CN107058591A - 端粒长度检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人类染色体端粒长度快速定量检测方法及其试剂盒，其特征在于对生物染色体端粒DNA长度和变化速率的精准测量。基本原理为对染色体端粒DNA的从98℃到50℃的快速变温，实现温度的快速降温，达到液相双链探针核酸分子杂交的目的。通过检测杂交前后的荧光值，计算荧光变化值，换算成单位待测DNA对应的荧光变化量，即用杂交前后分别检测荧光值的变化量除以杂交用DNA的量表示端粒DNA的相对长度。本发明严格控制杂交的温度和温度下降的时间，最大限度降低端粒DNA自身的复性，使其与探针杂交更充分，因此，具有准确、快速、廉价、方便、高效和省时省力的优点，为端粒DNA长度的检测提供一个简便实用的技术方法。

Description

端粒长度检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种从外周血DNA中快速定量检测染色体端粒DNA平均长度的技术方法及其试剂盒，属于分子生物学检测领域。具体是涉及一种通过简单的荧光探针与端粒DNA竞争性杂交及定量测量探针杂交的荧光信号来实现对端粒DNA平均长度的测量的技术，可以应用于人体生物年龄检测，人类慢性病的评估及促衰老和抗衰老药物药效学的检测和评估。

背景技术

端粒（Telomere）是由存在于真核细胞染色体末端的一小段特殊的端粒DNA及其结合蛋白构成的核酸蛋白复合体，是染色体保持完整和稳定的三大要素之一（另外两大要素为着丝粒和复制原点），主要作用是稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，即保护染色体末端免于融合和退化，保持染色体的完整性和控制细胞分裂周期，在染色体定位、复制、保护和控制细胞生长及寿命方面具有重要作用。

端粒DNA的组成和功能。端粒DNA由简单的DNA高度重复序列组成。在人类中其重复单位序列为TTAGGG，新生儿脐带血重复序列长度平均约10kb，其长度决定了端粒的长度。端粒DNA具有非常重要的功能，正常体细胞中DNA分子每次复制，端粒DNA就缩短一点。一旦端粒DNA消耗到一定程度，染色体将变得极不稳定，细胞也将会激活凋亡机制，走向凋亡。细胞每有丝分裂一次，就有一段端粒序列丢失，当端粒长度缩短到一定程度，会使细胞停止分裂，导致衰老与死亡。所以，端粒DNA长度反映细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟”。

组织培养的细胞实验证明，端粒在决定动植物细胞的寿命中起着重要作用，经过多代培养的老化细胞端粒均变短，染色体也变得不稳定。细胞分裂次数越多，其端粒越短，细胞寿命也越短。因此，端粒的长短，往往代表细胞分裂潜力的大小：端粒越短，表明细胞年纪越老，剩余的分裂次数越少；端粒越长，则意味着细胞的活力越强，人体的生殖细胞就具有最长的端粒。所以，Olovnikov提出端粒学说，细胞在每次分裂过程中都会由于DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体，最后复制的端粒DNA序列可能会部分丢失，最终造成细胞衰老死亡。因此，端粒的长度是一个人老化程度的最重要和准确的指标。

端粒DNA长度和变化速率的意义。有些细胞类型如生殖系细胞，其端粒长度并不随细胞分裂而变短，秘密在于一种能够修复端粒的端粒酶。端粒酶是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，能以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，再连接到新合成DNA链末端，从而修复缩短了的端粒。在人体内端粒酶在大多数的胚胎组织、生殖细胞、炎性细胞、更新组织的增生细胞以及肿瘤细胞中表达。大量实验证实端粒、端粒酶活性与细胞衰老及永生有关。如体外培养不同年龄供体的成纤维细胞发现，随着供体增龄，端粒的长度逐渐变短，有丝分裂的能力明显渐渐变弱；生殖细胞系由于具有较高的端粒酶活性，其端粒可以维持其长度，要比一般体细胞的长；体细胞缺失端粒酶活性，端粒逐渐变短，会逐渐衰老；转化细胞通过端粒酶的活性完全复制端粒以得永生。因此，通过测定端粒的长度，了解端粒、端粒酶活性与细胞衰老的关系具有非常重要的意义。

