JP6857622B2 - オリゴヌクレオチドの同時検出法、それに関するキットおよび使用法 - Google Patents
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Description
(a) 等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドを含有するかまたは含有する疑いのある生体試料を提供する段階;
(b) 生体試料を、等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドと相補的な少なくとも2種類の検出分子と接触させることにより、ハイブリダイゼーション混合物を形成する段階であって、検出分子が、少なくとも1つの蛍光部分でそれぞれ標識されており、かつ検出分子が、異なる表面電荷を有する、段階;
(c) 陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー (AEX-HPLC) により、等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした検出分子を、ハイブリダイズしなかった検出分子の部分から分離する段階;
(d) 定量的蛍光読み取りによって、ハイブリダイズした検出分子-オリゴヌクレオチド部分を検出する段階
を含む。
[本発明1001]
(a) 等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドを含有するかまたは含有する疑いのある生体試料を提供する段階;
(b) 該生体試料を、該等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドと相補的な少なくとも2種類の検出分子と接触させることにより、ハイブリダイゼーション混合物を形成する段階であって、該検出分子が、少なくとも1つの蛍光部分でそれぞれ標識されており、かつ該検出分子が、異なる表面電荷を有する、段階;
(c) 陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー (AEX-HPLC) により、該等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした該検出分子を、ハイブリダイズしなかった検出分子の該部分から分離する段階;
(d) 定量的蛍光読み取りによって、ハイブリダイズした該検出分子-オリゴヌクレオチド部分を検出する段階
を含む、該等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドを1つの生体試料から同時並行して定量的に検出するための方法。
[本発明1002]
前記少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドが、10〜50ヌクレオチドの長さ、好ましくは12〜40ヌクレオチドの長さ、より好ましくは18〜30ヌクレオチドの長さを有する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドが、miRNA (miRNA)、低分子干渉RNA (siRNA)、短鎖活性化RNA (saRNA)、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、およびspiegelmerからなる群より選択される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記検出分子が、ペプチド核酸 (PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー (PMO)、およびugimerからなる群より選択される、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記検出分子が、10〜30ヌクレオチドの長さ、好ましくは10〜20ヌクレオチドの長さ、より好ましくは15〜20ヌクレオチドの長さを有する、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記少なくとも2種類の検出分子が、同じアイデンティティーの蛍光部分でそれぞれ標識されている、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記少なくとも2種類の検出分子の前記異なる表面電荷が、中性電荷、負電荷、および正電荷の群より選択され、好ましくは、中性電荷と負電荷、中性電荷と正電荷、および/または負電荷と正電荷の組み合わせより選択され、好ましくは、複数の負電荷、複数の正電荷、またはこれらの任意の組み合わせより選択される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
負の前記表面電荷が、少なくとも2つの組み込まれた負荷電アミノ酸残基またはアミノグリシン骨格修飾の存在を特徴とし、好ましくは、該負荷電アミノ酸残基がグルタミン酸の形態である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
