JP2006506068A - テロメラーゼ活性を検出するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
プライマー伸長、次いでリアルタイムPCR定量を用いてテロメラーゼ活性を測定する方法が開示される。本発明の方法は、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性に関して、迅速な、感度よい、且つ正確な測定を提供する。一つの態様において、当該方法は、第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物;第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物;及び第1反応混合物と第2混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること;生物学上のサンプルを第1反応混合物とインキュベートすること;伸長産物を第2反応混合物と混合すること;リアルタイムPCRを用いて伸長産物を増幅及び定量すること、の工程を含む。別の態様において、上記検出方法は、完全細胞内で伸長産物の生成を許容するインサイチュプライマー伸長工程を含む。この態様においては、定量工程の完了の前に延長された時間のための適切な条件下で伸長産物が保存される。
Description
関連出願に対するクロスレファレンス
この出願は、2002年11月12日に出願された合衆国仮特許出願連続番号60/425,620の利益を主張し、その開示は引用により本明細書に編入する。
この出願は、2002年11月12日に出願された合衆国仮特許出願連続番号60/425,620の利益を主張し、その開示は引用により本明細書に編入する。
技術分野
本発明は、一般的には、医学上の診断及び予後の技術に関する。特定すれば、本発明は、テロメラーゼ活性の検出のための方法及び組成物に関する。
本発明は、一般的には、医学上の診断及び予後の技術に関する。特定すれば、本発明は、テロメラーゼ活性の検出のための方法及び組成物に関する。
背景
テロメラーゼは、染色体の末端上でテロメアを合成する酵素である。テロメアは真核染色体の末端に見いだされるDNA配列であり、複製の間の遺伝情報の忠実度を保持する。正常な状況下では、テロメアは細胞分割の各サイクルと共に短くなる。十分に短いテロメアは、細胞が分割を停止させるシグナルを送ると信じられる。
テロメラーゼは、染色体の末端上でテロメアを合成する酵素である。テロメアは真核染色体の末端に見いだされるDNA配列であり、複製の間の遺伝情報の忠実度を保持する。正常な状況下では、テロメアは細胞分割の各サイクルと共に短くなる。十分に短いテロメアは、細胞が分割を停止させるシグナルを送ると信じられる。
テロメラーゼは、DNAを創製するための鋳型としてRNAを使用する逆転写酵素として知られる種類の酵素である。テロメラーゼは、RNA成分及び蛋白質成分の両方を含む。当該酵素のRNA部分はテロメア中のDNAに結合し、一方蛋白質部分はDNAサブユニットを当該領域へ誘い出し、それらを染色体の末端に付着させる。テロメラーゼは、次に、テロメアリピートを付加することにより染色体の末端のGリッチ鎖を伸長する。この伸長は、テロメラーゼのRNA成分の一部の逆転写により生じ、その部分はテロメアリピートに相補な配列を含む。Gリッチ鎖のテロメラーゼにより触媒された伸長に続き、テロメアの相補なDNA鎖は、より慣用な手段により、おそらく複製される。真核生物の場合、テロメラーゼは、例えばヒトにおいては配列TTAGGGを含む、繰り返された限定ヌクレオチド配列(リピート)の蓄積から構成される。
テロメラーゼ活性は、生殖細胞を除いた正常組織では検出不可能である。生殖細胞は、その染色体末端が繰り返しラウンドのDNA複製を通して保持されなければならず、おそらくはテロメラーゼ活性のために、時間と共にそれらのテロメラーゼの長さを減少させることがない。再生する組織の幹細胞は極めて低いレベルのテロメラーゼを発現し、そしてそれらのテロメアは複数の細胞分割により短くなる。テロメラーゼ活性は、時折、腫瘍に隣接した組織において検出可能であり、肉眼では見えない微小癌組織の転移の存在を反映する可能性がある。
テロメラーゼは細胞の老化のプロセスにおいて役割を有すると信じられている。体細胞中のテロメラーゼ活性の抑圧は、それらが分割する回数を制御するのに重要らしい。事実、初期繊維芽細胞中のテロメアの長さは、老化する前にそれらの細胞が経験できた分割の回数と、よく相関する。テロメアDNAの損失は、多細胞生物がそれらの細胞の増殖を制限することによる全体の機構の一部として、その複製能力の終わりを細胞に合図するのかもしれない。
複製を制御するその役割のために、テロメラーゼは、最近、腫瘍形成にも関係付けられてきた。テロメラーゼ活性はほとんどの腫瘍細胞において検出された。テロメラーゼがヒト癌細胞の制御されていない成長に必須であることが示唆されている。正常細胞と異なり、癌細胞においては、分割を停止するためのシグナルを細胞が決して受け入れないようにテロメアの長さを保持することにより、テロメラーゼが細胞の不死性を授与するらしい。テロメラーゼ酵素は、この酵素がヒトの腫瘍において約90%活性であるがほとんどの正常細胞においては不活性であるため、化学治療のための理想的な標的である。製薬会社は、テロメラーゼをブロックすることができる薬剤を発見するために幾千もの化合物をスクリーニングした。
テロメラーゼリピート増幅プロトコル(TRAP)と呼ばれる方法が、テロメラーゼ活性を測定するために開発された。TRAPは、酵素活性のインビトロ検出を基礎とする。簡単に言えば、テロメア配列由来の合成オリゴヌクレオチドを基質として使用する。この基質を試験サンプル中のテロメラーゼにより伸長させ、そして次に伸長産物を増幅及び定量する。TRAP法の詳細な記載は、例えば、Harleyらに対する合衆国特許番号5,891,639(以後、Harley)及びEmrichらに対する合衆国特許番号6,221,584(以後、Emrich)に見いだすことができる。最近、多数の研究グループが、リアルタイムポリメラーゼチェイン反応(PCR)技術を用いた修飾TRAP法を報告した(例えば、Hou et al.,Clin.Chem.47:519−524,2001;Elmore et al.,Diagn.Mol.Pathol.,11,177−185,2002;及びWege et al.,Nucleic Acids Res.,31:E3−3,2003を参照)。特定すれば、テロメラーゼの伸長産物の迅速かつより感度の高い定量を提供するために、リアルタイムPCR技術を用いた。
現在のTRAPsは、複数のインキュベーション工程及び各インキュベーション工程の後のサンプルの一つのチューブから別のチューブへの移し替えを含むのが典型的である。移し替えのプロセスは、時間を浪費し、そして汚染及び誤操作をこうむる(例えば、サンプルを間違ったチューブ又はウエルに加えること)。現在のTRAPsは、細胞抽出物又は組織抽出物から始めるのが典型的である。RNA成分と蛋白質成分の両方を含むテロメラーゼは、抽出物中のプロテアーゼ及びRNaseの消化に供されるから、テロメラーゼの分解を防ぐために、プロテアーゼ阻害剤及び/又はRNase阻害剤がしばしば必要とされる。プロテアーゼ阻害剤及び/又はRNase阻害剤の抽出物への添加は、分析のコストを増加させる。即ち、より柔軟性があり、且つ低コストにて容易に素早く実施可能なテロメラーゼアッセイに関する要求が存在する。
