JP5797971B2

JP5797971B2 - １８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブ

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Description

本発明は１８ＳｒＲＮＡ検出用蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブに関する。

リボソームの合成過程は真核細胞において最もエネルギーが消費される過程である。真核細胞で転写される遺伝子の６割強はリボソームに関わる遺伝子であり、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の転写は細胞の分化・増殖と密接な関係にある。また細胞内のエネルギー消費調節にも大きく影響している。ｒＲＮＡ量の増減は、老化、寿命、細胞周期、細胞増殖、癌、栄養状態、低酸素状態等の生体の状態や疾患を大きく反映したものである。

例えば、非特許文献１には、アルツハイマー病患者の末梢血中に含まれる１８ＳｒＲＮＡと２８ＳｒＲＮＡの量比が、健常人のそれと異なることが報告されている。

真核生物のｒＲＮＡには、１８Ｓ、２８Ｓ及び５．８Ｓの３種類が存在する。１８ＳｒＲＮＡは小サブユニットを構成し、２８Ｓ及び５．８ＳｒＲＮＡは大サブユニットを構成する。

ｒＲＮＡの検出方法としては、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、非特許文献２を参照）、アクリジンオレンジによる染色（例えば、非特許文献３を参照）、ｑｕｅｎｃｈｅｄａｕｔｏｌｉｇａｔｉｎｇＦＲＥＴ（ＱＦＲＥＴ）プローブによる染色（例えば、非特許文献４を参照）等が報告されている。

非特許文献３の方法は、アクリジンオレンジが２本鎖核酸と結合した場合と１本鎖核酸と結合した場合でそれぞれ発する蛍光の波長が異なることを利用したものである。非特許文献４の方法は、２本のプローブが近接すると、プローブ間で共有結合するように２価試薬により修飾された、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブを使用するものである。標的ＲＮＡ分子上に隣接してハイブリダイズしたＦＲＥＴプローブ間で共有結合が形成されることにより、ＦＲＥＴが起きる状況が維持される。これにより、信号の増幅が可能となり、より少ない分子の有無を定性的に判断できる。

特許文献１には、１８Ｓ、２８Ｓ及び５．８ＳｒＲＮＡをコードするリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列及びその部分配列が記載されている。

特許文献２には、ＦＲＥＴ効率の高いＦＲＥＴプローブを設計する方法が記載されている。

特表２００９−５０４１９２号公報特開２００７−３７４６５号公報

ｄａＳｉｌｖａＡＭ、ｅｔａｌ、"ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒＲＮＡｉｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ"、ＭｅｃｈＡｇｅｉｎｇＤｅｖ．、２０００、１２０（１−３）、５７−６４ＷａｌｌｎｅｒＧ、ｅｔａｌ、"ＯｐｔｉｍｉｚｉｎｇｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｒＲＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓｆｏｒｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ"、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９３、１４（２）、１３６−４３ＧｏｒｄｏｎＲＹ、ｅｔａｌ、"Ａｃｒｉｄｉｎｅｏｒａｎｇｅａｓａｎｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｒｉｂｏｓｏｍｅｓｔａｔｅ"、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９７、２９（３）、２１５−２１ＨｉｒｏｓｈｉＡｂｅ、ＥｒｉｃＴ．Ｋｏｏｌ、"ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃＲＮＡｓｉｎｎａｔｉｖｅｈｕｍａｎｃｅｌｌｓｗｉｔｈｑｕｅｎｃｈｅｄａｕｔｏｌｉｇａｔｉｎｇＦＲＥＴｐｒｏｂｅｓ"、ＰＮＡＳ、２００６、１０３（２）、２６３−２６８

しかしながら、非特許文献２の方法では、２本鎖核酸と１本鎖核酸とを染め分けることが可能であるものの、１８ＳｒＲＮＡを選択的に検出することは不可能である。また、１８ＳｒＲＮＡの検出を目的とした場合、細胞内に数十万分子以上存在することから、非特許文献４のＱＦＲＥＴプローブによる信号の増幅は必要ない。また、非特許文献４の方法では、連続的な信号の増幅により定量性が低下する場合がある。そこで、本発明は、１８ＳｒＲＮＡを高感度で定量的に検出することが可能なＦＲＥＴプローブを提供することを目的とする。

本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６３１〜７２５位（番目）の領域に、隣接してハイブリダイズ可能な第１のプローブ及び第２のプローブからなり、第１のプローブは第１の蛍光物質で標識されており、第２のプローブは前記第１の蛍光物質とＦＲＥＴを起こす第２の蛍光物質で標識されている、１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを提供する。

上記本発明のＦＲＥＴプローブによれば、１８ＳｒＲＮＡを高感度で定量的に検出することができる。

上記第１のプローブは、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６６９〜６８７位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体であり、上記第２のプローブは、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６４５〜６６４位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体であることがより好ましい。

さらに、上記第１のプローブは、配列番号２に記載の塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドであり、上記第２のプローブは、配列番号３に記載の塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドであることが更に好ましい。