正の前記表面電荷が、少なくとも2つの組み込まれた正荷電アミノ酸残基またはアミノグリシン骨格修飾の存在を特徴とし、好ましくは、該正荷電アミノ酸残基がリジンの形態である、本発明1007の方法。
[本発明1010]
段階 (c) における陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー (AEX-HPLC) が、30℃〜75℃の温度で、好ましくは40℃〜55℃の温度で、より好ましくは50℃の温度で行われる、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
段階 (d) の定量的読み取りが、前記ハイブリダイズした検出分子-オリゴヌクレオチド部分の蛍光シグナルを、内部標準とまたは外部較正曲線の形態の外部標準と比較することを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
(i) 関心対象の等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドと相補的な少なくとも2種類の検出分子であって、該検出分子のそれぞれが、少なくとも1つの蛍光部分で標識されており、かつ該検出分子が、異なる表面電荷を特徴とする、検出分子;
(ii) プロテイナーゼKおよびプロテイナーゼK消化緩衝液を好ましくは含有する、ハイブリダイゼーション混合物
を含むキット。
[本発明1013]
前記検出分子が、同じアイデンティティーの蛍光部分でそれぞれ標識されている、本発明1012のキット。
[本発明1014]
前記少なくとも2種類の検出分子の結合部位に相補的な少なくとも1種類の蛍光標識分子をさらに含み、該結合部位が標的配列結合に関与しない、本発明1012または1013のキット。
[本発明1015]
等しい長さの少なくとも2種類の異なるオリゴヌクレオチドを1つの生体試料から同時並行して定量的に検出するための、異なる表面電荷を有する少なくとも2種類の検出分子の使用であって、好ましくは該検出が、本発明1001〜1011のいずれかにおいて定義された通りに行われる、使用。
ペプチド核酸 (PNA) は、いくつかの技法により修飾することができる。一方では、鎖が例えばリジンまたはグルタミン酸などのアミノ酸で修飾されるという点で、表面電荷を配列の両端にそれぞれ導入することができる。これらのアミノ酸は、特定のpH値において荷電された側鎖を有する。他方では、例えばリジンによるγ修飾により、配列内に正電荷を生じさせることができる(図1Aを参照されたい)。
研究の目的は、Roehlら (WO 2010/043512) の既存の方法をさらに発展させることであった。目標は、1種類のみの蛍光色素を使用する状況において、異なって荷電されたPNAにより、例えばmiR16、miR210、およびmiR320などの最大3種類までのmiRNAを同時検出することであった。初めに、生体マトリックスを含まない緩衝液からの、miR16と異なって修飾されたPNAとの間で形成された二重鎖の検出を行った。この点において、中性荷電PNA、負荷電PNA、および正荷電γ修飾PNAを使用した。
3.1 光学濃度の測定
最近隣法 (Tataurov et al. (2008) Biophysical Chemistry, 133:60-70) により、miR16、miR210、およびmiR320の吸光係数を決定し、式1に従ってそれぞれの濃度を計算した。
式1:吸光係数ε0と共に光学濃度 (OD) を用いた、μMでのmiR16、miR210、およびmiR320の濃度の計算
試料調製は、miRNAと相補的PNAとのハイブリダイゼーションに基づいた。miR16の解析に関して、最初に、生体マトリックスを含まないハイブリダイゼーション緩衝液を作製した。その後、ヒト血漿を用いてハイブリダイゼーションを行い、次いでまた、2種類のさらなるmiRNAのmiR210およびmiR320を用いてハイブリダイゼーションを行った。
試料調製に使用した材料および試薬を表1および表2に列挙する。
式1に従って計算された濃度を有するmiRNA保存溶液から、最初に1 μM溶液を調製し、その後これを1:10に希釈した。10容量%アセトニトリル (ACN) および0.01容量% Tween 20を含む溶液を希釈剤として使用した。続いて、Panagene (South Korea) から入手した凍結乾燥PNA(表3を参照されたい)のそれぞれから、10容量% ACN および0.01容量% Tween 20を含む溶液を添加することにより、25 μM保存溶液を調製した。この保存溶液を、ハイブリダイゼーション用に同じ希釈剤で1:25に希釈した。