概要
プライマー伸長、続いてリアルタイムのPCRを用いてテロメラーゼ活性を測定するための方法が開示される。当該方法は、生物学上のサンプル中での迅速で、感度がよく、そして正確なテロメラーゼ活性測定を提供する。
プライマー伸長、続いてリアルタイムのPCRを用いてテロメラーゼ活性を測定するための方法が開示される。当該方法は、生物学上のサンプル中での迅速で、感度がよく、そして正確なテロメラーゼ活性測定を提供する。
一つの態様において、上記方法は、(1)第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物、第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物、及び第1反応混合物と第2混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること;(2)第1プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下で生物学上のサンプルを第1反応混合物とインキュベートすること;(3)伸長産物を第2反応混合物と混合すること;(4)単一の293T細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせる条件下でリアルタイムPCRを用いて伸長産物を増幅すること;及び(5)工程(4)の条件下で増幅される対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、の工程を含む。上記態様の単一のチューブのデザインは、実験手法を単純化させ、そして実験誤差を減らす。
別の態様において、上記検出方法は、(1)サンプル細胞へ第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を導入すること;(2)細胞内で第1プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下でサンプル細胞をインキュベートすること;(3)リアルタイムPCRを用いて伸長産物を増幅すること;及び(4)工程(3)の条件下で増幅される対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、の工程を含む。この態様において、伸長産物は完全なサンプル細胞の中で生成され、そして定量工程の完了の前の延長された時間、適切な条件下で保存できる。
また、上記方法を実施するため及びテロメラーゼ関連疾患を診断するための試薬キットも開示される。一つの態様において、当該試薬キットは、(1)第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物、第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物、及び第1反応混合物を第2混合物反応から分離するワックス層を含む反応チューブ、及び(2)第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物、第2プライマー、DNAポリメラーゼ及び対照鋳型を有する第2反応混合物、及び第1反応混合物を第2混合物反応から分離するワックス層を含む、対照チューブ又はウエルを含む。
詳細な説明
図1は、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量する方法を示す。最初に、生物学上のサンプルを、第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第2反応混合物及び第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物を含む反応チューブに加える(工程102)。第1反応混合物は、高温で溶けるワックスの層により、第2反応混合物から分離される。生物学上のサンプルを第1反応混合物と混合し、反応チューブの上部を占め、第1プライマーから伸長産物を生成するためにテロメラーゼのために適した条件下でインキュベートされる(工程104)。伸長産物は、次に、ワックス層を溶かすことにより第2反応混合物と混合され(工程108)、そしてリアルタイムPCRにより増幅される(工程110)。第1反応混合物中の伸長されなかった第1プライマー及び第2反応混合物中の第2プライマーが、PCR増幅のためのプライマー対を形成する。次に、反応チューブ中のPCR産物の量を公知の量の対照鋳型を有する対照チューブの中のPCR産物の量に比較することにより、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を定量する(工程112)。この態様において、第1プライマー伸長及びPCR反応のための実験条件は、単一の293T細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせるように、最適化される。
図1は、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量する方法を示す。最初に、生物学上のサンプルを、第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第2反応混合物及び第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物を含む反応チューブに加える(工程102)。第1反応混合物は、高温で溶けるワックスの層により、第2反応混合物から分離される。生物学上のサンプルを第1反応混合物と混合し、反応チューブの上部を占め、第1プライマーから伸長産物を生成するためにテロメラーゼのために適した条件下でインキュベートされる(工程104)。伸長産物は、次に、ワックス層を溶かすことにより第2反応混合物と混合され(工程108)、そしてリアルタイムPCRにより増幅される(工程110)。第1反応混合物中の伸長されなかった第1プライマー及び第2反応混合物中の第2プライマーが、PCR増幅のためのプライマー対を形成する。次に、反応チューブ中のPCR産物の量を公知の量の対照鋳型を有する対照チューブの中のPCR産物の量に比較することにより、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を定量する(工程112)。この態様において、第1プライマー伸長及びPCR反応のための実験条件は、単一の293T細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせるように、最適化される。
