ES2759991T3 - Ensayo para detectar y cuantificar el VIH-1 - Google Patents

Abstract

Un método para cuantificar la cantidad combinada de un ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y un ácido nucleico del grupo O del VIH-1 que puede estar presente en una muestra biológica, que comprende las etapas de: (i) combinar en un único recipiente de reacción dicha muestra biológica, un primer cebador de amplificación en el que dicho primer cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana que consiste en la SEQ ID NO: 15, un segundo cebador de amplificación y una sonda de hibridación; (ii) amplificar con una eficacia sustancialmente igual cualquiera del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica usando una reacción de amplificación in vitro que comprende la amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación usando una 1primera cadena de dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 como primera plantilla para crear un primer producto de amplificación de cebador, y la amplificación enzimática de dicho segundo cebador de amplificación usando dicho producto de amplificación del primer cebador como segunda plantilla, por lo que se producen amplicones del grupo M del VIH-1 si la muestra biológica contenía dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1, y amplicones del grupo O del VIH-1 si la muestra biológica contenía dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1; (iii) monitorizar la producción de amplicones de dichos amplicones en dicha reacción de amplificación in vitro en función del tiempo mediante un procedimiento que comprende la detección de una señal de dicha sonda de hibridación, mediante la cual se obtienen datos cuantitativos dependientes del tiempo; y (iv) cuantificar la cantidad combinada de dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica usando los datos cuantitativos dependientes del tiempo obtenidos en la etapa de monitorización, en el que ni dicho primer cebador de amplificación ni dicho segundo cebador de amplificación son completamente complementarios con dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o su complemento, o con dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 o su complemento, y en donde dicha sonda de hibridación se hibrida con tanto amplicones del grupo M de VIH-1 como amplicones del grupo O de VIH-1.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo para detectar y cuantificar el VIH-1

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/615.533, presentada el 30 de septiembre de 2004.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología. Más específicamente, la invención se refiere a ensayos diagnósticos para detectar y cuantificar los ácidos nucleicos del VIH-1.

Antecedentes de la invención

Los avances en la terapéutica clínica de individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) han sido capaces de reducir los títulos virales por debajo de los límites de detección de algunos ensayos de VIH-1 de primera generación. Más específicamente, la terapia con fármacos antirretrovirales altamente activos (HAART) puede reducir la carga viral a un nivel cercano a 50 copias de ARN del VIH-1/ml, un nivel sustancialmente inferior al umbral de 400-500 copias/ml de algunos ensayos de detección anteriores. Este hecho, junto con el deseo de controlar y mantener bajos títulos virales, ha requerido del desarrollo de mejores ensayos cuantitativos para medir el ARN del VIH-1. (Elbeik y col., J. Clin. Micro. 38:1113-1120 (2000)). Sin embargo, el hecho de que los ensayos cuantitativos útiles deban ser capaces de medir con precisión una gama de variantes genéticamente diversas de VIH-1 es complicado.

Se han desarrollado tres clases de VIH-1 en todo el mundo: M (principal), O (aislado) y N (nuevo). Entre el grupo M, que representa más del 90% de los casos notificados de VIH/SIDA, las envolturas virales se han diversificado tanto que este grupo se ha subclasificado en nueve clados principales, incluidos A-D, F-H, J y K, así como en varias formas recombinantes circulantes. Los subtipos dentro del grupo O del VIH-1 no están claramente definidos, y la diversidad de secuencias dentro del grupo O es casi tan grande como la diversidad de secuencias en el grupo M del VIH-1. Los análisis filogenéticos de los genes gag y env no han logrado revelar clados de virus del grupo O tan claramente como los clados detectados en el grupo M. Se cree que los subtipos y los subtipos del grupo M del VIH-1 divergieron en humanos después de un solo evento de transmisión de chimpancé a humano. Por el contrario, se cree que los grupos O y N del VIH-1 son el resultado de eventos separados de transmisión de chimpancés a humanos. De los genomas de VIH-1 completamente secuenciados, casi el 20% tiene una estructura tipo mosaico que consiste en al menos dos subtipos, otra complicación potencial para los ensayos de detección de VIH-1 ultrasensibles. (Spica et al., J. Antimicrobial Chemotherapy 51: 229 (2003)).

La mayor parte de la monitorización de la carga viral se realiza actualmente en el mundo occidental desarrollado, donde predomina el clado B (es decir, del "subtipo B" en adelante), que representa solo alrededor del 3% de las infecciones por VIH en todo el mundo. Es importante destacar que los subtipos virales del VIH-1 se están expandiendo en diferentes regiones geográficas, requiriéndose así un esfuerzo adicional para disponer de una capacidad más amplia de detección en los ensayos comunes de detección y monitoreo de la carga viral. En consecuencia, existe todavía la necesidad de producir ensayos de detección de VIH-1 ultrasensibles que sean capaces de medir con precisión la gama completa de subtipos de VIH-1. La presente invención aborda esta necesidad.

En la solicitud de patente internacional publicada WO 2003106714 se describe un ejemplo de un ensayo cuantitativo del VIH-1 realizado usando monitoreo en tiempo real de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

Compendio de la invención

Los aspectos y realizaciones de la presente invención se establecen en las reivindicaciones.

Un primer aspecto de la descripción se refiere a una mezcla de una reacción útil para amplificar ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. La mezcla de reacción incluye normalmente primeros y segundos cebadores de amplificación. El primer cebador de amplificación incluye una primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador que puede hibridarse independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1, y con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. El segundo cebador de amplificación incluye una segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida con un producto de amplificación enzimática del primer cebador de amplificación usando como plantilla la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. La segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 33. En una realización preferida, la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 2. Cuando este es el caso, la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador puede consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 13. Alternativamente, la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador puede consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 15. En una realización preferida diferente, la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 5. Cuando este es el caso, la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador puede consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 15. En otra realización preferida más, la mezcla de reacción incluye además una sonda de hibridación. La sonda de hibridación es una sonda de hibridación de baliza molecular. Se prefiere en ciertas realizaciones que no se usen más de dos cebadores y una sola sonda para amplificar y detectar los ácidos nucleicos del grupo M de VIH-1 o los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1.

También se describe un método para cuantificar la cantidad combinada de un ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y un ácido nucleico del grupo O del VIH-1 que puede estar presente en una muestra biológica. El método inventado implica etapas para: (a) combinar en un solo recipiente de reacción la muestra biológica, un primer cebador de amplificación, un segundo cebador de amplificación y una sonda de hibridación; (b) amplificar, con una eficacia sustancialmente igual, cualquiera del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica usando una reacción de amplificación in vitro que se basa en la amplificación enzimática del primer cebador de amplificación usando una primera cadena del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 como primera plantilla para crear un primer producto de amplificación de cebador, y la amplificación enzimática del segundo cebador de amplificación usando el primer producto de amplificación de cebador como segunda plantilla, mediante la cual se producen amplicones del grupo M del VIH-1 si la muestra biológica contiene ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1, y amplicones del grupo O del VIH-1 si la muestra biológica contiene ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1; (c) monitorizar la producción de amplicones en la reacción de amplificación in vitro en función del tiempo mediante un procedimiento que incluye la detección de una señal de la sonda de hibridación, mediante la cual se obtienen datos cuantitativos dependientes del tiempo; y (d) cuantificar la cantidad combinada del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica usando los datos cuantitativos dependientes del tiempo obtenidos en la etapa de monitorización. De acuerdo con este aspecto de la descripción, ni el primer cebador de amplificación ni el segundo cebador de amplificación son completamente complementarios al ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o al complemento del mismo, o al ácido nucleico del grupo O del VIH-1 o al complemento del mismo. Además, de acuerdo con este aspecto, la sonda de hibridación se hibrida con amplicones del grupo M del VIH-1 y amplicones del grupo O del VIH-1. En particular, el método también se contempla para su uso en la detección y cuantificación de ácidos nucleicos del grupo N del VIH-1. En una realización preferida, la reacción de amplificación in vitro es una reacción de amplificación in vitro isotérmica que no requiere ciclos de temperatura para lograr algún grado de amplificación exponencial. Más preferiblemente, la reacción de amplificación isotérmica in vitro es una reacción de amplificación asociada a la transcripción que es tanto una reacción TMA como una reacción NASBA. En una realización preferida alternativa, la señal detectada en la etapa de monitorización es una señal fluorescente, tal como una señal fluorescente producida por una sonda de hibridación de baliza molecular. En una realización altamente preferida, el primer cebador de amplificación incluye una primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 15. Más preferiblemente, el segundo cebador de amplificación incluye una segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador que consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 5. De acuerdo con otra realización preferida, no se usan más de dos cebadores y una sola sonda para amplificar y detectar tanto el ácido nucleico del grupo M del VIH-1 como el ácido nucleico del grupo O del VIH-1. En una realización altamente preferida, la reacción de amplificación in vitro es una reacción de amplificación in vitro isotérmica. En una realización alternativa altamente preferida, la etapa de cuantificación implica comparar un resultado cuantitativo con no más de una sola curva estándar.

Un aspecto más de la descripción se refiere a un método para establecer un punto en una curva estándar que se puede usar para cuantificar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 en una sola reacción. El método implica etapas para: (a) proporcionar una cantidad conocida de un estándar de VIH-1; (b) amplificar en una reacción de amplificación in vitro el estándar VIH-1 usando un primer cebador y un segundo cebador en presencia de una sonda de hibridación para producir amplicones estándar VIH-1, en donde la reacción de amplificación amplifica los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 con una eficiencia sustancialmente igual; (c) controlar la producción de amplicones estándar de VIH-1 sintetizados en la reacción de amplificación in vitro en función del tiempo mediante un procedimiento que implica la detección de una señal de la sonda de hibridación, mediante la cual se obtienen datos cuantitativos; y (d) establecer a partir de los datos cuantitativos un punto en la curva estándar. En una realización preferida, el primer cebador de amplificación incluye una primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, en la que el segundo cebador de amplificación incluye una segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida con un producto de amplificación enzimática del primer cebador de amplificación utilizando como plantilla la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. De acuerdo con esta realización, (a) ni la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador ni la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador son completamente complementarias a los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 o sus complementos, y (b) la sonda de hibridación puede hibridarse con ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, o con sus complementos. En una realización preferida, la sonda de hibridación es una baliza molecular. Más preferiblemente, cuando la sonda de hibridación es una baliza molecular, el estándar de VIH-1 es un estándar de ácido nucleico del grupo M de VIH-1. Aún más preferiblemente, cuando la sonda de hibridación es una baliza molecular, y cuando el estándar de VIH-1 es un estándar de ácido nucleico del grupo M del VIH-1, puede haber un paso adicional para usar la curva estándar para cuantificar los ácidos nucleicos del grupo de O del VIH-1 contenidos en una muestra biológica. En una realización preferida diferente, el estándar de VIH-1 es un estándar de ácido nucleico del grupo O del VIH-1. Cuando este es el caso, puede haber un paso más para usar la curva estándar para cuantificar un ácido nucleico del grupo M del VIH-1 contenido en una muestra biológica. En otra realización diferente más, la reacción de amplificación in vitro en la etapa de amplificación puede ser una reacción de amplificación in vitro isotérmica. Cuando este es el caso, la reacción de amplificación isotérmica in vitro puede ser una reacción de amplificación asociada a la transcripción, como una reacción de TMA o una reacción NASBA. En tal caso, la etapa para el monitoreo puede involucrar la medición de una señal fluorescente.

Un cuarto aspecto de la descripción se refiere a un método para preparar una mezcla de reacción para amplificar uno 0 ambos ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. El método incluye etapas para: (a) seleccionar un primer cebador de amplificación que incluye una secuencia que se hibrida independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1; (b) seleccionar un segundo cebador de amplificación que incluye una secuencia que se hibrida con productos de amplificación enzimática del primer cebador de amplificación usando la primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 como plantilla; (c) seleccionar una sonda de hibridación que se hibrida con amplicones sintetizados mediante el uso del primer y el segundo cebadores de amplificación, en el que ni la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador ni la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador son completamente complementarias a los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 o sus complementos, y en donde el primer cebador de amplificación, el segundo cebador de amplificación y la sonda de hibridación se seleccionan adicionalmente para amplificar en una reacción de amplificación in vitro los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH -1 con eficiencias sustancialmente iguales; y (d) combinar en un único recipiente de reacción el primer cebador de amplificación, el segundo cebador de amplificación y la sonda de hibridación. En una realización preferida, la mezcla de reacción incluye no más de dos cebadores y una única sonda de hibridación para amplificar y detectar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. Más preferiblemente, la reacción de amplificación in vitro es una reacción de amplificación in vitro isotérmica. Aún más preferiblemente, la reacción de amplificación isotérmica in vitro es una reacción de amplificación asociada a la transcripción que es una reacción TMA o una reacción NASBA.

Un quinto aspecto de la descripción se refiere a una composición para amplificar ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1. La composición incluye: (a) un primer cebador de amplificación que incluye una primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y con una primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 y (b) un segundo cebador de amplificación que incluye una segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida con productos de amplificación enzimática del primer cebador de amplificación usando la primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 como plantillas. De acuerdo con este aspecto de la invención, ni la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador ni la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador son completamente complementarias a los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 o sus complementos. En una realización preferida, la composición también incluye una sonda de hibridación que se hibrida con un producto de amplificación producido en una reacción de amplificación in vitro por la actividad combinada del primer y segundo cebadores de amplificación utilizando como plantilla ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1. Más preferiblemente, la composición amplifica los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 en la reacción de amplificación in vitro del ácido nucleico con una eficacia sustancialmente igual. Aún más preferiblemente, la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 15, y la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 5. En una realización alternativa preferida, la sonda de hibridación es una baliza molecular. En ciertos casos, se prefiere que la sonda de hibridación sea una baliza molecular. En otras realizaciones preferidas, la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador consiste esencialmente en la SEQ ID N°: 5. Cuando este es el caso, la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador puede consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones más preferidas, cuando la composición incluye la sonda de hibridación mencionada anteriormente, la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador puede consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 15, y la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador puede consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 5. Más preferiblemente, la sonda de hibridación es una baliza molecular.

Un sexto aspecto de la descripción se refiere a una mezcla de reacción para amplificar ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1. La mezcla de reacción inventada incluye: (a) un primer cebador de amplificación que incluye una primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1; (b) un segundo cebador de amplificación que incluye una segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador que se hibrida con un producto de amplificación enzimática del primer cebador de amplificación, utilizando como plantilla la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M de VIH-1 o la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1; y (c) una sonda de hibridación de baliza molecular que se hibrida con un amplicón sintetizado por la actividad combinada del primer cebador de amplificación y el segundo cebador de amplificación. De acuerdo con este aspecto de la invención, ni la primera secuencia de hibridación que reconoce el cebador ni la segunda secuencia de hibridación que reconoce el cebador son completamente complementarias a los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 o sus complementos. Significativamente, los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 se amplifican en la mezcla de reacción con una eficiencia sustancialmente igual.

Definiciones

Los siguientes términos tienen los siguientes significados para los fines de esta descripción, a menos que se indique expresamente lo contrario en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, una "muestra biológica" es cualquier tejido o material que contiene polinucleótidos obtenido de una muestra humana, animal o ambiental. Las muestras biológicas de acuerdo con la invención incluyen sangre periférica, plasma, suero u otros fluidos corporales, médula ósea u otros órganos, tejidos de biopsia u otros materiales de origen biológico. Una muestra biológica puede tratarse para alterar el tejido o la estructura celular, liberando así componentes intracelulares en una solución que puede contener enzimas, tampones, sales, detergentes y similares.

Como se usa en el presente documento, "polinucleótido" significa ARN o ADN, junto con cualquier análogo de nucleótido sintético u otras moléculas que puedan estar presentes en la secuencia y que no eviten la hibridación del polinucleótido con una segunda molécula que tenga una secuencia complementaria.

Como se usa en el presente documento, un "marcador detectable" es una especie química que puede detectarse o puede conducir a una respuesta detectable. Los marcadores detectables de acuerdo con la invención pueden unirse a sondas de polinucleótidos directa o indirectamente e incluyen radioisótopos, enzimas, haptenos, cromóforos, como tintes o partículas que imparten un color detectable (p. ej., cuentas de látex o partículas metálicas), compuestos luminiscentes (por ejemplo, restos bioluminiscentes, fosforescentes o quimioluminiscentes) y compuestos fluorescentes.