初めに、生体マトリックスを含まないハイブリダイゼーション設定を選択した。ハイブリダイゼーション緩衝液の組成は、SDS沈澱済みのプロテイナーゼK−細胞および組織のための溶解緩衝液に依存する。10 mlの溶解緩衝液には、33 μlのプロテイナーゼKならびに9967 μlの組織および細胞溶解溶液を必要とする。次いで、thermo-mixerを使用して、ハイブリダイゼーション緩衝液を65℃および350 rpmで30分間加熱した。その後、溶液を氷上で冷却した。ハイブリダイゼーション混合物の一部としてのSDSは陰イオン交換カラムを不可逆的に損傷するため、これを1000 μlの3M KCl溶液で沈殿させ、次いで沈殿物を5℃および4000 rpmで15分間遠心分離した。ハイブリダイゼーションにおけるさらなる使用のために、上清を氷上で分離し、SDSペレットを廃棄した。
続いて、前記方法をヒト血漿由来のmiRNAの検出にまで拡張した。Na-ヘパリンにより抗凝固処理されたヒト血漿は、企業Dunn Labortechnik GmbHから購入した。生体マトリックスがアッセイにおいて使用され得る前に、存在するすべてのヌクレアーゼ(RNase Aなど)は、組織および細胞溶解溶液中でプロテイナーゼKによる処理によって消化される必要がある。このために、血漿3 mlを、細胞および組織溶解緩衝液2.9 mlと、プロテイナーゼK 33 μl、および水4.1 mlからなる溶解緩衝液7 mlにより、65℃にて30分間消化した。その後、SDSを項目3.2.3において記載されたように沈殿させ、遠心分離し、ペレットを廃棄した。
表4に提供されるスキームに従って、ハイブリダイゼーション混合物を設定した。
較正線については、0.1 μmのmiR16溶液(3.2.2を参照されたい)を使用した。この溶液を、6回の後続する検出段階において1:5に希釈した。10容量% ACNおよび0.01容量% Tween 20を含む溶液を希釈剤として使用した。ハイブリダイゼーションの段階は、項目3.2.5と同様に行った。ここで、異なって修飾されたPNA(表3を参照されたい)を、ハイブリダイゼーション緩衝液中のヒト血漿と混合した。単一希釈段階により、100 μl注入当たり0.16〜500 fmol という一連の濃度のmiRNAが得られた。この方法により、1回のHPLC実験設定において同時並行検出が可能となるべきであるため、ハイブリダイゼーション溶液を1:1:1の比率で混合した。
miRNAとそれぞれの相補的PNAのハイブリダイゼーションは、段落3.2.5に記載された通りに行った。最初に、修飾を伴わず、かついずれの電荷も伴わない相補的PNAを選択した。このために、3.2.2に記載された通りの1 μM PNA溶液および0.1 μM miRNA溶液を使用した。同時並行の検出のため、全3つの試料を、ハイブリダイゼーション後に1:1:1の比率で混合した。
より良いクロマトグラフィー分離を得るために、負電荷によって修飾されたPNAをハイブリダイゼーションの次の段階に使用した。ここで、miR16と相補的なPNAは4つの負電荷を含有し、miR210と相補的なPNAは8つの負電荷を含有した。両PNAは、企業Panagene, South Koreaによって合成された(表5を参照されたい)。
3.3.1 緩衝液調製
緩衝液を調製するために使用した材料および試薬を表6および表7に示す。
緩衝液A:30容量% ACN、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH7
緩衝液B:30容量% ACN、900 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH7
緩衝液C:10容量% ACN、4 M NaClO4
緩衝液A:30容量% ACN、100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH8
緩衝液B:30容量% ACN、900 mM NaCl、10 mM Tris-HCl pH8
緩衝液C:10容量% ACN、4 M NaClO4
HPLCシステム1
前記方法を確立する状況におけるHPLC解析については、デガッサー、オートサンプラー、カラムオーブン、およびポンプシステムを包含するHPLC Dionex Ultimate 3000を使用した。検出は、Dionexから入手したRF蛍光検出器を用いて、励起波長436 nmおよび発光波長484 nmならびに初期設定検出感度 中程度4×で行った。
さらなる解析については、企業Shimadzuから購入した、より感度の高い蛍光検出器RF-20 A xsと共にHPLCシステムDionex Ultimate 3000を使用し、励起波長436 nmおよび発光波長484 nmならびに初期設定感度 中程度16×で行った。
この方法を確立するために、長さ250 mmおよび直径4 mmのDNAPac(登録商標)100 Columnを使用した。カラム温度は30℃〜60℃の間で異なった。加えて、緩衝系(3.3.1を参照されたい)および勾配を調整した。注入容量は100 μlであり、測定は流速1 ml/分で行った。