体细胞端粒长度与有丝分裂能力呈正比，而不同的体细胞其有丝分裂能力是不尽相同的，胃肠黏膜细胞的分裂增殖速度就比较快，神经细胞分裂的速度就比较慢。端粒DNA长度是一个人老化速度的最重要和准确的指标，它会随着人们年龄的增长而缩短，是衰老的最佳生物标志物。但是，每条染色体都有两个端粒，每个端粒的端粒DNA长度都可能有所不同，这给端粒长度的测定带来了困难。另外，端粒的绝对长度与寿命的关系并不成正比，体细胞端粒长度与个体的寿命及不同组织器官的预期寿命并非一致，例如鼠的端粒比人类长近5-10倍，寿命却比人类短得多。因此，测定端粒长度的缩短速度也是非常重要的方面。

端粒长度的变化速度与氧化应激关系密切。研究表明氧化应激在一定程度上可以引起人淋巴细胞端粒长度的缩短；维生素C具有一定的抗氧化作用，它能减低过氧化损伤，从而减缓端粒缩短的速率。糖尿病的病理特征就是糖脂代谢异常，其中氧化应激在糖尿病的发生发展过程中起到了关键性的作用。有研究表明，T1DM组外周血白细胞端粒长度较对照组明显缩短，胰岛素抵抗和2型糖尿病患者外周白细胞端粒长度也均明显缩短，而2型糖尿病患者端粒长度减短的幅度更为明显。胰岛素抵抗时端粒长度进一步减短可作为2型糖尿病的一个独立危险因素。因此，研究端粒DNA的长度与人体慢性疾病之间的关系是一个崭新的医学研究方向。

端粒DNA检测中存在的问题和解决方案目前，端粒DNA长度和变化速率的检测尚无令人满意的技术方法。这是由于每个细胞中染色体的端粒长度都不相同，且随细胞分裂处于不停的动态变化过程之中，因此，要想精确测定端粒DNA的长度异常困难。

目前主要有三种方法测定端粒的长度：

1、Southern blot，目前该方法被认为是金标准方法，系将提取到的待测基因组DNA首先用限制性内切酶HinfⅠ消化，再用琼脂糖凝胶电泳分离，转移至尼龙膜上后与放射性同位素P32标记的（CCCATT）N探针杂交，放射自显影显示端粒DNA片段位置，测其光密度进行半定量检测。该技术所测得的端粒序列还包含了亚端粒区序列，不能提供端粒的实际长度，也不能对端粒长度进行精确的定量。同时该技术耗时耗力，且需要大量的DNA。

2、flow-FISH，它综合了流式细胞仪和荧光原位杂交，但技术复杂，存在细胞固定与染色体DNA完全变性的固有矛盾，且杂交探针进入细胞的数量与未杂交探针洗出细胞的完全性均无法控制，且需要在整个实验流程中保持细胞完整才能分析，而且定量不够准确。

3、定量PCR，即设计合成端粒DNA序列特异的引物对端粒DNA进行荧光定量PCR扩增，同时用单个参考基因来标准化端粒分析的Ct值，每个样品的端粒长度表示为相对的端粒与单拷贝基因的比值（T/S比值）。端粒长度，该方法虽然灵敏度高，但由于端粒DNA序列为近上千拷贝的6核苷酸重复序列，扩增过程中出现的产物极其复杂，且重复序列本身就难以有效扩增，因此定量结果难以令人信服，也缺乏标准化。

综上所述，尽管端粒DNA长度是一个人老化速度的最重要和准确的指标，但是目前国内外还缺乏有效的端粒DNA长度定量检测技术。因此，建立一套稳定可靠、操作简便、快速准确的定量检测端粒DNA平均长度的新方法，并可用于个体生物学年龄的检测及抗衰老药物研发与评价，具有重要现实意义。