生物学上のサンプルは、被験者から単離された組織、細胞、及び生物学上の流体、並びに被験者中に存在する組織、細胞及び生物学上の流体を含む。生物学上のサンプルは、始原(primary)細胞、形質転換された細胞、及びあらゆるその他の培養細胞をも含む。本発明の方法はRNase感受性のリボヌクレオプロテインであるテロメラーゼの活性を検出するのであって、単にテロメラーゼのRNA成分及び蛋白質成分の存在を検出するのではないから、上記方法は酵素上活性な細胞又はサンプルを必要とする。一つの態様において、生物学上のサンプルは、被験者から慣用手段により単離された組織サンプル、例えば生検である。好ましくは、生物学上のサンプルは、細胞抽出物又は組織抽出物、特にヒト細胞又は組織からの抽出物である。抽出物は、細胞の凍結/解凍の繰り返しによるか、細胞又は組織をホモジェナイズするか、又は非イオン性又は/及び両性イオン性の洗浄剤を含む溶解バッファーの中で細胞又は組織を溶解することにより、生成してよい。非イオン性洗浄剤の例は、限定ではないが、トゥイーン20、トライトンX−100、トライトンX−114,ポリドカノール(Thesit)、NP−40,n−オクチルグルコシド、N−ドデシルグルコシド、N−ドデシル−ベータ−D−マルトシド、オクタノイル−N−メチルグルカミド(MEGA−8)、デカノイル−N−メチルグルカミド(MEGA−10)、及びイソトリデシル−ポリ(エチレングリコエーテル)nを含む。両性イオン性洗浄剤の例は、限定ではないが、CHAPS(3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパン−スルフォネート)、CHAPSO(3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシ−1−プロパン−スルフォネート)、N−ドデシル−N,N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパン−スルフォネート、及びジギトニンを含む。溶解バッファー中の洗浄剤の量は、約0.1重量%から約2重量%まで変更してよい。一つの態様において、溶解バッファーは約0.5重量%の洗浄剤を含む。
テロメラーゼはRNA成分及び蛋白質成分の両方を含むから、プロテアーゼ及び/又はRNase阻害剤を抽出物に添加することにより、他の細胞プロテアーゼによる抽出物中のテロメラーゼの分解を防いでよい。プロテアーゼ阻害剤の例は、限定ではないが、アマスタチン、4−アミジノフェニルメタンスルフォニルフルオリド(AMPSF)、アンチパイン、アプロチニン、ベスタチン、キモスタチン、シスタチン、3,4−ジクロロイソクマリン、エベラクトンA及びB、エラスタチナル、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、エチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)、ロイペプチン、ペプスタチンA、ふぇにるメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)、ホスホロアミドン、トシルリジルクロロメチルケトン(TLCK)、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)、及びトリプシン阻害剤を含む。RNase阻害剤の例は、限定ではないが、膵臓タイプのRNase阻害剤、ヒト胎盤RNase阻害剤、及びジエチルピロカーボネート(DEPC)を含む。
反応チューブは、上記方法の特定の適用の要求に適合したあらゆる形態及びサイズのコンテナであり得る。第1のプライマーは2つの機能を担う:伸長産物を生成するためのテロメラーゼの基質となり、そして次のPCR反応においてプライマーとしても機能する。一つの態様において、第1プライマーの長さは10−60ヌクレオチドである。別の態様において、第1プライマーの長さは12ー30ヌクレオチドである。好ましくは、第1プライマーはテロメラーゼの基質として機能するが、第1プライマーを基質として用いる特定のテロメラーゼの全テロメアリピート配列を含まない。例えば、ヒトのテロメラーゼは配列5’−TTAGGG−3’(配列番号:1)のテロメアリピートを付加する。従って、本発明の方法を用いてヒトのテロメラーゼ活性をアッセイするのなら、テロメラーゼ基質は完全なリピート配列5’−TTAGGG−3’を欠くヒトテロメラーゼ基質であるべきである。理由は、テロメアリピートの添加によってのみテロメラーゼはテロメラーゼ基質を伸長できるからである。よって、第2プライマーはPCR反応において第1プライマーとプライマー対を形成するためのものであるが、必然的に、テロメアリピートに相補な配列を含むことになる。テロメラーゼ伸長反応において用いられる第1プライマー(即ち、テロメラーゼ基質)がテロメアリピートを含むのなら、その場合、PCR反応において用いられる第2プライマーは、伸長していない第1プライマーに容易にハイブリダイズして、プライマーダイマーを形成して、負のPCR結果を導く可能性がある。
反応混合物中のヌクレオシド3リン酸は、限定ではないが、デオキシアデノシン3リン酸(dATP)、デオキシグアノシン3リン酸(dGTP)、デオキシウリジン3リン酸(dUTP)、デオキシチミジン3リン酸(dTTP)及びデオキシシチジン3リン酸(dCTP)を含む。一つの態様において、反応混合物は、dATP,dGTP,dCTP及びdUTPかdTTPのうちの一方を等モル比にて含む。ヌクレオシド3リン酸は集合的にdNTPsと記される。
第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸に加えて、第1反応混合物は、テロメラーゼのためのプライマー伸長反応のために最適なpHを保持するためのバッファー系を含んでもよい。バッファー系の例は、限定ではないが、リン酸バッファー系、クエン酸バッファー系、硼酸バッファー系、(トリス−ヒドロキシメチル)アミノメタン、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパン−スルフォネート(CHAPS)、N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−2−[エタンスルフォン酸](HEPES)、及び3−[N−モルフォリノ]プロパンスルフォン酸(MOPS)を含む。
テロメラーゼが第1プライマーから伸長産物を生成するのに適した条件は、当業界公知である。典型的には、テロメア伸長反応が約20−30℃において約10−60分間、好ましくは約25℃においてか又は約30℃において約15−30分間、そしてもっとも好ましくは約25℃において約20分間実施される。