このようなプローブは、１８ＳｒＲＮＡを高感度で定量的に検出する性能が更に高い。

本発明により、１８ＳｒＲＮＡを高感度で定量的に検出することが可能なＦＲＥＴプローブが提供される。

（ａ）は、１８ＳｒＲＮＡの塩基配列について、横軸に塩基番号、縦軸にＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値をプロットしたグラフである。（ｂ）は、２８ＳｒＲＮＡの塩基配列について、横軸に塩基番号、縦軸にＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値をプロットしたグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示したグラフである。（ａ）〜（ｄ）は、実験例２の結果を示したグラフである。実験例３の結果を示したグラフ及び写真である。５ＦＵとＦＵＤＲの作用機序を示す図である。実験例４の結果を示したグラフである。実験例５の結果を示したグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、実験例６の結果を示したグラフである。１８ＳｒＲＮＡの塩基配列について、横軸に塩基番号、縦軸にＳＳ−ｃｏｕｎｔ値の平均値をプロットしたグラフである。（ａ）〜（ｃ）は、実験例７の結果を示したグラフである。

（プローブの設計）
本実施形態の１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブは、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６３１〜７２５位の領域に、隣接してハイブリダイズ可能な第１のプローブ及び第２のプローブからなり、第１のプローブは第１の蛍光物質で標識されており、第２のプローブは前記第１の蛍光物質と蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす第２の蛍光物質で標識されている。

上記第１のプローブ及び第２のプローブのうち、隣接して標的核酸にハイブリダイズした状態で、（標的配列の相補鎖配列で）５’側に位置する方を５’側プローブと呼び、他方を３’側プローブと呼ぶ。本明細書において、「隣接」とは、５’側プローブの３’末端塩基と３’側プローブの５’末端塩基との間が、０〜８塩基、好ましくは０〜４塩基離れて隣り合うことをいう。５’側プローブの３’末端及び３’側プローブの５’末端を、それぞれＦＲＥＴを起こす組み合わせの蛍光物質で標識する。ＦＲＥＴを起こす蛍光物質の組み合わせのうち、エネルギーを与える方の物質をドナー蛍光物質と呼び、エネルギーを受けとる方の分子をアクセプター蛍光物質と呼ぶ。５’側プローブと３’側プローブのいずれにドナー蛍光物質を標識してもよい。以下、ドナー蛍光物質で標識した方のプローブをドナープローブと呼び、アクセプター蛍光物質で標識した方のプローブをアクセプタープローブと呼ぶ場合がある。

本実施形態のＦＲＥＴプローブを設計する場合、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６３１〜７２５位の領域に隣接してハイブリダイズ可能なようにドナープローブとアクセプタープローブを設計する。

ドナープローブとアクセプタープローブの融解温度（Ｔｍ値）は、ほぼ一致することが好ましい。これは、ドナープローブとアクセプタープローブをほぼ同じ確率で標的配列に結合させるためである。

ドナープローブとアクセプタープローブのＴｍ値は、３６℃以上であることが好ましい。これは生細胞が生息可能な温度域で標的核酸とプローブがハイブリダイズしなければならないためである。また、ドナープローブとアクセプタープローブの長さは、それぞれ１５〜２５塩基であることが好ましく、１６〜２２塩基であることがより好ましい。

ＦＲＥＴプローブは、蛍光物質に隣接してグアニン（Ｇ）塩基が存在しないことが好ましい。これは、蛍光物質の近傍に核酸塩基（特にグアニン）が存在すると蛍光物質が消光する場合があるためである。

また、ドナープローブ同士、アクセプタープローブ同士、又はドナープローブ及びアクセプタープローブが相補的に結合しにくい配列であることが好ましい。これは、相補的な配列が存在すると、プローブのみで互いにハイブリダイズしてしまう場合があるためである。その結果、標的核酸に依存せずＦＲＥＴを起こしたり、プローブが定量的に標的核酸にハイブリダイズできなくなる等の問題が生じる場合がある。経験的に、４塩基以上連続して相補的な配列を持たないような配列を選択するとよい。プローブ単独又はプローブ間で相補的に結合しにくい配列であるか否かは、実際にプローブを合成し、溶液中における蛍光測定により確認することができる。

（プローブの合成）
上記のようにして設計したＦＲＥＴプローブの塩基配列に基づいて、実際にＦＲＥＴプローブを合成する。プローブは核酸又は核酸誘導体により構成される。より具体的には、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＬＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴリボヌクレオチド等の核酸誘導体、及び、部分的にこれらの核酸や核酸誘導体が混合したものが挙げられる。また、Ｕ（ウラシル）がＴ（チミン）に置き換えられていてもよい。ＦＲＥＴプローブがＲＮＡである場合、ＲＮａｓｅによる分解を抑制するために、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドとすることが好ましい。

（蛍光物質）
５’側プローブ及び３’側プローブの一方をドナー蛍光物質で修飾し、他方をアクセプター蛍光物質で修飾する。ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間の距離は、５’側プローブ及び３’側プローブが標的核酸にハイブリダイズした状態で４塩基であることが好ましい。この距離がＦＲＥＴを起こすのに適しているためである。