融解温度Tmは融解曲線の屈曲点における温度と定義され、その点で物質は50%が一本鎖として存在する。miRNAに関する融解温度の解析は、Beckman Counter DU800 UV/Vis分光光度計を用いて260 nmにおけるUV吸収を測定することによって行った。各miRNAについて、リン酸緩衝食塩溶液 (PBS) 中の1 μM溶液を調製した。試料を350 μlマイクロキュベットに移し、キュベットホルダー中で20℃にて3分間平衡化してから、0.5℃/分で80℃まで加熱した。80℃の温度で、試料を5分間平衡化し、続いて0.5℃/分で20℃まで冷却した。20℃〜80℃の範囲の温度において1℃間隔で、UV吸収を測定した。融解温度は一次微分の最大値に基づいて決定され、これは分子の50%が一本鎖であり、50 %が構造化している温度である。
Hanover Medical SchoolのProf. Thumのグループによって提供された、全部で10件の血漿試料を解析した。これらの血漿試料のうちの5件は対照群の対象に由来し、別の5件の血漿試料は、急性腎損傷と診断された対象に由来した。チャプター3.2.4に記載された通りに血漿を溶解緩衝液で処理し、SDSを塩化カリウム溶液の存在下で沈殿させた。続いて、表8のスキームにおいて概説される通りに、試料を80℃でハイブリダイズさせた。
4.1 miRNAの濃度
最近隣法(Nearest-Neighbor Method)に従って決定されたmiR16、miR210、およびmiR320の吸光係数を、表9に要約する。
4.2.1 クロマトグラフィー分離に及ぼすPNA電荷の影響
類似の長さのmiRNA鎖を検出するために中性PNAを使用した場合、二重鎖の高品質のグラフィー分離を達成することはできない。HPLCによる分離に関してPNAに及ぼす付加的な正荷電および負電荷の影響を評価するため、以下のPNAをmiR16の検出に使用した:中性、負、および正γ(表3を参照されたい)。
クロマトグラムに及ぼすハイブリダイゼーション条件の影響を評価するため、miR16を、それぞれ、混合物を95℃まで加熱した後に氷上で、および25℃で、異なって荷電されたPNAとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの条件は3.2.5に記載され、クロマトグラフィーの条件は4.3.4に記載される。
オートサンプラー内で試料のインキュベーション時間がより長い場合に、マレイミド環構造の加水分解が増加することが観察された。したがって、ハイブリダイゼーションの段階中に2 Mおよび4.5 Mの濃度の尿素を添加することを試験した。比較として、チャプター3.2.5に従った尿素の非存在下でのさらなるハイブリダイゼーションもそのために行った。続いてハイブリダイゼーション混合物を、0時間、5.5時間、および11時間後に、確立されたHPLC条件(4.3.4を参照されたい)下でHPLCシステム1(3.3.2を参照されたい)により測定した。これらの測定中の試料のいかなる加水分解も回避するために、オートサンプラーを4℃まで冷却した。
miR16と異なって荷電されたPNAとの間の二重鎖の場合に、マレイミド環の加水分解は、ハイブリダイゼーション温度を25℃まで下げることにより、および4.5 Mの尿素を添加することにより完全に阻害することはできないが、かなりの程度まで減少させることができることが、ハイブリダイゼーション実験によって示された。
4.3.1 カラム温度の最適化
クロマトグラフィー分解能に及ぼすカラム温度の影響を評価するため、異なる温度を試験した。このために、段落3.2.5に記載された通りに試料をハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは40℃で行った。続いて、段落4.3.4に記載されるHPLCパラメータに従って、試料を30℃、40℃、50℃、55℃、および60℃の温度で測定した。
pHはPNA試料のイオン化のレベル、およびそれによってPNA試料の保持時間に影響を及ぼすため、pH値の最適化が、これら3種類の二重鎖の最適な分離を目指すための次の段階であった。このために、pH 7およびpH 8を有するHPLCカラム緩衝液を試験した。pH 7およびpH 8を有するそれぞれの緩衝液は、段落3.3.1に記載される通りに作製した。続いて、試料を3.2.5に従ってハイブリダイズさせ、最適化HPLC条件(4.3.4を参照されたい)下においてこれらのpH値で測定した。これらの実験から、7から8へのpH値の上昇により保持時間が長くなるがことが示された。pH値を上昇させることによって、マレイミド環の加水分解の回避によるピーク分割の全体的な改善、およびそれによるより良いシグナル強度が達成され得た。pH値を7から8に上昇させることにより、シグナル強度もまた改善された。シグナル強度は、miR16-中性の場合には87.3 mVから103.9 mVに、miR16-負の場合は86.3 mVから94.7 mVに、およびmiR16-正γの場合には76.3 mvから97.8 mVに増加した。それと同時に、主ピーク面積の増加を観察することができた(表13を参照されたい)。miR16-中性の場合、主ピーク面積は12.8 mV*分から13.4 mV*分に増加した。miR16-負の場合には、主ピーク面積は9.9 mV*分から11.8 mV*分に増加し、およびmiR16-正γの場合には、主ピーク面積は11.6 mV*分から12.3 mV*分に増加した。