工程104の伸長産物は、追加の鋳型非依存性伸長(工程106)に供してよい。この伸長は、好ましくは、酵素反応により、例えばターミナルトランスフェラーゼを用いてヌクレオチドを付加することによるか、又はDNAリガーゼを用いて短いDNA断片を連結することにより達成される。一つの態様において、ポリAテイルをターミナルトランスフェラーゼにより伸長産物の3’末端に添加する。別の態様においては、10−20ヌクレオチドの短いオリゴマーを伸長産物の3’末端に連結する。これらの修飾は第2プライマーのための唯一の配列を生じ、即ち、全テロメアリピート配列の第1プライマーへの包含を可能にさせる。図2に示すとおり、ヒトテロメアリピートTTAGGGを含む第1プライマーをヒトテロメラーゼ基質として用いる。テロメラーゼ媒介性の伸長の後に、伸長産物は、(TTAGGG)nTTAGGGTTAGGG−3’の3’配列を有することになり、式中、nは0に等しいか又は0より大きい整数である。少なくとも10ヌクレオチドのポリAテイルを伸長産物の3’末端に添加する追加の鋳型非依存性伸長の後で、伸長された伸長産物は、(TTAGGG)nTTAGGGTTAGGGAAAAAAAAAAAm−3’の3’配列を有することになり、式中、nは0に等しいか又は0より大きい整数である。第2プライマーは、次に、伸長された伸長産物の3’末端におけるテロメアリピート配列とポリA配列の接合点に対して相補な配列を有するようにデザインされ得る。図2に示すとおり、テロメアリピートと追加のヌクレオチドの接合点に相補な第2プライマーは、第1プライマーがその3’末端において完全なテロメアリピート配列を有さない限り、伸長されなかった第1プライマーを伸長された産物から識別することができるべきである。
追加の伸長工程106の不在下では、第2反応混合物中の第2プライマーは、典型的には、複数の不完全なテロメアリピート配列及び少なくとも一つの完全なテロメアリピート配列を含むことにより、非特異的PCR産物、例えばプライマーダイマーの形成を最少にする。
第2反応混合物中のDNAポリメラーゼは、標準PCR条件に適したあらゆるDNAポリメラーゼであり得る。そのような酵素は当業者に知られている。一つの態様において、第2反応混合物は、伸長産物のPCR増幅のための最適なマグネシウムを提供するマグネシウム塩も含む。別の態様において、第2反応混合物は、第1プライマー、又はdNTP又は両方も含む。
第1反応混合物を第2反応混合物から分離するワックス層は、約50−90℃の範囲、そして好ましくは約60−80℃の範囲の熔融(melting)温度を有するべきである。一つの態様において、トレース量の染料を第1反応混合物か第1反応混合物の一方に加えることにより、PCR増幅の前にワックス層を通して可能な漏れを監視してよい。別の態様においては、第2反応混合物をワックスと予め混合し、そしてワックスが固形化するときにワックス層内に閉じ込められる。第2反応混合物の含有物は、ワックス層が高温において熔融するときに、放出される。
伸長産物(追加の伸長を伴おうと伴わずとも)は、リアルタイムPCR増幅により定量される。当業者には知られるとおり、PCR増幅は、典型的には、熱安定性酵素及びプライマーの対を、鋳型を含み且つ複数のサーマルサイクルを通る反応混合物に加えることにより達成される。方法100においては、第1反応混合物中の伸長されない第1プライマーが5’PCRプライマーとして機能し、そして第2反応混合物中の第2プライマーが3’PCRプライマーとして機能する。
リアルタイムPCR反応におけるPCR産物は蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)技術を用いて検出できる。特異的PCR産物の蓄積は、各増幅の直線部分を公知の鋳型を用いて生じさせた標準曲線と比較することにより、測定することができる。
一つの態様において、pH反応は通常どおりに実施されるが、2つのフランキングPCRプライマーの間の配列に結合する蛍光標識プローブオリゴヌクレオチドの添加により実施される。上記方法は、プローブの5’末端から蛍光標識ヌクレオチドを分割するTaqポリメラーゼの5’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。上記プローブオリゴヌクレオチドは全蛍光を抑圧する3’末端における蛍光クエンチャーも有するので、5’標識ヌクレオチドを除去するときには効果が失われ、なぜなら2つのフルオロフォアの距離は互いに干渉しあうのにはあまりに離れすぎているからである。各サイクルは蛍光の増大をさらに生じさせ、全PCR反応がリアルタイムにおいて追随することを可能にさせる。反応中に存在する鋳型DNAの量は対数増幅の直線部分を標準曲線と比較することにより計算することができる。各検出系の例は、限定ではないが、TaqMan(登録商標)システム(アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア)。
別の態様において、PCR産物は、単一標識の蛍光原性(fluorogenic)プライマー、例えばLUX(登録商標)(インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア)及びAmplifluor RP(登録商標)プライマー(ケミコン、テメクラ、カリフォルニア)を用いて検出される。プライマーは、蛍光原性プライマーが二重鎖PCR産物に取り込まれた場合に、増量した蛍光放射を生じる。次に、密閉された反応チューブ内の各PCRサイクルの増幅工程の間に生成する蛍光に基づいて、PCR産物の量を測定する。
また別の態様においては、二重鎖DNAに選択的に結合する蛍光染料を用いて、PCR産物を検出する。染料、例えばSYBR(登録商標)Greenは、即ち、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーの存在下で作成された二重鎖産物の量を定量することができる。
テロメラーゼ活性は、反応チューブ中の蛍光の増加を、公知量の対照鋳型を含む対照チューブ内の蛍光の増加に対して比較することにより、定量される(工程110)。典型的には、リアルタイムPCRを実施することにより、異なる希釈の対照鋳型を含むセットの対照チューブ又はウエルを用いて、標準曲線を生じさせる。テロメラーゼ活性は、通常、一定の時間内に合成されたテロメアリピートの量に基づいて表現される。ヒトテロメラーゼのための好ましい対照鋳型はTSR9であり、
5’−
AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG−3’(配列番号:2)の配列を有する。
5’−
AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAG−3’(配列番号:2)の配列を有する。
別の態様において、細胞抽出物又は組織抽出物を、第1プライマー、第2プライマー、dNTPs、DNAポリメラーゼ及び二重鎖DNAに選択的に結合する蛍光染料を含むマスター反応混合物に加える。テロメラーゼ媒介性の伸長及びPCR増幅は、同じ反応チューブ内で連続して実施される。