一実施形態において、プローブが標的核酸にハイブリダイズした状態で、５’側プローブの３’末端と、３’側プローブの５’末端の間の距離が４塩基となるようにプローブを設計し、５’側プローブの３’末端と、３’側プローブの５’末端を蛍光物質で修飾する。別の実施形態において、蛍光物質で修飾するのはプローブの末端ではなく、より内側の塩基である。このような場合であっても、プローブが標的核酸にハイブリダイズした状態で、ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質との間の距離が４塩基であれば、効率よくＦＲＥＴを起こすことができる。

ドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の組み合わせとしては、例えば、表１に示すものが使用できる。

（１８ＳｒＲＮＡの検出）
一実施形態において、インビトロで１８ＳｒＲＮＡを検出し、定量することができる。サンプルとしては、対象から抽出した全ＲＮＡ等を使用できる。例えば、１μＭのドナープローブおよびアクセプタープローブを溶解した緩衝液中に全ＲＮＡを混合する。プローブを標的核酸にハイブリダイズさせるためには、例えば１５０ｍＭＮａＣｌ−１５ｍＭＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅｐＨ７．０（ＳＳＣ）溶液中、温度３７℃等の条件下で２０分間放置するとよい。続いて、蛍光顕微鏡、蛍光分光光度計等の装置を用いて、ＦＲＥＴの蛍光を検出する。より具体的には、ドナー蛍光物質の励起波長の光を照射し、アクセプター蛍光物質の蛍光を測定する。例えば、ドナー蛍光物質にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社）を用い、アクセプター蛍光物質にＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（インビトロジェン社）を用いた場合、ドナー蛍光物質の励起波長は４８８ｎｍであり、アクセプター蛍光物質の蛍光波長は６３０ｎｍである。

別の実施形態において、生きた又は固定した細胞内で１８ＳｒＲＮＡを検出し、定量することができる。生きた細胞へのプローブの導入には、後述するストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を使用する方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等の方法が使用できる。固定した細胞を対象として１８ＳｒＲＮＡを検出する場合には、細胞へのプローブの導入には、界面活性剤を用いる等の方法が使用できる。細胞内にプローブを導入する方法は条件が異なってくるので一概に同じ条件を設定できないが、ハイブリダイゼーションに限れば数分でハイブリダイズする。続いて、蛍光顕微鏡、フローサイトメーター等を用いて、ＦＲＥＴの蛍光を検出することができる。

以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。

（ＦＲＥＴプローブの設計及び合成）
ヒト１８ＳｒＲＮＡ遺伝子（配列番号１、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｋ０３４３２．１）及びヒト２８ＳＲＮＡ遺伝子（配列番号４、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００３２８７）の塩基配列を使用し、特開２００７−３７４６５号公報に記載された方法にしたがって、１８ＳｒＲＮＡ及び２８ＳＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを設計した。

具体的には、１８ＳｒＲＮＡ及び２８ＳＲＮＡのそれぞれの塩基配列について、次の操作を行った。まず、長さｎの塩基配列のｉ番目（１≦ｉ≦ｎ）の塩基のＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）を算出した。ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値とは、ＲＮＡの高次構造予測の指標の一つである。ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値は、ＲＮＡの各塩基における相補鎖を形成しない場合の数を表し、この数値が高い塩基ほど、高次構造の中で熱的に不安定で１本鎖となっている確率が高い。ＳＳ−ｃｏｕｎｔ値は、Ｚｕｃｋｅｒらによって開発されたＲＮＡの２次構造を予測するプログラムである、ｍｆｏｌｄ（ＺｕｋｅｒＭ．Ｍｆｏｌｄｗｅｂｓｅｒｖｅｒｆｏｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｆｏｌｄｉｎｇａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００３Ｊｕｌ１；３１（１３）：３４０６−１５．）を使用して算出することができる。

Ｌは一組のＦＲＥＴプローブがハイブリダイズする標的部位全体の長さである。ここではドナープローブ２０塩基、アクセプタープローブ２０塩基、ドナー色素−アクセプター色素間の至適間隔４塩基の合計Ｌ＝４４塩基とした。

続いて、１８Ｓ及び２８ＳｒＲＮＡの各塩基配列の塩基番号をｉとし、１≦ｉ≦ｎ−Ｌ＋１である全てのｉについて、ｉ番目の塩基からｉ＋Ｌ−１番目の塩基までのＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）の平均値Ｍ（ｉ）を算出した。図１（ａ）は、１８ＳｒＲＮＡの塩基配列について、横軸に塩基番号、縦軸にＭ（ｉ）をプロットしたグラフである。図１（ｂ）は、２８ＳｒＲＮＡの塩基配列について、図１（ａ）と同様にして作成したグラフである。

図１（ａ）及び（ｂ）において、塩基配列上のＭ（ｉ）の値が大きい領域は、１本鎖となっている確率が高いため、ＦＲＥＴプローブがハイブリダイズする標的領域として適していると考えられる。図１（ａ）及び（ｂ）中、ＦＲＥＴプローブの標的領域として選択した領域を太線で示した。

