수 있다. 실제로, 1차 섬유아세포의 텔로미어의 길이는 이 세포가 노화되기 전에 수행할 수 있는 분열 횟수와 상당한 상관관계가 있다. 텔로미어 DNA의 감소는 다세포 생물이 그의 세포 증식을 제한하는 전체 메카니즘의 일부로서 세포에 복제 잠재력을 제거하는 신호를 전달할 수 있다.
최근에 이르러, 복제 조절 작용으로 인해 텔로머라제가 종양발생에도 관여하는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 종양 세포에서 텔로머라제 활성이 검출되었다. 이에 따라, 인간 암세포의 성장이 억제되지 않는 원인은 텔로머라제인 것으로 제안되었다. 정상 세포와 달리, 암세포에서는 텔로머라제가 텔로미어 길이를 유지하여 세포가 분열 중지 신호를 받지 않도록 함으로써 세포에 불멸성을 제공하는 것으로 보인다. 텔로머라제 효소가 인간 종양의 약 90％에서 활성이 있지만 대부분의 정상 세포에서는 불활성이기 때문에 이 효소는 화학요법에서 이상적인 표적이 된다. 제약 회사들은 텔로머라제를 차단시킬 수 있는 작용제를 발견하기 위해 수천종의 화합물을 스크리닝해 왔다.
텔로머라제 활성을 측정하기 위해 텔로미어 반복부 증폭 프로토콜 (TRAP)이라 불리는 방법이 개발되었다. 트랩(TRAP)은 상기 효소 활성의 시험관내 검출을 기초로 한다. 요컨대, 텔로미어 서열로부터 유도된 합성 올리고뉴클레오티드를 기질로 사용한다. 이 기질은 시험 시료에서 텔로머라제에 의해 연장되며, 이후 연장 생성물이 증폭 및 정량된다. 트랩 방법에 대한 상세한 설명은 예를 들어 할리(Harley) 등(이하, 할리)의 미국 특허 제5,891,639호 및 엠리치(Emrich) 등(이하, 엠리치)의 미국 특허 제6,221,584호에서 찾을 수 있다. 최근, 다수의 연구 그룹들이 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하는 변형된 트랩 방법을 보고하였다 (예를 들어, 문헌 [Hou et al., Clin. Chem. 47:519-524, 2001; Elmore et al., Diagn. Mol. Pathol., 11, 177-185, 2002; and Wege et al., Nucleic Acids Res., 31:E3-3, 2003] 참조). 특히, 실시간 PCR 기술을 사용하여 텔로머라제의 연장 생성물을 더 빠르고 더 민감하게 정량하였다.
현재의 트랩은 전형적으로 다수의 인큐베이션 단계 및 각 인큐베이션 단계 후 시료를 하나의 튜브에서 다른 튜브로 전달하는 단계를 포함한다. 전달은 시간 소모적인 과정이며, 오염 및 조작 오류(예, 시료를 잘못된 튜브 또는 웰(well)에 가함)가 발생하기 쉽다. 현재의 트랩은 일반적으로 세포 또는 조직 추출물로 시작한다. RNA 및 단백질 성분을 둘 다 함유하는 텔로머라제는 추출물에서 프로테아제 및 RNase에 의해 분해되기 때문에, 흔히 텔로머라제의 분해를 방지하기 위해 프로테아제 저해제 및(또는) RNase 저해제가 필요하다. 프로테아제 저해제 및(또는) RNase 저해제를 추출물에 첨가하는 경우, 분석 비용이 증가한다. 따라서, 보다 융통성이 있고 저비용으로 쉽고 빠르게 수행할 수 있는 텔로머라제 분석법이 필요한 실정이다.
발명의 개요
프라이머 확장에 이어서 실시간 PCR 정량을 이용하여 텔로머라제 활성을 측정하는 방법을 개시한다. 이 방법은 생물 시료의 텔로머라제 활성을 빠르고 민감하며 정확하게 측정한다.
한 실시양태에서, 상기 방법은 (1) 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 갖는 제2 반응 혼합물, 및 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 함유하는 반응 튜브에 생물 시료를 가하는 단계; (2) 텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조하기에 적합한 조건하에 생물 시료와 제1 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계; (3) 확장 생성물과 제2 반응 혼합물을 혼합하는 단계; (4) 단일 293T 세포로부터 텔로머라제 활성이 검출되도록 허용하는 조건하에 실시간 PCR을 이용하여 확장 생성물을 증폭하는 단계; 및 (5) 단계 (4)의 조건하에 증폭된 대조군 템플레이트를 사용하여 상기 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계를 포함한다. 이 실시양태의 단일 튜브 디자인은 실험 절차를 단순화하여 실험 오류를 감소시킨다.
다른 실시양태에서, 검출 방법은 (1) 시료 세포에 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 도입하는 단계; (2) 세포 내부에서 텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조(원위치 프라이머 확장)하는데 적합한 조건하에 시료 세포를 인큐베이션하는 단계; (3) 실시간 PCR을 이용하여 확장 생성물을 증폭하는 단계; 및 (4) 단계 (3)의 조건하에 증폭된 대조군 템플레이트를 사용하여 상기 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계를 포함한다. 이 실시양태에서, 확장 생성물은 원형(intact) 시료 세포내에서 제조되며, 연장된 시간 동안 적절한 조건하에 보존한 다음, 정량 단계를 완료할 수 있다.
또한, 상기 방법의 수행을 위한 시약 키트 및 텔로머라제 관련 질병의 진단을 위한 시약 키트를 개시한다. 한 실시양태에서, 시약 키트는 (1) 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 갖는 제2 반응 혼합물, 및 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 함유하는 반응 튜브; 및 (2) 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머, DNA 폴리머라제 및 대조군 템플레이트를 갖는 제2 반응 혼합물, 및 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 함유하는 대조군 튜브 또는 웰을 포함한다.
