JP4963164B2 - 蛍光共鳴エネルギー移動プローブの設計方法 - Google Patents
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ドナープローブとアクセプタープローブとからなるFRETプローブのRNA上のハイブリダイゼーション領域を設定する方法であって、
mfoldにより塩基の長さがnであるRNAの塩基配列のi番目(1≦i≦n)の塩基のSS−count値S(i)を算出する工程と、
蛍光共鳴エネルギー移動プローブの長さL(2L<n)を決める工程と、
1≦i≦n−L+1であるすべてのiについて、i番目の塩基からi+L−1番目の塩基までのSS−count値S(i)の平均値M(i)を算出する工程と、
1≦i≦n−2L+2であるすべてのiについて、F(i)=M(i+L−1)−M(i)を算出する工程と、
c≦i≦c+L−1におけるF(i)の最大値が正かつF(i)の最小値が負であり、かつ、F(c)<F(c+L−1)となるcを算出し、RNAのc番目からc+L−1番目の塩基領域をFRETプローブのハイブリダイゼーション領域と設定する工程と、
を含む方法、を提供する。
(1)mfoldにより塩基の長さがnであるRNAの塩基配列のi番目(1≦i≦n)の塩基のSS−count値S(i)を算出する工程;
(2)蛍光共鳴エネルギー移動プローブの長さL(2L<n)を決める工程;
(3)1≦i≦n−L+1であるすべてのiについて、i番目の塩基からi+L−1番目の塩基までのSS−count値S(i)の平均値M(i)を算出する工程;
(4)1≦i≦n−2L+2であるすべてのiについて、F(i)=M(i+L−1)−M(i)を算出する工程;及び
(5)c≦i≦c+L−1におけるF(i)の最大値が正かつF(i)の最小値が負であり、かつ、F(c)<F(c+L−1)となるcを算出し、RNAのc番目からc+L−1番目の塩基領域をFRETプローブのハイブリダイゼーション領域と設定する工程。
ヒトWT1 mRNA(GenBank受入番号:NM_024426)の塩基配列のうち、開始コドンのアデニン塩基から数えて1350の塩基長の配列データ(配列番号1)をmfoldに入力し、37℃の条件におけるSS−conut値を計算した。得られた結果を図1に示す。図1から分かるように、SS−conut値自体は離散的な数値をとり、このままでは何ら有力な情報を得ることができない。
図2から6つの領域を選んで、実際にFRETプローブを合成した。合成したFRETプローブを表1に示す。
ヒトWT1のcDNAを含むプラスミドDNA(pUCWT1;理化学研究所バイオリソースセンターから購入)を制限酵素EcoRI及びHincIIで切断し、WT1 cDNA断片を得た。WT1 cDNA断片を、RNA合成用ベクターpBluescriptII KS+のEcoRI/HincIIによる消化部位に、T7プロモーター下流に断片が位置するように、ライゲーションキット(タカラバイオ社製)を用いて結合させた。得られた組換えプラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル(タカラバイオ社製)に導入し、得られた形質転換体を培養し組換えプラスミドを複製した。
ドナープローブとアクセプタープローブが近接してハイブリダイゼーションすることに伴うFRETによる蛍光スペクトルの変化を測定した。ドナープローブ及びアクセプタープローブを終濃度1μMとなるように150μLの1xSSC(150mM塩化ナトリウム、17mMクエン酸ナトリウム、pH7.0)溶液に加え、室温で15分放置した後、四面透過の石英製のキュベットに注入し、蛍光分光光度計(F4500;日立製作所製)により励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。次に、この溶液にWT1 mRNAを200pmol添加し、30分放置した後、室温における蛍光スペクトルを測定して、ハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察した。
既に公表した、ヒトIL−2 mRNAのFRETプローブによる検出の実験結果と、本発明の方法により設定されるハイブリダイゼーション領域との比較を試みた。公表した実験結果は、Ishibashi K. et al., Anal. Chem., vol. 75, pp. 2715-2723 (2003) 及びそれに対応する特許出願(特許文献1)を用いた。ヒトIL−2 mRNA検出用の様々なFRETプローブ(エネルギーアクセプター蛍光色素としてXRITCを用いている)を用いたときの蛍光強度比(I606nm/I515nm)を図4に示す。プローブ名は、ヒトIL−2 mRNAのヌクレオチドの位置(開始コドンのアデニンを1とする)に対応している。FRETプローブの長さは30である。
ヒトIL−4 mRNAについても、実施例2と同様に、既出の実験結果と、本発明の方法により設定されるハイブリダイゼーション領域との比較を行った。実験結果を引用した文献は、実施例2と同じである。ヒトIL−4 mRNA検出用の様々なFRETプローブを用いたときの蛍光強度比(I670nm/I515nm)を図6に示す。プローブ名は、ヒトIL−4 mRNAのヌクレオチドの位置(開始コドンのアデニンを1とする)に対応している。FRETプローブの長さは30である。
WT1Ex1プローブのみを用いた場合と、WT1Ex1プローブ、WT1Ex2プローブ、WT1Ex6プローブ及びWT1KTS+プローブの4種類のプローブの混合物を用いた場合とで、ヒトWT1 mRNAの増加に伴うFRETの蛍光強度変化を比較した。
Claims (2)
- ドナープローブとアクセプタープローブとからなる蛍光共鳴エネルギー移動プローブのRNA上のハイブリダイゼーション領域を設定する方法であって、
mfoldにより塩基の長さがn(nは200以上)であるRNAの塩基配列のi番目(1≦i≦n)の塩基のSS−count値S(i)を算出する工程と、
蛍光共鳴エネルギー移動プローブの長さL(2L<n)を決める工程と、
1≦i≦n−L+1であるすべてのiについて、i番目の塩基からi+L−1番目の塩基までのSS−count値S(i)の平均値M(i)を算出する工程と、
1≦i≦n−2L+2であるすべてのiについて、F(i)=M(i+L−1)−M(i)を算出する工程と、
c≦i≦c+L−1におけるF(i)の最大値が正かつF(i)の最小値が負であり、かつ、F(c)<F(c+L−1)となるcを算出し、RNAのc番目からc+L−1番目の塩基領域を蛍光共鳴エネルギー移動プローブのハイブリダイゼーション領域と設定する工程と、
を含む方法。 - 20≦L≦50である、請求項1に記載の方法。
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JP2005225689A JP4963164B2 (ja) | 2005-08-03 | 2005-08-03 | 蛍光共鳴エネルギー移動プローブの設計方法 |
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