図１（ａ）及び（ｂ）に示したＦＲＥＴプローブの標的領域から、ドナープローブ及びアクセプタープローブの塩基配列を選択した。ＦＲＥＴプローブとしては、Ｍ（ｉ）の値が大きいだけでなく、上述した理由から、次の条件を満たす配列を選択した。
（１）ドナープローブとアクセプタープローブの融解温度（Ｔｍ値）がほぼ一致すること。
（２）蛍光物質標識に隣接してグアニン（Ｇ）塩基が存在しないこと。
（３）ドナープローブ同士、アクセプタープローブ同士、又はドナープローブ及びアクセプタープローブが相補的に結合しにくい配列であること。

以上の方法により、１８ＳｒＲＮＡ用ＦＲＥＴプローブセットとして次の塩基配列を設計した。
５’−ＧＡＵＣＣＡＡＣＵＡＣＧＡＧＣＵＵＵＵ−３’（１８Ｓ＿ＤｎｒＲ、配列番号２）
５’−ＵＧＣＡＧＣＡＡＣＵＵＵＡＡＵＡＵＡＣＧ−３’（１８Ｓ＿ＡｃｃＲ、配列番号３）

設計した塩基配列に基づき、ＦＲＥＴプローブを合成した。合成は株式会社日本バイオサービスに依頼した。プローブの合成には、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２’ＯＭｅ）を用いた。プローブの合成に用いるアミダイト試薬としては、いずれもＧｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ社製の２’−ＯＭｅ−Ａ−ＣＥ−Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ（型番＃１０−３１００−９０）、２’−ＯＭｅ−Ｃ−ＣＥ−Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ（型番＃１０−３１１０−９０）、２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥ−Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ（型番＃１０−３１２１−９０）、２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＣＥ−Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅ（型番＃１０−３１３０−９０）を用いた。

また、プローブ１８Ｓ＿ＤｎｒＲの３’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社）で修飾した。また、プローブ１８Ｓ＿ＡｃｃＲの５’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（インビトロジェン社）で修飾した。より具体的には、プローブの３’末端は、プローブ合成後に蛍光物質と結合させることにより、蛍光物質で修飾した。また、プローブの５’末端は、蛍光物質修飾済みのアミダイド試薬を使用してプローブを合成することによって蛍光物質で修飾した。

上記のプローブ１８Ｓ＿ＤｎｒＲは、配列番号１に示す１８ＳｒＲＮＡの塩基配列に対して相補的な配列であり、配列番号１の塩基配列の第６８７〜６６９位にハイブリダイズする。同様に、プローブ１８Ｓ＿ＡｃｃＲは、配列番号１の塩基配列の第６６４〜６４５位にハイブリダイズする。この結果、第６６９位に位置するドナー蛍光色素と第６６４位に位置するアクセプター蛍光色素が４塩基離れて隣接することになり、効率的にＦＲＥＴを起こすことが可能となる。

２８ＳｒＲＮＡ用ＦＲＥＴプローブセットとして次の塩基配列を設計した。
５’−ＡＣＵＵＣＧＧＣＣＵＵＣＡＡＡＧＵＵ−３’（２８Ｓ＿ＤｎｒＲ、配列番号５）
５’−ＵＵＵＧＡＡＵＡＵＵＵＧＣＵＡＣＵＡＣＣ−３’（２８Ｓ＿ＡｃｃＲ、配列番号６）

設計した塩基配列に基づき、ＦＲＥＴプローブを合成した。プローブの合成には２’ＯＭｅを用いた。また、プローブ２８Ｓ＿ＤｎｒＲの３’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で修飾した。また、プローブ２８Ｓ＿ＡｃｃＲの５’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で修飾した。

上記のプローブ２８Ｓ＿ＤｎｒＲは、配列番号４に示す２８ＳｒＲＮＡの塩基配列に対して相補的な配列であり、配列番号４の塩基配列の第２３９８〜２３８１位にハイブリダイズする。同様に、プローブ２８Ｓ＿ＡｃｃＲは、配列番号４の塩基配列の第２３７６〜２３５７位にハイブリダイズする。この結果、第２３８１位に位置するドナー蛍光色素と第２３７６位に位置するアクセプター蛍光色素が４塩基離れて隣接することになり、効率的にＦＲＥＴを起こすことが可能となる。

合成した１８Ｓ及び２８ＳｒＲＮＡ用ＦＲＥＴプローブをそれぞれ水に溶解し、１００ｎＭの溶液を調製した。

（実験例１）
（細胞内のｒＲＮＡのＦＲＥＴによる検出）
慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２を実験に用いた。細胞内へのＦＲＥＴプローブの導入には、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）により膜穿孔を行い、血清培地により再封入する方法を用いた（例えば、特開２００７−３７４６３号公報を参照）。