이하의 상세한 설명에서는 첨부된 도면을 참고하며, 여기서 유사한 숫자는 유사한 요소를 의미한다:
도 1은 텔로머라제 활성 검출 방법의 실시양태를 도시하는 개요도이다.
도 2는 텔로머라제 활성 검출 방법에서 추가의 확장 단계를 도시하는 개요도이다.
도 3은 텔로머라제 활성 검출 방법의 다른 실시양태를 도시하는 개요도이다.
도 4A 및 4B는 각각 검출 방법의 민감도를 입증하는 형광/PCR 사이클 그래프 및 역치 사이클/세포수 그래프이다.
도 5A 및 5B는 각각 대조군 템플레이트를 사용한 실시간 PCR에 의해 생성된 형광/PCR 사이클 그래프 및 역치 사이클/템플레이트 분자수 그래프이다.
도 6은 시료 세포수와 역치 사이클 또는 템플레이트 분자수와 역치 사이클 사이의 선형 회귀를 나타내는 그래프이다.
도 7은 다양한 세포주 및 조직의 텔로머라제 활성을 나타내는 막대 그래프이다.
도 8은 주사기 처리 후 원위치 프라이머 확장 처리된 세포의 텔로머라제 활성 검출을 나타내는 형광/PCR 사이클 그래프이다.
도 9는 인산 칼슘 침전 후 원위치 프라이머 확장 처리된 세포의 텔로머라제 활성 검출을 나타내는 형광/PCR 사이클 그래프이다.
도 1은 생물 시료의 텔로머라제 활성을 검출 및 정량하는 방법 100을 나타낸다. 먼저, 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 갖는 제1 반응 혼합물 및 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 갖는 제2 반응 혼합물을 함유하는 반응 튜브에 생물 시료를 가한다 (단계 102). 고온에서 용융하는 왁스층으로 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리한다. 생물 시료를 반응 튜브의 상부를 차지하는 제1 반응 혼합물과 혼합하고, 텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조하기에 적합한 조건하에 인큐베이션한다 (단계 104). 이후, 왁스층을 용융시켜 확장 생성물을 제2 반응 혼합물과 혼합하고 (단계 108), 실시간 PCR에 의해 증폭시킨다 (단계 110). 제1 반응 혼합물 중의 확장되지 않은 제1 프라이머와 제2 반응 혼합물 중의 제2 프라이머가 PCR 증폭을 위한 프라이머 쌍을 형성한다. 이어서, 반응 튜브 중의 PCR 생성물의 양을 공지된 양의 대조군 템플레이트를 갖는 대조군 튜브 중의 PCR 생성물의 양과 비교하여 생물 시료의 텔로머라제 활성을 정량한다 (단계 112). 이 실시양태에서, 제1 프라이머 확장 및 PCR 반응에 대한 실험 조건을 최적화하여 단일 293T 세포로부터 텔로머라제 활성을 검출하였다.
생물 시료로는 대상체로부터 단리된 조직, 세포 및 생물 유체, 및 대상체내 존재하는 조직, 세포 및 생물 유체가 포함된다. 생물 시료로는 또한 1차 세포, 형질전환된 세포, 및 배양된 임의의 다른 세포가 포함된다. 본 발명의 방법이 단지 텔로머라제의 RNA 또는 단백질 성분의 존재가 아니라 RNase 민감성 리보뉴클레오단백질인 텔로머라제의 활성을 검출하기 때문에, 본 발명의 방법은 효소 활성 세포 또는 조직 시료를 필요로 한다. 한 실시양태에서, 생물 시료는 대상체로부터 통상의 방법, 예를 들어 생검법에 의해 단리된 조직 시료이다. 바람직하게는, 생물 시료는 세포 또는 조직 추출물, 특히 인간 세포 또는 조직 유래의 추출물이다. 세포를 반복하여 해동/동결하거나, 세포 또는 조직을 균질화하거나, 또는 비이온성 및(또는) 쯔비터이온성 디터전트를 함유하는 용해 완충액 중에 세포 또는 조직을 용해시켜 추출물을 제조할 수 있다. 비이온성 디터전트의 예로는 트윈(Tween) 20, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, 폴리도칸올 (Thesit), NP-40, n-옥틸글루코시드, n-도데실글루코시드, n-도데실-베타-D-말토시드, 옥타노일-N-메틸글루카미드(MEGA-8), 데카노일-N-메틸글루카미드(MEGA-10), 및 이소트리데실-폴리(에틸렌글리콜에테르)n가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 쯔비터이온성 디터전트의 예로는 CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판-술포네이트), CHAPSO (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸-암모니오]-2-히드록시-1-프로판-술포네이트), N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판-술포네이트, 및 디지토닌이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 용해 완충액 중 디터전트의 양은 약 0.1 중량％ 내지 약 2 중량％로 달라질 수 있다. 한 실시양태에서, 용해 완충액은 약 0.5 중량％의 디터전트를 함유한다.
텔로머라제가 RNA 및 단백질 성분을 둘 다 함유하기 때문에, 추출물에 프로테아제 및(또는) RNase 저해제를 첨가하여 추출물 중의 텔로머라제가 다른 세포 프로테아제에 의해 파괴되는 것을 방지할 수 있다. 프로테아제 저해제의 예로는 아마스타인, 4-아미디노페닐메탄술포닐 플루오라이드 (AMPSF), 안티페인, 아프로티닌, 베스타틴, 키모스타틴, 시스타틴, 3,4-디클로로이소쿠마린, 에벨락톤 A 및 B, 엘라스타티날, 에틸렌디아민, 테트라-아세트산 (EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA), 류펩틴, 펩스타틴 A, 페닐메틸 술포닐 플루오라이드 (PMSF), 포스포르아미돈, 토실 리실 클로로메틸케톤 (TLCK), 토실 페닐알라닐 클로로메틸케톤 (TPCK), 및 트립신 저해제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. RNase 저해제의 예로는 췌장 유형 RNase 저해제, 인간 태반 RNase 저해제, 및 디에틸 피로카르보네이트 (DEPC)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
반응 튜브는 본 발명의 방법의 특정 적용 요건에 적합한 임의의 형태 또는 크기의 용기일 수 있다. 전형적으로, 반응 튜브는 당업자에게 잘 알려진 PCR 튜브 또는 PCR 웰이다.