有鉴于此，我们设计发明了一种通过竞争性荧光探针杂交快速检测端粒长度的技术方法，从而实现对端粒长度的快速准确定量检测。

发明内容

本发明目的在于提供一种操作简便，快速准确的定量检测染色体端粒DNA长度的技术方法及其成套试剂盒。

本发明的技术原理是：提供一种快速准确的定量检测染色体端粒DNA长度的技术方法：首先根据人类端粒DNA序列设计合成一对特殊标记的人端粒DNA特异的荧光探针，两条探针序列互补，而且标记的荧光基团及标记位置不同，一条于5’端标记一种荧光素，另一条于3’端标记能够淬灭该荧光素荧光的淬灭基团，使两条探针杂交结合成双链，荧光素与荧光淬灭基团在空间位置上相互靠近从而使该双链探针在常温条件下检测不到荧光素的荧光。当加入一定量的待测DNA并加热变性时，基因组DNA及双链探针变性为单链；降温杂交时，由于探针浓度远远高于待测DNA浓度，因而两条探针分别与其互补的端粒DNA链杂交，荧光素与淬灭基团空间位置上相互分离，其荧光能够被检测；多余的单链探针随着杂交反应的完成而互相复性为双链探针，其荧光素的荧光被淬灭基团所淬灭，因而分子杂交前检测到的荧光值为杂交体系的荧光本底，杂交后检测到的荧光为结合于靶端粒DNA上的探针的荧光与荧光本底之和，分子杂交前后荧光变化量反映了结合靶端粒DNA探针的量，间接反映端粒DNA重复序列的长短。从而通过检测杂交前后探针荧光素的荧光值计算其荧光变化值，及每单位量的DNA对应的荧光变化值，从而计算端粒DNA的平均长度。

本发明的技术方案具体为：

一种端粒长度的检测方法，采用液相双链探针核酸分子杂交方法检测端粒DNA相对长度。

一种端粒长度的检测方法，根据人类端粒DNA序列设计合成一对特殊标记的人端粒DNA特异的双链荧光探针，使过量的双链荧光探针与一定量的待测DNA混合于杂交缓冲液中，通过加热升温变性与降温杂交使探针与靶DNA特异结合并发出荧光，多余的探针杂交成双链不发荧光；再通过检测杂交前后的荧光值，计算荧光变化值，换算成单位待测DNA对应的荧光变化量，即用杂交前后分别检测荧光值除以杂交用DNA的量表示端粒DNA的相对长度。

进一步的，所述双链荧光探针的两条荧光探针长度15-24nt，序列互补，而且标记的荧光基团及标记位置不同，一条于5’端标记FAM荧光素，另一条于3’端标记TAMRA淬灭基团，并使两条探针杂交结合成双链。

进一步的，所述双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'。

进一步的，所述加热升温变性的温度为98℃，降温杂交的温度为45℃-65℃。

一种端粒长度的检测方法，包括

（1）首先根据人类端粒DNA序列设计合成一对特殊标记的人端粒DNA特异的荧光探针，并使其结合成双链，双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'；

（2）取待测受试者外周静脉血3-5ml于枸橼酸钠盐抗凝采血管中，实验室常规酚氯仿抽提法提取其DNA，溶解于TE缓冲液中，得混合液A，并测定混合液A中DNA的浓度；

（3）将双链荧光探针混于核酸杂交缓冲液中，得混合液B；

（4）取含有10μg DNA的混合液A加入到含有50μL混合液B的试管中，其中，50μL混合液B中含有1μM双链荧光探针，并记录其荧光值；然后加热到98℃变性DNA与双链荧光探针，再迅速降温至50℃使双链荧光探针与端粒DNA竞争性分子杂交，杂交完全后再次测定其荧光值，计算杂交前后荧光值的变化量与用于杂交的DNA的量的比值表示端粒DNA的相对长度。

本发明还提供了一种端粒长度的检测试剂盒，其中包括：

双链荧光探针；所述双链荧光探针的两条荧光探针长度15-24nt，序列互补，标记的荧光基团一条于5’端标记FAM荧光素，另一条于3’端标记TAMRA淬灭基团，两条探针杂交结合成双链；所述双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'；以及

杂交缓冲液。

本发明的有益效果是：本发明采用液相竞争性杂交不仅能够大大提高杂交的效率，省时省力，而且避免了一般核酸分子杂交的洗涤步骤，能够快速、高通量地定量检测端粒DNA的长度。

具体实施方式

实施例

端粒长度的检测方法

（1）首先根据人类端粒DNA序列设计合成一对特殊标记的人端粒DNA特异的荧光探针，并使其结合成双链，此时TAMRA将FAM发出的荧光淬灭，检测不到FAM的荧光；双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'；

（2）取待测受试者外周静脉血3-5ml于枸橼酸钠盐抗凝采血管中，实验室常规酚氯仿抽提法提取其DNA，溶解于TE缓冲液中，得混合液A，并测定混合液A中DNA的浓度；

（3）将双链荧光探针混于核酸杂交缓冲液中，得混合液B；

（4）取含有10μg DNA的混合液A加入到含有50μL混合液B的试管中，其中，50μL混合液B中含有1μM双链荧光探针，在静态荧光检测仪上测定并记录其荧光值；然后加热到98℃变性DNA与双链荧光探针，再迅速降温至50℃左右使双链荧光探针与端粒DNA竞争性竞争性核酸分子杂交2小时，杂交完全后再次测定其荧光值，计算杂交前后荧光值的变化量与用于杂交的DNA的量的比值表示端粒DNA的相对长度。

SEQUENCE LISTING

<110> 张晓

<120> 端粒长度检测方法及其试剂盒

<130> 0

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 根据人类端粒DNA重复序列设计人工合成并进行末端修饰

<400> 1

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-.3' 15

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 根据人类端粒DNA重复序列设计人工合成并进行末端修饰

<400> 2

3'.TAMRA-CCCAATCCCAATCCC-5' 15

Claims (7)

1.一种端粒长度的检测方法，其特征在于：采用液相双链探针核酸分子杂交方法检测端粒DNA相对长度。

2.一种端粒长度的检测方法，其特征在于：根据人类端粒DNA序列设计合成一对特殊标记的人端粒DNA特异的双链荧光探针，使过量的双链荧光探针与一定量的待测DNA混合于杂交缓冲液中，通过加热升温变性与降温杂交使探针与靶DNA特异结合并发出荧光，多余的探针杂交成双链不发荧光；再通过检测杂交前后的荧光值，计算荧光变化值，换算成单位待测DNA对应的荧光变化量，即用杂交前后分别检测荧光值除以杂交用DNA的量表示端粒DNA的相对长度。

3.根据权利要求2所述的端粒长度的检测方法，其特征在于：所述双链荧光探针的两条荧光探针长度15-24nt，序列互补，而且标记的荧光基团及标记位置不同，一条于5’端标记FAM荧光素，另一条于3’端标记TAMRA淬灭基团，并使两条探针杂交结合成双链。

4.根据权利要求2或3所述的端粒长度的检测方法，其特征在于：所述双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'。

5.根据权利要求2所述的端粒长度的检测方法，其特征在于：所述加热升温变性的温度为98℃，降温杂交的温度为45℃-65℃。

6.一种端粒长度的检测方法，其特征在于：包括

（1）首先根据人类端粒DNA序列设计合成一对特殊标记的人端粒DNA特异的荧光探针，并使其结合成双链，双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'；

（2）取待测受试者外周静脉血3-5ml于枸橼酸钠盐抗凝采血管中，提取其DNA，溶解于TE缓冲液中，得混合液A，并测定混合液A中DNA的浓度；

（3）将双链荧光探针混于核酸杂交缓冲液中，得混合液B；

（4）取含有10μg DNA的混合液A加入到含有50μL混合液B的试管中，其中，50μL混合液B中含有1μM双链荧光探针，并记录其荧光值；然后加热到98℃变性DNA与双链荧光探针，再迅速降温至50℃使双链荧光探针与端粒DNA竞争性分子杂交，杂交完全后再次测定其荧光值，计算杂交前后荧光值的变化量与用于杂交的DNA的量的比值表示端粒DNA的相对长度。

7.一种端粒长度的检测试剂盒，其中包括：

双链荧光探针；所述双链荧光探针的两条荧光探针长度15-24nt，序列互补，标记的荧光基团一条于5’端标记FAM荧光素，另一条于3’端标记TAMRA淬灭基团，两条探针杂交结合成双链；所述双链荧光探针的序列及标记为：

5'.FAM-GGGTTAGGGTTAGGG-3'

3'.TAMRA-CCC AATCCC AATCCC-5'；以及

杂交缓冲液。