具体的には、まず、培養したＫ５６２細胞を常法により回収して、血球計数板で細胞密度を測定し、１×１０^６個／ｍｌの細胞密度となるように調整した。次に、濃度調整したＫ５６２細胞１ｍｌを遠心チューブに移し、遠心して上澄みを除去した後、等容量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で懸濁して洗浄し、再び遠心して上澄みを捨てた。続いて、１００ｎＭのドナープローブ及びアクセプタープローブを４μｌずつ添加し、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＬＯ（シグマアルドリッチ社）の０．０１％ウシ血清アルブミン溶液を加えて全量を４０μｌに調整し、ピペッティングにより懸濁した。続いて３７℃で５分間インキュベートした。次に、３７℃に加温した血清入りの培地１ｍｌを加えて３７℃で３０分間放置し、ＳＬＯを失活させ、細胞膜を再封入した。血清入りの培地としては、具体的には１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、シグマアルドリッチ社）−ＲＰＭＩ１６４０（シグマアルドリッチ社）を用いた。続いて、遠心して細胞を回収後、ＰＢＳに懸濁してフローサイトメトリーで測定した。フローサイトメーターとしては、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商品名、日本ＢＤバイオサイエンス社）を使用した。

図２（ａ）及び（ｂ）に、フローサイトメトリーによる測定結果を示す。図２（ａ）はＦＲＥＴプローブで１８ＳｒＲＮＡを検出した結果を示し、（ｂ）は、２８ＳｒＲＮＡを検出した結果を示す。

グラフの横軸は、アクセプター蛍光物質の励起波長（波長６３３ｎｍ）で励起した結果発生したアクセプター蛍光物質の蛍光（波長６９５ｎｍ）を検出した値（以下「ＡＡ」という場合がある。）であり、すなわち、各細胞内に存在するアクセプタープローブの量を示す。

グラフの縦軸は、ドナー蛍光物質の励起波長（波長４８８ｎｍ）で励起した結果発生したアクセプター蛍光物質の蛍光（波長６９５ｎｍ）を検出した値（すなわちＦＲＥＴによる蛍光、以下「ＤＡ」という場合がある）を、ドナー蛍光物質の励起波長（波長４８８ｎｍ）で励起した結果発生したドナー蛍光物質の蛍光（波長５２５ｎｍ）を検出した値（以下「ＤＤ」という場合がある）で割った値（ＤＡ／ＤＤ）であり、ＦＲＥＴを蛍光強度比で示すことにより蛍光強度変化をより明確に示したものである。

図２の結果から明らかなように、１８ＳｒＲＮＡ及び２８ＳｒＲＮＡのいずれを検出した場合においてもＦＲＥＴが観察され、各ｒＲＮＡが検出されたことが示された。また、１８ＳｒＲＮＡの検出に使用したＦＲＥＴプローブは、ＤＡ／ＤＤの比が大きく、非常に感度が高いことが明らかとなった。

（実験例２）
（細胞内のｒＲＮＡのＦＲＥＴによる検出）
プローブの組み合わせを変更し、正しくＦＲＥＴを検出できているか否かについて検討した。図３（ａ）〜（ｄ）は、プローブの組み合わせを変更した点以外は実験例１と同様にして細胞内のｒＲＮＡをＦＲＥＴにより検出した結果を示すグラフである。図３（ａ）は１８ＳｒＲＮＡ検出用ドナープローブ１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及びアクセプタープローブ１８Ｓ＿ＡｃｃＲを組み合わせた結果であり、（ｂ）は２８ＳｒＲＮＡ検出用ドナープローブ２８Ｓ＿ＤｎｒＲ及びアクセプタープローブ２８Ｓ＿ＡｃｃＲを組み合わせた結果であり、（ｃ）は１８ＳｒＲＮＡ検出用ドナープローブ１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び２８ＳｒＲＮＡ検出用アクセプタープローブ２８Ｓ＿ＡｃｃＲを組み合わせた結果であり、（ｄ）は２８ＳｒＲＮＡ検出用ドナープローブ２８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８ＳｒＲＮＡ検出用アクセプタープローブ１８Ｓ＿ＡｃｃＲを組み合わせた結果である。図３の結果から明らかなように、正しいプローブの組み合わせの場合にＦＲＥＴによる蛍光強度比の変化が観察された。このことから、各ＦＲＥＴプローブが標的分子に特異的に結合して蛍光を発していると考えられた。

（実験例３）
（熱ショックによるｒＲＮＡの増加）
細胞を数時間、４０℃程度の高温環境に晒すと、細胞の保護を目的とした一群のタンパク質が合成される。これらのタンパク質は熱ショックタンパク質と呼ばれ、温度変化に対する発現が迅速であり、かつ大量に合成されることが知られている。タンパク質合成が盛んであれば、その合成の場となるリボソームも必要となり、従ってｒＲＮＡの合成が盛んになることが推定される。そこで熱ショック（４２℃、２時間）の有無により増加する細胞内のｒＲＮＡの定量的な測定を行った。

Ｋ５６２細胞を１０^６個／ｍｌの濃度に調整し、（１）３７℃で２時間インキュベーション、（２）３７℃で１時間インキュベーション後に４２℃で１時間インキュベーション、及び（３）４２℃で２時間インキュベーションした後に、実験例１と同様にしてＦＲＥＴプローブを用いて細胞内のｒＲＮＡを検出した。また、細胞の蛍光顕微鏡観察及びＲＴ−ＰＣＲも行った。