pH値を最適化した後、それに従って勾配を調整することを目的とした。一般に、平坦な勾配はより良い分解能をもたらす。しかしながら、より高いシグナル強度はより急な勾配で達成される。勾配最適化の結果を表14に示す。初めに、9分間での緩衝液Bの5〜55 %の傾斜で勾配を実行した。この結果、3つの二重鎖の保持時間は7.25分〜9.47分の範囲であった。その後、勾配の傾斜を1分当たり5.6 %から7.3 %まで増加させた。緩衝液Bの初期塩濃度を5 %から15 %に増加させることにより、流動の総時間が17分から15分に最小化され得た。それぞれの保持時間は4.84分〜6.47分の範囲であった。
図7は、miR16-RNAと異なって荷電されたそれぞれの3種類のPNAとの間の3種類の二重鎖の分離のクロマトグラムを示す。ボイド容量中に、増加したPNA過剰のシグナルが示され、これは二重鎖が完全に形成されたことを保証するのに必要である。これら3種類の二重鎖は、4分〜7.5分の範囲に溶出した。HPLCランニング緩衝液はpH 8を有し、勾配は7分間での緩衝液Bの15〜66 %の傾斜を有した。勾配のこの傾斜はまた、必要とされる分解能を示した。
ハイブリダイゼーション条件およびHPLC条件を最適化した後、確立された方法の較正を行った。このために、カラムにおいて0.16〜500 fmolの範囲のmiRNAの較正を可能にする系列希釈を行った(3.2.5を参照されたい)。続いて、試料を25℃でハイブリダイズさせた。目的は同時並行検出を可能にすることであったため、ハイブリダイゼーション段階後に作製された、それぞれの系列希釈段階の等モル混合物を、確立されたHPLC条件(4.3.4を参照されたい)下で測定した。図8は、それぞれの系列希釈物の測定によって得られたクロマトグラムを示す。この図は、それぞれの系列希釈濃度の1:1:1混合物のクロマトグラムを示し、ここでは0.053〜166.7 fmolが注入された。0.267 fmolのmiR16を注入した場合、miR16-正γのシグナル・ノイズ比 (S/N) は2.2である。同様の濃度のmiR16-中性およびmiR16-負の場合、シグナル・ノイズ比はそれぞれ9.4および11.5である。結果として、miR16-正γの場合、検出限界 (LOD) はおよそ0.267 fmolであり、その他の二重鎖の双方についても同じ同一量が既に検出限界 (LOD) と規定され得た。0.053 fmolという較正のための最少量は、この量が検出限界未満であったために、解析され得なかった。
マレイミド化学による蛍光色素の連結は、調節が難しい加水分解と共に進行し、加水分解の完全な抑制を達成することができなかったため、蛍光色素をNHS化学によってより安定した方法でPNAに連結するように、別のPNA設計を選択した。
3種類の二重鎖の最適な分離を得るために、新たに修飾されたPNAを使用しなければならなかった。これに関して、miR16およびmiR210と相補的な新たなPNAを解析した。保持時間の移行の増大を得るために、miR16と相補的なPNAを、配列の各末端のそれぞれにおいて2つのグルタミン酸残基を付加し、それにより4つの付加的な負電荷をもたらすことにより修飾した。miR210と相補的なPNAは、同様の様式で、しかし8つの負電荷を用いて修飾した。miR320に対するPNAは中性に保持した。
その後、Hannover Medical Schoolによって提供されたト血漿由来のmiR16、miR210、およびmiR320の検出を行った。ここでは、急性腎損傷と推定バイオマーカーとしてのmiRNAとの間の相関関係を解析することを目的とした。
本研究において開発された新たに確立されたHPLC法により、1回のHPLC流動での、類似の長さを有する異なるmiRNAの同時検出が可能になる。これに関連して、3種類のmiRNA、すなわちmiR16、miR210、およびmiR320が、異なって荷電されたPNAの存在下でのハイブリダイゼーション後に、AEX-HPLCにより分離された。最初は、マレイミド化学により蛍光色素をPNA配列に連結できるようにするPNA設計が選択された。しかしながら、ハイブリダイゼーション条件およびHPLC条件を最適化する過程において、マレイミド環の加水分解に起因して、クロマトグラムがピークの分割を示し、それによってシグナル強度を最小化したため、これが最適ではないことが判明した。この影響は、温度の上昇時および試料のより長いインキュベーション時間後に特に観察された。
Claims (12)
- (a) 等しい長さの少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドを含有するかまたは含有する疑いのある生体試料を提供する段階;