図3は、テロメラーゼ活性の検出のための別の方法300を示す。この態様においては、プライマー伸長工程を完全細胞中で実施する。特定すれば、第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を完全なサンプル細胞に導入する(工程302);サンプル細胞を次に細胞構造の完全性を保持しながら第1プライマーから伸長産物を生成させるのに細胞内のテロメラーゼに適した条件下でインキュベートする(工程304)。工程304は「インサイチュプライマー伸長工程」とも呼ばれるが、伸長産物がサンプル細胞の内部で生じるからである。伸長産物を、次に、リアルタイムPCR及び対照鋳型を用いて増幅及び定量する(工程308)。一つの態様においては、サンプル細胞を第2反応混合物と混合して、PCR増幅に供する。別の態様においては、サンプル細胞を溶解バッファー中で溶解して、そして溶解物をリアルタイムPCR反応に用いる。
或いは、サンプル細胞をテロメラーゼ媒介性プライマー伸長の完了後に保存してよい(工程306)。この態様において、伸長産物はまだ完全なサンプル細胞の中に存在するから、伸長産物は、細胞/組織抽出物により生成される伸長産物よりも良好に保存できる。方法300は、即ち、操作者が、サンプルを受け取った直後にテロメラーゼ媒介プライマー伸長工程を実施し、そしてのちの定量のためにプライマー伸長工程304の後に中間生成物、即ちサンプル細胞を保存することを可能にさせる。
サンプル細胞は、懸濁又は単層にて培養してよい。第1プライマー及びdNTPsは、当業者に知られた方法を用いて細胞内に導入してよい。例は、限定ではないが、リン酸カルシウム沈殿法、DEAEデキストラントランスフェクション、リポフェクチン/リポフェクタミントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、音波処理、機械的専断(例えば、シリンジ針に細胞を押し通す)、及び細胞膜を破壊するか又は細胞膜の透過性を改善するための他の化学的又は物理的手段を含む。一つの態様においては、細胞を懸濁して、25ゲージの針に少なくとも1回、好ましくは2−5回押し通す。次に、細胞を反応チューブ又はウエルの中の。第1プライマー及びdNTPsを含む培養培地に植える。針を通過することの専断効果は、細胞膜を破壊し、そして第1プライマーが細胞内に侵入するのを可能にさせる。シリンジ処理された細胞を、次に、第1プライマー及びdNTPsとインキュベートすることにより、細胞内のテロメラーゼにより伸長産物の生成を可能にする。
別の態様においては、第1プライマー及びdNTPsをリン酸カルシウム沈殿法を用いて細胞内に導入する。リン酸カルシウム沈殿法は第1プライマー及びdNTPsの存在下で形成され、そして細胞の添加される。細胞は、次に、37℃において10−120分間インキュベートされて、細胞内のテロメラーゼによる伸長産物の生成を可能にさせる。
本発明の方法は、ホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患の推移又は重度を決定するための診断アッセイにおいて使用してよい。テロメラーゼ活性の定量は、例えば、治療後のテロメラーゼ関連疾患の重度の決定にも有用である。
本明細書にて記載された検出方法は、例えば、第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を含む伸長組成物、及び第2プライマー、ヌクレオシド3リン酸、二重鎖DNA結合染料、及びDNAポリメラーゼを含む検出組成物を含む予めパッケージされた診断キットを利用することにより、実施してよい。伸長組成物はテロメラーゼと混合されたときに第1プライマーから伸長産物を生成することができ;そして検出組成物はPCR反応において伸長産物を増幅して、標識された増幅産物を定量のために生成できる。診断キットは、被験者が呈する兆候又はホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患の家族の病歴を診断するために、例えば臨床セッティングにおいて便利に使用してよい。テロメラーゼが発現される全ての細胞種又は組織を、本明細書にて記載された予後(prognostic)又は診断のアッセイにおいて利用してよい。
一つの態様においては、生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を決定し、そして予め決定された正常レベルを超えるテロメラーゼ活性の増加がホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患を示唆する。
本明細書にて記載された検出方法は、異常なテロメラーゼ活性に付随した、ホジキン病のようなテロメラーゼ関連疾患を発症する危険を有する被験者を同定するための予想アッセイとして利用することもできる。
さらに、本明細書にて記載された予想アッセイは、異常なテロメラーゼ活性に付随した疾患を治療又は予防するための薬剤の候補を被験者が投与される得るか否かを決定するために使用することができる。即ち、本発明は、異常なテロメラーゼ活性に付随した疾患のための薬剤により被験者が有効に治療され得るか否かを決定する方法を提供する。予想アッセイは、テロメラーゼ関連疾患の治療を受ける被験者が長期間の生存又は疾患の進行に関する見通しが乏しいか否かを決定するために工夫され得る。上記疾患の異なるステージのテロメラーゼ活性プロフィールを、始まりから後のステージまで確立するために、貧困な予後の増加した尤度(likelihood)に対して特定の活性プロフィールを相関させるために、活性パターンが出現するかもしれない。この予後は、次に、より攻撃的な治療プログラムを工夫して、長期間の生存及び幸福(well-being)の尤度を増加させるために使用してよい。同様に、本発明の検出方法は、テロメラーゼの活性に対する薬剤(例えば、ドラッグ類、小分子類、蛋白質類、ヌクレオチド類)の影響を監視するために基礎的なドラッグのスクリーニング又は臨床試験において使用することができる。例えば、テロメラーゼ活性を低下させるためのスクリーニングアッセイにより決定される薬剤の効果は、増加したテロメラーゼ活性を呈する被験者の臨床試験において監視することができる。そのような臨床試験においては、テロメラーゼの活性を特定の組織の表現型の「読み出し(read-out)」として使用することができる。
一つの態様において、本発明は、被験者の薬剤による治療の効果を監視するための方法を提供し、(i)薬剤を投与する前に被験者から、前投与サンプル(pre-administration sample)を得て;(ii)前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを検出し;(iii)一つ又はそれより多い後投与サンプルを被験者から得て;(iv)後投与サンプル中のテロメラーゼ活性を検出し;(v)前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを後投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルと比較し;そして(vi)薬剤の被験者への投与を結果的に変更する、工程を含む。例えば、テロメラーゼ活性を検出されたレベルよりも高いレベルに増加させる、即ち薬剤の効果を低下させるために、薬剤の投与の低下が望まれてよい。そのような態様によれば、観察可能な表現型の応答の不在下でさえ、テロメラーゼ活性を薬剤の効果の指示薬として使用してよい。
本明細書にて記載されるとおり、テロメラーゼ活性検出方法は様々な適用のために使用してよく、限定ではないが、テロメラーゼ阻害剤の効果を評価すること、テロメラーゼ活性と細胞培養条件の間の関係を測定すること、テロメラーゼ活性と薬剤の間、或いはテロメラーゼ活性と腫瘍形成能の間の関係を決定すること、テロメラーゼ関連疾患を診断すること、及びそのような疾患の治療を監視することを含む。
実施例
実施例1、プライマー比の決定
293T細胞系(専断されたヒトアデノウイルス5型(Ad 5)DNA及びSV−40のT抗原により形質転換された初代ヒト胚腎臓、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)の中で37℃において加湿インキュベーターにて5%のCO2と共に培養した。細胞を70−85%コンフルエンスにて回収し、計数し、そして10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EGTA,0.1mMベンズアミジン、5mM b−メルカプトエタノール、0.5% w/v CHAPS,及び10% w/vグリセロールを含む溶解バッファー(CHAPS溶解バッファー)を用いて氷の上で30分間かけて溶解した。蛋白質濃度はBCA蛋白質アッセイキット(ピアス、ロックフォード、イリノイ)を用いて測定した。細胞抽出物を−70℃にて保存した。
実施例1、プライマー比の決定
293T細胞系(専断されたヒトアデノウイルス5型(Ad 5)DNA及びSV−40のT抗原により形質転換された初代ヒト胚腎臓、アメリカンタイプカルチャーコレクションから得た)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)の中で37℃において加湿インキュベーターにて5%のCO2と共に培養した。細胞を70−85%コンフルエンスにて回収し、計数し、そして10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EGTA,0.1mMベンズアミジン、5mM b−メルカプトエタノール、0.5% w/v CHAPS,及び10% w/vグリセロールを含む溶解バッファー(CHAPS溶解バッファー)を用いて氷の上で30分間かけて溶解した。蛋白質濃度はBCA蛋白質アッセイキット(ピアス、ロックフォード、イリノイ)を用いて測定した。細胞抽出物を−70℃にて保存した。
オリゴヌクレオチドプライマーは、インテグレイテッドDNAテクノロジーズ社から得た。第1プライマー(FP)は、5’−AATCCGTCGAGCAGAGTT−3’(配列番号:3)を有し、そしてTSと呼び、そして第2プライマー(SP)は5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’(配列番号:4)を有し、そしてACXと呼ぶ。第1プライマー対第2プライマーのプライマー比の効果を試験するために、異なる比率(FP:SP=1:1,1:0.8,1:0.5,及び1:0.2)を用いた。簡単に言うと、異なる希釈の1μlの細胞抽出物を1μlのプライマー混合物(0.5μgのTS/ACXを異なる比率で)、11.5μlの水、及び0.25ユニットのDNAポリメラーゼ、2.5mMのdATP,dUTP,dCTP及びdGTP及びSYBRグリーン(モリキュラープローブズ社、ユージーン、オレゴンから購入した、SYBRグリーン1ストック溶液(S−7563)の1:2000希釈)を含む12.5μlのPCRプレミックスバッファーと混合し、25℃において20分間インキュベートし、そして次に95℃において10分間インキュベートし、そして定量性リアルタイムPCRにより増幅した(95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて30秒間を40サイクル)。結果は、比率1/1(w/w)が最良の結果を提供したことを示した(表1)。
実施例2、アッセイ感度の測定
テロメラーゼ活性アッセイ方法の感度を試験するため、実施例1に記載された条件及び1/1のFP/SP比において、異なる量(細胞数)の293T細胞抽出物を用いてアッセイを実施した。表2及び図4に示すとおり、上記方法は、単一の293T細胞からテロメラーゼ活性を検出できる。
テロメラーゼ活性アッセイ方法の感度を試験するため、実施例1に記載された条件及び1/1のFP/SP比において、異なる量(細胞数)の293T細胞抽出物を用いてアッセイを実施した。表2及び図4に示すとおり、上記方法は、単一の293T細胞からテロメラーゼ活性を検出できる。
実施例3、標準曲線の生成
リアルタイムPCR反応からの結果を定量するため、対照鋳型分子を用いて、実施例2に記載された条件下で標準曲線を生成して、閾値サイクルを通した反応あたりの鋳型分子数にテロメラーゼ活性を相関させた。表3及び図5に示すとおり、標準反応条件及び対照鋳型TSR9下でリアルタイムPCRの閾値(CT)の読み取りを用いて、標準曲線を生成した。図6は、293T細胞数と閾値サイクルの間の直線回帰及び対照鋳型TSR9分子数と閾値サイクルの間の直線回帰を示す。
リアルタイムPCR反応からの結果を定量するため、対照鋳型分子を用いて、実施例2に記載された条件下で標準曲線を生成して、閾値サイクルを通した反応あたりの鋳型分子数にテロメラーゼ活性を相関させた。表3及び図5に示すとおり、標準反応条件及び対照鋳型TSR9下でリアルタイムPCRの閾値(CT)の読み取りを用いて、標準曲線を生成した。図6は、293T細胞数と閾値サイクルの間の直線回帰及び対照鋳型TSR9分子数と閾値サイクルの間の直線回帰を示す。
実施例4、テロメラーゼアッセイ方法の特異性
テロメラーゼアッセイ方法の特異性を試験するため、MCF7(胸膜の流出性アデノカルシノーマ),ZR−75−1(胸部腹水の動脈管カルシノーマ)及びヒーラ(子宮頸部アデノカルシノーマ)細胞を含む幾つかの腫瘍細胞系、脳、腎臓、肝臓、心臓、精巣、及び血液を含む様々なマウス組織(成体C57BL/6マウスから回収された)並びに熱不活性化(95℃において10分間)された293T細胞からの抽出物を用いて、アッセイを実施した。表4及び図7に示すとおり、テロメラーゼ活性を、増殖細胞、癌細胞系、(293T、ヒーラ、MCF7及びZR−75−1)において検出するが、熱不活性化293T細胞抽出物及びブランク対照においては検出しない。結果は、正常な成体マウス組織において低いテロメラーゼ活性が存在したことも示したため、正常組織中の増殖細胞(例えば、幹細胞)は検出可能であることを示唆する。
テロメラーゼアッセイ方法の特異性を試験するため、MCF7(胸膜の流出性アデノカルシノーマ),ZR−75−1(胸部腹水の動脈管カルシノーマ)及びヒーラ(子宮頸部アデノカルシノーマ)細胞を含む幾つかの腫瘍細胞系、脳、腎臓、肝臓、心臓、精巣、及び血液を含む様々なマウス組織(成体C57BL/6マウスから回収された)並びに熱不活性化(95℃において10分間)された293T細胞からの抽出物を用いて、アッセイを実施した。表4及び図7に示すとおり、テロメラーゼ活性を、増殖細胞、癌細胞系、(293T、ヒーラ、MCF7及びZR−75−1)において検出するが、熱不活性化293T細胞抽出物及びブランク対照においては検出しない。結果は、正常な成体マウス組織において低いテロメラーゼ活性が存在したことも示したため、正常組織中の増殖細胞(例えば、幹細胞)は検出可能であることを示唆する。