図４に測定結果をまとめた。左側３列は１８ＳｒＲＮＡの測定結果を示し、右側３列は２８ＳｒＲＮＡの測定結果を示す。最上行は横軸にＡＡを、縦軸にＤＡ／ＤＤを示したフローサイトメトリー測定の結果である。第２行は、横軸にＤＡ／ＤＤを、縦軸に細胞数をとり、最上行のフローサイトメトリーの結果を表示し直したヒストグラムである。第３行は、培養細胞のＤＡの蛍光を観察した蛍光顕微鏡像である。最下段は、各熱処理を施した細胞のｒＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより増幅後、アガロース電気泳動した結果を示す写真であり、各レーンの数字はＰＣＲのサイクル数を示す。ｃＤＮＡの調製には、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ｃＤＮＡ（商品名、Ａｍｂｉｏｎ社製）を使用した。ｃＤＮＡ溶液は、２倍ずつ段階希釈して６〜８系列の希釈溶液を調製して鋳型とし、同時にＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分熱変性した後、９４℃３０秒、５３℃３０秒及び７２℃３０秒を２６サイクル行い、最後に７２℃で５分の反応条件で行った。ＰＣＲ産物を電気泳動して増幅断片のバンドを確認し、希釈系列の倍数とサイクル数からｒＲＮＡ量を見積もった。ＰＣＲに使用したプライマーの塩基配列は次の通りである。

１８ＳｒＲＮＡ増幅用プライマー
５’−ＴＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＡＡＴＴＧＧＡＡ−３’（１８Ｓ＿Ｆｗｄ、配列番号７）
５’−ＴＴＧＣＧＣＣＧＧＴＣＣＡＡＧＡＡＴＴＴ−３’（１８Ｓ＿Ｒｅｖ、配列番号８）

２８ＳｒＲＮＡ増幅用プライマー
５’−ＧＣＧＣＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡ−３’（２８Ｓ＿Ｆｗｄ、配列番号９）
５’−ＡＡＧＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴ−３’（２８Ｓ＿Ｒｅｖ、配列番号１０）

４２℃で２時間のインキュベーションにより、多くのｒＲＮＡが転写されたことが示された。これは、熱ショック関連タンパク質が盛んに合成され、タンパク質合成の場であるリボソームが必要となり、その要請に応じて多くのｒＲＮＡが転写された結果であると考えられる。フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡観察及びＲＴ−ＰＣＲの結果は、いずれもＦＲＥＴによる蛍光強度変化とｒＲＮＡ量の間に相関関係があることを示した。

（実験例４）
（抗がん剤によるｒＲＮＡ合成阻害実験）
癌細胞は細胞増殖が盛んなことから、タンパク質の合成も盛んである。タンパク質合成の場であるリボソームは精密にタンパク質の合成を制御しているため、リボソームの要求をサポートする為にｒＲＮＡの転写も盛んである。抗がん剤の一つである５ＦＵ（５−フルオロウラシル）はｒＤＮＡからｒＲＮＡを転写する酵素であるＲＮＡポリメラーゼＩの酵素活性を選択的に阻害することでｒＲＮＡの合成を阻害する薬剤として一般的に用いられている（例えば、ＷｉｌｋｉｎｓｏｎＤＳ，ＴｉｓｔｙＴＤ．ＡｎｄＨａｎａｓＲＪ．ＴｈｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＲｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＭａｔｕｒａｔｉｏｎｏｎＮｏｖｉｋｏｆｆＨｅｐａｔｏｍａＣｅｌｌｓｂｙ５−Ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１９７５Ｎｏｖ；３５，３０１４−３０２０．を参照。総説であれば、ＬｏｎｇｌｅｙＤＢ，ＨａｒｋｉｎＤＰ，ＪｈｏｎｓｔｏｎＰＧ．５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆａｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ．２００３Ｍａｙ；３（５）：３３０−８．を参照。）。

図５は、５ＦＵとＦＵＤＲ（フルオロデオキシウリジン）の作用機序を示す図である。５ＦＵは代謝を受けてＦＵＴＰ（フルオロウリジン三リン酸）になり、ＲＮＡの中に入り込んでＲＮＡ合成を阻害する。また、５ＦＵは代謝を受けてＦｄＵＭＰ（フルオロデオキシウリジン一リン酸）になり、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を阻害してＤＮＡ合成を阻害する。したがって、５ＦＵはＲＮＡ合成及びＤＮＡ合成の双方を阻害する。これに対し、ＦＵＤＲはＤＮＡ合成を阻害するのみで、ＲＮＡ合成には影響しない。

白血病細胞株ＨＬ６０（１×１０^６個）に各濃度の５ＦＵを添加して、３７℃で２時間インキュベーションした後、実験例１と同様にして、ＦＲＥＴプローブ１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ＡｃｃＲを用いて細胞内の１８ＳｒＲＮＡを検出した。図６は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。最左列から順に、０、０．０６２５、０．１２５、０．２５及び１ｍＭの５ＦＵを添加した結果を示す。また、最上行は横軸にＡＡを、縦軸にＤＡ／ＤＤを示した測定の結果である。第２行は、横軸にＤＡ／ＤＤを、縦軸に細胞数をとり、最上行のフローサイトメトリーの結果を表示し直したヒストグラムである。また、グラフ中の数値は全細胞のＤＡ／ＤＤの値の平均値である。第３行は、横軸にＤＤを、縦軸に細胞数をとり、最上行のフローサイトメトリーの結果を表示し直したヒストグラムである。