Un "marcador detectable homogéneo" se refiere a un marcador que puede detectarse de manera homogénea determinando si la marcador está en una sonda hibridada a una secuencia diana. Es decir, se pueden detectar marcadores detectables homogéneos sin eliminar físicamente las formas hibridadas del marcador o la sonda marcada. Se prefieren los marcadores detectables homogéneos cuando se usan sondas marcadas para detectar los ácidos nucleicos del VIH-1. Ejemplos de marcadores homogéneos han sido descritos con detalle por Arnold et al., Patente de EE.UU. N° 5.283.174; Woodhead et al., Patente de EE.UU. N° 5.656.207; y Nelson et al., patente de EE.UU. No.

5.658.737. Los marcadores preferidos para su uso en ensayos homogéneos incluyen compuestos quimioluminiscentes (por ejemplo, véase Woodhead et al., Patente de los Estados Unidos N° 5.656.207; Nelson et al., Patente de los Estados Unidos N° 5.658.737; y Arnold, Jr., y col., Patente de los Estados Unidos 5.639.604). Los marcadores quimioluminiscentes preferidos son compuestos de éster de acridinio ("AE"), tales como AE estándar o derivados de los mismos (por ejemplo, naftil-AE, orto-AE, 1- o 3-metil-AE, 2,7-dimetil-AE, 4,5-dimetil-AE, orto-dibromo-AE, ortodimetil-AE, meta-dimetil-AE, orto-metoxi-AE, orto-metoxi(cinnamil)-AE, orto-metil-AE, orto-fluoro-AE , 1-o 3-metil-ortofluoro-AE, 1- o 3-metil-meta-difluoro-AE y 2-metil-AE).

Un "ensayo homogéneo" se refiere a un procedimiento de detección que no requiere la separación física de la sonda hibridada de la sonda no hibridada antes de determinar el alcance de la hibridación específica de la sonda. Ensayos homogéneos ejemplares, como los descritos en este documento, pueden emplear balizas moleculares u otras sondas de autoinformantes que emitan señales fluorescentes cuando se hibridan con una diana apropiada, marcadores de éster de acridinio quimioluminiscente que pueden destruirse selectivamente por medios químicos a menos que estén presentes en un dúplex híbrido, y otros marcadores homogéneamente detectables que serán familiares para aquellos que tienen un nivel de experto medio en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "amplificación" o "amplificar" se refiere a un procedimiento in vitro para obtener múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana, su complemento o sus fragmentos.

Por "ácido nucleico diana" o "diana" se entiende una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ácido nucleico diana.

Por "secuencia de ácido nucleico diana" o "secuencia diana" o "región diana" se entiende una secuencia específica de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico monocatenario y que, posiblemente, comprende (cuando se especifica) su secuencia desoxirribonucleotídica o ribonucleotídica complementaria. En general, una secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar se colocará entre dos cebadores dispuestos opuestamente, e incluirá la porción de la molécula de ácido nucleico diana que sea parcial o totalmente complementaria a cada uno de los cebadores. En el contexto de la invención, una molécula de ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de VIH-1. La porción de esta molécula de ácido nucleico diana a amplificar en una reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro se denominaría la "secuencia de ácido nucleico diana" a amplificar.

Por "amplificación asociada a la transcripción" se entiende cualquier tipo de amplificación de ácido nucleico que utilice una ARN polimerasa para producir múltiples transcripciones de ARN a partir de una plantilla de ácido nucleico. Un ejemplo de un método de amplificación asociado a la transcripción, llamado "Amplificación Mediada por la Transcripción" (TMA), generalmente emplea una ARN polimerasa, una ADN polimerasa, desoxirribonucleósidos trifosfatos, ribonucleósidos trifosfatos y un oligonucleótido complementario promotor-plantilla y, opcionalmente, puede incluir uno o más oligonucleótidos análogos. Las variaciones de TMA son comunes en la técnica como se describe con detalle en Burg et al., patente de EE.UU. N° 5.437.990; Kacian et al., Patentes de EE.UU. Nos. 5.399.491 y 5.554.516; Kacian et al., PCT No. WO 93/22461; Gingeras et al., PCT No. WO 88/01302; Gingeras et al., PCT No. WO 88/10315; Malek et al., Patente de EE.UU. N° 5.130.238; Urdea et al., Patentes de EE.UU. Nos. 4.868.105 y 5.124.246; McDonough et al., PCT No. WO 94/03472; y Ryder et al., PCT No. WO 95/03430. Se prefieren los métodos de Kacian et al. para llevar a cabo procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos del tipo descrito en este documento. Otro ejemplo de un método de amplificación asociado a la transcripción es el método de amplificación basado en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) descrito en la patente de EE.UU. No. 5.554.517.

Como se usa en el presente documento, un "oligonucleótido" u "oligómero" es una cadena polimérica de al menos dos, generalmente entre aproximadamente cinco y aproximadamente 100, subunidades químicas, comprendiendo cada subunidad un resto de base de nucleótidos, un resto de azúcar y un resto de unión que une las subunidades. Los restos de bases de nucleótidos comunes son guanina (G), adenina (A), citosina (C), timina (T) y uracilo (U), aunque otras bases de nucleótidos raras o modificadas, incluidos análogos de nucleótidos, capaces de formar enlaces de hidrógeno son también comunes para los expertos en la materia. Los oligonucleótidos pueden incluir opcionalmente análogos de cualquiera de los restos de azúcar, los restos de base y los constituyentes del esqueleto. Los oligonucleótidos preferidos de la presente invención se incluyen en un intervalo de tamaños de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 residuos. Los oligonucleótidos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, pero preferiblemente se sintetizan usando cualquiera de una variedad de métodos enzimáticos o químicos comunes.

Como se usa en el presente documento, una "sonda de hibridación" es un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una secuencia diana en un ácido nucleico, preferiblemente en un ácido nucleico amplificado, en condiciones que promueven la hibridación para formar un híbrido detectable. Una sonda opcionalmente puede contener un resto detectable que puede estar unido al extremo o extremos de la sonda o puede ser interno. Los nucleótidos de la sonda que se combinan con el polinucleótido diana no necesitan ser estrictamente contiguos, como puede ser el caso con un resto detectable interno a la secuencia de la sonda. La detección puede ser directa (es decir, como resultado de una sonda que se hibrida directamente con la secuencia diana o ácido nucleico amplificado) o indirectamente (es decir, como resultado de una sonda que se hibrida con una estructura molecular intermedia que une la sonda con la secuencia diana o ácido nucleico amplificado). La "diana" de una sonda generalmente se refiere a una secuencia contenida dentro de una secuencia de ácido nucleico amplificada que se hibrida específicamente con al menos una porción de un oligonucleótido de sonda usando enlaces de hidrógeno estándar (es decir, emparejamiento de bases). Una sonda puede comprender secuencias diana específicas y, opcionalmente, otras secuencias que no sean complementarias de la secuencia diana que se va a detectar. Estas secuencias no complementarias pueden comprender una secuencia promotora, un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción o secuencias que contribuyan a la conformación tridimensional de la sonda (por ejemplo, como se describe en Lizardi et al., Patentes de EE.Uu . Nos. 5.118.801 y 5.312.728). Las secuencias que son "suficientemente complementarias" permiten la hibridación estable de un oligonucleótido sonda a una secuencia diana que no es completamente complementaria a la secuencia específica de la sonda.

Como se usa en el presente documento, un "cebador de amplificación" es un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico diana, o su complemento, y participa en una reacción de amplificación de ácido nucleico. Por ejemplo, los cebadores de amplificación, o más simplemente "cebadores" a secas, pueden ser oligonucleótidos opcionalmente modificados que sean capaces de hibridarse con un ácido nucleico plantilla y que tengan un extremo 3' que pueda ampliarse por la actividad de la ADN polimerasa. En general, el cebador tendrá una secuencia complementaria de VIH-1 posterior y, opcionalmente, una secuencia anterior que no será complementaria con los ácidos nucleicos de VIH-1. La secuencia anterior opcional puede, por ejemplo, servir como un promotor de la ARN polimerasa o contener sitios de escisión de la endonucleasa de restricción.

Por "sustancialmente homólogo", "sustancialmente correspondiente" o "que sustancialmente corresponde" significa que el oligonucleótido diana tiene una secuencia de bases que contiene al menos 10 regiones de bases contiguas que son al menos un 70% homólogas, preferiblemente al menos un 80% homólogas, más preferiblemente al menos un 90% homólogas y, lo más preferiblemente, un 100% homólogas con una región de al menos 10 bases contiguas presentes en la secuencia de base de referencia (excluyendo los equivalentes de ARN y ADN). Los expertos en la materia apreciarán fácilmente las modificaciones que podrían hacerse a las condiciones del ensayo de hibridación en diversos porcentajes de homología para permitir la hibridación del oligonucleótido con la secuencia diana mientras se evitan niveles inaceptables de hibridación no específica. El grado de similitud se determina comparando el orden de las nucleobases que forman las dos secuencias y no tiene en cuenta otras diferencias estructurales que puedan existir entre las dos secuencias, siempre que las diferencias estructurales no impidan los puentes de hidrógeno con las bases complementarias. El grado de homología entre dos secuencias también se puede expresar en términos del número de desajustes de bases presentes en cada conjunto de al menos 10 bases contiguas que se comparan, que pueden variar de 0 a 3 diferencias de bases.

Por "sustancialmente complementario" se entiende que el oligonucleótido diana tiene una secuencia de bases que contiene una región de al menos 10 bases contiguas que sea al menos un 70% complementaria, preferiblemente al menos un 80% complementaria, más preferiblemente al menos un 90% complementaria y, lo más preferiblemente, un 100% complementaria con una región de al menos 10 bases contiguas presentes en una secuencia de ácido nucleico diana (excluyendo los equivalentes de ARN y ADN). (Los expertos en la materia apreciarán fácilmente las modificaciones que podrían realizarse en las condiciones del ensayo de hibridación a diversos porcentajes de complementariedad para permitir la hibridación del oligonucleótido con la secuencia diana mientras se evitan niveles inaceptables de hibridación no específica). El grado de complementariedad se determina comparando el orden de las nucleobases que forman las dos secuencias y no tiene en cuenta otras diferencias estructurales que pueden existir entre las dos secuencias, siempre que las diferencias estructurales no impidan que se formen puentes de hidrógeno con las bases complementarias. El grado de complementariedad entre dos secuencias también se puede expresar en términos del número de desapareamientos de bases presentes en cada conjunto de al menos 10 bases contiguas que se comparan, el cual puede variar entre 0 y 3 desapareamientos de bases.

Por "suficientemente complementario" se entiende una secuencia de bases de ácido nucleico contigua que es capaz de hibridarse con otra secuencia de bases mediante enlaces de hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición en la secuencia de bases de un oligonucleótido usando el emparejamiento de bases estándar (p. ej., emparejamiento G:C, A:T o A:U) o pueden contener uno o más residuos que no sean complementarios usando puentes de hidrógeno estándar (incluidos los "nucleótidos" no básicos), pero en el que toda la secuencia de bases complementarias es capaz de hibridarse específicamente con otra secuencia de bases en condiciones de hibridación apropiadas. Las bases contiguas son preferiblemente al menos aproximadamente un 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% y, lo más preferiblemente, aproximadamente un 100% complementarias con la secuencia con la que se pretende que el oligonucleótido se hibride específicamente. Los expertos en la materia conocen perfectamente las condiciones de hibridación apropiadas, se pueden predecir fácilmente en función de la composición de la secuencia de bases, o se pueden determinar empíricamente mediante pruebas de rutina (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) en §§1,90-1,91, 7,37-7,57, 9,47-9,51 y 11,47-11,57, particularmente, en §§9,50-9,51, 11,12-11,13, 11,45-11,47 y 11,55 -11,57).

Por "oligonucleótido de captura" se entiende al menos un oligonucleótido de ácido nucleico que proporciona medios para unir específicamente una secuencia diana y un oligonucleótido inmovilizado debido a la hibridación de pares de bases. Un oligonucleótido de captura incluye preferiblemente dos regiones de unión: una región de unión a la secuencia diana y una región de unión a la sonda inmovilizada, generalmente contigua en el mismo oligonucleótido, aunque el oligonucleótido de captura puede incluir una región de unión a la secuencia diana y una región de unión a la sonda inmovilizada que están presentes en dos oligonucleótidos diferentes unidos por uno o más enlazadores. Por ejemplo, una región de unión a la sonda inmovilizada puede estar presente en un primer oligonucleótido, la región de unión a la secuencia diana puede estar presente en un segundo oligonucleótido, y los dos oligonucleótidos diferentes están unidos por enlaces de hidrógeno con un conector que es un tercer oligonucleótido que contiene secuencias que se hibridan específicamente con las secuencias del primer y segundo oligonucleótidos.

Por "sonda inmovilizada" o "ácido nucleico inmovilizado" se entiende un ácido nucleico que une, directa o indirectamente, un oligonucleótido de captura a un soporte inmovilizado. Una sonda inmovilizada es un oligonucleótido unido a un soporte sólido que facilita la separación de la secuencia diana unida del material no unido en una muestra.

Por "separación" o "purificación" se entiende que uno o más componentes de la muestra biológica se eliminan de uno o más componentes de la muestra. Los componentes de la muestra incluyen ácidos nucleicos en una fase de solución generalmente acuosa que también puede incluir materiales tales como proteínas, carbohidratos, lípidos y sondas marcadas. Preferiblemente, la etapa de separación o purificación elimina al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% y, aún más preferiblemente, al menos aproximadamente el 95% de los otros componentes presentes en la muestra.

Por "equivalentes de ARN y ADN" o "bases equivalentes de ARN y ADN" se entiende moléculas, tales como ARN y ADN, que tienen las mismas propiedades de hibridación de los pares de bases complementarios. Los equivalentes de ARN y ADN tienen restos de azúcar diferentes (es decir, ribosa versus desoxirribosa) y pueden diferir por la presencia de uracilo en ARN y timina en ADN. Las diferencias entre los equivalentes de ARN y ADN no contribuyen a las diferencias en la homología porque los equivalentes tienen el mismo grado de complementariedad con una secuencia particular.

Como se usa en el presente documento, una "reacción de amplificación in vitro" es una reacción catalizada por enzimas que da como resultado la síntesis de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana, su complemento o sus fragmentos. A continuación se dan ejemplos de algunos métodos de amplificación útiles que pueden usarse para preparar reacciones de amplificación in vitro. Una "reacción de amplificación isotérmica in vitro" es una reacción de amplificación in vitro que puede sintetizar múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana, su complemento o sus fragmentos a una temperatura constante (es decir, sin ciclos térmicos).

Como se usa en el presente documento, el término "amplicones" se refiere a los productos de amplificación de ácidos nucleicos de una reacción de amplificación in vitro. Los amplicones pueden comprender ADN o a Rn , dependiendo de la naturaleza de la reacción de amplificación in vitro utilizada para producir los amplicones.

Como se usa en el presente documento, la "secuencia de hibridación diana" de una sonda de hibridación o un cebador de amplificación se refiere a la secuencia base de la sonda o del cebador que participa en una estructura dúplex tras la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. En el caso de un cebador promotor que incluye la secuencia posterior complementaria al ácido nucleico diana y la secuencia promotora T7 anterior que no es complementaria al ácido nucleico diana, la secuencia promotora no complementaria del cebador no se consideraría una secuencia de hibridación diana. A la inversa, una secuencia cebadora posterior suficientemente complementaria del ácido nucleico diana para poder formar una estructura dúplex tras la hibridación con el ácido nucleico diana sería una secuencia de hibridación diana. Si la secuencia de hibridación diana del cebador contiene desapareamientos ocasionales con la secuencia de ácido nucleico diana, entonces no sería completamente complementaria con la secuencia de ácido nucleico diana dentro de la molécula de ácido nucleico diana.

Por "completamente complementario" se entiende el 100% de complementariedad de bases entre dos moléculas de polinucleótidos a lo largo de la secuencia de hibridación diana.

Como se usa en el presente documento, el monitoreo de la producción del amplicón "en función del tiempo" se refiere al proceso de tomar mediciones periódicas de la cantidad del amplicón presente en una reacción de amplificación in vitro, y asociar esa cantidad medida con el tiempo transcurrido desde el inicio de la reacción de amplificación in vitro. Por ejemplo, se pueden tomar mediciones periódicas en el mismo punto de diferentes ciclos de una reacción de amplificación, o en intervalos de tiempo periódicos (como cada 20 segundos) durante una reacción que no implica ciclos físicos de los pasos de reacción.

Como se usa en el presente documento, una "curva estándar" es una representación que relaciona (1) una cantidad de preamplificación de un polinucleótido, y (2) algunas indicaciones dependientes del tiempo de una cantidad de post­ amplificación de un amplicón correspondiente. Por ejemplo, una curva estándar puede ser un gráfico con números conocidos de moléculas de plantilla de entrada trazadas en el eje x, y un valor de tiempo requerido para que la reacción de amplificación logre cierto nivel de producción del amplicón detectable trazada en el eje y. Las curvas estándar se producen típicamente usando estándares de polinucleótidos de control que contienen números conocidos de plantillas de polinucleótidos. Las curvas estándar se pueden almacenar en forma electrónica o se pueden representar gráficamente. La cantidad de preamplificación de un polinucleótido analito en una muestra de prueba se puede determinar comparando un valor medido dependiente del tiempo obtenido para la muestra de prueba con una curva estándar, como será familiar para aquellos que tienen un nivel de experto medio en la técnica.

Por "estándar de VIH-1" se entiende un número conocido de copias de un polinucleótido de VIH-1, sin especificar el genotipo de VIH-1.

Por "estándar del grupo M del VIH-1" se entiende un número conocido de copias de un polinucleótido del grupo M del VIH-1.

Por "estándar del grupo O del VIH-1" se entiende un número conocido de copias de un polinucleótido del grupo O del VIH-1.

Como se usa en el presente documento, la etapa del procedimiento de "seleccionar" un cebador de amplificación o una sonda de hibridación significa elegir un cebador de amplificación o una sonda de hibridación que tenga ciertas características específicas.

Como se usa en el presente documento, se dice que dos dianas de ácido nucleico diferentes se amplifican con "eficiencia sustancialmente igual" cuando las velocidades de síntesis de amplicón son sustancialmente iguales en reacciones de amplificación in vitro realizadas usando números similares de las dos dianas de ácido nucleico diferentes como plantillas. En términos prácticos, no es necesario amplificar todas las especies de ácidos nucleicos del VIH-1 con eficiencias idénticas para lograr los beneficios de la invención. En cambio, solo es necesario usar cebadores y una sonda que produzca eficiencias de amplificación sustancialmente iguales. Con esto se quiere decir que, para las reacciones de amplificación in vitro independientes realizadas usando plantillas de ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y del grupo O a niveles iniciales de 1.000 copias/reacción, la diferencia entre el número promedio de copias/reacción inicial determinada para cada diana y el número real de copias iniciales/reacción no es mayor que 1,0log-^{i 0} copias/reacción, más preferiblemente no mayor que 0,7log-ⁱ⁰ copias/reacción y, aún más preferiblemente, no mayor que 0,5log-ⁱ⁰ copias/reacción.

Como se usa en el presente documento, requerir que dos cebadores y una sonda se "seleccionen para amplificar en una reacción de amplificación in vitro ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 con eficiencias sustancialmente iguales" significa que, después de seleccionar diferentes combinaciones de cebadores y sondas, se eligen combinaciones particulares por la característica de amplificar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y del grupo O del VIH-1 en reacciones de amplificación in vitro con eficiencias sustancialmente iguales.

Por "un producto de amplificación producido por la actividad combinada de dichos cebadores de amplificación primero y segundo usando como plantilla ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1" se entiende cualquier amplicón sintetizado usando una combinación de dos cebadores, donde cada uno de los cebadores puede usar ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1, o sus complementos, como plantillas.

Por "que consiste esencialmente en" se entiende que el componente o los componentes adicionales, composición o composiciones o etapa, o etapas, del método que no cambian materialmente las características básicas y novedosas de la presente invención pueden incluirse en las composiciones o kits o métodos de la presente invención. Dichas características incluyen la capacidad de detectar selectivamente los ácidos nucleicos del VIH-1 en muestras biológicas como sangre completa o plasma. Cualquier componente o componentes adicionales, composición o composiciones o etapa, o etapas, del método que tengan un efecto material sobre las características básicas y novedosas de la presente invención quedarían fuera de este término.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 es un diagrama esquemático que ilustra los diversos polinucleótidos que pueden usarse para detectar una región diana dentro del ácido nucleico del VIH-1 (representado por una línea horizontal gruesa). Las posiciones de los siguientes ácidos nucleicos se muestran en relación con la región diana: "Oligonucleótido de captura" se refiere al ácido nucleico utilizado para hibridarse y capturar el ácido nucleico diana antes de la amplificación, donde "T" se refiere a una secuencia de cola utilizada para hibridar un oligonucleótido inmovilizado que tiene una secuencia complementaria (no mostrada); "Cebador no T7" y "Cebador promotor T7" representan dos cebadores de amplificación utilizados para realizar TMA, donde "P" indica la secuencia promotora del cebador promotor T7; y "Sonda" se refiere a la sonda utilizada para detectar el ácido nucleico amplificado.

Fig. 2 es un gráfico lineal que relaciona la cantidad de entrada estándar del VIH-1 en una reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real (eje x) y el tiempo de aparición de la señal fluorescente medida por encima de un umbral de fondo (eje y). Los resultados se muestran para los ensayos realizados usando el cebador de SEQ ID NO: 1 en combinación con un promotor-cebador que tiene la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 (cuadrados/línea continua), y usando el cebador de SEQ ID NO: 2 en combinación con un cebador promotor que tiene la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 (triángulos/línea discontinua).

Fig. 3 es un gráfico lineal que relaciona la cantidad de entrada estándar del VIH-1 en una reacción de amplificación del ácido nucleico en tiempo real (eje x) y el tiempo de aparición de la señal fluorescente medida por encima de un umbral de fondo (eje y). Los resultados representan la amplificación dependiente del tiempo de las plantillas de VIH-1 subtipo B (triángulos/línea continua) y del grupo O del VIH-1 (diamantes/línea discontinua) utilizando un cebador promotor de primera hebra que incluye la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 y un cebador de segunda cadena que tiene la secuencia de s Eq ID NO: 2.

Las figs. 4A-4B son gráficos de líneas que relacionan la cantidad de entrada estándar del VIH-1 en una reacción de amplificación del ácido nucleico en tiempo real (eje x) y el tiempo de aparición de la señal fluorescente medida por encima de un umbral de fondo (eje y). Los resultados representan la amplificación dependiente del tiempo de las plantillas de VIH-1 del subtipo B (Figura 4A) y del grupo O del VIH-1 (Figura 4B) usando un cebador promotor de primera cadena que incluye la secuencia de hibridación diana de la SEQ ID N°: 13 y un cebador de segunda hebra que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 (triángulos/líneas discontinuas), o un cebador promotor de primera hebra que incluye la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 15 y un cebador de segunda hebra que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 (diamantes/líneas continuas).

Las Figs. 5A-5B son gráficos de barras que representan el tiempo de aparición de señales fluorescentes medidas por encima de un umbral de fondo (eje y) para diferentes variantes del VIH-1 a 1.000 copias/reacción. La Fig. 5A muestra resultados para reacciones realizadas usando un cebador promotor de primera cadena que incluye la secuencia de hibridación diana de SEQ ID N°: 13 y un cebador de segunda cadena con la secuencia de SEQ ID N°: 2. La Fig. 5B muestra los resultados de las reacciones realizadas usando un cebador promotor de primera cadena que incluye la secuencia de hibridación diana de SEQ ID N°: 15 y un cebador de segunda cadena con la secuencia de SEQ ID N°: 2.

Las Figs. 6A-6B muestran una serie de gráficos de barras que representan resultados para la amplificación dependiente del tiempo de numerosas variantes del VIH-1. Los cebadores de amplificación tenían las secuencias de hibridación diana de SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 15. La sonda de hibridación de la baliza molecular utilizada en el procedimiento tenía la secuencia de hibridación diana de la SEQ ID NO: 23. Los resultados se muestran para las reacciones de amplificación realizadas usando 1.000 copias/reacción de los diferentes subtipos de VIH-1. La Fig. 6A identifica la entrada del ácido nucleico del VIH-1 en una reacción de amplificación de ácido nucleico en tiempo real (eje x) y el tiempo de aparición de la señal fluorescente medida por encima de un umbral de fondo (eje y). Los valores numéricos que se muestran sobre cada barra indican el tiempo de aparición. La Fig. 6B presenta los mismos datos mostrados en la FIG. 6A, pero traza el número promedio de copias log-10 en el eje y. Los valores numéricos que se muestran encima de cada barra indican el número promedio determinado de copias logm

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se describen composiciones, métodos y kits para detectar selectivamente los ácidos nucleicos del VIH-1 en muestras biológicas tales como sangre, suero, plasma u otros fluidos o tejidos corporales. Las sondas, los cebadores y los métodos de la invención pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico, aplicaciones de pruebas de cargas virales, o para detectar sangre donada y productos sanguíneos u otros tejidos que puedan contener partículas infecciosas.

Introducción y resumen general

La presente invención incluye composiciones (oligonucleótidos de captura de ácido nucleico, oligonucleótidos de amplificación y sondas), métodos que son particularmente útiles para detectar ácidos nucleicos de VIH-1 en una muestra biológica. Para diseñar secuencias de oligonucleótidos apropiadas para tales usos, las secuencias conocidas de ácido nucleico del VIH-1 se compararon primero para identificar regiones candidatas del genoma viral que podrían servir como reactivos en un ensayo de diagnóstico. Como resultado de estas comparaciones, los oligonucleótidos de captura, cebadores y sondas mostrados esquemáticamente en la FIG. 1 fueron seleccionados para su uso en un ensayo amplificado. Se eligieron porciones de secuencias que contenían relativamente pocas variantes entre las secuencias comparadas como puntos de partida para diseñar oligonucleótidos sintéticos adecuados para su uso en la captura, amplificación y detección de secuencias amplificadas.

En base a estos análisis, se diseñaron el oligonucleótido de captura, el cebador de amplificación y las secuencias sonda presentadas a continuación. Aquellos que tengan un nivel de experto medio en la técnica apreciarán que cualquier secuencia de cebador específica para un diana de VIH-1, con o sin una secuencia promotora T7, puede usarse como cebador en los diversos métodos de amplificación in vitro basados en cebadores descritos a continuación. También se contempla que los oligonucleótidos que tienen las secuencias descritas en el presente documento podrían cumplir funciones alternativas en ensayos para detectar ácidos nucleicos del VIH-1. Por ejemplo, los oligonucleótidos de captura descritos en este documento podrían servir como sondas de hibridación, las sondas de hibridación descritas en este documento podrían usarse como cebadores de amplificación, y los cebadores de amplificación descritos en este documento podrían usarse como sondas de hibridación en ensayos de detección alternativos.

Métodos útiles de amplificación

Los métodos de amplificación útiles en relación con la presente invención incluyen: métodos de amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) y de amplificación que utilizan la autorreplicación moléculas de polinucleótidos y enzimas de replicación tales como ARN de m DV-1 y enzima Q-beta. Los métodos para llevar a cabo estas diversas técnicas de amplificación respectivamente se pueden encontrar en la patente de EE.UU. N° 5.399.491, la patente de EE.UU. No. 5.554.517, la patente de EE.UU. 4.965.188, patente de EE.UU. 5.455.166, la patente de EE.UU. 5.472.840 y Lizardi et al., BioTechnology 6: 1197 (1988).

En una realización muy preferida de la invención, las secuencias de ácido nucleico del VIH-1 se amplifican usando un protocolo TMA. Según este protocolo, la transcriptasa inversa que proporciona la actividad de la ADN polimerasa también posee una actividad endógena de RNasa H. Uno de los cebadores utilizados en este procedimiento contiene una secuencia promotora colocada anterior a una secuencia que es complementaria con una cadena de un ácido nucleico diana que se va a amplificar. En el primer paso de la amplificación, un promotor-cebador se hibrida con el ARN diana del VIH-1 en un sitio definido. La transcriptasa inversa crea una copia de ADN complementaria del ARN diana por amplificación desde el extremo 3' del cebador promotor. Después de la interacción de un cebador de cadena opuesta con la cadena de ADN recién sintetizada, se sintetiza una segunda cadena de ADN desde el extremo del cebador mediante transcriptasa inversa, creándose así una molécula de ADN de doble cadena. La ARN polimerasa reconoce la secuencia promotora en esta plantilla de ADN bicatenario e inicia la transcripción. Cada uno de los amplicones de ARN recién sintetizados vuelve a entrar en el proceso de TMA y sirve como plantilla para una nueva ronda de replicación, lo que conduce a una amplificación exponencial del amplicón de ARN. Dado que cada una de las plantillas de ADN puede hacer 100-1000 copias del amplicón de ARN, esta amplificación puede producir 10 mil millones de amplicones en menos de una hora. Todo el proceso es autocatalítico y se realiza a una temperatura constante.

Características estructurales de los cebadores

Como se indicó anteriormente, "cebador" se refiere a un oligonucleótido opcionalmente modificado que es capaz de participar en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos. Los cebadores preferidos son capaces de hibridarse con un ácido nucleico plantilla y que tiene un extremo 3' que puede ampliarse por la actividad de la ADN polimerasa. La región 5' del cebador puede no ser complementaria del ácido nucleico diana. Si la región no complementaria 5' incluye una secuencia promotora, se denomina "cebador promotor". "Los expertos en la materia apreciarán que cualquier oligonucleótido que pueda funcionar como un cebador (es decir, un oligonucleótido que se hibrida específicamente con una secuencia diana y que tenga un extremo 3' capaz de ampliarse por la actividad de la ADN polimerasa) puede modificarse para incluir un secuencia del promotor 5', y por lo tanto podría funcionar como un promotor-cebador. De manera similar, cualquier promotor-cebador puede modificarse mediante la eliminación o síntesis de una secuencia promotora y seguir funcionando como cebador.

Los restos de bases de nucleótidos de los cebadores pueden modificarse (por ejemplo, mediante la adición de grupos propino), siempre que el resto de la base modificada conserve la capacidad de formar una asociación no covalente con G, A, C, T o U, y siempre que un oligonucleótido que comprenda al menos un resto de base de nucleótido modificado o análogo no éste impedido estéricamente de hibridarse con un ácido nucleico monocatenario. Como se indica a continuación en relación con la composición química de sondas útiles, las bases nitrogenadas de los cebadores de acuerdo con la invención pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), sus análogos conocidos (por ejemplo, inosina o "I" con hipoxantina como su resto base; véase The Biochemistry of Nucleic Acids, 5-36, Adams et al., ed., 11a ed., 1992), derivados conocidos de bases de purina o pirimidina (p. ej., N4-metildesoxiguanosina, deazao aza-purinas y deaza- o aza-pirimidinas, bases de pirimidina que tienen grupos sustituyentes en la posición 5 ó 6, bases de purina que tienen un sustituyente alterado o de reemplazo en las posiciones 2, 6 u 8, 2-amino-6-metilaminopurina, O6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetilhidrazina-pirimidinas y O4-alquilpirimidinas (véase, Cook, PCT Int'l Pub. No. WO 93/13121) y residuos "no básicos" en los que la cadena principal no incluye la base nitrogenada para uno o más residuos del polímero (véase Arnold et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.585.481). Los restos de azúcar comunes que comprenden la estructura principal del cebador incluyen ribosa y desoxirribosa, aunque también se pueden usar 2'-O-metil ribosa (OMe), azúcares halogenados y otros restos de azúcar modificados. Por lo general, el grupo de enlace de la estructura principal del cebador es un resto que contiene fósforo, más comúnmente un enlace de fosfodiéster, aunque se encuentran otros enlaces, como, por ejemplo, fosforotioatos, metilfosfonatos y enlaces que no contienen fósforo, como enlaces tipos peptídicos en "ácidos nucleicos peptídicos" (PNA) también se pretenden usar en el ensayo descrito en este documento.

Sistemas útiles de marcaje de sondas y restos detectables

Esencialmente cualquier sistema de marcaje y detección que pueda usarse para controlar la hibridación del ácido nucleico específico puede usarse junto con la presente invención. Entre la colección de marcajes útiles se incluyen radiomarcajes, enzimas, haptenos, oligonucleótidos unidos, moléculas quimioluminiscentes, restos fluorescentes (solos o en combinación con restos "inactivadores") y restos redox-activos que son susceptibles de utilizarse en métodos de detección electrónica. Las moléculas quimioluminiscentes preferidas incluyen ésteres de acridinio del tipo descrito por Arnold et al., en la patente de EE.UU. N° 5.283.174 para su uso en conexión con ensayos de protección homogéneos, y del tipo descrito por Woodhead et al., en la patente de EE.UU. No. 5.656.207 para su uso en conexión con los ensayos que cuantifican múltiples dianas en una sola reacción. Los enfoques de detección y marcaje electrónico preferidos se describen en las patentes de EE.UU. Nos. 5.591.578 y 5.770.369, y la solicitud de patente internacional publicada WO 98/57158. Los restos activos redox útiles como marcajes en la presente invención incluyen metales de transición tales como Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe y Ru.

Los marcadores detectables particularmente preferidos para las sondas de acuerdo con la presente invención son detectables en sistemas de ensayo homogéneos (es decir, aquellos que, en una mezcla, la sonda marcada unida exhibe un cambio detectable, tal como una cierta estabilidad o degradación diferencial, en comparación con la sonda marcada no unida). Los ejemplos de marcadores homogéneamente detectables incluyen marcadores fluorescentes, marcadores detectables electrónicamente y compuestos quimioluminiscentes (p. ej., según lo descrito por Woodhead et al., en la patente de los Estados Unidos número 5.656.207; por Nelson et al., en la patente de los Estados Unidos número 5.658.737; o por Arnold et al., en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.639.604).

En algunas aplicaciones, las sondas que muestran al menos cierto grado de autocomplementariedad son deseables para facilitar la detección de la sonda: dúplex diana en una muestra de prueba sin requerir primero la extracción de la sonda no hibridada antes de la detección. A modo de ejemplo, las estructuras denominadas "balizas moleculares" comprenden moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia complementaria diana, un par de afinidad (o brazos de ácido nucleico) que sostienen la sonda en una conformación cerrada en ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana, y un par de marcadores que interactúan cuando la sonda está en una conformación cerrada. La hibridación del ácido nucleico diana y la secuencia complementaria diana separa los miembros del par de afinidad, cambiando así la sonda a una conformación abierta. El cambio a la conformación abierta es detectable debido a la interacción reducida del par de marcadores, que puede ser, por ejemplo, un fluoróforo y un desactivador (por ejemplo, DABCYL y EDANS). Las balizas moleculares se describen detalladamente en la patente de EE.UU. 5.925.517. Las balizas moleculares útiles para detectar secuencias de ácido nucleico específicas del VIH-1 pueden crearse añadiendo a cada extremo de una de las secuencias de las sondas descritas en el presente documento, un primer brazo de ácido nucleico que comprende un fluoróforo y un segundo brazo de ácido nucleico que comprende un resto inhibidor. En esta configuración, la secuencia de la sonda específica del VIH-1 descrita en el presente documento sirve como la porción de "bucle" complementaria con la diana de la baliza molecular resultante, mientras que los "brazos" autocomplementarios de la sonda representan la porción "vástago" de la sonda.

Otro ejemplo de una sonda de ensayo de hibridación autocomplementaria que se puede usar junto con la invención es una estructura comúnmente denominada "Baliza Molecular". Estas sondas de auto-referencia están diseñadas para incluir distintas regiones de autocomplementariedad (acuñadas "el dominio de unión a la diana" y "el dominio de cierre de la diana") que están conectadas por una región de unión y que se hibridan entre sí en las condiciones de ensayo de hibridación predeterminadas. Cuando se exponen a un diana apropiada o a condiciones desnaturalizantes, las dos regiones complementarias (que pueden ser total o parcialmente complementarias) de la baliza molecular se fusionan, dejando el dominio de unión a la diana disponible para la hibridación a una secuencia diana cuando se restauran las condiciones predeterminadas del ensayo de hibridación. Las balizas moleculares están diseñadas para que el dominio de unión a la diana favorezca la hibridación con la secuencia de la diana respecto al dominio de cierre de la diana. El dominio de unión a la diana y el dominio de cierre de la diana de una baliza molecular incluyen marcadores que interactúan (p. ej., fluorescentes/apagadores) posicionados de manera que se produzca una señal diferente cuando la baliza molecular se autohibrida en lugar de cuando la baliza molecular se híbrida a un ácido nucleico diana, lo que permite la detección de la sonda: dúplex diana en una muestra de prueba en presencia de una sonda no hibridada que tiene un marcador viable asociado con ella. Las balizas moleculares se describen completamente en la patente de EE.UU. N° 6.361.945.

Las balizas moleculares preferiblemente están marcadas con un par interactivo de marcadores detectables. Los ejemplos de marcadores detectables que se prefieren como miembros de un par interactivo de marcadores interactúan entre sí mediante mecanismos de transferencia de energía FRET o no FRET. La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) implica la transmisión sin radiación de cuantos de energía desde el sitio de absorción al sitio de su utilización en la molécula, o sistema de moléculas, por interacción de resonancia entre cromóforos, a distancias considerablemente mayores que las distancias interatómicas, sin conversión a la energía térmica, y sin que el donante y el receptor entren en colisión cinética. El "donante" es el resto que inicialmente absorbe la energía, y el "aceptor" es el resto al que la energía se transfiere posteriormente. Además de FRET, existen al menos otros tres procesos de transferencia de energía "no FRET" mediante los cuales la energía de excitación se puede transferir de una molécula donante a una aceptora.

Cuando dos marcadores se mantienen lo suficientemente cerca como para que la energía emitida por uno de los marcadores pueda ser recibida o absorbida por el segundo marcador, ya sea por un mecanismo FRET o no FRET, se dice que los dos marcadores están en "relación de transferencia de energía" entre sí. Este es el caso, por ejemplo, cuando una baliza molecular se mantiene en el estado cerrado mediante la formación de un dúplex vástago, y la emisión fluorescente de un fluoróforo unido a un brazo de la sonda se apaga mediante un grupo de desactivación en el brazo opuesto.

Los restos marcadores altamente preferidos para las balizas moleculares inventadas incluyen un fluoróforo y un segundo resto que tiene propiedades de apagado de fluorescencia (es decir, un "inactivador"). En esta realización, la señal característica es probablemente la fluorescencia de una longitud de onda particular, pero alternativamente podría ser una señal de luz visible. Cuando está involucrada la fluorescencia, los cambios en la emisión se deben preferiblemente a FRET, o a la transferencia de energía radiactiva o modos no FRET. Cuando una baliza molecular que tiene un par de marcadores interactivos en estado cerrado es estimulada por una frecuencia de luz apropiada, se genera una señal fluorescente en un primer nivel, que puede ser muy baja. Cuando esta misma sonda está en el estado abierto y es estimulada por una frecuencia de luz apropiada, el fluoróforo y los restos desactivadores están lo suficientemente separados entre sí para que la transferencia de energía entre ellos esté sustancialmente impedida. Bajo esa condición, el resto desactivador no puede extinguir la fluorescencia del resto fluoróforo. Si el fluoróforo es estimulado por la energía de la luz de una longitud de onda apropiada, se generará una señal fluorescente de un segundo nivel, más alta que en el primer nivel. La diferencia entre los dos niveles de fluorescencia es detectable y medible. Utilizando radicales fluoróforos e inactivadores de esta manera, la baliza molecular solo está "encendida" en la conformación "abierta" e indica que la sonda está unida a la diana de la que emana una señal fácilmente detectable. El estado conformacional de la sonda altera la señal generada por la sonda al regular la interacción entre los restos del marcador.

Los ejemplos de pares de marcadores de donante/aceptor que pueden usarse en conexión con la invención, sin intentar distinguir los pares FRET de los que no son FRET, incluyen fluoresceína/tetrametilrodamina, lAEDANS/fluororesceína, EDANS/DABCYL, cumarina/DABCYL, fluoresceína/fluoresceína, BODIPY FL/BODIPY FL, fluoresceína/DABCYL, amarillo lucifer/DABCYL, BODIPY/DABCYL, eosina/DABCYL, eritrosina/DABCYL, tetrametilrodamina/DABCYL, Rojo de Texas/DABCYL, CY5/BH1, CY5/BH2, CY3/BH1, CY3/BH2 y colorante fluoresceína/QSY7. Aquellos que tengan un nivel de experto medio en la técnica entenderán que cuando los tintes del donante y del aceptor son diferentes, la transferencia de energía puede detectarse mediante la aparición de fluorescencia sensibilizada del aceptor o mediante el apagado de la fluorescencia del donante. Cuando las especies donantes y aceptoras son iguales, la despolarización de fluorescencia resultante puede detectar energía. Los aceptores no fluorescentes como DABCYL y los colorantes QSY 7 eliminan ventajosamente el problema potencial de la fluorescencia de fondo resultante de la excitación directa (es decir, no sensibilizada) del aceptor. Los restos fluoróforos preferidos que se pueden usar como un miembro de un par donante-receptor incluyen fluoresceína, ROX y los colorantes CY (tales como CY5). Los restos inhibidores altamente preferidos que pueden usarse como otro miembro de un par donante-receptor incluyen DABCYL y los restos BLACK HOLE QUENCHER que están disponibles de Biosearch Technologies, Inc., (Novato, California).

Las técnicas y métodos sintéticos para unir marcadores a ácidos nucleicos y detectar marcadores son comunes en la técnica (por ejemplo, véase Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), Capítulo 10; Nelson et al., Patente de EE.UU. N° 5.658.737; Woodhead et al., Patente de EE.UU. N° 5.656.207; Hogan et al., Patente de EE.UU. N° 5.547.842; Arnold et al., Patente de EE.UU. N° 5.283.174; Kourilsky et al., Patente de EE.UU. N° 4.581.333), y Becker et al., Solicitud de Patente Europea No. 0747 706.

Composición química de las sondas

Las sondas de acuerdo con la descripción comprenden polinucleótidos o análogos de polinucleótidos y, opcionalmente, pueden llevar un marcador detectable unido covalentemente a los mismos. Los nucleósidos o análogos de nucleósidos de la sonda comprenden bases heterocíclicas nitrogenadas, o análogos de bases, donde los nucleósidos están unidos entre sí, por ejemplo mediante enlaces fosfodiéster para formar un polinucleótido. Por consiguiente, una sonda puede comprender ácido ribonucleico convencional (ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (ADN), pero también puede comprender análogos químicos de estas moléculas. La "estructura" de una sonda puede estar compuesta por una variedad de enlaces conocidos en la técnica, que incluyen uno o más enlaces azúcarfosfodiéster, enlaces péptido-ácido nucleico (a veces denominados "ácidos nucleicos peptídicos" según lo descrito por Hyldig-Nielsen y col., PCT Int'l Pub. WO 95/32305), enlaces de fosforotioato, enlaces de metilfosfonato o sus combinaciones. Los restos de azúcar de la sonda pueden ser o bien ribosa o bien desoxirribosa, o compuestos similares que tienen sustituciones conocidas, tales como, por ejemplo, sustituciones de 2'-O-metil ribosa y haluros de 2' (por ejemplo, 2'-F). Las bases nitrogenadas pueden ser bases convencionales (A, G, C, T, U), sus análogos conocidos (p. ej., inosina o "I"; véase The Biochemistry of the Nucleic Acids, 5-36, Adams et al., Ed., 11a ed., 1992), derivados conocidos de bases de purina o pirimidina (p. ej., N4-metildesoxiguanosina, deaza- o aza-purinas y deazao aza-pirimidinas, bases de pirimidina que tienen grupos sustituyentes en las posiciones 5 ó 6, bases de purina que tienen un sustituyente alterado o de reemplazo en las posiciones 2, 6 u 8, 2-amino-6-metilaminopurina, O6-metilguanina, 4-tio-pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetilhidrazina-pirimidinas, y O4-alquil-pirimidinas (véase, Cook, PCT Int'l Pub. WO 93/13121) y residuos "no básicos" en los que la cadena principal no incluye bases nitrogenadas para uno o más de los residuos del polímero (véase Arnold et al., Patente de los Estados Unidos Núm.

5.585.481). Una sonda puede comprender solo azúcares, bases y enlaces convencionales encontrados en ARN y ADN, o puede incluir componentes y sustituciones convencionales (por ejemplo, bases convencionales unidas a través de una cadena principal metoxi o un ácido nucleico que incluya bases convencionales y uno o más análogos de bases).

Mientras que las sondas de oligonucleótidos de diferentes longitudes y composición de bases pueden usarse para detectar ácidos nucleicos de VIH-1, las sondas preferidas tienen longitudes de hasta 100 nucleótidos y, más preferiblemente, tienen longitudes de hasta 60 nucleótidos. Los intervalos de longitud preferidos para los oligonucleótidos son de 10 a 100 bases de longitud o, más preferiblemente, entre 15 y 50 bases de longitud o, aún más preferiblemente, entre 15 y 30 bases de longitud. Sin embargo, las secuencias de sondas específicas descritas a continuación también pueden proporcionarse en un vector de clonación de ácido nucleico o transcripción u otro ácido nucleico más largo y aún pueden usarse para detectar ácidos nucleicos de VIH-1.

Selección de cebadores de amplificación y sondas de detección específicas para el VIH-1

En este documento se describen pautas útiles para diseñar cebadores y sondas de amplificación con las características deseadas. Los sitios óptimos para amplificar y sondear ácidos nucleicos de VIH-1 contienen dos, y preferiblemente tres, regiones conservadas, cada una de más de aproximadamente 15 bases de longitud, dentro de aproximadamente 200 bases de secuencia contigua. El grado de amplificación observado con un conjunto de cebadores o cebadores promotores depende de varios factores, incluida la capacidad de los oligonucleótidos de hibridarse con sus secuencias complementarias y su capacidad de ampliarse enzimáticamente. Debido a que el alcance y la especificidad de las reacciones de hibridación se ven afectadas por varios factores, la manipulación de esos factores determinará la sensibilidad y especificidad exactas de los oligonucleótidos particulares, ya sea perfectamente complementario a su diana o no. Los expertos en la materia conocen los efectos de las condiciones de ensayo variables, y son descritos en Hogan et al., en la patente de EE.UU. N° 5.840.488.

La longitud de la secuencia de ácido nucleico diana y, en consecuencia, la longitud de la secuencia del cebador o la secuencia de la sonda pueden ser importantes. En algunos casos, puede haber varias secuencias de una región diana particular, que varían en ubicación y longitud, lo que producirá cebadores o sondas con las características de hibridación deseadas. Si bien es posible que los ácidos nucleicos que no sean perfectamente complementarios hibridasen, el tramo más largo de la secuencia de bases perfectamente homólogas determinará normalmente y de forma principal la estabilidad del híbrido.

Los cebadores y las sondas de amplificación deben colocarse para minimizar la estabilidad del oligonucleótido: híbrido de ácido nucleico no diana (es decir, el ácido nucleico con una secuencia similar al ácido nucleico diana). Se prefiere que los cebadores de amplificación y las sondas de detección puedan distinguir entre secuencias diana y no diana. Al diseñar cebadores y sondas, las diferencias en estos valores de Tm deben ser tan grandes como sea posible (por ejemplo, al menos 2°C y preferiblemente 5°C).

El grado de amplificación no específica (dímero cebador o copia no diana) también puede afectar a la eficiencia de la amplificación. Por esta razón, los cebadores se seleccionan para disponer de una baja complementariedad propia o cruzada, particularmente en los extremos 3' de la secuencia. Se evitan largos tramos de homopolímeros y un alto contenido de GC para reducir la amplificación de cebadores espurios. El software informático disponible comercialmente puede ayudar en este aspecto del diseño. Los programas informáticos disponibles incluyen MacDNASIS™ 2.0 (Hitachi Software Engineering American Ltd.) y OLIGO ver. 6.6 (Molecular Biology Insights; Cascade, Colorado).

Aquellos que tienen un nivel de experto medio en la técnica apreciarán que la hibridación implica la asociación de dos cadenas simples de ácido nucleico complementario para formar una cadena doble unida por hidrógeno. Está implícito que si una de las dos cadenas está total o parcialmente involucrada en un híbrido, entonces esa cadena será menos capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido. Al diseñar cebadores y sondas de modo que porciones sustanciales de las secuencias de interés sean monocatenarias, la velocidad y el alcance de la hibridación pueden aumentar considerablemente. Si la diana es una secuencia genómica integrada, entonces ocurrirá naturalmente en una forma bicatenaria (como es el caso con el producto de la reacción en cadena de la polimerasa). Estas dianas bicatenarias inhiben naturalmente la hibridación con una sonda y requieren la desnaturalización antes de la etapa de hibridación.

La velocidad a la que un polinucleótido se hibrida con su diana es una medida de la estabilidad térmica de la estructura secundaria diana en la región de unión a la diana. La medida estándar de la velocidad de hibridación es el Cüt1/2 que se mide como moles de nucleótidos por litro multiplicado por segundos. Por lo tanto, es la concentración de la sonda multiplicada por el momento en que se produce el 50% de la hibridación máxima a esa concentración. Este valor se determina hibridando varias cantidades de polinucleótido a una cantidad constante de diana durante un tiempo fijo. El Cüt1/2 se encuentra gráficamente por procedimientos estándar familiares para aquellos que tienen un nivel de experto medio en la técnica.

Cebadores de amplificación preferidos

Los cebadores útiles para realizar reacciones de amplificación pueden tener diferentes longitudes para acomodar la presencia de secuencias ajenas que no participan en la unión a la diana y que pueden no afectar sustancialmente los procedimientos de amplificación o detección. Por ejemplo, los cebadores promotores útiles para realizar reacciones de amplificación de acuerdo con la descripción tienen al menos una secuencia mínima que se hibrida con el ácido nucleico diana del VIH-1, y una secuencia promotora colocada anterior a esa secuencia mínima. Sin embargo, la inserción de secuencias entre la secuencia de unión a la diana y la secuencia promotora podría cambiar la longitud del cebador sin comprometer su utilidad en la reacción de amplificación. Además, las longitudes de los cebadores de amplificación y las sondas de detección son cuestiones de elección siempre que las secuencias de estos oligonucleótidos se ajusten a los requisitos esenciales mínimos para hibridar la secuencia complementaria deseada.

Las tablas 1 y 2 presentan ejemplos específicos de secuencias de oligonucleótidos que se usaron como cebadores para amplificar los ácidos nucleicos del VIH-1 en la región pol. La Tabla 1 presenta las secuencias de cebadores que eran complementarios a las secuencias de VIH-1 en una cadena de ácido nucleico. La Tabla 2 presenta las secuencias de los cebadores complementarios de la diana del VIH-1 y las secuencias completas para los cebadores promotores que se usaron durante el desarrollo de la invención. En concreto, las secuencias de oligonucleótidos en la Tabla 1 y la Tabla 2 son complementarias a las cadenas opuestas del ácido nucleico del VIH-1.

Tabla 1

Secuencias de polinucleótidos de cebadores de amplificación

La Tabla 2 presenta secuencias de oligonucleótidos diana complementarios de VIH-1 y las secuencias de cebador promotor correspondientes que se usaron para amplificar secuencias de ácido nucleico de VIH-1 en la región pol de VIH-1. Como se indicó anteriormente, los cebadores promotores que se usan para poner en práctica la invención incluyen secuencias complementarias a una secuencia diana de VIH-1 en sus extremos 3' y una secuencia promotora T7 (presentada en minúsculas) en sus extremos 5'.

TABLA 2

Secuencias de polinucleótidos de cebadores de amplificación

Los conjuntos preferidos de cebadores para amplificar secuencias de VIH-1 en la región pol incluyen un primer cebador que hibrida una secuencia diana de VIH-1 (como uno de los cebadores enumerados en la Tabla 2) y un segundo cebador complementario a la secuencia de un producto de amplificación del primer cebador (como una de las secuencias de cebadores enumeradas en la Tabla 1). En una realización muy preferida, el primer cebador es un cebador promotor que incluye una secuencia promotora T7 en su extremo 5'.

Sondas de detección preferidas

Otro aspecto de la invención se refiere a sondas de hibridación para detectar ácidos nucleicos de VIH-1. Los métodos para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana presente en el ácido nucleico del VIH-1 pueden incluir un paso adicional opcional para detectar amplicones. Este método incluye un paso para poner en contacto una muestra de prueba con una sonda de ensayo de hibridación que se hibrida preferentemente con la secuencia de ácido nucleico diana, o su complemento, formándose así una dúplex sonda:diana que es estable para la detección. A continuación, hay un paso para determinar si el híbrido está presente en la muestra de prueba como una indicación de la presencia o ausencia de ácidos nucleicos de VIH-1 en la muestra de prueba. Esto puede implicar la detección del dúplex sonda:diana y, preferiblemente, implica sistemas de ensayo homogéneos.

Las sondas de ensayo de hibridación útiles para detectar secuencias de ácido nucleico de VIH-1 incluyen una secuencia de bases sustancialmente complementarias a una secuencia de ácido nucleico diana de VIH-1. Por lo tanto, las sondas hibridan preferiblemente una cadena de una secuencia de ácido nucleico diana de VIH-1, o su complemento. Estas sondas pueden tener opcionalmente bases adicionales fuera de la región del ácido nucleico diana que puede ser o no complementaria al ácido nucleico de VIH-1.

Ciertas sondas altamente preferidas pueden hibridarse con ácidos nucleicos diana de VIH-1 en condiciones adecuadas para realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, como las descritas en el presente documento. Los ejemplos de sondas particularmente preferidas útiles en relación con este aspecto de la invención incluyen balizas moleculares.

Otras sondas preferidas son suficientemente homólogas al ácido nucleico diana para hibridarse en condiciones de hibridación rigurosas correspondientes a aproximadamente 60°C cuando la concentración de sal está en el intervalo de 0,6-0,9 M. Las sales preferidas incluyen cloruro de litio, pero otras sales tales como el cloruro de sodio y el citrato de sodio también se pueden usar en la solución de hibridación. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad ejemplares se proporcionan alternativamente con tampón de fosfato de sodio 0,48 M, dodecilsulfato de sodio al 0,1% y 1 mM de Ed Ta y EGTA, o con LiCl 0,6 M, lauril sulfato de litio al 1%, succinato de litio 60 mM y 10 mM de EDTA y también de EGTA.

Las sondas de acuerdo con la descripción tienen secuencias complementarias o correspondientes a una porción del genoma del VIH-1. Ciertas sondas que se prefieren para detectar secuencias de ácido nucleico de VIH-1 tienen una secuencia de sonda, que incluye la secuencia de bases diana complementaria junto con cualesquiera secuencias de bases que no sean complementarias al ácido nucleico que se va a detectar, en el intervalo de longitud de 10 a 100 nucleótidos. Ciertas sondas específicas que se prefieren para detectar secuencias de ácido nucleico del VIH-1 tienen secuencias diana complementarias en el intervalo de longitud de 10-50, de 10-20 o de 10-15 nucleótidos. Por supuesto, estas secuencias complementarias diana pueden ser 5 secuencias lineales, o pueden estar contenidas en la estructura de una baliza molecular u otra construcción que tenga una o más secuencias opcionales de ácido nucleico que no sean complementarias de la secuencia diana VIH-1 que debe ser detectada. Como se indicó anteriormente, las sondas pueden prepararse con ADN, ARN, una combinación de ADN y ARN, un análogo de ácido nucleico, o contener uno o más nucleósidos modificados (por ejemplo, un ribonucleósido que tiene una sustitución 2'-O-metilo al resto ribofuranosilo).

Ciertas sondas muy preferidas incluyen un marcador detectable. En una realización, el marcador detectable es un marcador fluorescente que puede, opcionalmente, usarse en combinación con un resto desactivador. En otras realizaciones, el marcador es un éster de acridinio unido a la sonda por medio de un enlazador no nucleotídico. Por ejemplo, las sondas de detección pueden marcarse con compuestos de éster de acridinio quimioluminiscente que están unidos a través de un conector sustancialmente como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.585.481; y en la patente de EE.UU. 5.639.604, particularmente como se describe en la columna 10, línea 6 a la columna 11, línea 3, y en el Ejemplo 8. Por supuesto, las sondas muy preferidas para su uso en la detección de amplicones dependientes del tiempo incluyen balizas moleculares.

La Tabla 3 presenta las secuencias de bases diana complementarias y las secuencias completas de algunas de las sondas de hibridación que se usaron para detectar amplicones de VIH-1. Dado que las sondas alternativas para detectar secuencias de ácido nucleico de VIH-1 pueden hibridarse con la cadena de VIH-1 de sentido opuesto, la presente descripción también incluye oligonucleótidos que son complementarios a las secuencias presentadas en la tabla. La secuencia de hibridación diana de la SEQ ID NO: 21 se incorporó a la baliza molecular que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 22. La secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 23 se incorporó a la baliza molecular que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 24. Las balizas moleculares que aparecen en la Tabla 3 se marcaron con un resto de fluoresceína en su extremo 5', y con un resto desactivador dA b c Yl en su extremo 3'.

Tabla 3

Secuencias de polinucleótidos de las sondas de detección del VIH-1

Como se indicó anteriormente, se puede usar cualquier cantidad de estructuras principales diferentes como una estructura para las secuencias de nucleobase de las sondas de hibridación inventadas. En ciertas realizaciones altamente preferidas, la secuencia de la sonda utilizada para detectar amplicones de VIH-1 incluye una cadena principal metoxi o, al menos, un enlace metoxi en la cadena principal del ácido nucleico.

Selección y uso de oligonucleótidos de captura

Los oligonucleótidos de captura preferidos incluyen una primera secuencia que es complementaria a una secuencia de VIH-1 (es decir, una "secuencia diana del VIH-1") unida covalentemente a una segunda secuencia (es decir, una secuencia de "cola") que sirve como diana para la inmovilización sobre un soporte sólido. Se puede usar cualquier estructura para unir la secuencia de bases de un oligonucleótido de captura. En ciertas realizaciones preferidas, el oligonucleótido de captura incluye al menos un enlace metoxi en la cadena principal. La secuencia de cola, que está preferiblemente en el extremo 3' de un oligonucleótido de captura, se usa para hibridarse con una secuencia de base complementaria para proporcionar un medio para capturar el ácido nucleico de VIH-1 diana hibridado con preferencia a otros componentes en la muestra biológica.

Aunque cualquier secuencia de bases que se hibrida con una secuencia de bases complementarias puede usarse en la secuencia de cola, se prefiere que la secuencia de hibridación abarque una longitud de aproximadamente 5-50 residuos de nucleótidos. Las secuencias de cola particularmente preferidas son sustancialmente homopoliméricas, contienen de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 residuos de nucleótidos, o más preferiblemente de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 residuos. Un oligonucleótido de captura según la presente descripción puede incluir una primera secuencia que se une específicamente a un polinucleótido diana del VIH-1, y una segunda secuencia que se une específicamente a un tramo de oligo (dT) inmovilizado en un soporte sólido.

Usando los componentes ilustrados en la FIG. 1, el ensayo para detectar secuencias de VIH-1 en una muestra biológica incluye los pasos de capturar el ácido nucleico diana usando el oligonucleótido de captura, amplificar la región diana capturada usando al menos dos cebadores y detectar el ácido nucleico amplificado hibridando primero la sonda marcada a una secuencia contenida en el ácido nucleico amplificado y luego detectar una señal resultante de la sonda marcada unida.

La etapa de captura utiliza preferiblemente un oligonucleótido de captura donde, en condiciones de hibridación, una porción del oligonucleótido de captura se hibrida específicamente con una secuencia en el ácido nucleico diana y una porción de cola sirve como un componente de un par de unión, como un ligando (por ejemplo, un par de unión biotinaavidina) que permite que la región diana se separe de otros componentes de la muestra. Preferiblemente, la porción de cola del oligonucleótido de captura es una secuencia que se hibrida con una secuencia complementaria inmovilizada en una partícula de soporte sólida. Preferiblemente, primero, el oligonucleótido de captura y el ácido nucleico diana están en solución para aprovechar la cinética de hibridación en fase de solución. La hibridación produce un complejo de oligonucleótido de captura:ácido nucleico diana que puede unirse a una sonda inmovilizada a través de la hibridación de la porción de cola del oligonucleótido de captura con una secuencia inmovilizada complementaria. Por lo tanto, se forma un complejo que comprende un ácido nucleico diana, un oligonucleótido de captura y una sonda inmovilizada en condiciones de hibridación. Preferiblemente, la sonda inmovilizada es una secuencia repetitiva y, más preferiblemente, una secuencia homopolimérica (por ejemplo, poli-A, poli-T, poli-C o poli-G), que es complementaria a la secuencia de cola y está unida a un soporte sólido. Por ejemplo, si la porción de cola del oligonucleótido de captura contiene una secuencia poli-A, entonces la sonda inmovilizada contendrá una secuencia poli-T, aunque puede usarse cualquier combinación de secuencias complementarias. El oligonucleótido de captura también puede contener residuos "espaciadores", que son una o más bases ubicadas entre la secuencia de bases que se hibrida con la diana y la secuencia de bases de la cola que se hibrida con la sonda inmovilizada. Se puede usar cualquier soporte sólido para unir el complejo de ácido nucleico diana:oligonucleótidos de captura. Los soportes útiles pueden ser matrices o partículas libres en solución (por ejemplo, nitrocelulosa, nylon, vidrio, poliacrilato, polímeros mixtos, poliestireno, silano, polipropileno y, preferiblemente, partículas magnéticamente atraíbles). Los métodos para unir una sonda inmovilizada al soporte sólido son comunes. El soporte es preferiblemente una partícula que se puede recuperar de la solución usando métodos estándar (por ejemplo, centrifugación, atracción magnética de partículas magnéticas y similares). Los soportes preferidos son partículas monodispersas paramagnéticas (es decir, de tamaño uniforme ± aproximadamente 5%).

La recuperación del complejo de ácido nucleico diana:oligonucleótido de captura:sonda inmovilizada concentra de forma efectiva el ácido nucleico diana (en relación con su concentración en la muestra biológica) y purifica el ácido nucleico diana de los inhibidores de amplificación que pueden estar presentes en la muestra biológica. El ácido nucleico diana capturado puede lavarse una o más veces, purificando aún más la diana, por ejemplo, resuspendiendo las partículas con el complejo de ácido nucleico diana unido:oligonucleótido de captura:sonda inmovilizada en una solución de lavado y luego recuperando las partículas con el complejo unido de la solución de lavado como se describe anteriormente. En una realización preferida, la etapa de captura tiene lugar hibridando secuencialmente el oligonucleótido de captura con el ácido nucleico diana y luego ajustando las condiciones de hibridación para permitir la hibridación de la porción de cola del oligonucleótido de captura con una secuencia complementaria inmovilizada (por ejemplo, como se describe en el documento PCT No. WO 98/50583). Después de completar el paso de captura y los pasos de lavado opcionales, el ácido nucleico diana puede entonces amplificarse. Para limitar el número de pasos de manipulación, el ácido nucleico diana puede amplificarse opcionalmente sin liberarlo del oligonucleótido de captura.

Los oligonucleótidos de captura útiles pueden contener incompatibilidades con las secuencias indicadas anteriormente, siempre que las secuencias incompatibles se hibriden con el ácido nucleico del VIH-1 que contiene la secuencia que se va a amplificar. Cada oligonucleótido de captura descrito en este documento incluía una de las secuencias de VIH-1 presentadas en la Tabla 4 unidas a una cola de poli-(dA) en su extremo 3'. Todos los oligonucleótidos de captura también incluyeron tres nucleótidos de timidina opcionales interpuestos entre la secuencia complementaria del VIH-1 y la cola poli-(dA). No se cree que la presencia de estos nucleótidos de timidina sea esencial para el éxito del procedimiento de captura. Los tres nucleótidos de timidina y la cola de poli-(dA) se sintetizaron usando precursores de ADN, mientras que las porciones complementarias de VIH-1 de los oligonucleótidos se sintetizaron usando análogos de nucleótidos 2'-O Me.

Tabla 4

Porciones complementarias del VIH-1 de oligonucleótidos de captura

Métodos preferidos para amplificar y detectar secuencias de polinucleótidos del VIH-1

Los métodos preferidos de la presente descripción se describen e ilustran mediante los ejemplos presentados a continuación. La Fig. 1 ilustra esquemáticamente un sistema que puede usarse para detectar una región diana del genoma del VIH-1 (mostrada por una línea horizontal continua gruesa). Este sistema incluye cuatro oligonucleótidos (mostrados por las líneas continuas más cortas): un oligonucleótido de captura que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una secuencia de VIH-1 en la región diana y una cola ("T") que se hibrida con una secuencia complementaria inmovilizada en un soporte sólido para capturar la región diana presente en una muestra biológica; un promotor-cebador T7 que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una secuencia de VIH-1 en la región diana y una secuencia promotora T7 ("P") que, cuando es bicatenaria, sirve como un promotor funcional para la ARN polimerasa T7; un cebador no T7 que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con un ADNc de primera hebra hecho a partir de la secuencia de la región diana usando el cebador promotor T7; y una sonda marcada que incluye una secuencia que se hibrida específicamente con una porción de la región diana que se amplifica usando los dos cebadores.

Como se indicó anteriormente, la amplificación de la región diana capturada usando los dos cebadores puede lograrse mediante cualquiera de una variedad de reacciones de amplificación de ácidos nucleicos conocidas que serán familiares para aquellos que tienen un nivel de experto medio en la técnica. En una realización preferida, se emplea una reacción de amplificación asociada a la transcripción, tal como TMA. En tal realización, se producen muchas cadenas de ácidos nucleicos a partir de una única copia del ácido nucleico diana, lo que permite la detección de la diana mediante la detección de sondas que están unidas a las secuencias amplificadas. Preferiblemente, la amplificación asociada a la transcripción usa dos tipos de cebadores (uno denominado promotor-cebador porque contiene una secuencia promotora, marcada con "P" en la Figura 1, para una ARN polimerasa) dos enzimas (una transcriptasa inversa y una ARN polimerasa) y sustratos (desoxirribonucleósidos trifosfatos, ribonucleósidos trifosfatos) con sales y tampones apropiados en solución para producir múltiples transcripciones de ARN a partir de una plantilla de ácido nucleico.

Con referencia a la FIG. 1, durante la amplificación mediada por la transcripción, el ácido nucleico diana capturado se hibrida con un primer cebador que se muestra como un cebador promotor T7. Usando la transcriptasa inversa, se sintetiza una cadena de ADN complementaria a partir del cebador promotor T7 usando el ADN diana como plantilla. Un segundo cebador, que se muestra como un cebador no T7, se hibrida con la cadena de ADN recién sintetizada y se extiende por la acción de una transcriptasa inversa para formar un dúplex de ADN, formando así una región promotora de T7 bicatenaria. La ARN polimerasa de T7 genera entonces múltiples transcripciones de ARN utilizando este promotor T7 funcional. El mecanismo autocatalítico de TMA emplea pasos de hibridación y polimerización repetitivos siguiendo un paso de síntesis de ADNc usando las transcripciones de ARN como plantillas para producir transcripciones adicionales, amplificando así las secuencias de ácido nucleico específicas de la región diana.

El paso de detección utiliza al menos una sonda de detección que se une específicamente a los transcriptos de ARN amplificados o amplicones descritos anteriormente. Preferiblemente, la sonda de detección está marcada con un marcador que puede detectarse usando un sistema de detección homogéneo. Por ejemplo, la sonda marcada se puede marcar con un compuesto de éster de acridinio a partir del cual se puede producir y detectar una señal quimioluminiscente, como se describió anteriormente. Alternativamente, la sonda marcada puede comprender un fluoróforo o una combinación de fluoróforos y restos inhibidores. Las balizas moleculares son realizaciones alternativas de tales sondas marcadas que pueden usarse en sistemas de detección homogéneos.

Uso de una curva estándar: cuantificación de cantidades de preamplificación de polinucleótidos analitos

En general, los métodos descritos pueden implicar el paso de consultar una curva estándar que relaciona las cantidades previas a la amplificación del polinucleótido analito y las cantidades posteriores a la amplificación del amplicón analito.

Dado que las reacciones de amplificación en tiempo real presentan ventajosamente relaciones cuantitativas entre el número de polinucleótidos analitos ingresados en la reacción y el número de amplicones analitos sintetizados en función del tiempo, el número de polinucleótidos analitos presentes en una muestra de prueba puede determinarse usando una curva estándar. Por ejemplo, una serie de reacciones de amplificación que contienen cantidades conocidas de un estándar de polinucleótidos se puede realizar en paralelo con una reacción de amplificación preparada usando una muestra de prueba que contiene un número desconocido de polinucleótidos analitos. Alternativamente, se puede preparar una curva estándar por adelantado para que no sea necesario preparar una curva cada vez que se realiza un procedimiento analítico. Tal curva preparada de antemano puede incluso almacenarse electrónicamente en un dispositivo de memoria de un instrumento de prueba. Una curva estándar que tiene cantidades de preamplificación del estándar de polinucleótidos en un primer eje y algunos indicios del tiempo requerido para efectuar un cierto nivel de amplificación de ácidos nucleicos (como, p. ej., un tiempo de emergencia por encima de una señal de fondo) en un segundo eje se prepara entonces. La cantidad posterior a la amplificación del amplicón analito medida para la reacción de prueba se ubica luego en el eje posterior a la amplificación de la curva estándar. El valor correspondiente en el otro eje de la curva representa la cantidad de preamplificación de polinucleótido analito que estaba presente en la reacción de prueba. Por lo tanto, la determinación del número de moléculas de polinucleótidos analitos presentes en la muestra de prueba se realiza consultando la curva estándar o, más particularmente, comparando los resultados cuantitativos obtenidos para la muestra de prueba con la curva estándar, un procedimiento que será familiar para aquellos que tienen un nivel de experto medio en la materia.

Los procedimientos descritos en este documento pueden usarse fácilmente para cuantificar polinucleótidos analitos presentes en una muestra de prueba. De hecho, si se inicia una pluralidad de reacciones de amplificación de control estándar usando números conocidos de un estándar de polinucleótido de analito y, si se lleva a cabo una reacción de prueba que incluya un número desconocido de moléculas de polinucleótidos de analitos, entonces es posible después de medir el tiempo requerido para efectuar un cierto nivel de amplificación en cada reacción para determinar el número de moléculas de polinucleótidos analitos que deben haber estado presentes en la muestra de prueba. La relación entre el número de moléculas de polinucleótidos analitos ingresados en la reacción de amplificación estándar y el tiempo requerido para efectuar un cierto nivel de amplificación se establece convenientemente usando un gráfico. Determinar el número de moléculas de polinucleótidos analitos presentes en una muestra de prueba es simplemente una cuestión de determinar a partir del gráfico estándar el número de moléculas de polinucleótidos analitos que corresponden a una intensidad de señal de amplicón analito medido. Esto ilustra cómo los estándares de polinucleótidos analitos pueden usarse en conexión con las reacciones de amplificación de polinucleótidos para cuantificar las cantidades de preamplificación de polinucleótidos analitos contenidos en las muestras de prueba.

Kits para detectar ácidos nucleicos del VIH-1

La presente invención también abarca kits para realizar reacciones de amplificación de polinucleótidos usando plantillas de ácido nucleico viral. Ciertos kits preferidos contendrán una sonda de ensayo de hibridación que incluirá una secuencia de bases complementaria a la diana y, opcionalmente, cebadores u otros oligonucleótidos auxiliares para amplificar la diana que se va a detectar. Otros kits preferidos contendrán un par de cebadores oligonucleotídicos que podrán usarse para amplificar ácidos nucleicos diana en una reacción de amplificación in vitro. Los kits ejemplares incluyen oligonucleótidos de amplificación primero y segundo que son complementarios a cadenas opuestas de una secuencia de ácido nucleico de VIH-1 que se va a amplificar. Los kits pueden contener además una o más sondas de detección de oligonucleótidos. Aún otros kits de acuerdo con la invención pueden incluir adicionalmente oligonucleótidos de captura para purificar ácidos nucleicos plantilla de VIH-1 lejos de otras especies antes de la amplificación.

Los principios generales de la presente invención pueden apreciarse más completamente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Estos ejemplos describen el desarrollo de ensayos cuantitativos de amplificación de ácido nucleico caracterizados por relaciones sustancialmente lineales entre el tiempo requerido para producir una señal de amplificación positiva y la cantidad inicial de ácido nucleico plantilla de VIH-1 incluido en la reacción. Los ensayos descritos se caracterizan además por altos niveles de precisión en la cuantificación de dianas de VIH-1 en números de copia bajos, y por la detección precisa de diferentes subtipos de VIH-1, incluidas las variantes del grupo M y del grupo O.

Los cebadores de oligonucleótidos descritos en la solicitud internacional publicada WO 2003106714, junto con una baliza molecular, sirvieron como punto de partida para el desarrollo del ensayo descrito. Como lo indica la evidencia presentada en el Ejemplo 1, la modificación del conjunto de cebadores iniciales mediante la sustitución de uno de los cebadores mejoró drásticamente la capacidad cuantitativa del ensayo al aumentar la detectabilidad de niveles bajos de la plantilla de VIH-1. En todos los casos, la amplificación positiva se indicó por la aparición dependiente del tiempo de una señal fluorescente en ensayos homogéneos.

El análisis de los datos experimentales se realizó utilizando un algoritmo implementado por computadora para establecer una relación sustancialmente lineal entre el número de copias de plantillas de VIH-1 incluidas en una reacción de amplificación y el momento en que la señal fluorescente excedió un valor de fondo (es decir, "tiempo-deemergencia" respecto al fondo). Se realizaron análisis esencialmente idénticos para todos los ensayos dependientes del tiempo descritos en este documento.

Según lo confirmado por los resultados presentados a continuación, se pueden usar procedimientos similares para cuantificar las cantidades diana de analito presentes en una muestra de prueba. Más específicamente, cuando se usan cantidades conocidas de un polinucleótido analito como patrones de calibración, es posible determinar la cantidad de analito presente en una muestra de prueba comparando el aspecto dependiente del tiempo de una señal fluorescente medida para la muestra de prueba con una curva estándar.

El ejemplo 1 describe procedimientos en los que se usó una sonda de una baliza molecular marcada con un par interactivo de fluoróforo/desactivador para controlar la producción de amplicón dependiente del tiempo en reacciones de amplificación de ácidos nucleicos. Aunque las balizas moleculares descritas en este ejemplo se hibridaron con solo una cadena del producto del ácido nucleico amplificado, las secuencias sondas complementarias al ácido nucleico de VIH-1 en la cadena opuesta también cayeron dentro del alcance de la descripción. Los resultados de estos procedimientos indicaron que la elección de cebadores oligonucleotídicos afectó profundamente la capacidad cuantitativa del ensayo.

Ejemplo 1

Monitoreo dependiente del tiempo del grupo M del VIH-1.

Producción de amplicones del subtipo B

Una transcripción sintetizada in vitro de concentración conocida incluyó la secuencia:

TAAAAG AAAAGGGGGG ATTG GGG GGTAC AGTGC AGGGG AAAGAATAGTAGAC ATAATAGC AAC AGACATACAMCTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTA CAGGGACAGCAGAAAT CCACTTTGG AAAGGACCAG CAAAGCT CCTCTG GAAAGGTGAAGGGG C AGTAGTAAIACAAG ATAATAGT GAC ATAAAAGTAGT GCC AAG AAG AAAAGC AAAG ATC ATTAG 5 GGATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGATG ATTGTGTGGCAAGTAGACAGGATGAGGAT (S EQ IDN 0 :29),

y sirvió como fuente de secuencias de plantillas del subtipo B de VIH-1 en reacciones de amplificación que emplearon conjuntos de cebadores emparejados. Esta transcripción in vitro contenía porciones del genoma del VIH-1 que incluían secuencias sustancialmente correspondientes o sustancialmente complementarias a cada uno de los cebadores utilizados en el procedimiento. Las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos se realizaron usando un protocolo TMA, y se llevaron a cabo esencialmente como se describe por Kacian et al., en la patente de EE.UU. 5.399.491. Los cebadores promotores utilizados en las reacciones TMA incluyeron una secuencia promotora T7 AATTTAATACGACTCACTATAGGGAG (SEQ ID NO: 30) adjunta anterior de una secuencia complementaria de VIH-1. La secuencia del promotor T7 está ausente del polinucleótido del analito de VIH-1, por lo que no fue complementaria a la plantilla de ViH-1. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo utilizando cantidades variables de la transcripción in vitro de VIH-1 y aproximadamente 0,07-0,12 pmoles/jl de cada cebador en volúmenes de reacción de 30 |jl.

Una baliza molecular capaz de hibridarse con los amplicones del VIH-1 se sintetizó mediante la química estándar de triéster de fosfito en fase sólida usando vidrio de poro controlado (CPG) unido al inactivador de 3' y un fosforamidito marcado con fluoróforo de 5' en un sintetizador automático EXPEDITE modelo 8909 de Perkin-Elmer (Foster City, California). Se usó fluoresceína como fluoróforo, se usó DABCYL como inhibidor y se usaron análogos de 2'-metoxi nucleótidos para la construcción de la baliza molecular. Los reactivos de CPG y fosforamidita se compraron en Glen Research Corporation (Sterling, Virginia). Después de la síntesis, la desprotección y escisión de la matriz de soporte sólido, las sondas se purificaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida seguido de HPLC usando procedimientos estándar que serán familiares para aquellos que tienen un nivel de experto medio en la técnica. La secuencia complementaria a la diana contenida en la baliza molecular, que permite la sustitución de un único análogo de nucleótido de inosina en la posición cuatro, y la sustitución de uracilos por bases de timina, fue TGGGGGGTACAGTGC (SEQ ID NO: 31). En particular, las secuencias de hibridación diana de las sondas de hibridación de baliza molecular descritas en el presente documento no eran completamente complementarias a los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, ni a los amplicones del grupo O del VIH-1 sintetizados usando los cebadores descritos en este documento. Además, las secuencias de hibridación diana de estas sondas no eran completamente complementarias a los ácidos nucleicos o amplicones para los miembros del grupo M de VIH-1 representados por los subtipos A, E y F. Por el contrario, estas secuencias de hibridación diana eran completamente complementarias a los amplicones del VIH-1 subtipo B. La secuencia global de la sonda de la baliza molecular utilizada en el procedimiento fue proporcionada por la s Eq ID NO: 22.

Los pocillos individuales en una placa de pocillos múltiples contenían 30 pl de una solución tamponada con Tris que incluía sales de potasio y magnesio, N-acetil-L-cisteína, trifosfatos de ribonucleótidos, trifosfatos de nucleótidos y otros reactivos, un polinucleótido diana y una baliza molecular. El polinucleótido diana se incluyó en cantidades que variaban de 5 a 5 x 106 copias/reacción. El cebador-promotor de la primera cadena para amplificar la plantilla de VIH-1 tenía la secuencia de hibridación diana de la SEQ ID NO: 13 (que estaba contenida dentro de la secuencia de la SEQ ID NO: 17). Los cebadores de la segunda cadena tenían la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. Las muestras se incubaron durante 10 minutos a 60°C para facilitar el recocido del cebador, y luego se incubaron a 42°C durante al menos 5 minutos. Se agregaron alícuotas de un reactivo enzimático que incluía tanto la transcriptasa inversa MMLV como las enzimas ARN polimerasa T7 a cada uno de los tubos usando una pipeta repetidora. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo a 42°C, y las lecturas de fluorescencia se tomaron cada 19,4 segundos usando un DETECTOR DE TIEMPO REAL CHROMO4 (MJ Research; Reno, NV.), o cada 30 segundos usando un instrumento a tiempo real OPTICON 2 (MJ Research; Reno, NV) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones se realizaron en réplicas de 4-8.

Los resultados presentados en la FIG. 2 mostraron cómo la sustitución de un cebador de amplificación por otro aumentaba drásticamente la capacidad cuantitativa y la precisión del ensayo. Las señales de amplificación dependientes del tiempo obtenidas usando un cebador promotor de primera cadena que incluía la secuencia de hibridación diana de la SEQ ID N°: 13 y un cebador de segunda cadena que tenía la secuencia complementaria de la SEQ ID N°: 1 mostraron una menor precisión, como se juzgó por la mayor difusión entre los puntos de datos individuales y la divergencia sustancial de la linealidad cuando el nivel de plantilla utilizado en la reacción caía por debajo de 500 copias. Esta combinación de cebadores se prefirió para los ensayos destinados a cuantificar los ácidos nucleicos del VIH-1 a niveles superiores a 500 copias/reacción. Por el contrario, las señales de amplificación dependientes del tiempo obtenidas usando un cebador de primera hebra que incluía la secuencia complementaria de diana SEQ ID NO: 13 y un cebador de segunda hebra que tenía la secuencia complementaria de diana de SEQ ID NO: 2 mostraron una mejor precisión y una excelente linealidad en el intervalo de 25 a 5 * 106 copias/reacción de la plantilla de ácido nucleico. Esta última combinación de cebadores mejoró ventajosamente la capacidad cuantitativa de gama baja del ensayo en 20 veces, un resultado drástico que no podría haberse predicho antes de esta demostración.

Aunque no se ilustra en la FIG. 2, hubo un fallo en la amplificación cuando se usó un cebador promotor de primera cadena que tenía la secuencia complementaria diana SEQ ID NO: 13 y un cebador de segunda cadena que tenía la secuencia complementaria diana SEQ ID NO: 1 cuando se usó la plantilla del grupo O del VIH-1 en niveles menores o iguales a 50.000 copias/reacción. Esto demostró que la pérdida de precisión observada a niveles bajos de plantilla de entrada era una característica de la combinación de cebadores y era independiente de la plantilla que se estaba amplificando. Por el contrario, los resultados presentados en el siguiente Ejemplo confirmaron que la combinación de un cebador promotor de primera cadena que tenía la secuencia de hibridación diana de SEQ ID N°: 13 y un cebador de segunda cadena que tenía la secuencia de SEQ ID N°: 2 daba ventajosamente relaciones lineales entre las cantidades de plantilla de entrada y las señales de amplificación dependientes del tiempo en un intervalo ampliado con buena precisión para plantillas que representaban múltiples subtipos del VIH-1.

El ejemplo 2 demuestra que las plantillas del grupo de M del VIH-1, subtipo B y grupo O del VIH-1 podrían amplificarse con buena precisión en un intervalo de plantilla de entrada extendido desde 25 a 5 * 105 copias/reacción. En particular, las dos plantillas se amplificaron con una cinética algo diferente.

Ejemplo 2

Diferentes perfiles cinéticos caracterizan la amplificación de las variantes del VIH-1

Se realizaron reacciones de amplificación esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. Se llevaron a cabo reacciones paralelas utilizando un cebador promotor de la primera cadena que tenía la secuencia de hibridación diana de la SEQ ID N°: 13, un cebador de la segunda cadena que tenía la secuencia complementaria de la SEQ ID N°: 2 y cantidades variables de la plantilla del subtipo B descrita en el Ejemplo 1, o una plantilla del grupo O que incluía la secuencia:

AGTGGGTTCATAGAAGCAGAAGTGATACCAGCAGAAACAGGACAAGAAACTGCCTACTTCCTG TTAAAAC TG G C TG C AAG ATG G C C TG TTAAAG TAATAC ATAC AG AC AAC G G G C C TAATTTTAC A AGTACAACTATG AAG G CTG CATG TTG G TG G G CCAACATACAACATG AG TTTG G AATACCATAT AATC C AC AAAG TC AAG G AG TAG TAG AAG C C ATG AATAAG G AATTAAAATC AATTATAC AG C AG G TG AG G G ACCAAG CAG AACACTTAAG AACAG CAG TACAAATG G CAG TATTTG TTCACAATTTT AAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACACTGCAGGAGAAAGGATAATAGACATATTAGCATCA C A A A TA C A A A C A A C A G A A TTA C A A A A A C A A A TTTTA A A A N TTC A C A A A TTTC G G G TC TA TTA C ^{AGAGACAGCAGAGACCCTAT} (SEQ ^ID NO:32).

Al igual que la plantilla del subtipo B, la plantilla del grupo O también era una transcripción in vitro preparada utilizando materiales y procedimientos que eran familiares para aquellos con un nivel de experto medio en la técnica. Se incluyeron plantillas en las reacciones en cantidades que variaban de 50 a 5 x 105 copias/reacción.

Los resultados presentados en la FIG. 3 confirmaron que las ventajas asociadas con la combinación de un cebador de primera cadena que incluía la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 y un cebador de segunda cadena que tenía la secuencia complementaria de diana de SEQ ID NO: 2 se extendían a la amplificación de las plantillas del grupo O del VIH-1. Más específicamente, las reacciones realizadas usando esta combinación de cebadores exhibieron ventajosamente una buena precisión entre los puntos de datos a niveles bajos de la plantilla de VIH-1, y una linealidad de la señal de amplificación dependiente del tiempo. Además, se observaron las características beneficiosas de esta combinación de cebadores para las plantillas de los grupos de subtipo B y O del VIH-1. Como se indicó anteriormente, las pruebas realizadas usando la plantilla del grupo O del VIH-1, un cebador promotor de la primera cadena con la secuencia de hibridación diana SEQ ID NO: 13 y un cebador de la segunda cadena con la secuencia complementaria al diana SEQ ID NO: 1 no produjo señales de amplificación útiles cuando el número de copias de entrada de la plantilla era inferior a 50.000 copias.

Curiosamente, las diferentes muestras de las plantillas del VIH-1 usadas en el procedimiento dieron lugar a líneas sustancialmente paralelas en el gráfico, que se muestran en la FIG. 3, produciendo la plantilla del grupo O del VIH-1 una cinética de amplificación algo más lenta. Por ejemplo, una reacción realizada con 5.000 copias de la plantilla del subtipo B del VIH-1 requirió aproximadamente 15 minutos para lograr un resultado positivo, pero una reacción similar realizada con la plantilla del grupo O del VIH-1 requirió cuatro minutos adicionales para lograr el mismo resultado. En un ensayo cuantitativo que mide el tiempo para lograr un resultado positivo, tal diferencia posiblemente podría comprometer la interpretación de los resultados y conducir a una conclusión errónea.

A pesar de los beneficios de la combinación de cebadores utilizada en este Ejemplo, los resultados indicaron que las diferentes variantes del VIH-1 se amplificaban con diferentes perfiles cinéticos. En el caso ilustrado en la FIG. 3, la detección de una señal de amplificación positiva a los 15 minutos indicaba de manera ambigua la presencia de 5.000 copias de la plantilla del subtipo B, o 500.000 copias de la plantilla del grupo O. El deseo de realizar ensayos usando un solo calibrador, o un conjunto de calibradores para cuantificar múltiples muestras del VIH-1 en una sola reacción, hizo preferible que hubiera una relación directa entre los perfiles de amplificación de las variantes del VIH-1 a detectar. Por lo tanto, para mejorar aún más la capacidad cuantitativa del ensayo, se buscaron condiciones de reacción para normalizar la cinética de amplificación para diferentes subtipos del VIH-1.

El siguiente ejemplo describe cebadores de amplificación que contienen emparejamientos erróneos tanto para las plantillas de los grupos del subtipo B del VIH-1 como O del VIH-1, y el uso de estos cebadores para normalizar la cinética de amplificación de las variantes del VIH-1. El enfoque utilizado en este procedimiento fue sustituir los nucleótidos dentro de la secuencia del cebador de primera cadena de modo que la sustitución fuera complementaria a una posición contenida en la plantilla del grupo O, pero no complementaria con la secuencia contenida en la plantilla del subtipo B. El objetivo de este enfoque era mejorar la cinética de amplificación de la plantilla del grupo O en relación con la plantilla del subtipo B.

El ejemplo 3 describe métodos que identificaron un cebador de primera cadena que mejoraba la cinética de amplificación de las plantillas del grupo O del VIH-1. Al contrario de lo que podría haberse esperado, no hubo sustancialmente ningún efecto respecto a la cinética de amplificación para la plantilla del subtipo B del VIH-1.

Ejemplo 3

Mejora de la cinética de amplificación de las plantillas del grupo O del VIH-1

Se prepararon conjuntos paralelos de reacciones de amplificación para comparar los efectos de dos combinaciones de cebadores diferentes respecto a la cinética de amplificación de las plantillas de los grupos VIH-1 subtipo B y O del VIH-1. En cada caso, se usó un cebador promotor de primera cadena que tenía la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 15 en combinación con un cebador de segunda cadena que tenía la secuencia complementaria de diana de SEQ ID NO: 2. Curiosamente, la secuencia de SEQ ID NO: 15 difería de la secuencia de SEQ ID NO: 13 por la sustitución de timina por adenina en la posición 15 en la porción de hibridación diana del cebador. Esta sustitución corresponde a la posición 41 de los cebadores promotores identificados por SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 17. Las cantidades de plantillas del VIH-1 utilizadas en las reacciones variaron de 5 a 5 x 104 copias/reacción. Las reacciones de amplificación se prepararon y monitorearon usando materiales y procedimientos esencialmente como se describe anteriormente.

Los resultados presentados en las Figs. 4A-4B indicaron que la sustitución del cebador que tenía la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 15 por el cebador que tenía la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 tuvo diferentes efectos sobre la cinética de amplificación de las diferentes plantillas. Más específicamente, la FIG. 4A muestra que los diferentes conjuntos de cebadores amplificaron la plantilla del subtipo B del VIH-1 con una cinética sustancialmente idéntica. Sin embargo, la Fig. 4B muestra que la plantilla del grupo O del VIH-1 se amplificó con una cinética algo más rápida en el intervalo completo de valores de plantilla de entrada probados cuando se usaba el cebador que tenía la secuencia de hibridación diana de la SEQ ID NO: 15 en lugar de la SEQ ID NO: 13. En consecuencia, la combinación de cebadores que incluían las secuencias de hibridación diana SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 2 amplificaron ventajosamente las diferentes muestras de plantilla del VIH-1 con cinética que se aproximaban más entre sí en comparación con la combinación de cebadores que incluían las secuencias de hibridación diana SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 2.

En un procedimiento relacionado, se usaron diferentes combinaciones de cebadores para amplificar plantillas independientes que representaban los subtipos del VIH-1 A-C, E-F, G/A, H y el grupo O del VIH-1. El tiempo requerido para producir una señal de amplificación positiva se determinó para niveles de entrada de plantilla equivalentes a 1.000 copias/reacción. Las reacciones se realizaron utilizando réplicas de seis.

Los diagramas de barras en las Figs. 5A-5B demostraron que la nueva combinación de cebadores reducía ventajosamente las diferencias entre los tiempos necesarios para lograr resultados de amplificación positivos para numerosos subtipos del VIH-1. La Fig. 5A indica que 3,4 minutos hacían distinguir los tiempos para lograr resultados de amplificación positivos para las plantillas del grupo del subtipo B y O cuando se usaban cebadores que incluían las secuencias de hibridación diana de SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 2. Por el contrario, la Fig. 5B muestra que esta diferencia se reducía a solo 1,3 minutos cuando los cebadores incluían las secuencias de hibridación diana de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 2. Además, las diferencias entre los tiempos necesarios para lograr resultados positivos para varios subtipos también parecían minimizarse en las reacciones realizadas con estos cebadores. A pesar de estas mejoras, la cinética de amplificación para las plantillas del subtipo E y subtipo F del VIH-1 parecía algo retrasada en comparación con la cinética de amplificación observada para las otras muestras.

También se demostró que, cuando se combina con el cebador de SEQ ID NO: 2, el cebador que tiene la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 16 mejoraba ventajosamente la precisión de la cuantificación para la plantilla del grupo O del VIH-1 en comparación con la combinación de los cebadores que tenían las secuencias de hibridación diana de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 13. Por lo tanto, el cebador representa una realización preferida de la invención, particularmente cuando se combina con el cebador de SEQ ID NO: 2.

Finalmente, cada uno de los cebadores identificados por SEQ ID NO: 3-6 y 8-12 en la Tabla 1, cuando se combina con el cebador de SEQ ID NO: 15, y cuando se compara con los resultados obtenidos usando el cebador de SEQ ID NO: 2 en combinación con el cebador de SEQ ID NO: 15, se comportaba de manera sustancialmente equivalente. Este patrón se demostró usando la baliza molecular descrita en este documento con los cebadores de la Tabla 1 identificados por SEQ ID NO: 3-9, y usando la baliza molecular descrita en este documento con los cebadores de la ^{Tabla 1 identificados por SEQ ID} nO: ^{5 (véase más abajo), SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 10-12. Por alguna razón que} aún no está clara, no se lograron resultados igualmente buenos usando la combinación de cebadores que tenía las secuencias de hibridación diana de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 15. Por lo tanto, cualquier combinación del cebador de SEQ ID NO: 15 con cualquiera de los cebadores identificados por SEQ ID NO: 3-6 y 8-12 representaba una combinación preferida de cebadores para amplificar los ácidos nucleicos del VIH-1. Estas combinaciones son particularmente preferidas cuando se combinaban adicionalmente con una sonda de hibridación de baliza molecular.

Los procedimientos anteriores identificaron una combinación de cebadores que ventajosamente era capaz de amplificar varios subtipos del VIH-1 con perfiles cinéticos sustancialmente equivalentes. En particular, los subtipos E y F del VIH-1 exhibían una cinética de amplificación algo retrasada en comparación con las otras dianas utilizadas en el procedimiento de prueba. Después de haber modificado los cebadores de primera y segunda hebra, un enfoque diferente investigaba los efectos de modificar la sonda de detección utilizada en el protocolo de monitorización fluorescente.

El ejemplo 4 describe procedimientos que identificaban cebadores oligonucleotídicos y una sonda que producía una cinética de amplificación sustancialmente equivalente para todas las diferentes variantes del VIH-1.

Ejemplo 4

Monitoreo dependiente del tiempo de la síntesis de amplicones usando una baliza molecular

Se prepararon reacciones de amplificación paralelas esencialmente como se describe en los ejemplos anteriores con las siguientes modificaciones. Se usó un cebador de primera cadena que tenía la secuencia de hibridación diana de SEQ ID NO: 15 colocada posterior a una secuencia promotora T7 (es decir, el cebador promotor de SEQ ID NO: 19) en combinación con un cebador de segunda cadena que tenía la secuencia SEQ ID NO: 5. Además, la baliza molecular que tenía la secuencia de SEQ ID NO: 24 (es decir, que tenía la secuencia de hibridación diana dada por SEQ ID NO: 23) se sustituía por la baliza molecular que tenía la secuencia de SEQ ID NO: 22. La baliza molecular se marcó en su extremo 5' con un fluoróforo fluoresceína, y en su extremo 3' con un resto inhibidor DABCYL. Finalmente, las transcripciones in vitro que representaban los subtipos del VIH-1 A-C, E-F, G/A, H y O se usaron como plantillas a 50 y 1.000 copias/reacción.

Se preparó una curva estándar a partir de los datos obtenidos en los ensayos realizados utilizando las plantillas del subtipo B del VIH-1 como estándares ilustrativos del grupo M del VIH-1 a 50 y 1.000 copias/reacción. Las reacciones se llevaron a cabo en réplicas de seis. El tiempo requerido para efectuar niveles detectables de amplificación respecto al fondo se representó en el eje y, y el número de copias/reacción del estándar se representó en el eje x de la curva estándar. Se determinó el tiempo promedio requerido para efectuar niveles detectables de amplificación en cada reacción realizada usando los diferentes subtipos del VIH-1, y esos valores de tiempo se usaron para establecer los valores promedio de copias log-10 en comparación con la curva estándar.

Los resultados presentados en las Figs. 6A-6B mostraron que todas las variantes del VIH-1 se amplificaron ventajosamente con una eficacia sustancialmente igual cuando se usaba la combinación especificada de cebadores de amplificación, y cuando se sustituía una baliza molecular por la sonda de hibridación de baliza molecular. La diferencia máxima entre los tiempos requeridos para lograr señales de amplificación positivas al nivel de 1.000 copias/reacción se redujo a solo 1,3 minutos (0,7 log-10 copias/reacción). De hecho, la diferencia entre el número determinado de plantillas del subtipo F del VIH-1 (es decir, las muestras que exhibían la cinética de amplificación más lenta entre el grupo M del VIH-1) no excedía 0,7 log-10 copias/reacción cuando las reacciones se iniciaban usando 1.000 copias de plantilla/reacción. Del mismo modo, el número determinado de plantillas del grupo O de VIH-1 difería del número real de copias de plantilla/reacción en no más de 0,5 log-10 copias/reacción cuando las reacciones se iniciaban usando 1.000 copias de plantilla/reacción. La naturaleza de los sistemas de amplificación en tiempo real, como los descritos en este documento, proporciona una mejor precisión a niveles de copia crecientes. En consecuencia, las diferencias entre el número real de copias de plantilla/reacción del VIH-1 y el número determinado de copias de plantilla/reacción eran inferiores a 0,7 log-10 copias/reacción para las reacciones realizadas utilizando más de 1.000 copias/reacción de la muestra del subtipo F del VIH-1, y era inferior a 0,5 log-10 copias/reacción para las reacciones llevadas a cabo utilizando más de 1.000 copias/reacción de la plantilla del grupo O del VIH-1.

El hecho de que los diferentes subtipos del VIH-1 dieran valores de tiempo más normalizados en este procedimiento se atribuía a la sustitución de una baliza molecular por una baliza molecular (como se ilustra en el Ejemplo anterior), porque se establecía independientemente que los cebadores de segunda cadena de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 se realizaban esencialmente de manera equivalente en las reacciones de amplificación. En particular, las secuencias de hibridación diana de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 5 se ajustaban al consenso CCACAATTTTRAAAGAAAAGGG (SEQ ID NO: 33). Además, el hallazgo de los inventores demuestra que las balizas moleculares pueden tener ventajas respecto a las balizas moleculares cuando se usan como sondas para el monitoreo en tiempo real de reacciones de amplificación isotérmica, particularmente cuando se requiere que la porción de unión diana de la sonda se hibride a amplicones que no son completamente complementarios. Como se indicó anteriormente, la secuencia de hibridación diana de la baliza molecular no era completamente complementaria al ácido nucleico o amplicón del grupo O del VIH-1, ni a los ácidos nucleicos o amplicones de los subtipos A, E y F del grupo M del VIH-1. Aunque no se muestre en la figura, todos los diferentes subtipos se detectaban fácilmente cuando estaban presentes en el nivel de 50 copias/reacción, lo que demuestra la robustez del sistema de amplificación.

Si se usa una combinación de cebadores y una sonda que amplificaba los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y del grupo O del VIH-1 con una eficacia sustancialmente igual en el protocolo de amplificación en tiempo real, entonces se preferirá emplear un polinucleótido de un solo subtipo del VIH-1 como un estándar de calibración para ensayos capaces de cuantificar numerosos subtipos diferentes de VIH-1. Por ejemplo, se prefiere usar un estándar del grupo M del VIH-1, tal como una cantidad conocida de un ácido nucleico del subtipo B del VIH-1, como estándar de calibración. Este estándar de ácido nucleico del grupo M del VIH-1 se puede usar para establecer un punto en una curva estándar, y la curva estándar resultante se puede usar para cuantificar los ácidos nucleicos del grupo del M del VIH-1 y del grupo O del VIH-1. Por supuesto, también es posible emplear una colección de estándares del grupo M de VIH-1, cada uno con una cantidad conocida diferente de ácidos nucleicos del grupo M de VIH-1, para establecer varios puntos en una curva estándar y usar la curva estándar resultante para cuantificar los diversos ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y del grupo O. Alternativamente, en lugar de usar el estándar de ácido nucleico del grupo M del VIH-1, se pueden emplear los estándares del grupo O del VIH-1. En este caso, las cantidades conocidas de un ácido nucleico del grupo O del VIH-1 se emplean como estándares para crear una curva estándar al amplificar los ácidos nucleicos usando una combinación de cebadores de amplificación y una sonda de hibridación que amplifique los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y del O del VIH-1 con eficiencias sustancialmente iguales. La curva estándar resultante se puede usar para cuantificar los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 y del grupo M. Incluso se contempla que un ácido nucleico estándar quimérico que no sea estrictamente un ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o un ácido nucleico del grupo O del VIH-1 podría usarse como un estándar para cuantificar tanto los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 como del grupo O.

Esta invención se ha descrito con referencia a una serie de ejemplos específicos y realizaciones de la misma. Por supuesto, se puede sugerir una serie de realizaciones diferentes a las de la presente invención a los expertos en la materia tras la revisión de la descripción detallada anterior. Por lo tanto, el verdadero alcance de la presente invención se determinará con referencia a las reivindicaciones adjuntas.

Otros aspectos de la presente invención se exponen en los siguientes párrafos numerados:

1. Una mezcla de reacción para amplificar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, que comprende:

(a) un primer cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del primer cebador que se hibrida de forma independiente a una primera hebra de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y una primera hebra de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1; y

(b) un segundo cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que se hibrida a un producto de extensión enzimática de dicho primer cebador de amplificación utilizando como plantilla dicha primera hebra de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o dicha primera hebra de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, consistiendo dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador esencialmente en SEQ ID NO:33.

2. La mezcla de reacción del apartado 1, en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:2.

3. La mezcla de reacción del párrafo 2, en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:13.

4. La mezcla de reacción del párrafo 2, en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:15.

5. La mezcla de reacción del párrafo 1, en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:5.

6. La mezcla de reacción del párrafo 5, en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:15.

7. La mezcla de reacción del párrafo 1, que comprende además una sonda de hibridación.

8. La mezcla de reacción del párrafo 7, en la que dicha sonda de hibridación se selecciona del grupo que consiste en una sonda de hibridación de baliza molecular.

9. La mezcla de reacción del párrafo 8, en la que no se utilizan más de dos cebadores y una sola sonda para amplificar y detectar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1.

10. Un método para cuantificar la cantidad combinada del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y un ácido nucleico del grupo O del VIH-1 que puede estar presente en una muestra biológica, comprendiendo las etapas de:

combinar en un solo recipiente de reacción dicha muestra biológica, un primer cebador de amplificación, un segundo cebador de amplificación y una sonda de hibridación;

amplificar con una eficiencia sustancialmente igual cualquiera del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica utilizando una reacción de amplificación in vitro que comprende la extensión enzimática de dicho primer cebador de amplificación utilizando una primera hebra de dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 como primera plantilla para crear un primer producto de amplificación de cebador, y utilizando la amplificación enzimática de dicho segundo cebador de amplificación dicho producto de amplificación de primer cebador como segunda plantilla, en la que se producen amplicones del grupo M del VIH-1 si la muestra biológica contenía dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1, y amplicones del grupo O del VIH-1 si la muestra biológica contenía dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1;

monitorear la producción de amplicones en dicha reacción de amplificación in vitro en función del tiempo mediante un procedimiento que comprende la detección de una señal de dicha sonda de hibridación, mediante la cual se obtienen datos cuantitativos dependientes del tiempo; y

cuantificar la cantidad combinada de dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica utilizando los datos cuantitativos dependientes del tiempo obtenidos en la etapa de seguimiento,

en el que ni dicho primer cebador de amplificación ni dicho segundo cebador de amplificación son totalmente complementarios con dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o su complemento, ni con dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 o su complemento, y

en el que dicha sonda de hibridación se híbrida tanto a los amplicones del grupo M del VIH-1 como a los amplicones del grupo O del VIH-1.

11. El método del párrafo 10, en el que dicha reacción de amplificación in vitro es una reacción de amplificación in vitro isotérmica.

12. El método del párrafo 11, en el que dicha reacción isotérmica de amplificación in vitro es una reacción de amplificación asociada a la transcripción seleccionada del grupo consistente en una reacción TMA y una reacción NASBA.

13. El método del apartado 10, en el que la señal detectada en la etapa de seguimiento es una señal fluorescente.

14. El método del párrafo 13, donde dicha sonda de hibridación es una sonda de hibridación de baliza molecular. 15. El método del párrafo 14, en el que dicho primer cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana del primer cebador que consiste esencialmente en SEQ ID NO:15.

16. El método del párrafo 15, en el que dicho segundo cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que consiste esencialmente en SEQ ID NO:5.

17. El método del párrafo 10, en el que no se utilizan más de dos cebadores y una sola sonda para amplificar y detectar tanto dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 como dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1.

18. El método del párrafo 17, en el que dicha reacción de amplificación in vitro es una reacción de amplificación in vitro isotérmica.

19. El método del párrafo 17, en el que la etapa de cuantificación comprende comparar un resultado cuantitativo con no más de una sola curva estándar.

20. Un método para establecer un punto en una curva estándar que pueda utilizarse para cuantificar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 en una sola reacción, que comprende las etapas de:

proporcionar una cantidad conocida de un estándar del VIH-1;

amplificar en una reacción de amplificación in vitro dicho estándar del VIH-1 utilizando un primer cebador y un segundo cebador en presencia de una sonda de hibridación para producir amplicones del estándar del VIH-1,

en el que dicha reacción de amplificación amplifica los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 con una eficiencia sustancialmente igual;

monitorear la producción de amplicones del estándar del VIH-1 sintetizados en dicha reacción de amplificación in vitro en función del tiempo mediante un procedimiento que comprende la detección de una señal desde dicha sonda de hibridación, mediante la cual se obtienen datos cuantitativos; y establecer a partir de los datos cuantitativos dicho punto en dicha curva estándar.

21. El método del párrafo 20, en el que dicho primer cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana del primer cebador que se hibrida independientemente a una primera hebra de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y una primera hebra de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1,

donde dicho segundo cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que se hibrida a un producto de amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación utilizando como plantilla dicha primera hebra de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o dicha primera hebra de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1,

donde ni dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador ni dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador son totalmente complementarias con los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o grupo O del VIH-1 o sus complementos, y

donde dicha sonda de hibridación se hibrida a los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y a los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, o a sus complementos.

22. El método del párrafo 21, en el que dicha sonda de hibridación es una baliza molecular.

23. El método del párrafo 21, en el que dicho estándar del VIH-1 es un estándar de ácido nucleico del grupo M del VIH-1.

24. El método del párrafo 23 comprende además una etapa para utilizar la curva estándar para cuantificar el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 contenido en una muestra biológica.

25. El método del párrafo 20, en el que dicho estándar del VIH-1 es un estándar de ácido nucleico del grupo O del VIH-1.

26. El método del párrafo 25 que comprende además una etapa para utilizar la curva estándar para cuantificar un ácido nucleico del grupo M del VIH-1 contenido en una muestra biológica.

27. El método del párrafo 21, en el que dicha reacción de amplificación in vitro en la etapa de amplificación es una reacción de amplificación in vitro isotérmica.

28. El método del párrafo 27, en el que dicha reacción isotérmica de amplificación in vitro es una reacción de amplificación asociada a la transcripción seleccionada del grupo consistente en una reacción TMA y una reacción NASBA.

29. El método del párrafo 28, en el que la etapa de control comprende medir una señal fluorescente.

30. Un método para preparar una mezcla de reacción para amplificar uno o ambos ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, que comprende:

(a) seleccionar un primer cebador de amplificación que comprenda una secuencia que se hibride independientemente a una primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1;

(b) seleccionar un segundo cebador de amplificación que comprenda una secuencia que se hibride a los productos de amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación utilizando dicha primera hebra de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 como plantilla;

(c) seleccionar una sonda de hibridación que se hibride a amplicones sintetizados por el uso de dicho primer y dicho segundo cebador de amplificación,

en el que ni dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador ni dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador son totalmente complementarias a dichos ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o grupo O del VIH-1 o sus complementos, y

en el que dicho primer cebador de amplificación, dicho segundo cebador de amplificación, y dicha sonda de hibridación se seleccionan además para amplificar, en una reacción de amplificación in vitro, ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 con sustancialmente iguales eficiencias; y (d) combinar en un solo recipiente de reacción dicho primer cebador de amplificación, dicho segundo cebador de amplificación y dicha sonda de hibridación.

31. El método del párrafo 30, en el que dicha mezcla de reacción no comprende más de dos cebadores y una sola sonda de hibridación para amplificar y detectar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1.

32. El método del párrafo 31, en el que dicha reacción de amplificación in vitro es una reacción de amplificación in vitro isotérmica.

33. El método del párrafo 32, en el que dicha reacción de amplificación isotérmica in vitro es una reacción de amplificación asociada a la transcripción seleccionada del grupo consistente en una reacción TMA y una reacción NASBA.

34. Una composición para amplificar los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1, que comprende:

un primer cebador de amplificación que comprende una primera secuencia de hibridación diana del cebador que se hibrida independientemente a una primera hebra de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y una primera hebra de ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1;

un segundo cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que se hibrida a los productos de amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación utilizando dicha primera hebra de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 como plantilla,

en el que ni dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador ni dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador son totalmente complementarias a dichos ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 o sus complementos.

35. La composición del párrafo 34, que comprende además una sonda de hibridación que se hibrida a un producto de amplificación producido en una reacción de amplificación in vitro por la actividad combinada de dichos cebadores de amplificación primero y segundo utilizando como plantilla ya sea los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o los ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1.

36. La composición del párrafo 35, en la que dicha composición amplifica los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro con una eficiencia sustancialmente igual.

37. La composición del párrafo 36, en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:15, y en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:5.

38. La composición del párrafo 36, en la que dicha sonda de hibridación es una baliza molecular.

39. La composición del párrafo 35, en la que dicha sonda de hibridación se selecciona del grupo formado por una baliza molecular.

40. La composición del párrafo 39, en la que dicha sonda de hibridación es una baliza molecular.

41. La composición del párrafo 34, en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:5.

42. La composición del párrafo 41, en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:15.

43. La composición del párrafo 35, en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:15, y en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO:5.

44. La composición del párrafo 43, en la que dicha sonda de hibridación es una baliza molecular.

45. Una mezcla de reacción para amplificar los ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o los ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, que comprende:

(a) un primer cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del primer cebador que se hibrida independientemente a una primera hebra de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y una primera hebra de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1;

(b) un segundo cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que se hibrida a un producto de amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación utilizando como plantilla dicha primera hebra de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o dicha primera hebra de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1; y

(c) una sonda de hibridación de baliza molecular que se hibrida a un amplicón sintetizado por la actividad combinada de dicho primer cebador de amplificación y dicho segundo cebador de amplificación, en la que ni dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador ni dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador son totalmente complementarias a los ácidos nucleicos de dicho grupo M del VIH-1 o del grupo O del VIH-1 o su complemento, y

en el que dichos ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 y ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 se amplifican en la mezcla de reacción con una eficiencia sustancialmente igual.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para cuantificar la cantidad combinada de un ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y un ácido nucleico del grupo O del VIH-1 que puede estar presente en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

(i) combinar en un único recipiente de reacción dicha muestra biológica, un primer cebador de amplificación en el que dicho primer cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana que consiste en la SEQ ID NO: 15, un segundo cebador de amplificación y una sonda de hibridación;

(ii) amplificar con una eficacia sustancialmente igual cualquiera del ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y el ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica usando una reacción de amplificación in vitro que comprende la amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación usando una primera cadena de dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 como primera plantilla para crear un primer producto de amplificación de cebador, y la amplificación enzimática de dicho segundo cebador de amplificación usando dicho producto de amplificación del primer cebador como segunda plantilla, por lo que se producen amplicones del grupo M del VIH-1 si la muestra biológica contenía dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1, y amplicones del grupo O del VIH-1 si la muestra biológica contenía dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1;

(iii) monitorizar la producción de amplicones de dichos amplicones en dicha reacción de amplificación in vitro en función del tiempo mediante un procedimiento que comprende la detección de una señal de dicha sonda de hibridación, mediante la cual se obtienen datos cuantitativos dependientes del tiempo; y

(iv) cuantificar la cantidad combinada de dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 y dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 presente en la muestra biológica usando los datos cuantitativos dependientes del tiempo obtenidos en la etapa de monitorización,

en el que ni dicho primer cebador de amplificación ni dicho segundo cebador de amplificación son completamente complementarios con dicho ácido nucleico del grupo M del VIH-1 o su complemento, o con dicho ácido nucleico del grupo O del VIH-1 o su complemento, y en donde dicha sonda de hibridación se hibrida con tanto amplicones del grupo M de VIH-1 como amplicones del grupo O de VIH-1.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el primer cebador de amplificación es un cebador promotor.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la reacción de amplificación in vitro es una amplificación asociada a la transcripción, preferiblemente, una reacción de amplificación isotérmica in vitro, preferiblemente,

en donde dicha reacción de amplificación isotérmica in vitro es una reacción de amplificación asociada a la transcripción seleccionada del grupo que consiste en una reacción TMA y una reacción NASBA.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicha sonda de hibridación es una sonda de hibridación de baliza molecular.

5. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica es un componente intercelular.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicho segundo cebador de amplificación comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que consiste en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 2.

7. Una composición para amplificar los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1, que comprende:

(i) un primer cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del primer cebador que se hibrida independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y una primera cadena de ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 y dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador que consiste en SEQ ID NO: 15; y

(ii) un segundo cebador de amplificación que comprende una secuencia de hibridación diana del segundo cebador que se hibrida con productos de amplificación enzimática de dicho primer cebador de amplificación usando dicha primera hebra de ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 como plantilla,

en donde ni dicha primera secuencia de hibridación diana de cebador ni dicha segunda secuencia de hibridación diana de cebador es completamente complementaria a dichos ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o grupo O del VIH-1 o sus complementos;

una sonda de hibridación que se hibrida con un producto de amplificación producido en una reacción de amplificación in vitro por la actividad combinada de dichos cebadores de amplificación primero y segundo usando como plantilla ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1; y

en el que dicha composición amplifica los ácidos nucleicos diana del grupo M del VIH-1 y los ácidos nucleicos diana del grupo O del VIH-1 en dicha reacción de amplificación in vitro de ácido nucleico con una eficacia sustancialmente igual.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste en la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 2; o

en donde dicha sonda de hibridación es una baliza molecular, preferiblemente, en donde dicha sonda de hibridación se selecciona del grupo que consiste en una baliza molecular.

9. La composición de la reivindicación 8, en la que dicha secuencia de hibridación de diana del segundo cebador consiste en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 2; o

en donde dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste en la SEQ ID NO: 15; o en la que dicha secuencia de hibridación diana del primer cebador consiste en la SEQ ID NO: 15, y en la que dicha secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste en SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 2.

10. Un cebador de amplificación que consiste en SEQ ID NO: 15 y opcionalmente unido a la secuencia anterior que sirve como un promotor de ARN polimerasa o contiene sitios de escisión de endonucleasa de restricción.

11. El cebador de amplificación según la reivindicación 10, en el que la ARN polimerasa es un promotor T7.

12. El cebador de amplificación de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el cebador de amplificación consiste en SEQ ID NO: 19.

13. Una mezcla de reacción útil para amplificar ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1 que incluye:

(i) un primer cebador de amplificación que incluye una secuencia de hibridación diana que puede hibridarse independientemente con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1, y con una primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, consistiendo esencialmente la secuencia de hibridación diana del primer cebador en SEQ ID NO: 15;

(ii) un segundo cebador de amplificación que incluye una secuencia de hibridación diana que se hibrida con un producto de amplificación enzimática del primer cebador de amplificación utilizando como plantilla la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo M del VIH-1 o la primera cadena de ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1, en el que la secuencia de hibridación diana del segundo cebador consiste esencialmente en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 5.

14. La mezcla de reacción de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la mezcla de reacción incluye además una sonda de hibridación, preferiblemente, en donde la sonda de hibridación es una sonda de hibridación de baliza molecular.

15. El uso de la mezcla de reacción según la reivindicación 13 o la reivindicación 14 para amplificar y detectar ácidos nucleicos del grupo M del VIH-a o ácidos nucleicos del grupo O del VIH-1.