実施例5、反応混合物の安定性
テロメラーゼアッセイにおいて使用された試薬の安定性を試験するため、第1プライマーTS、DNAポリメラーゼ、dNTPs及びSYBRグリーンを含む反応混合物を調製した。反応混合物のアリコートを室温において、0、24、48又は72時間放置し、そしてテロメラーゼアリコートにおいて試験した。表5に示すとおり、反応混合物は室温において少なくとも72時間は安定であったようである。
テロメラーゼアッセイにおいて使用された試薬の安定性を試験するため、第1プライマーTS、DNAポリメラーゼ、dNTPs及びSYBRグリーンを含む反応混合物を調製した。反応混合物のアリコートを室温において、0、24、48又は72時間放置し、そしてテロメラーゼアリコートにおいて試験した。表5に示すとおり、反応混合物は室温において少なくとも72時間は安定であったようである。
実施例6、完全細胞内でのプライマー伸長
293T細胞を成長培地(10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコイーグル修飾培地(DMEM))中で37℃にて加湿インキュベーター中で5%のCO2と共に培養した。細胞をトリプシン処理し、成長培地で洗浄し、1x106細胞/mlにて成長培地に懸濁し、そして以下の処理の一つに供した:
処理A:細胞懸濁液を滅菌遠心分離管に移し、800rpmにて5分間ベックマンGS−6R遠心分離機の中で遠心分離し、リン酸緩衝塩溶液(PBS)に再懸濁した。再懸濁細胞を滅菌1mlシリンジの中へ25ゲージの針を通して吸い上げ、そしてプランジャー上で一定の圧力によりはじいた。当該シリンジ法を5回繰り返した。細胞を滅菌遠心分離チューブに1x104細胞/チューブに移し、移動培地(2.5mMのdNTP及び0.1%のウシ血清アルブミン(BSA))を加え、そしてTSプライマーを加えるか又は加えなかった。細胞を37℃において60分間培養した。チューブを4℃において20分間遠心分離し、そして懸濁液を回収した。沈殿は、Chapsバッファーを用いて4℃において30分間溶解した。溶解物を14,000rpmにて20分間4℃において遠心分離した。上清を回収し、95℃において10分間過熱し、そして使用前に−70℃において保存した。
293T細胞を成長培地(10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコイーグル修飾培地(DMEM))中で37℃にて加湿インキュベーター中で5%のCO2と共に培養した。細胞をトリプシン処理し、成長培地で洗浄し、1x106細胞/mlにて成長培地に懸濁し、そして以下の処理の一つに供した:
処理A:細胞懸濁液を滅菌遠心分離管に移し、800rpmにて5分間ベックマンGS−6R遠心分離機の中で遠心分離し、リン酸緩衝塩溶液(PBS)に再懸濁した。再懸濁細胞を滅菌1mlシリンジの中へ25ゲージの針を通して吸い上げ、そしてプランジャー上で一定の圧力によりはじいた。当該シリンジ法を5回繰り返した。細胞を滅菌遠心分離チューブに1x104細胞/チューブに移し、移動培地(2.5mMのdNTP及び0.1%のウシ血清アルブミン(BSA))を加え、そしてTSプライマーを加えるか又は加えなかった。細胞を37℃において60分間培養した。チューブを4℃において20分間遠心分離し、そして懸濁液を回収した。沈殿は、Chapsバッファーを用いて4℃において30分間溶解した。溶解物を14,000rpmにて20分間4℃において遠心分離した。上清を回収し、95℃において10分間過熱し、そして使用前に−70℃において保存した。
或いは、シリンジ法の後に、細胞を1x104細胞/ウエルの密度にて96ウエルプレート内に収容し、そして37℃において一晩、加湿インキュベーター内で5%のCO2と共に培養してよい。次の日に、細胞をPBSで洗浄し、所望の量の移動バッファー(TSプライマー、0.5μg/ウエル、dNTP 2.5mM及び0.1%BSAを含むPBS;又はdNTP,2.5mM及び0.1%BSAを含むPBS、又はPBSのみ)を各ウエルに加える。37℃において30分間、60分間及び一晩インキュベートした後、細胞を回収し、そしてCHAPSバッファーにより4℃にて30分間で溶解した。溶解物を14,000rpmにて遠心分離した。上清を回収し、95℃において10分間過熱し、そして使用前に−70℃において保存した。
処理B:細胞懸濁液を直接96ウエルプレートに収容し、一晩培養し、そして所望の量のTSプライマー及びdNTPによりリン酸カルシウム沈殿法を用いてトランスフェクトした。簡単に言えば、293T細胞を成長培地(10%FBSを含むDMEM)の中で一晩生育させた。リン酸簡単に沈殿法(GIBCOからのリン酸カルシウムキットを用いた)は、TSプライマー及びdNTP(HBS 100ul,リン酸2ul,H2O 26ul,キャリアDNA 10ul,第1プライマー 20ul,0.25mM dNTP,12ul カルシウム)の下で形成し、そして細胞に加えた。細胞を37℃において10、30、60分間インキュベートし、そしてCHAPS溶解バッファーを用いて4℃において30分間で溶解した。溶解物を100℃において10分間過熱し、そして14,000rpmにて2分間遠心分離した。上清を回収して−70℃に保存した。
処理A又はBからの1マイクロリットルの溶解物を、11.5μlの水及びdNTPs(各ヌクレオシド3リン酸に関して2.5mM)、0.25ユニットのDNAポリメラーゼ、0.25μgのACXプライマーを含む12.5μlのプレミックスと混合し、そして定量リアルタイムPCRに供した(95℃において10分間、95℃において30秒間、60℃において30秒間、72℃において30秒間を35−40サイクル)。図8に示す結果は、処理Aにおいて記載されたとおりTSプライマー及びdNTPによる1時間のインキュベーション後にテロメラーゼ活性が293T細胞中で検出可能であることを示す。図9に示す結果は、処理Bにおいて記載されたとおりTSプライマー及びdNTPを含むリン酸カルシウム沈殿法による30分間のインキュベーション後にテロメラーゼ活性が293T細胞中で検出可能であることを示す。TSプライマー不在下ではテロメラーゼ活性が検出不可能であったことから、検出された生成物はテロメラーゼ特異的であることを示唆する。
好ましい態様及びそれらの利点を詳細に記載してきたが、請求の範囲及びそれらの均等物により定義されるとおりの組成物及び方法の範囲から逸脱することなしに本明細書において、様々な変化、置換及び変更がなされてよく、そして全てのそのようなものは請求された範囲内であることを意図する。
Claims (20)
- 生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量するための方法であって、
第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物;