図６から明らかなように、５ＦＵの添加量が増加するにしたがってＤＡ／ＤＤの値が低下していくことが確認された。すなわち、５ＦＵの添加量が増加するにしたがって１８ＳｒＲＮＡの合成が抑制された。この結果は、第２行及び第３行のヒストグラムからも明らかである。第２行のヒストグラムでは、５ＦＵの濃度が上昇するにしたがってヒストグラムの肩（右上部分）が消失し、ＤＡ／ＤＤの値の平均値も低下した。また、第３行のヒストグラムでは、５ＦＵを添加しない場合には蛍光強度の異なる細胞集団が２つ存在（ピークが２つ）していたものが、５ＦＵの添加により蛍光強度の低い細胞集団が消失して、蛍光強度の高い細胞集団に移行する過程が観察された。

この現象は蛍光がＦＲＥＴに由来するものであるかを蛍光顕微鏡で確認するために行われる「アクセプターブリーチング操作」に類似していると考えられる。つまり、ｒＲＮＡが十分に存在する状況では、ＦＲＥＴに関与するドナープローブの蛍光強度は低いが、５ＦＵによってＲＮＡの合成が阻害された細胞では、ｒＲＮＡの量が減少するためにＦＲＥＴが解消される。その結果、細胞内に導入されたドナープローブのうち、ＦＲＥＴが成立しないドナープローブの割合が増加し、細胞から発せられる蛍光の強度はドナープローブのみを導入した場合の蛍光強度に近づく。蛍光顕微鏡観察では、ＦＲＥＴを起こしているプローブにおいて、アクセプタープローブが存在しない場合のドナープローブの蛍光強度を測定するには、アクセプター蛍光物質を退色させて、ドナー蛍光物質の蛍光を測定するが（アクセプターブリーチング操作）、フローサイトメトリーでそのようなことはできないので、実際はＦＲＥＴを起こしている細胞の有無を総和として観察していると考えられる。

このように、ＨＬ６０細胞を用いた細胞内ＦＲＥＴによるｒＲＮＡの蛍光検出では、５ＦＵの添加によりＲＮＡ合成が阻害された結実、ＲＮＡ量が低下し、ｒＲＮＡに由来するＦＲＥＴの蛍光が低下した。

（実験例５）
（抗がん剤によるｒＲＮＡ合成阻害実験）
５ＦＵの代わりにＦＵＤＲを用いた点以外は実験例４と同様の実験を行った。上述したように、ＦＵＤＲはＤＮＡ合成を阻害するのみで、ＲＮＡ合成には影響しない。

ＨＬ６０細胞（１×１０^６個）に各濃度のＦＵＤＲを添加して、３７℃で２時間インキュベーションした後、実験例１と同様にして、ＦＲＥＴプローブ１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ＡｃｃＲを用いて細胞内の１８ＳｒＲＮＡを検出した。図７は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。最左列から順に、０、０．０６２５、０．１２５、０．２５及び１ｍＭのＦＵＤＲを添加した結果を示す。グラフは、横軸にＡＡを、縦軸にＤＡ／ＤＤを示した測定の結果である。

図７の結果から明らかなように、ＨＬ６０細胞にＦＵＤＲを添加しても、１８ＳｒＲＮＡの量は変化しなかった。これは、ＦＵＤＲがＤＮＡ合成を阻害するのみで、ＲＮＡ合成には影響しないことによると考えられた。

（実験例６）
（抗がん剤によるｒＲＮＡ合成阻害実験）
抗がん剤によって実際にＲＮＡの合成が阻害されることを、別の染色法により確認した。染色には、ＳＹＴＯ−ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商品名、インビトロジェン社）を使用した。

具体的には、まず、ＨＬ６０細胞（２×１０^６個）に、各濃度の５ＦＵ又はＦＵＤＲを添加し、血清を除いた培地中で３７℃で２時間インキュベーションした。続いて、培地に対して１／１００００量のＳＹＴＯ−ＲＮＡＳｅｌｅｃｔを添加して３０分インキュベートした。続いて、細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＳＹＴＯ−ＲＮＡＳｅｌｅｃｔに由来する蛍光を測定した。

図８（ａ）及び（ｂ）は、実験結果を示すグラフである。図８（ａ）は５ＦＵを添加した結果であり、（ｂ）はＦＵＤＲを添加した結果である。横軸は添加した５ＦＵ又はＦＵＤＲの濃度を示し、縦軸はＳＹＴＯ−ＲＮＡＳｅｌｅｃｔに由来する蛍光の蛍光強度の平均値を示す。