(b) 該生体試料を、該等しい長さの少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドと相補的な少なくとも3種類の検出分子と接触させることにより、ハイブリダイゼーション混合物を形成する段階であって、該検出分子が、少なくとも1つの蛍光部分でそれぞれ標識されており、該検出分子が、互いに異なる表面電荷を有し、該少なくとも3種類の検出分子の該異なる表面電荷が、中性電荷、負電荷、および正電荷の群より選択され、該負の表面電荷が、少なくとも2つの組み込まれた負荷電アミノ酸残基またはアミノグリシン骨格修飾の存在を特徴とし、かつ該正の表面電荷が、少なくとも2つの組み込まれた正荷電アミノ酸残基またはアミノグリシン骨格修飾の存在を特徴とする、段階;
(c) 陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー (AEX-HPLC) により、該等しい長さの少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした該検出分子を、ハイブリダイズしなかった検出分子の該部分から分離する段階;
(d) 定量的蛍光読み取りによって、ハイブリダイズした該検出分子-オリゴヌクレオチド部分を検出する段階
を含む、該等しい長さの少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドを1つの生体試料から同時並行して定量的に検出するための方法。 - 前記少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドが、10〜50ヌクレオチドの長さ、好ましくは12〜40ヌクレオチドの長さ、より好ましくは18〜30ヌクレオチドの長さを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記等しい長さの少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドが、miRNA (miRNA)、低分子干渉RNA (siRNA)、短鎖活性化RNA (saRNA)、デコイオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、およびspiegelmer(登録商標)からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記検出分子が、ペプチド核酸 (PNA)、およびホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー (PMO)からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出分子が、10〜30ヌクレオチドの長さ、好ましくは10〜20ヌクレオチドの長さ、より好ましくは15〜20ヌクレオチドの長さを有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも3種類の検出分子が、同じアイデンティティーを有する蛍光部分でそれぞれ標識されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも3種類の検出分子の前記異なる表面電荷が、中性電荷と負電荷、中性電荷と正電荷、および/または負電荷と正電荷の組み合わせより選択され、好ましくは、複数の負電荷、複数の正電荷、またはこれらの任意の組み合わせより選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記負荷電アミノ酸残基がグルタミン酸の形態である、請求項1に記載の方法。
- 前記正荷電アミノ酸残基がリジンの形態である、請求項1に記載の方法。
- 段階 (c) における陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー (AEX-HPLC) が、30℃〜75℃の温度で、好ましくは40℃〜55℃の温度で、より好ましくは50℃の温度で行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 段階 (d) の定量的読み取りが、前記ハイブリダイズした検出分子-オリゴヌクレオチド部分の蛍光シグナルを、内部標準とまたは外部較正曲線の形態の外部標準と比較することを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー(AEX-HPLC)によって、等しい長さの少なくとも3種類の異なるオリゴヌクレオチドを1つの生体試料から同時並行して定量的に検出するための、互いに異なる表面電荷を有する少なくとも3種類の検出分子の使用であって、該少なくとも3種類の検出分子の該異なる表面電荷が、中性電荷、負電荷、および正電荷の群より選択され、該負の表面電荷が、少なくとも2つの組み込まれた負荷電アミノ酸残基またはアミノグリシン骨格修飾の存在を特徴とし、かつ該正の表面電荷が、少なくとも2つの組み込まれた正荷電アミノ酸残基またはアミノグリシン骨格修飾の存在を特徴とし、好ましくは該検出が、請求項1〜11のいずれか一項において定義された通りに行われる、使用。
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