第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物;及び
第1反応混合物と第2混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること;
第1プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下で生物学上のサンプルを第1反応混合物とインキュベートすることであって、但し伸長産物は3’末端を有し;
伸長産物を第2反応混合物と混合すること;
単一の293T細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせる条件下でリアルタイムPCRを用いて伸長産物を増幅すること;及び
対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、
の工程を含む方法。 - 生物学上のサンプルを細胞抽出物又は組織抽出物の形態で添加する、請求項1記載の方法。
- 第1プライマーと第2プライマーの間の配列に結合する蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いることによりリアルタイムポリメラーゼ鎖反応を定量する、請求項1記載の方法。
- 二重鎖DNAに選択的に結合する蛍光染料の存在下でリアルタイムポリメラーゼ鎖反応を実施する、請求項1記載の方法。
- 第2プライマーが、蛍光原性プライマーが二重鎖ポリメラーゼ鎖反応産物に取り込まれた時に増量の蛍光放射を生じる単一標識蛍光原性プライマーである、請求項1記載の方法。
- ポリアデニル化及び連結の一方により3’末端の伸長産物を伸長させることをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 対照鋳型が配列番号:2に記載されたヌクレオチド配列を有する、請求項1記載された方法。
- サンプル細胞中のテロメラーゼ活性を検出及び定量するための方法であって、
サンプル細胞へ第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を導入すること;
細胞内で第1プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下でサンプル細胞をインキュベートすること;
リアルタイムPCRを用いて伸長産物を増幅すること;及び
対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、
の工程を含む方法。 - サンプル細胞を溶解バッファーにより溶解することをさらに含む、請求項8岸の方法。
- 第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸をリン酸カルシウム沈殿法によりサンプル細胞に導入する、請求項8記載の方法。
- 細胞を少なくとも1回針に通過さること;及び
第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を含む培養培地中で細胞を培養することを含む方法により、第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸をサンプル細胞に導入する、請求項8岸の方法。 - 二重鎖DNAに選択的に結合する蛍光染料の存在下でリアルタイムポリメラーゼ鎖反応を実施する、請求項8記載の方法。
- リアルタイムポリメラーゼ鎖反応を第2プライマーの存在下で実施し、そして第2プライマーが、蛍光原性プライマーが二重鎖ポリメラーゼ鎖反応産物に取り込まれた時に増量の蛍光放射を生じる蛍光原性プライマーである、請求項8記載の方法。
- 対照鋳型が配列番号:2に記載されたヌクレオチド配列を有する、請求項8記載された方法。
- 生物学上のサンプル中のテロメラーゼ活性を検出及び定量するための方法であって、
第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物;
第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物;及び
第1反応混合物と第2混合物反応を分離するワックス層を含む反応チューブに、生物学上のサンプルを添加すること;
第1プライマーから伸長産物を生じさせるためにテロメラーゼのために適した条件下で生物学上のサンプルを第1反応混合物とインキュベートすること;
ポリアデニル化及び連結のうちの一つにより伸長産物を3’において伸長すること;
ワックス層を溶解することにより伸長産物を第2反応混合物と混合すること;
単一の293T細胞からのテロメラーゼ活性の検出を可能にさせる条件下でリアルタイムPCRを用いて伸長産物を増幅すること;及び
対照鋳型を用いて、増幅された伸長産物を定量すること、
の工程を含み、但し、第2プライマーは伸長された伸長産物の3’末端のヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列を含む、方法。 - テロメラーゼ活性を検出するためのキットであって、
第1プライマー及びヌクレオシド3リン酸を有する第1反応混合物;
第2プライマー及びDNAポリメラーゼを有する第2反応混合物;及び
第1反応混合物を第2混合物反応から分離するワックス層
を含む反応チューブ、及び
第1反応混合物;
第2プライマー、対照鋳型、及びDNAポリメラーゼを含む第2反応混合物;及び
対照チューブ内で第1反応混合物を第2混合物反応から分離するワックス層を含む、対照チューブ
を含むキット。 - 対照鋳型が配列番号:2に記載されたヌクレオチド配列を有する、請求項16記載されたキット。
- (a)DNAポリメラーゼ又は(b)リガーゼ及びオリゴヌクレオチドを含む伸長混合物をさらに含む、請求項16記載のキット。
- テロメラーゼ活性を検出するためのキットであって、
サンプル細胞を溶解するための溶解バッファー;
第1プライマー;
ヌクレオシド3リン酸;
第2プライマー;及び
DNAポリメラーゼ
を含む反応バッファー;及び
配列番号:2に記載されたヌクレオチド配列又は配列番号:2に記載されたヌクレオチド配列に相補なヌクレオチド配列を含む対照鋳型
を含むキット。 - テロメラーゼ活性を阻害する薬剤による被験者の治療の効果を監視するための方法であって、
薬剤を投与する前に被験者から、前投与サンプル(pre-administration sample)を得て;
前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを検出し;
一つ又はそれより多い後投与サンプルを被験者から得て;
後投与サンプル中のテロメラーゼ活性を検出し;そして
前投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルを後投与サンプル中のテロメラーゼ活性のレベルと比較する、
工程を含む方法。
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