제1 반응 혼합물 중의 제1 프라이머는 텔로머라제 기질로서 적합한 올리고데옥시리보뉴클레오티드이다. 제1 프라이머는 2가지 기능으로 작용한다: 즉, 제1 프라이머는 확장 생성물을 제조하는 텔로머라제에 대한 기질로서 작용하며, 이후의 PCR 반응에서 프라이머로서 작용하기도 한다. 한 실시양태에서, 제1 프라이머의 길이는 뉴클레오티드 10개 내지 60개 길이이다. 다른 실시양태에서, 제1 프라이머의 길이는 뉴클레오티드 12개 내지 30개 길이이다. 바람직하게는, 텔로머라제 기질로서 작용하는 제1 프라이머가, 기질로서 제1 프라이머를 사용하는 특정 텔로머라제의 완전한 텔로미어 반복부 서열을 함유하지 않는다. 예를 들어, 인간 텔로머라제는 서열 5'-TTAGGG-3' (서열 1)의 텔로미어 반복부를 부가한다. 따라서, 인간 텔로머라제 활성에 대한 본 발명의 분석 방법을 이용한다면, 텔로머라제 기질은 서열 5'-TTAGGG-3'의 완전한 반복 서열이 결여된 인간 텔로머라제 기질이어야 한다. 이는 텔로머라제가 텔로미어 반복부의 부가에 의해서만 텔로머라제 기질을 확장할 수 있기 때문이다. 따라서, PCR 반응에서 제1 프라이머와 프라이머 쌍을 형성하는 제2 프라이머는 텔로미어 반복부에 상보적인 서열을 필수적으로 포함할 것이다. 텔로머라제 확장 반응에 사용된 제1 프라이머(즉, 텔로머라제 기질)가 완전한 텔로미어 반복부를 포함한다면, PCR 반응에 사용된 제2 프라이머는 확장되지 않은 제1 프라이머와 쉽게 혼성화하여 잠재적으로는 음성 PCR 결과를 초래하게 될 프라이머 이량체를 형성할 수 있을 것이다.
반응 혼합물 중의 뉴클레오시드 트리포스페이트로는 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 반응 혼합물은 dATP, dGTP, dCTP, 및 dUTP와 dTTP 중 어느 하나를 등몰비로 함유한다. 뉴클레오시드 트리포스페이트는 집합적으로 dNTP로 표시한다.
제1 반응 혼합물은 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트 이외에도 텔로머라제의 프라이머 확장 반응에 대한 최적 pH를 유지하는 완충계를 함유할 수도 있다. 완충계의 예로는 인산염 완충계, 시트르산염 완충계, 붕산염 완충계, 트리스-(히드록시메틸)아미노메탄, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니올]-1-프로판 술포네이트 (CHAPS), N-[2-히드록시에틸]피페라진-N'-2-[에탄술폰산](HEPES), 및 3-[N-모르폴리노]프로판술폰산(MOPS)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조하는데 적합한 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 통상적으로, 텔로미어 확장 반응은 약 20℃ 내지 30℃에서 약 10분 내지 60분 동안, 바람직하게는 약 25℃ 또는 약 30℃에서 약 15분 내지 30분 동안, 가장 바람직하게는 약 25℃에서 약 20분 동안 수행한다.
단계 104의 확장 생성물은 템플레이트에 의존하여 추가로 연장할 수 있다 (단계 106). 이러한 연장은 효소 반응에 의해, 예를 들어 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 뉴클레오티드를 부착하거나 또는 DNA 리가제를 사용하여 짧은 DNA 단편을 라이게이션하여 달성하는 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 말단 트랜스퍼라제에 의해 확장 생성물의 3' 말단에 폴리A 테일을 부가한다. 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 10개 내지 20개의 짧은 DNA 올리고머를 확장 생성물의 3' 말단에 라이게이션한다. 이러한 변형은 제2 프라이머에 대한 특이적 서열을 생성시키며, 따라서 제1 프라이머에 완전한 텔로미어 반복부 서열을 포함시킨다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 인간 텔로미어 반복부 TTAGGG를 함유하는 제1 프라이머를 인간 텔로머라제 기질로 사용한다. 텔로머라제 매개된 확장 후, 확장 생성물은 (TTAGGG)nTTAGGGTTAGGG-3'의 3' 서열(여기서, n은 0 이상의 정수임)을 가질 것이다. 확장 생성물의 3' 말단에 뉴클레오티드 10개 이상의 폴리A 테일을 부가하는 추가의 템플레이트 의존적 연장 후, 연장된 확장 생성물은 (TTAGGG)nTTAGGGTTAGGGAAAAAAAAAAAm-3'의 3' 서열(여기서, n은 0 이상의 정수임)을 가질 것이다. 이어서, 텔로미어 반복부 서열의 연결부에 상보적인 서열 및 연장된 확장 생성물의 3' 말단의 폴리A 서열을 갖는 제2 프라이머를 설계할 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 제1 프라이머가 그의 3' 말단에 완전한 텔로미어 반복부 서열을 갖지 않는다면, 텔로미어 반복부와 추가의 뉴클레오티드의 연결부에 상보적인 제2 프라이머가 확장되지 않은 제1 프라이머와 확장된 생성물을 구별할 수 있을 것이다.
추가의 연장 단계 106의 부재하에, 제2 반응 혼합물 중의 제2 프라이머가 프라이머 이량체와 같은 비-특이적 PCR 생성물의 형성을 최소화하기 위해 다수개의 불완전한 텔로미어 반복부 서열 및 하나 이상의 완전한 텔로미어 반복부 서열을 함유하는 것이 전형적이다.
제2 반응 혼합물 중의 DNA 폴리머라제는 표준 PCR 조건에 적합한 임의의 DNA 폴리머라제일 수 있다. 이러한 효소는 당업자에게 잘 알려져 있다. 어떤 실시양태에서, 제2 반응 혼합물은 확장 생성물의 PCR 증폭에서 최적의 마그네슘을 제공하는 마그네슘 염을 함유하기도 한다. 다른 실시양태에서, 제2 반응 혼합물은 제1 프라이머 또는 dNTP, 또는 이들 둘 다를 함유한다.
제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층은 약 50℃ 내지 90℃ 범위, 바람직하게는 약 60℃ 내지 80℃ 범위의 용융 온도를 가져야 한다. 어떤 실시양태에서, 제1 반응 혼합물 및 제2 반응 혼합물 중 어느 하나에 미량의 염료를 첨가하여 PCR 증폭에 앞서 왁스층을 통한 가능한 누출을 모니터링할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 반응 혼합물은 왁스와 예비혼합되며, 왁스가 고화될 때 왁스층내에 국한된다. 왁스층이 더 높은 온도에서 용융되는 경우, 제2 반응 혼합물의 함유물이 방출된다.
확장 생성물 (추가로 연장되거나 연장되지 않음)은 실시간 PCR 증폭에 의해 정량한다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 템플레이트를 함유하는 반응 혼합물에 열안정성 효소 및 프라이머 쌍을 첨가하고 열 사이클을 다수회 수행함으로써 PCR 증폭을 달성하는 것이 전형적이다. 방법 100에서, 제1 반응 혼합물 중의 확장되지 않은 제1 프라이머가 5' PCR 프라이머로 작용하며, 제2 반응 혼합물 중의 제2 프라이머가 3' PCR 프라이머로 작용한다.
형광 공명 에너지 전달(FRET) 기술을 이용하여 실시간 PCR 반응의 PCR 생성물을 검출할 수 있다. 각 증폭의 선형 부분을 공지된 템플레이트를 사용하여 생성한 표준 그래프와 비교함으로써 특정 PCR 생성물의 축적을 측정할 수 있다.
한 실시양태에서, 2개의 플랭킹(flanking) PCR 프라이머 사이의 서열에 결합하는 형광 표지된 프로브 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 PCR 반응을 통상적으로 수행한다. 이 방법은 프로브의 5' 말단으로부터 형광 표지된 뉴클레오티드를 절단하는 Taq 폴리머라제의 5' 엑소뉴클레아제 활성에 의존한다. 또한, 프로브 올리고뉴클레오티드는 전체 형광을 억제하는 형광 켄쳐(quencher)를 3' 말단에 가지며, 따라서 5' 표지된 뉴클레오티드가 제거되는 경우에 두 형광단 사이의 거리가 너무 멀어져 서로를 방해할 수 없기 때문에 켄칭 효과가 상실된다. 각 사이클에서 형광이 더 증가하여 전체 PCR 반응이 실시간으로 수행된다. 지수적으로 증폭되는 선형 부분을 표준 그래프와 비교하여 반응물에 존재하는 템플레이트 DNA의 양을 계산할 수 있다. 이러한 검출계의 예로는 태크만(TaqMan)(등록상표) 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 실시양태에서, 단일-표지된 형광발생 프라이머, 예를 들어 LUX(등록상표) 프라이머 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 앰플리플루오르(Amplifluor) RP(등록상표) 프라이머 (Chemicon, Temecula, CA)를 사용하여 PCR 생성물을 검출한다. 형광발생 프라이머가 이중 가닥 PCR 생성물에 혼입되는 경우에 프라이머는 형광 방출량 증가를 나타낸다. 이후, 밀폐된 반응 튜브에서 각 PCR 사이클의 증폭 단계 동안 생성된 형광을 기준으로 PCR 생성물의 양을 결정한다.
또 다른 실시양태에서, 이중 가닥 DNA에 우선적으로 결합하는 형광 염료를 사용하여 PCR 생성물을 검출한다. 따라서, SYBR(등록상표) 그린(Green)과 같은 염료는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프라이머의 존재하에 생성된 이중 가닥 생성물의 양을 정확하게 정량할 수 있다.
반응 튜브 중의 형광 증가와 공지된 양의 대조군 템플레이트를 함유하는 대조군 튜브 중의 형광 증가를 비교하여 텔로머라제 활성을 정량한다 (단계 110). 전형적으로, 대조군 템플레이트의 여러 희석물을 함유하는 대조군 튜브 또는 웰의 세트를 사용하여 실시간 PCR을 수행함으로써 표준 그래프를 작성한다. 이어서, 동일한 PCR 조건하에 시험 튜브 또는 웰 중의 확장 생성물을 증폭시키고, 표준 그래프를 기준으로 시험 튜브 또는 웰 중의 텔로머라제 활성을 정량한다. 일반적으로, 텔로머라제 활성은 일정 시간내에 합성된 텔로미어 반복부의 양으로 표현한다. 인간 텔로머라제에 대한 바람직한 대조군 템플레이트는 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG-3'의 서열(서열 2)을 갖는 TSR9이다.
다른 실시양태에서, 제1 프라이머, 제2 프라이머, dNTP, DNA 폴리머라제, 및 이중 가닥 DNA에 우선적으로 결합하는 형광 염료를 함유하는 마스터(master) 반응 혼합물에 세포 또는 조직 추출물을 첨가한다. 텔로머라제 매개된 확장 및 PCR 증폭을 동일한 반응 튜브에서 연속적으로 수행한다.
도 3은 텔로머라제 활성의 검출을 위한 또 다른 방법 300을 나타낸다. 이 실시양태에서, 원형 세포내에서 프라이머 확장 단계를 수행한다. 구체적으로, 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 원형 시료 세포에 도입하고 (단계 302), 이어서 세포 구조의 일체성을 유지하면서 세포의 텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조하기에 적합한 조건하에 시료 세포를 인큐베이션한다 (단계 304). 확장 생성물이 시료 세포 내부에서 생성되기 때문에, 단계 304를 "원위치 프라이머 확장 단계"로 부르기도 한다. 이어서, 실시간 PCR 및 대조군 템플레이트를 이용하여 확장 생성물을 증폭 및 정량한다 (단계 308). 한 실시양태에서, 시료 세포를 제2 반응 혼합물과 혼합하고, PCR 증폭으로 처리한다. 다른 실시양태에서, 시료 세포를 용해 완충액 중에 용해시키고, 용해물을 실시간 PCR 반응에 사용한다.
별법으로, 텔로머라제 매개된 프라이머 확장 완료 후에 시료 세포를 저장할 수 있다 (단계 306). 이 실시양태에서, 확장 생성물이 원형 시료 세포내에 여전히 존재하기 때문에, 이 확장 생성물은 세포/조직 추출물을 사용하여 생성된 확장 생성물보다 더 잘 보존될 수 있다. 따라서, 상기 방법 300에서 조작자는 시료 수령 직후에 텔로머라제 매개된 프라이머 확장 단계를 수행할 수 있으며, 중간 생성물, 즉 프라이머 확장 단계 304 이후의 시료 세포를 추후의 정량을 위해 저장할 수 있다.
시료 세포는 현탁액 중에 배양하거나 단층으로 배양할 수 있다. 당업자에게 잘 알려진 방법을 이용하여 세포에 제1 프라이머 및 dNTP를 도입할 수 있다. 그러한 방법의 예로는 인산 칼슘 침전법, DEAE 덱스트란(Dextran) 형질감염법, 리포펙션법/리포펙타민 형질감염법, 전기천공법, 미세주입법, 초음파분해법, 기계적 전단법 (예, 주사기 바늘을 통해 세포를 밀어넣음), 및 세포막을 파열시키거나 세포막의 투과성을 향상시키는 기타 화학적 또는 물리적 수단이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 세포를 현탁시켜 25-게이지 바늘을 통해 1회 이상, 바람직하게는 2회 내지 5회 통과시킨다. 이후, 제1 프라이머 및 dNTP를 함유하는 배양 배지 중의 반응 튜브 또는 웰에 상기 세포를 파종(seed)한다. 주사기 바늘을 통해 통과시키는 전단 효과는 세포막을 손상시켜 제1 프라이머가 세포에 진입하도록 한다. 이어서, 주사기-처리된 세포를 제1 프라이머 및 dNTP와 함께 인큐베이션하여 세포의 텔로머라제에 의해 확장 생성물을 생성시킨다.
다른 실시양태에서, 인산 칼슘 침전법을 이용하여 세포에 제1 프라이머 및 dNTP를 도입한다. 인산 칼슘 침전물은 제1 프라이머 및 dNTP의 존재하에 형성되며, 이를 세포에 가한다. 이후, 세포를 37℃에서 약 10분 내지 120분 동안 인큐베이션하여 세포의 텔로머라제에 의해 확장 생성물을 생성시킨다.
본 발명의 방법은 텔로머라제-관련 질병, 예를 들어 호지킨(Hodgkin's) 병의 진행 또는 중증도를 측정하는 진단 분석법으로 사용할 수 있다. 또한, 텔로머라제 활성의 정량은 예를 들어 치료 후 텔로머라제-관련 질병의 중증도를 결정하는데 유용하다.
예를 들어, 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 함유하는 연장 조성물, 및 제2 프라이머, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 이중 가닥 DNA 결합 염료 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 검출 조성물을 함유하는 미리 포장된 진단 키트를 이용함으로써 본원에 기술된 검출 방법을 수행할 수 있다. 연장 조성물은 텔로머라제와 혼합되는 경우에 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조할 수 있으며, 검출 조성물은 PCR 반응에서 확장 생성물을 증폭시키고 정량을 위한 표지된 증폭 생성물을 생성시킬 수 있다. 진단 기트는 예를 들어 호지킨 병과 같은 텔로머라제 관련 질병의 증상 또는 가족력을 나타내는 대상체를 진단하는 임상 상황에서 편리하게 사용될 수 있다. 텔로머라제가 발현되는 임의의 세포 유형 또는 조직은 본원에 기술된 예후 또는 진단 분석에서 사용할 수 있다.
한 실시양태에서, 생물 시료 중의 텔로머라제 활성을 측정하며, 이 활성이 소정의 정상 수준을 넘어 증가한 것은 호지킨 병과 같은 텔로머라제 관련 질병을 암시한다.
본원에 기술된 검출 방법은 비정상적인 텔로머라제 활성과 관련된 호지킨 병과 같은 텔로머라제-관련 질병이 발병했거나 또는 발병할 위험이 있는 대상체를 확인하는 예후 분석으로 이용할 수도 있다.
또한, 본원에 기술된 예후 분석을 이용하여 비정상적인 텔로머라제 활성과 관련된 질병의 치료용 또는 예방용 약물 후보를 대상체에 투여할 수 있는지를 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 비정상적인 텔로머라제 활성과 관련된 질병용 작용제로 대상체를 효과적으로 치료할 수 있는지를 결정하는 방법을 제공한다. 예후 분석을 계획하여 텔로머라제 관련 질병의 치료를 수행한 대상체가 장기간 생존 또는 질병 진행 동안 불량한 외양을 갖는지를 결정할 수 있다. 발병으로부터 후속 단계에 이르기까지 질병의 여러 단계들에서 텔로머라제 활성 프로필을 확립함으로써, 특정 활성 프로필이 불량한 예후 가능성 증가와 상관관계에 있는 활성 패턴이 나타날 수 있다. 이어서, 예후를 이용하여 더 공격적인 치료 프로그램을 계획하고 장기간 생존 및 번영 가능성을 증가시킬 수 있다. 유사하게, 기초 약물 스크리닝 또는 임상 실험에서 본 발명의 검출 방법을 이용하여 텔로머라제의 활성에 대한 작용제 (예, 약물, 소분자, 단백질, 뉴클레오티드)의 영향을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 스크리닝 분석에 의해 결정된, 텔로머라제 활성을 감소시키는 작용제의 효과는 텔로머라제 활성 증가를 나타내는 대상체의 임상 실험에서 모니터링할 수 있다. 이러한 임상 실험에서, 텔로머라제 활성은 특정 조직의 표현형에 대한 "판독 결과(read-out)"로 이용할 수 있다.
어떤 실시양태에서, 본 발명은 (i) 작용제의 투여 전에 대상체로부터 투여 전 시료를 얻는 단계; (ii) 투여 전 시료의 텔로머라제 활성 수준을 검출하는 단계; (iii) 대상체로부터 하나 이상의 투여 후 시료를 얻는 단계; (iv) 투여 후 시료의 텔로머라제 활성 수준을 검출하는 단계; (v) 투여 전 시료의 텔로머라제 활성 수준을 투여 후 시료 또는 시료들의 텔로머라제 활성 수준과 비교하는 단계; 및 (vi) 이에 따라 대상체에 투여하는 작용제를 변경하는 단계를 포함하는, 작용제를 사용한 대상체의 치료 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 작용제의 투여 감소는 텔로머라제 활성을 검출된 것보다 더 높은 수준으로 증가시키는데, 즉 작용제의 효과를 감소시키는데 바람직할 수 있다. 이러한 실시양태에 따라, 텔로머라제 활성은 관찰가능한 표현형 반응이 없는 경우에도 작용제 효과에 대한 지시자로 사용할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 텔로머라제 검출 방법은 텔로머라제 저해제의 효과 평가, 텔로머라제 활성과 세포 배양 조건 사이의 관계 측정, 텔로머라제 활성과 노화 또는 텔로머라제 활성과 종양발생 사이의 관계 결정, 텔로머라제 관련 질병의 진단 및 상기 질병 치료의 모니터링을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 용도로 사용할 수 있다.
실시예 1, 프라이머 비율 측정
5％ CO2를 갖는 습윤된 인큐베이터내 37℃에서 10％ 소과 동물 태아 혈청 (FBS)을 함유하는 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM))에서 293T 세포주 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 얻은, 전단된 인간 아데노바이러스 타입 5 (Ad 5) DNA 및 SV40 T-항원에 의해 형질전환된 1차 인간 배아 신장)를 배양하였다. 70％ 내지 85％ 전면생장된 시점에서 세포를 수획하여 계수하고, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0.1 mM 벤즈아미딘, 5 mM b-메르캅토에탄올, 0.5％ w/v CHAPS 및 10％ w/v 글리세롤 (CHAPS 용해 완충액)을 함유하는 용해 완충액을 사용하여 빙상에서 30분 동안 용해시켰다. BCA 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 세포 추출물을 -70 ℃에서 저장하였다.
인터그레이티드(Integrated) DNA 테크놀러지스, 인크.(Technologies, Inc.) (Coralville, IA)에 주문하여 올리고뉴클레오티드 프라이머를 입수하였다. 제1 프라이머 (FP)는 5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'의 서열(서열 3)을 가지며 TS로 표시되고, 제2 프라이머 (SP)는 5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3'의 서열 (서열 4)을 가지며 ACX로 표시된다. 제1 프라이머 대 제2 프라이머의 프라이머 비율의 효과를 시험하기 위해, 상이한 비율 (FP:SP = 1:1, 1:0.8, 1:0.5 및 1:0.2)을 사용하였다. 요컨대, 다르게 희석된 세포 추출물 1 ㎕를 프라이머 혼합물(상이한 비율의 TS/ACX 0.5 ㎍) 1 ㎕, 물 11.5 ㎕, 및 0.25 유닛 DNA 폴리머라제, 2.5 mM의 dATP, dUTP, dCTP 및 dGTP, 및 SYBR 그린 (몰레큘라 프로브스 인크.(Molecular Probes Inc., Eugene, OR)로부터 구입한 SYBR 그린 1 모액(S-7563)의 1:2000 희석물)을 함유하는 PCR 프리믹스(premix) 완충액 12.5 ㎕와 함께 혼합하고, 25 ℃에서 20분 동안 먼저 인큐베이션한 다음 95 ℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 정량 실시간 PCR (95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 40 사이클)에 의해 증폭시켰다. 그 결과, 비율 1/1 (w/w)이 최적의 결과를 제공한 것으로 나타났다 (표 1).
실시예 2, 분석 민감도 측정
텔로머라제 활성 분석 방법의 민감도를 시험하기 위해, 실시예 1에 기재된 조건 및 1/1의 FP/SP 비율하에 여러가지 양(또는 세포수)의 293T 세포 추출물을 사용하여 분석을 수행하였다. 표 2 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 이 방법에 의해 단일 293T 세포로부터 텔로머라제 활성을 검출할 수 있다.
실시예 3, 표준 그래프 작성
실시간 PCR 반응으로부터의 결과를 정량하기 위해, 실시예 2에 기재된 조건하에 대조군 템플레이트 분자를 사용하여 텔로머라제 활성과 역치 사이클을 통한 반응 당 템플레이트 분자수를 상호 관련시키는 표준 그래프를 작성하였다. 표 3 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 표준 반응 조건하의 실시간 PCR의 역치(CT)의 판독값 및 대조군 템플레이트 TSR9를 사용하여 표준 그래프를 작성하였다. 도 6은 293T 세포수와 역치 사이클 사이의 선형 회귀 및 대조군 템플레이트 TSR9 분자수와 역치 사이클 사이의 선형 회귀를 나타낸다.
실시예 4, 텔로머라제 분석 방법의 특이성
텔로머라제 분석 방법의 특이성을 시험하기 위해, MCF7 (유방 흉막 유출 선암종), ZR-75-1 (유방 복수 관 암종) 및 Hela (자궁경부 선암종) 세포를 비롯한 여러 종양 세포주, 뇌, 신장, 간, 심장, 고환 및 혈액을 비롯한 다양한 쥐과 동물 조직 (성체 C57BL/6 마우스로부터 회수함), 및 293T 세포 유래의 (95℃에서 10분 동안) 열 불활성화된 추출물을 사용하여 분석을 수행하였다. 표 4 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 텔로머라제 활성은 증식 세포, 암 세포주 (293T, Hela, MCF7 및 ZR-75-1)에서는 검출되지만, 열 불활성화된 293T 세포 추출물 및 블랭크 대조군에서는 검출되지 않는다. 또한, 결과는 정상 성체 쥐과 동물 조직에서 텔로머라제 활성이 낮았음을 나타내는데, 이는 정상 조직내의 증식 세포 (예, 줄기 세포)가 검출될 수 있음을 암시한다.
실시예 5, 반응 혼합물의 안정성
텔로머라제 분석에 사용된 시약의 안정성을 시험하기 위해, 제1 프라이머 TS, DNA 폴리머라제, dNTP 및 SYBR 그린을 함유하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물의 분취물을 실온에서 0, 24, 48 또는 72시간 동안 유지하고, 텔로머라제 분석에서 시험하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 반응 혼합물은 실온에서 적어도 72 시간까지 안정한 것으로 보인다.
실시예 6, 원형 세포에서의 프라이머 확장
293T 세포를 배양 배지(5％ C02를 갖는 습윤된 인큐베이터내 37℃에서 10％ 소과 동물 태아 혈청(FBS)을 함유하는 둘베코스 변형 이글 배지(DMEM))에서 배양하였다. 세포를 트립신으로 처리하고, 배양 배지로 세척하고, 배양 배지 중에 1×106 세포/ml의 밀도로 현탁시키고, 하기 처리법 중의 하나로 처리하였다:
처리 A: 세포 현탁액을 멸균 원심분리 튜브에 전달하고, 베크만(Beckman) GS-6R 원심분리기로 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 인산염 완충 염수(PBS) 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 25 게이지 바늘을 통해 멸균된 1 ml 주사기로 인출한 다음, 플런저(plunger)상에 일정한 압력을 가하여 배출시켰다. 이러한 주사기 과정을 5회 반복하였다. 세포를 멸균 원심분리 튜브에 튜브 당 1×104개의 세포로 전달하고, TS 프라이머를 갖거나 갖지 않는 전달 배지 (2.5 mM dNTP 및 0.1％ 소과 동물 혈청 알부민 (BSA))를 가하였다. 세포를 37 ℃에서 60분 동안 배양하였다. 튜브를 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 현탁액을 수획하였다. 챕스(Chaps) 완충액을 사용하여 4℃에서 30분 동안 펠릿을 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 20분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 수획하고, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 사용에 앞서 -70℃에서 저장하였다.
별법으로, 상기 주사기 과정 후에 세포를 96 웰 플레이트내에 웰당 1×104개의 세포 밀도로 넣고, 5％ C02를 갖는 습윤된 인큐베이터내 37℃에서 밤새 배양할 수 있다. 다음날, 세포를 PBS로 세척할 수 있으며, 원하는 양의 전달 완충액 (TS 프라이머, 0.5 ㎍/웰, dNTP 2.5 mM 및 0.1％ BSA를 함유하는 PBS; 또는 dNTP, 2.5 mM 및 0.1％ BSA를 함유하는 PBS, 또는 PBS 단독)을 각 배지에 가한다. 37℃에서 30분, 60분 및 밤새 동안 인큐베이션한 다음, 세포를 수획하여 4℃에서 30분 동안 CHAPS 완충액으로 용해시킨다. 용해물을 14,000 rpm으로 원심분리한다. 상등액을 수획하고, 95℃에서 10분 동안 가열하고, 사용에 앞서 -70℃에서 저장한다.
처리 B: 세포 현탁액을 96-웰 플레이트에 직접 파종하고, 밤새 배양하고, 인산 칼슘 침전법을 이용하여 원하는 양의 TS 프라이머 및 dNTP로 형질감염시켰다. 요컨대, 293T 세포를 배양 배지 (10％ FBS를 함유하는 DMEM)에서 밤새 배양하였다. 형질감염 3시간 전에 상기 배양 배지를 신선한 배양 배지로 교체하였다. 인산 칼슘 침전물 (기브코(GIBCO)사의 인산 칼슘 키트를 사용함)이 TS 프라이머 및 dNTP (HBS 100 ㎕, 인산염 2 ㎕, H20 26 ㎕, 운반체 DNA 10 ㎕, 제1 프라이머 20 ㎕, 0.25 mM dNTP, 12 ㎕ 칼슘)의 존재하에 형성되었으며, 상기 침전을 세포에 가하였다. 세포를 37℃에서 10, 30 및 60분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 30분 동안 CHAPS 용해 완충액으로 용해시켰다. 용해물을 100℃에서 10분 동안 가열하고, 14,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 상등액을 수획하고, -70℃에서 저장하였다.
상기 처리 A 또는 B로부터의 용해물 1 ㎕를 물 11.5 ㎕, 및 dNTP (각 뉴클레오시드 트리포스페이트에 대해 2.5 mM), DNA 폴리머라제 0.25 유닛, ACX 프라이머 0.25 ㎍을 함유하는 프리믹스 12.5 ㎕와 혼합하고, 정량적 실시간 PCR (95℃에서 10분, 95℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 35 내지 40 사이클)로 처리하였다. 도 8에 나타낸 결과는, 처리 A에 기술된 TS 프라이머 및 dNTP를 사용한 1시간 인큐베이션 후 293T 세포에서 텔로머라제 활성이 검출될 수 있음을 나타낸다. 도 9에 나타낸 결과는 처리 B에 기술된 바와 같이 TS 프라이머 및 dNTP를 함유하는 인산 칼슘 침전물을 사용한 30분 인큐베이션 후 293T세포에서 텔로머라제 활성이 검출될 수 있음을 나타낸다. TS 프라이머가 없는 경우에는 텔로머라제 활성이 검출되지 않았는데, 이는 검출된 생성물이 텔로머라제 특이적임을 시사한다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시양태 및 그의 이점을 상세히 기재하였지만, 본 명세서에 첨부된 청구의 범위에 정의된 조성물 및 방법 및 이들의 등가물의 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양하게 변화, 대체 및 변경할 수 있음은 물론이며, 이러한 모든 것들은 첨부된 청구의 범위내인 것으로 의도된다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 개시내용이 본원에 참고로 포함되는, 2002년 11월 12일 출원된 미국 특허 가출원 제60/425,620호를 우선권으로 주장한다.
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Claims (20)

  1. 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 제2 반응 혼합물, 및 반응 튜브내 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 포함하는 반응 튜브에 생물 시료를 가하는 단계;
    텔로머라제가 제1 프라이머로부터 3' 말단을 갖는 확장 생성물을 제조하기에 적합한 조건하에 생물 시료와 제1 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
    왁스층을 용융시켜 확장 생성물과 제2 반응 혼합물을 혼합하는 단계;
    단일 293T 세포로부터 텔로머라제 활성이 검출되도록 허용하는 조건하에 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 확장 생성물을 증폭하는 단계; 및
    대조군 템플레이트를 사용하여 상기 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계
    를 포함하는, 생물 시료의 텔로머라제 활성의 검출 및 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물 시료를 세포 또는 조직 추출물 형태로 가하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제1 프라이머와 제2 프라이머 사이의 서열에 결합하는 형광 표지된 프로브 올리고뉴클레오티드를 사용하여 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 정량하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 이중 가닥 DNA에 우선적으로 결합하는 형광 염료의 존재하에 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 제2 프라이머는 이중 가닥 폴리머라제 연쇄 반응 생성물에 혼입되는 경우에 형광 방출량을 증가시키는 단일-표지된 형광발생 프라이머인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 폴리아데닐화 및 라이게이션 중 어느 하나에 의해 확장 생성물을 3' 말단에서 연장시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 대조군 템플레이트가 서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
  8. 시료 세포에 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 도입하는 단계;
    텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조하기에 적합한 조건하에 시료 세포를 인큐베이션하는 단계;
    실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 확장 생성물을 증폭하는 단계; 및
    대조군 템플레이트를 사용하여 상기 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계
    를 포함하는, 시료 세포의 텔로머라제 활성의 검출 및 정량 방법.
  9. 제8항에 있어서, 용해 완충액으로 시료 세포를 용해시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 인산 칼슘 침전법에 의해 시료 세포에 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 도입하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 시료 세포를 바늘을 통해 1회 이상 통과시키고 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 함유하는 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 과정에 의해 시료 세포에 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 도입하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 이중 가닥 DNA에 우선적으로 결합하는 형광 염료의 존재하에 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 방법.
  13. 제8항에 있어서, 이중 가닥 폴리머라제 연쇄 반응 생성물에 혼입되는 경우에 형광 방출량을 증가시키는 형광발생 프라이머인 제2 프라이머의 존재하에 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 대조군 템플레이트가 서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
  15. 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 제2 반응 혼합물, 및 반응 튜브내 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 포함하는 반응 튜브에 생물 시료를 가하는 단계;
    텔로머라제가 제1 프라이머로부터 확장 생성물을 제조하기에 적합한 조건하에 생물 시료와 제1 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계;
    폴리아데닐화 및 라이게이션 중 어느 하나에 의해 확장 생성물을 3' 말단에서 연장하는 단계;
    왁스층을 용융시켜 확장 생성물과 제2 반응 혼합물을 혼합하는 단계;
    단일 293T 세포로부터 텔로머라제 활성이 검출되도록 허용하는 조건하에 실시간 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 확장 생성물을 증폭하는 단계; 및
    대조군 템플레이트를 사용하여 상기 증폭된 확장 생성물을 정량하는 단계
    를 포함하며, 여기서 제2 프라이머가 연장된 확장 생성물의 3' 말단의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 생물 시료의 텔로머라제 활성의 검출 및 정량 방법.
  16. 제1 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함하는 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 제2 반응 혼합물, 및 반응 튜브내 제1 반응 혼합물과 제2 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 포함하는 반응 튜브; 및
    상기 제1 반응 혼합물, 제2 프라이머, 대조군 템플레이트 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 제3 반응 혼합물, 및 대조군 튜브내 제1 반응 혼합물과 제3 반응 혼합물을 분리하는 왁스층을 포함하는 대조군 튜브
    를 포함하는, 텔로머라제 활성 검출용 키트.
  17. 제16항에 있어서, 대조군 템플레이트가 서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 키트.
  18. 제16항에 있어서, (a) DNA 폴리머라제 또는 (b) 리가제 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 연장 혼합물을 추가로 포함하는 키트.
  19. 시료 세포를 용해시키는 용해 완충액;
    제1 프라이머, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 제2 프라이머 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 반응 완충액; 및
    서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 2에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대조군 템플레이트
    를 포함하는, 텔로머라제 활성 검출용 키트.
  20. 텔로머라제 활성을 저해하는 작용제의 투여 전에 대상체로부터 투여 전 시료를 얻는 단계;
    투여 전 시료의 텔로머라제 활성 수준을 검출하는 단계;
    대상체로부터 하나 이상의 투여 후 시료를 얻는 단계;
    투여 후 시료의 텔로머라제 활성 수준을 검출하는 단계; 및
    투여 전 시료의 텔로머라제 활성 수준을 투여 후 시료 또는 시료들의 텔로머라제 활성 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 상기 작용제를 사용한 대상체의 치료 효과를 모니터링하는 방법.
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