ＲＮＡ合成を阻害する５ＦＵの添加量が増加するにしたがって、ＲＮＡの蛍光強度が低下することが示された。ここで、ＳＹＴＯ−ＲＮＡＳｅｌｅｃｔは、ｒＲＮＡを特異的に染色することはできないが、（一般的な細胞に含まれる）全ＲＮＡの９割をｒＲＮＡが占めることから、ＳＹＴＯ−ＲＮＡＳｅｌｅｃｔの蛍光は、ｒＲＮＡの量を反映していると考えられる。一方、ＲＮＡ合成を阻害しないＦＵＤＲを添加しても、ＲＮＡの蛍光強度には有意な変化は観察されなかった。この結果は、実験例４の結果が正しいことを支持するものであると考えられる。

（実験例７）
（１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの検討）
上記の検討により、１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ＡｃｃＲからなる１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブは、１８ＳｒＲＮＡの検出感度が非常に高いことが示された。そこで、上記プローブと標的部位を変更した１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを設計、合成し、反応性を検討した。

図９は、横軸に１８ＳｒＲＮＡの塩基番号、縦軸にＳＳ−ｃｏｕｎｔ値Ｓ（ｉ）の平均値をプロットしたグラフである。グラフ中（ｂ）と表示した領域は、１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ＡｃｃＲからなる１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの標的領域を示す。ここでは、（ｂ）の領域に隣接する、（ａ）及び（ｃ）の領域を標的領域とする１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを設計、合成した。

図９の（ａ）の領域を標的領域とする１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの塩基配列は次の通りであった。
５’−ＡＵＵＡＣＣＧＣＧＧＣＵＧＣＵＧＧＣＡ−３’（１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＤｎｒＲ、配列番号１１）
５’−ＡＣＵＵＧＣＣＣＵＣＣＡＡＵＧＧＡＵＣＣ−３’（１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＡｃｃＲ、配列番号１２）
プローブの合成には、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２’ＯＭｅ）を用いた。プローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＤｎｒＲの３’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社）で修飾した。また、プローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＡｃｃＲの５’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（インビトロジェン社）で修飾した。

図９の（ｃ）の領域を標的領域とする１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの塩基配列は次の通りであった。
５’−ＡＵＣＧＡＧＧＧＧＧＣＧＣＣＧＡＧＡ−３’（１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＤｎｒＲ、配列番号１３）
５’−ＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＧＧＧＣＧ−３’（１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＡｃｃＲ、配列番号１４）
プローブの合成には、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２’ＯＭｅ）を用いた。プローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＤｎｒＲの３’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（インビトロジェン社）で修飾した。また、プローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＡｃｃＲの５’末端を蛍光物質ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（インビトロジェン社）で修飾した。

上記のプローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＤｎｒＲは、配列番号１に示す１８ＳｒＲＮＡの塩基配列に対して相補的な配列であり、配列番号１の塩基配列の第７７０〜７５２位にハイブリダイズする。同様に、プローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＡｃｃＲは、配列番号１の塩基配列の第７４７〜７２８位にハイブリダイズする。この結果、第７５２位に位置するドナー蛍光色素と第７４７位に位置するアクセプター蛍光色素が４塩基離れて隣接することになり、効率的にＦＲＥＴを起こすことが可能となる。同様に、上記のプローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＤｎｒＲは、配列番号１の塩基配列の第９０４〜８８７位にハイブリダイズする。また、プローブ１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＡｃｃＲは、配列番号１の塩基配列の第８８２〜８６６位にハイブリダイズする。この結果、第８８７位に位置するドナー蛍光色素と第８８２位に位置するアクセプター蛍光色素が４塩基離れて隣接することになり、効率的にＦＲＥＴを起こすことが可能となる。

図１０（ａ）〜（ｃ）は、ＨＬ６０細胞を用いて、実験例１と同様にして細胞内の１８ＳｒＲＮＡをＦＲＥＴにより検出した結果を示すグラフである。図１０（ａ）は、プローブとして１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ｒｅｆＡ＿ＡｃｃＲを使用した結果であり、（ｂ）は、プローブとして１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ＡｃｃＲを使用した結果であり、（ｃ）は、プローブとして１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ｒｅｆＢ＿ＡｃｃＲを使用した結果である。図１０の結果から明らかなように、１８Ｓ＿ＤｎｒＲ及び１８Ｓ＿ＡｃｃＲからなる１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブは、他のプローブと比較して、格段に１８ＳｒＲＮＡの検出感度が高いことが示された。

Claims

配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６３１〜７２５位の領域に、隣接してハイブリダイズ可能な第１のプローブ及び第２のプローブからなり、
前記第１のプローブは第１の蛍光物質で標識されており、
前記第２のプローブは前記第１の蛍光物質と蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を起こす第２の蛍光物質で標識されている、
１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブ。
前記第１のプローブは、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６６９〜６８７位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体であり、
前記第２のプローブは、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の第６４５〜６６４位の領域にハイブリダイズ可能な核酸又は核酸誘導体である、請求項１に記載の１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブ。
前記第１のプローブは、配列番号２に記載の塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドであり、
前記第２のプローブは、配列番号３に記載の塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチドである、請求項１又は２に記載の１８ＳｒＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブ。