JP2002165595A - テロメレース活性測定方法 - Google Patents
テロメレース活性測定方法Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 生きた細胞内のテロメレース活性測定方法を
提供する。 【解決手段】 以下の工程を含む、生きた細胞内のヒト
・テロメレース活性測定方法とする：（Ａ）ヒト・テロ
メレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーを、カチオン脂
質キャリアにより生きた細胞に導入し、細胞内テロメレ
ースによりヒト・テロメア配列TTAGGGの繰り返し配列か
らなるＤＮＡ配列を前記ヒト・テロメレース伸長用オリ
ゴＤＮＡプライマーの３’末端に伸長させてヒト・テロ
メレース反応産物を調製する工程、（Ｂ）ヒト・テロメ
レース反応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロメレ
ース反応産物と、センス・プライマーとアンチセンス・
プライマーとを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチＰ
ＣＲ法により増幅してＰＣＲ産物を得る工程、（Ｃ）前
記（Ｂ）工程で得られたＰＣＲ産物を定量する工程。
提供する。 【解決手段】 以下の工程を含む、生きた細胞内のヒト
・テロメレース活性測定方法とする：（Ａ）ヒト・テロ
メレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーを、カチオン脂
質キャリアにより生きた細胞に導入し、細胞内テロメレ
ースによりヒト・テロメア配列TTAGGGの繰り返し配列か
らなるＤＮＡ配列を前記ヒト・テロメレース伸長用オリ
ゴＤＮＡプライマーの３’末端に伸長させてヒト・テロ
メレース反応産物を調製する工程、（Ｂ）ヒト・テロメ
レース反応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロメレ
ース反応産物と、センス・プライマーとアンチセンス・
プライマーとを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチＰ
ＣＲ法により増幅してＰＣＲ産物を得る工程、（Ｃ）前
記（Ｂ）工程で得られたＰＣＲ産物を定量する工程。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、癌細胞に特徴的な
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（テロメレース）の生
細胞内における活性の測定方法及びテロメレース阻害剤
の製造方法に関するものである。
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（テロメレース）の生
細胞内における活性の測定方法及びテロメレース阻害剤
の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞などの真核細胞染色体の線状Ｄ
ＮＡの両末端はテロメアと呼ばれ、特殊なＤＮＡ配列と
それに結合する蛋白質からなる複雑な高次構造をとって
いる。テロメアＤＮＡは、チミン（Ｔ）及びグアニン
（Ｇ）（反対鎖はアデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ））
の豊富な特徴的な繰返し配列からなる。例えば脊椎動物
細胞染色体のテロメアＤＮＡはTTAGGG（反対鎖はCCCTA
A）の６塩基の繰り返しで構成されており、ヒト体細胞
のテロメア配列の平均長は２〜２０キロ塩基対であるこ
とが知られている。
ＮＡの両末端はテロメアと呼ばれ、特殊なＤＮＡ配列と
それに結合する蛋白質からなる複雑な高次構造をとって
いる。テロメアＤＮＡは、チミン（Ｔ）及びグアニン
（Ｇ）（反対鎖はアデニン（Ａ）及びシトシン（Ｃ））
の豊富な特徴的な繰返し配列からなる。例えば脊椎動物
細胞染色体のテロメアＤＮＡはTTAGGG（反対鎖はCCCTA
A）の６塩基の繰り返しで構成されており、ヒト体細胞
のテロメア配列の平均長は２〜２０キロ塩基対であるこ
とが知られている。
【０００３】テロメア構造はエキソヌクレアーゼによる
染色体の消化や染色体同士の末端融合を防ぐことで染色
体の安定化に寄与していると考えられている。また、染
色体の空間配置を規定する「錨」としても機能している
と推測されている。このように重要な機能を担うテロメ
アだが、次に述べるような「末端複製問題（end replic
ation problem）」により細胞分裂に伴い短縮・消耗し
ていく。即ち、線状二本鎖ＤＮＡ両端の同時複製の過程
では、染色体ＤＮＡの３’末端をプライマーとして５’
→３’ＤＮＡポリメラーゼにより連続的に複製されるＤ
ＮＡ鎖（リーディング鎖）に対し、他方のＤＮＡ鎖（ラ
ギング鎖）では短いＲＮＡをプライマーとして用いた断
続的な複製となる。ラギング鎖の５’最末端のＲＮＡプ
ライマーはＤＮＡに置き換えられないので、細胞分裂を
繰り返す度に一方の娘細胞の５’末端が次第に短縮する
ことになる。
染色体の消化や染色体同士の末端融合を防ぐことで染色
体の安定化に寄与していると考えられている。また、染
色体の空間配置を規定する「錨」としても機能している
と推測されている。このように重要な機能を担うテロメ
アだが、次に述べるような「末端複製問題（end replic
ation problem）」により細胞分裂に伴い短縮・消耗し
ていく。即ち、線状二本鎖ＤＮＡ両端の同時複製の過程
では、染色体ＤＮＡの３’末端をプライマーとして５’
→３’ＤＮＡポリメラーゼにより連続的に複製されるＤ
ＮＡ鎖（リーディング鎖）に対し、他方のＤＮＡ鎖（ラ
ギング鎖）では短いＲＮＡをプライマーとして用いた断
続的な複製となる。ラギング鎖の５’最末端のＲＮＡプ
ライマーはＤＮＡに置き換えられないので、細胞分裂を
繰り返す度に一方の娘細胞の５’末端が次第に短縮する
ことになる。
【０００４】実際、正常細胞では細胞分裂を重ねるにつ
れてテロメア配列が短縮し、その平均長は細胞の継代回
数と相関すること、継代を経るにつれて細胞分裂能が低
下し、最終的には分裂を停止した「老化」細胞となるこ
とが知られている。このように、正常細胞が分裂を停止
する一因はテロメアにあり、細胞分裂に伴うその短縮化
が染色体の不安定化を引き起こし、次いでこれを感知す
る何らかの機構によって細胞分裂の停止に至ると推測さ
れている。テロメアはいわば細胞の寿命（分裂回数）を
規定するタイマーとしての働きも有していることにな
る。
れてテロメア配列が短縮し、その平均長は細胞の継代回
数と相関すること、継代を経るにつれて細胞分裂能が低
下し、最終的には分裂を停止した「老化」細胞となるこ
とが知られている。このように、正常細胞が分裂を停止
する一因はテロメアにあり、細胞分裂に伴うその短縮化
が染色体の不安定化を引き起こし、次いでこれを感知す
る何らかの機構によって細胞分裂の停止に至ると推測さ
れている。テロメアはいわば細胞の寿命（分裂回数）を
規定するタイマーとしての働きも有していることにな
る。
【０００５】ところが癌細胞、または癌遺伝子の導入な
どにより実験的に得た不死化細胞では継代に伴う増殖停
止現象は認められていない。そこで癌細胞並びに不死化
細胞のテロメア長と細胞分裂の関係を調べたところ、こ
れらの細胞ではテロメア配列は短いが、細胞分裂を重ね
てもその平均長は変化しないことが明らかにされた。従
って、癌細胞や不死化細胞では何らかの因子がテロメア
短縮化を防ぎ、これらの細胞が（理論的には）無限に増
殖することを可能にしていると予想された。
どにより実験的に得た不死化細胞では継代に伴う増殖停
止現象は認められていない。そこで癌細胞並びに不死化
細胞のテロメア長と細胞分裂の関係を調べたところ、こ
れらの細胞ではテロメア配列は短いが、細胞分裂を重ね
てもその平均長は変化しないことが明らかにされた。従
って、癌細胞や不死化細胞では何らかの因子がテロメア
短縮化を防ぎ、これらの細胞が（理論的には）無限に増
殖することを可能にしていると予想された。
【０００６】ヒト癌細胞の無限増殖能の責任因子とし
て、テロメア配列を合成・伸長させるＲＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（テロメレース）が同定されている。活
性に必要なサブユニットとしてテロメアＤＮＡ配列に相
補的な配列を含む鋳型ＲＮＡ（ヒトではｈＴＲ）と、こ
れを基にしてテロメアＤＮＡの一本鎖を延長するＤＮＡ
ポリメラーゼサブユニット（ヒトではｈＴＥＲＴ）から
成る逆転写酵素の一種である。動物細胞ではイン・ビト
ロでのヒト細胞の不死化過程におけるテロメレースの活
性の変化が調べられており、癌遺伝子を導入された培養
細胞の継代初期にはテロメレース活性は検出されなかっ
たが、継代後期に出現した無限増殖能を獲得した細胞集
団において、テロメレース活性が検出されることが明ら
かになった（Counter, EMBO J, 11, 1921, 1992）。
て、テロメア配列を合成・伸長させるＲＮＡ依存性ＤＮ
Ａポリメラーゼ（テロメレース）が同定されている。活
性に必要なサブユニットとしてテロメアＤＮＡ配列に相
補的な配列を含む鋳型ＲＮＡ（ヒトではｈＴＲ）と、こ
れを基にしてテロメアＤＮＡの一本鎖を延長するＤＮＡ
ポリメラーゼサブユニット（ヒトではｈＴＥＲＴ）から
成る逆転写酵素の一種である。動物細胞ではイン・ビト
ロでのヒト細胞の不死化過程におけるテロメレースの活
性の変化が調べられており、癌遺伝子を導入された培養
細胞の継代初期にはテロメレース活性は検出されなかっ
たが、継代後期に出現した無限増殖能を獲得した細胞集
団において、テロメレース活性が検出されることが明ら
かになった（Counter, EMBO J, 11, 1921, 1992）。
【０００７】また、実際のヒト癌細胞のほとんどにテロ
メレース活性が検出される一方で、多くの正常細胞では
テロメレース活性は検出されない（Autexier and Greid
er,Trends Biochem.Sci, 21, 387, 1996）。さらに、ヒ
ト子宮頚癌由来Ｈｅｌａ細胞においてｈＴＲのアンチセ
ンスＤＮＡを発現させることでテロメレース活性を低下
させると、その細胞は何回か分裂した後、死滅した（Fe
ng et al., Science, 269, 1236, 1995）。これらのこ
とから、ヒト癌細胞はその成立過程においてテロメレー
ス活性の発現によりテロメア配列の短縮化を免れ、無限
増殖能を獲得するのではないかと推測されている。
メレース活性が検出される一方で、多くの正常細胞では
テロメレース活性は検出されない（Autexier and Greid
er,Trends Biochem.Sci, 21, 387, 1996）。さらに、ヒ
ト子宮頚癌由来Ｈｅｌａ細胞においてｈＴＲのアンチセ
ンスＤＮＡを発現させることでテロメレース活性を低下
させると、その細胞は何回か分裂した後、死滅した（Fe
ng et al., Science, 269, 1236, 1995）。これらのこ
とから、ヒト癌細胞はその成立過程においてテロメレー
ス活性の発現によりテロメア配列の短縮化を免れ、無限
増殖能を獲得するのではないかと推測されている。
【０００８】以上述べたように、ヒト癌の発癌過程やヒ
ト癌細胞の悪性形質維持へのテロメレースの関わりが強
く疑われており、その阻害剤は癌細胞の無限増殖能を失
わしめる新しい抗癌剤になると期待されている。そこで
テロメレース阻害剤を発見するためのテロメレース活性
測定法の開発が求められている。
ト癌細胞の悪性形質維持へのテロメレースの関わりが強
く疑われており、その阻害剤は癌細胞の無限増殖能を失
わしめる新しい抗癌剤になると期待されている。そこで
テロメレース阻害剤を発見するためのテロメレース活性
測定法の開発が求められている。
【０００９】ヒト・テロメレース活性の測定法として
は、ヒト癌細胞抽出物や部分精製したテロメレースに対
し、基質となるヒトのテロメア配列TTAGGGを数単位繰返
したＤＮＡ配列の一本鎖オリゴヌクレオチド、デオキシ
チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシアデノシン三
リン酸（ｄＡＴＰ）、及び32Ｐ標識デオキシグアノシン
三リン酸（ｄＧＴＰ）を加え保温した後、TTAGGGの繰返
し配列が数回〜数百回にわたって合成・付加された様々
な長さの一本鎖ＤＮＡ生成物（ヒト・テロメレース反応
産物）をポリアクリルアミド電気泳動にて直接的に検出
・解析する方法がある（Morin GB, Cell, 59, 521, 198
9）。しかし、この方法では高放射活性の3 2Ｐ標識ｄＧ
ＴＰを使用し、電気泳動ゲルを長期にわたってＸ線フィ
ルムに露光する必要があるなど大変煩雑であるため阻害
剤の評価法、特に多検体スクリーニング法としては適さ
ない。
は、ヒト癌細胞抽出物や部分精製したテロメレースに対
し、基質となるヒトのテロメア配列TTAGGGを数単位繰返
したＤＮＡ配列の一本鎖オリゴヌクレオチド、デオキシ
チミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシアデノシン三
リン酸（ｄＡＴＰ）、及び32Ｐ標識デオキシグアノシン
三リン酸（ｄＧＴＰ）を加え保温した後、TTAGGGの繰返
し配列が数回〜数百回にわたって合成・付加された様々
な長さの一本鎖ＤＮＡ生成物（ヒト・テロメレース反応
産物）をポリアクリルアミド電気泳動にて直接的に検出
・解析する方法がある（Morin GB, Cell, 59, 521, 198
9）。しかし、この方法では高放射活性の3 2Ｐ標識ｄＧ
ＴＰを使用し、電気泳動ゲルを長期にわたってＸ線フィ
ルムに露光する必要があるなど大変煩雑であるため阻害
剤の評価法、特に多検体スクリーニング法としては適さ
ない。
【００１０】その後、上記方法によりイン・ビトロでヒ
ト・テロメレースが合成したテロメレース反応産物をpo
lymerase chain reaction（以下ＰＣＲ）を用いて増幅
できることが示されている（Morin GB, Nature, 353, 4
54, 1991）。この知見に基づき、ＰＣＲを応用したスト
レッチＰＣＲ（Tatematsu et al., Oncogene, 13, 226
5, 1996）やテロメリック・リピート・アンプリフィケ
イション・プロトコール（以下ＴＲＡＰ）（Kim et a
l., Science, 353, 454, 1994）が開発され、ヒト・テ
ロメレース活性の迅速・高感度な測定が可能になった。
これらの方法はヒト・テロメレースと細胞増殖、分化、
老化、癌などの関わりといった分子生物学・細胞生物学
的課題の解析手段としてだけでなく、ヒト・テロメレー
ス阻害剤の薬理学的評価法としても応用され、現在では
いくつかの阻害剤が見いだされている（Hayakawa et a
l., Biochemistry, 38, 11501, 1999, Naasani et al.,
CancerRes., 59, 4004,1999, Perry et al., J. Med.
Chem., 41, 3253, 1998）。
ト・テロメレースが合成したテロメレース反応産物をpo
lymerase chain reaction（以下ＰＣＲ）を用いて増幅
できることが示されている（Morin GB, Nature, 353, 4
54, 1991）。この知見に基づき、ＰＣＲを応用したスト
レッチＰＣＲ（Tatematsu et al., Oncogene, 13, 226
5, 1996）やテロメリック・リピート・アンプリフィケ
イション・プロトコール（以下ＴＲＡＰ）（Kim et a
l., Science, 353, 454, 1994）が開発され、ヒト・テ
ロメレース活性の迅速・高感度な測定が可能になった。
これらの方法はヒト・テロメレースと細胞増殖、分化、
老化、癌などの関わりといった分子生物学・細胞生物学
的課題の解析手段としてだけでなく、ヒト・テロメレー
ス阻害剤の薬理学的評価法としても応用され、現在では
いくつかの阻害剤が見いだされている（Hayakawa et a
l., Biochemistry, 38, 11501, 1999, Naasani et al.,
CancerRes., 59, 4004,1999, Perry et al., J. Med.
Chem., 41, 3253, 1998）。
【００１１】このように試験管内での酵素阻害活性を指
標として見いだされたヒト・テロメレース阻害剤につい
て、実際にヒト生細胞内においてもテロメレースを阻害
できるかどうかを知ることは重要である。例えば、試験
管内ではテロメレース阻害活性が確認されている、ある
化合物において、次に癌細胞の増殖抑制のような薬理学
的効果が認められたとき、それが細胞内テロメレースの
阻害に基づくものかどうかを確認することは、その化合
物の抗癌剤としての薬効及び作用機序を証明する上で重
要である。また、阻害様式が可逆性のテロメレース阻害
剤の場合は、細胞に投与したのち細胞からテロメレース
を抽出・活性測定する方法では、抽出段階で希釈などに
より阻害が解除されてしまうと予想される。こうした可
逆性阻害剤を評価するときは、生細胞内のテロメレース
活性の変化を追跡するしかない。
標として見いだされたヒト・テロメレース阻害剤につい
て、実際にヒト生細胞内においてもテロメレースを阻害
できるかどうかを知ることは重要である。例えば、試験
管内ではテロメレース阻害活性が確認されている、ある
化合物において、次に癌細胞の増殖抑制のような薬理学
的効果が認められたとき、それが細胞内テロメレースの
阻害に基づくものかどうかを確認することは、その化合
物の抗癌剤としての薬効及び作用機序を証明する上で重
要である。また、阻害様式が可逆性のテロメレース阻害
剤の場合は、細胞に投与したのち細胞からテロメレース
を抽出・活性測定する方法では、抽出段階で希釈などに
より阻害が解除されてしまうと予想される。こうした可
逆性阻害剤を評価するときは、生細胞内のテロメレース
活性の変化を追跡するしかない。
【００１２】生きたヒト細胞内のテロメレース活性を測
定する方法はすでに報告があり、大屋敷らのin situ
ＴＲＡＰ法（Ohyashiki K et al., Cancer. Res., 57,
2100,1997）、並びにNaasaniらの方法（Naasani I. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 249, 391, 199
8）がそれである。しかし、これらの方法にはいくつか
の難点がある。例えばin situ ＴＲＡＰ法は、プレパ
ラート上で培養したヒト生細胞に蛍光標識したヒト・テ
ロメレースの伸長用オリゴＤＮＡプライマーを投与し、
細胞内でテロメレース反応を行った後固定化し、プレパ
ラートのままＴＲＡＰ法に供する。この方法ではＰＣＲ
の際プレパラートを用いるため処理量が限られており、
また細胞内の全蛍光シグナルを検出した画像が結果とな
るためバックグランドが高く、定量性も低い。一方、Na
asaniらの方法はヒト細胞にヒト・テロメレースの伸長
用オリゴＤＮＡプライマーを導入し、生きた細胞内でテ
ロメレース反応を行い、後にテロメレース反応産物を抽
出して通常のＴＲＡＰ法により増幅・定量するものであ
る。この方法ではＰＣＲ以降の工程は従来のＴＲＡＰ法
と同様であるため、処理量や結果の定量性もＴＲＡＰ法
と同等である。しかし、テロメレースの伸長用プライマ
ー導入の際、ストレプトリシンＯという薬剤により生細
胞を一時的・強制的に透過性にしているため、この工程
において細胞にダメージを与えている可能性を否定でき
ない。またストレプトリシンＯによる生細胞の透過処理
工程はこの薬剤の品質に左右される為、再現が難しい場
合があり、安定な測定法とは言い難い。そこで簡便かつ
安定で定量性にも優れた生細胞内テロメレース活性測定
法の開発が望まれている。
定する方法はすでに報告があり、大屋敷らのin situ
ＴＲＡＰ法（Ohyashiki K et al., Cancer. Res., 57,
2100,1997）、並びにNaasaniらの方法（Naasani I. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun, 249, 391, 199
8）がそれである。しかし、これらの方法にはいくつか
の難点がある。例えばin situ ＴＲＡＰ法は、プレパ
ラート上で培養したヒト生細胞に蛍光標識したヒト・テ
ロメレースの伸長用オリゴＤＮＡプライマーを投与し、
細胞内でテロメレース反応を行った後固定化し、プレパ
ラートのままＴＲＡＰ法に供する。この方法ではＰＣＲ
の際プレパラートを用いるため処理量が限られており、
また細胞内の全蛍光シグナルを検出した画像が結果とな
るためバックグランドが高く、定量性も低い。一方、Na
asaniらの方法はヒト細胞にヒト・テロメレースの伸長
用オリゴＤＮＡプライマーを導入し、生きた細胞内でテ
ロメレース反応を行い、後にテロメレース反応産物を抽
出して通常のＴＲＡＰ法により増幅・定量するものであ
る。この方法ではＰＣＲ以降の工程は従来のＴＲＡＰ法
と同様であるため、処理量や結果の定量性もＴＲＡＰ法
と同等である。しかし、テロメレースの伸長用プライマ
ー導入の際、ストレプトリシンＯという薬剤により生細
胞を一時的・強制的に透過性にしているため、この工程
において細胞にダメージを与えている可能性を否定でき
ない。またストレプトリシンＯによる生細胞の透過処理
工程はこの薬剤の品質に左右される為、再現が難しい場
合があり、安定な測定法とは言い難い。そこで簡便かつ
安定で定量性にも優れた生細胞内テロメレース活性測定
法の開発が望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、生き
た細胞内のテロメレース活性、特に生きたヒト・細胞内
のヒト・テロメレース活性を定量性よく簡便かつ安定に
測定できる方法を提供するものである。
た細胞内のテロメレース活性、特に生きたヒト・細胞内
のヒト・テロメレース活性を定量性よく簡便かつ安定に
測定できる方法を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意努力した結果、テロメレースの基質とな
る伸長用オリゴＤＮＡプライマーを生きた細胞に導入す
る際、カチオン脂質などのキャリアを用いた「リポフェ
クション」による導入法が簡便・安定で細胞にも穏やか
であることを見いだした。この工程とストレッチＰＣＲ
法を組み合わせることで、生きた細胞内のテロメレース
活性を測定できることを見出し、本発明を完成させるに
至った。
解決すべく鋭意努力した結果、テロメレースの基質とな
る伸長用オリゴＤＮＡプライマーを生きた細胞に導入す
る際、カチオン脂質などのキャリアを用いた「リポフェ
クション」による導入法が簡便・安定で細胞にも穏やか
であることを見いだした。この工程とストレッチＰＣＲ
法を組み合わせることで、生きた細胞内のテロメレース
活性を測定できることを見出し、本発明を完成させるに
至った。
【００１５】即ち本発明は、以下の通りである。 （１）以下の工程を含む、生きた細胞内のヒト・テロメ
レース活性の測定方法である。 （Ａ）５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト・テ
ロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末端側
合成開始配列とを含むヒト・テロメレース伸長用オリゴ
ＤＮＡプライマーを、カチオン脂質キャリアにより生き
た細胞に導入し、細胞内テロメレースによりヒト・テロ
メア配列TTAGGGの繰り返し配列からなるＤＮＡ配列を前
記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの
３’末端に伸長させてヒト・テロメレース反応産物を調
製する工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたヒト・テ
ロメレース反応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロ
メレース反応産物と、センス・プライマーとしての前記
ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、
アンチセンス・プライマーとしての、第１のタグ配列と
相補性がなく５’末端側にある第２のタグ配列及びヒト
・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰返し配列からなる
３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮ
Ａプライマーとを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチ
ＰＣＲ法により増幅してＰＣＲ産物を得る工程、（Ｃ）
前記（Ｂ）工程で得られたＰＣＲ産物を定量する工程。 （２）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列か
らなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰り返し配
列からなる（１）の測定方法。 （３）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列か
らなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGを少なくとも
３回繰り返した配列からなる（１）又は（２）の測定方
法。 （４）前記アンチセンス・オリゴＤＮＡプライマーは、
ヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAを少なくとも３回
繰り返した配列からなるＤＮＡ配列を含むオリゴＤＮＡ
プライマーである（１）〜（３）のいずれかの測定方
法。 （５）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーがｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTTGGGG
TTGGGGTTG-3'）（配列番号１）であり、アンチセンス・
オリゴＤＮＡプライマーがｐＴＡＧγ（5'-CAGGAAACAGC
TATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番号２）で
ある（１）〜（４）のいずれかの測定方法。 （６）前記生きた細胞は、生きたヒト細胞であることを
特徴とする（１）〜（５）のいずれかのヒト・テロメレ
ース活性測定方法。 （７）上記（１）〜（６）のいずれかのテロメレース活
性測定方法を用いた悪性新生物性疾患、細胞増殖性疾患
または炎症の判定方法。 （８）５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト・テ
ロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末端側
合成開始配列とを含み、ヒト・テロメア配列TTAGGGの繰
り返し配列からなるＤＮＡ配列を３’末端に伸長させる
ためのヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマ
ー。 （９）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列か
らなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰り返し配
列からなる（８）のヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマー。 （１０）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列
からなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGを少なくと
も３回繰り返した配列からなる（８）のヒト・テロメレ
ース伸長用オリゴＤＮＡプライマー。 （１１）上記（８）〜（１０）のいずれかのヒト・テロ
メレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、前記第１の
タグ配列と相補性がなく５’末端側にある第２のタグ配
列及びヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰返し配
列からなる３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・
オリゴＤＮＡプライマーとのプライマーセット。 （１２）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーがｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTTGG
GGTTGGGGTTG-3'）（配列番号１）であり、アンチセンス
・オリゴＤＮＡプライマーがｐＴＡＧγ（5'-CAGGAAACA
GCTATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番号２）
である（１１）のプライマーセット。 （１３）下記工程を含む、テロメレース阻害剤の製造方
法。（Ｄ）上記（１）〜（６）のいずれかのヒト・テロ
メレース活性測定方法を用いて、テロメレース阻害活性
を有する物質をスクリーニングする工程、（Ｅ）前記
（Ｄ）工程で得られるテロメレース阻害活性を有する物
質を用いてテロメレース阻害剤を製剤化する工程。 （１４）テロメレース阻害活性を有する物質が細胞内に
投与された後に活性を発現するものであることを特徴と
する（１３）のテロメレース阻害剤の製造方法。 （１５）テロメレース阻害活性を有する物質を用いて、
テロメレース阻害剤を製造する方法において、上記
（１）〜（６）のいずれかのヒト・テロメレース活性測
定方法を用いて、テロメレース阻害活性を測定し、テロ
メレース阻害活性を確認する工程を含むテロメレース阻
害剤の製造方法。 （１６）テロメレース阻害活性を有する物質が細胞内に
投与された後に活性を発現するものであることを特徴と
する（１５）のテロメレース阻害剤の製造方法。
レース活性の測定方法である。 （Ａ）５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト・テ
ロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末端側
合成開始配列とを含むヒト・テロメレース伸長用オリゴ
ＤＮＡプライマーを、カチオン脂質キャリアにより生き
た細胞に導入し、細胞内テロメレースによりヒト・テロ
メア配列TTAGGGの繰り返し配列からなるＤＮＡ配列を前
記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの
３’末端に伸長させてヒト・テロメレース反応産物を調
製する工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたヒト・テ
ロメレース反応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロ
メレース反応産物と、センス・プライマーとしての前記
ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、
アンチセンス・プライマーとしての、第１のタグ配列と
相補性がなく５’末端側にある第２のタグ配列及びヒト
・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰返し配列からなる
３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮ
Ａプライマーとを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチ
ＰＣＲ法により増幅してＰＣＲ産物を得る工程、（Ｃ）
前記（Ｂ）工程で得られたＰＣＲ産物を定量する工程。 （２）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列か
らなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰り返し配
列からなる（１）の測定方法。 （３）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列か
らなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGを少なくとも
３回繰り返した配列からなる（１）又は（２）の測定方
法。 （４）前記アンチセンス・オリゴＤＮＡプライマーは、
ヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAを少なくとも３回
繰り返した配列からなるＤＮＡ配列を含むオリゴＤＮＡ
プライマーである（１）〜（３）のいずれかの測定方
法。 （５）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーがｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTTGGGG
TTGGGGTTG-3'）（配列番号１）であり、アンチセンス・
オリゴＤＮＡプライマーがｐＴＡＧγ（5'-CAGGAAACAGC
TATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番号２）で
ある（１）〜（４）のいずれかの測定方法。 （６）前記生きた細胞は、生きたヒト細胞であることを
特徴とする（１）〜（５）のいずれかのヒト・テロメレ
ース活性測定方法。 （７）上記（１）〜（６）のいずれかのテロメレース活
性測定方法を用いた悪性新生物性疾患、細胞増殖性疾患
または炎症の判定方法。 （８）５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト・テ
ロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末端側
合成開始配列とを含み、ヒト・テロメア配列TTAGGGの繰
り返し配列からなるＤＮＡ配列を３’末端に伸長させる
ためのヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマ
ー。 （９）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプラ
イマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列か
らなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰り返し配
列からなる（８）のヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマー。 （１０）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列
からなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGを少なくと
も３回繰り返した配列からなる（８）のヒト・テロメレ
ース伸長用オリゴＤＮＡプライマー。 （１１）上記（８）〜（１０）のいずれかのヒト・テロ
メレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、前記第１の
タグ配列と相補性がなく５’末端側にある第２のタグ配
列及びヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰返し配
列からなる３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・
オリゴＤＮＡプライマーとのプライマーセット。 （１２）前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーがｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTTGG
GGTTGGGGTTG-3'）（配列番号１）であり、アンチセンス
・オリゴＤＮＡプライマーがｐＴＡＧγ（5'-CAGGAAACA
GCTATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番号２）
である（１１）のプライマーセット。 （１３）下記工程を含む、テロメレース阻害剤の製造方
法。（Ｄ）上記（１）〜（６）のいずれかのヒト・テロ
メレース活性測定方法を用いて、テロメレース阻害活性
を有する物質をスクリーニングする工程、（Ｅ）前記
（Ｄ）工程で得られるテロメレース阻害活性を有する物
質を用いてテロメレース阻害剤を製剤化する工程。 （１４）テロメレース阻害活性を有する物質が細胞内に
投与された後に活性を発現するものであることを特徴と
する（１３）のテロメレース阻害剤の製造方法。 （１５）テロメレース阻害活性を有する物質を用いて、
テロメレース阻害剤を製造する方法において、上記
（１）〜（６）のいずれかのヒト・テロメレース活性測
定方法を用いて、テロメレース阻害活性を測定し、テロ
メレース阻害活性を確認する工程を含むテロメレース阻
害剤の製造方法。 （１６）テロメレース阻害活性を有する物質が細胞内に
投与された後に活性を発現するものであることを特徴と
する（１５）のテロメレース阻害剤の製造方法。
【００１６】
【発明の実施の形態】＜１＞本発明のヒト・テロメレー
ス活性測定方法 本発明において、テロメレースとはテロメア配列の繰返
し配列を伸長させる機能を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼのことである。テロメレースは、ヒトを含む
哺乳類動物などの多細胞真核生物、あるいは酵母や原生
動物などの単細胞真核生物由来のものが知られている
が、本発明の方法は、これらのテロメレースの内、ヒト
・テロメレースの細胞内活性測定に好適な方法である。
ス活性測定方法 本発明において、テロメレースとはテロメア配列の繰返
し配列を伸長させる機能を有するＲＮＡ依存性ＤＮＡポ
リメラーゼのことである。テロメレースは、ヒトを含む
哺乳類動物などの多細胞真核生物、あるいは酵母や原生
動物などの単細胞真核生物由来のものが知られている
が、本発明の方法は、これらのテロメレースの内、ヒト
・テロメレースの細胞内活性測定に好適な方法である。
【００１７】以下、本発明のヒト・テロメレース活性測
定方法を工程ごとに具体的に説明する。 （１）被検細胞の培養 まず、前記（Ａ）工程の前に被検細胞の培養を行う。
定方法を工程ごとに具体的に説明する。 （１）被検細胞の培養 まず、前記（Ａ）工程の前に被検細胞の培養を行う。
【００１８】被検細胞は、マウス、ラット、ウサギ等の
生きた動物細胞が挙げられるが、好ましくは生きたヒト
細胞であり、いずれもテロメレース活性陽性であれば特
に限定されない。
生きた動物細胞が挙げられるが、好ましくは生きたヒト
細胞であり、いずれもテロメレース活性陽性であれば特
に限定されない。
【００１９】被検細胞は、実験前日に動物血清や抗生物
質を含む適切な培養液に適切な細胞濃度で懸濁して、培
養用ディッシュまたはプレートに播き込む。多検体の評
価にあたっては９６穴プレートなどを用いるのが望まし
い。
質を含む適切な培養液に適切な細胞濃度で懸濁して、培
養用ディッシュまたはプレートに播き込む。多検体の評
価にあたっては９６穴プレートなどを用いるのが望まし
い。
【００２０】血球由来のヒト細胞のように、浮遊性の細
胞の場合はそのまま浮遊培養を行うが、接着性のヒト細
胞の場合はディッシュまたはプレートに接着・伸展する
まで適切な時間、培養を続ける。その際、接着能力が弱
い接着性ヒト細胞については、接着度を高めるためポリ
リジンやコラーゲン、フィブロネクチンなどでディッシ
ュやプレートをあらかじめコートしておくことも好まし
い。 （２）Ａ工程（ヒト・テロメレース伸長用プライマーの
被検細胞への導入とテロメレース伸長反応） Ａ工程は、５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト
・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末
端側合成開始配列とを含むヒト・テロメレース伸長用オ
リゴＤＮＡプライマーを、カチオン脂質キャリアにより
生きた細胞に導入し、細胞内テロメレースによりヒト・
テロメア配列TTAGGGの繰り返し配列からなるＤＮＡ配列
を前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマ
ーの３’末端に伸長させてヒト・テロメレース反応産物
を調製する工程である。
胞の場合はそのまま浮遊培養を行うが、接着性のヒト細
胞の場合はディッシュまたはプレートに接着・伸展する
まで適切な時間、培養を続ける。その際、接着能力が弱
い接着性ヒト細胞については、接着度を高めるためポリ
リジンやコラーゲン、フィブロネクチンなどでディッシ
ュやプレートをあらかじめコートしておくことも好まし
い。 （２）Ａ工程（ヒト・テロメレース伸長用プライマーの
被検細胞への導入とテロメレース伸長反応） Ａ工程は、５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト
・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末
端側合成開始配列とを含むヒト・テロメレース伸長用オ
リゴＤＮＡプライマーを、カチオン脂質キャリアにより
生きた細胞に導入し、細胞内テロメレースによりヒト・
テロメア配列TTAGGGの繰り返し配列からなるＤＮＡ配列
を前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマ
ーの３’末端に伸長させてヒト・テロメレース反応産物
を調製する工程である。
【００２１】本発明において「タグ配列」とは、後のＰ
ＣＲの際にテロメレース反応産物の５’末端または３’
末端から増幅させることのできる配列であれば制限され
ず、上記伸長用オリゴＤＮＡプライマーの５’末端にあ
る「第１のタグ配列」としては、例えば、GTAAAACGACGG
CCAGT（配列番号１に示すうち塩基番号１〜１７）が挙
げられる。
ＣＲの際にテロメレース反応産物の５’末端または３’
末端から増幅させることのできる配列であれば制限され
ず、上記伸長用オリゴＤＮＡプライマーの５’末端にあ
る「第１のタグ配列」としては、例えば、GTAAAACGACGG
CCAGT（配列番号１に示すうち塩基番号１〜１７）が挙
げられる。
【００２２】また、上記伸長用オリゴＤＮＡプライマー
の３’末端側合成開始配列は、ヒト・テロメレースが認
識しテロメア配列を伸長させる配列であれば何でも良
く、ヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からな
り、テロメア配列の繰返し配列を３’末端に伸長させる
配列であれば特に制限はない。本発明においては、前記
３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰返し配列からな
ることが好ましく、更にはTTGGGGを少なくとも３回繰返
した配列からなることが好ましい。
の３’末端側合成開始配列は、ヒト・テロメレースが認
識しテロメア配列を伸長させる配列であれば何でも良
く、ヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からな
り、テロメア配列の繰返し配列を３’末端に伸長させる
配列であれば特に制限はない。本発明においては、前記
３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰返し配列からな
ることが好ましく、更にはTTGGGGを少なくとも３回繰返
した配列からなることが好ましい。
【００２３】TTGGGGの繰返し配列とは、TTGGGGを数回繰
り返した配列であり、３’末端はTTGGGGの一部であって
も良い。
り返した配列であり、３’末端はTTGGGGの一部であって
も良い。
【００２４】上述の５’末端にある第１のタグ配列と
３’末端側合成開始配列とを有するヒト・テロメレース
伸長用オリゴＤＮＡプライマーとして、具体的にはｐＴ
Ｇ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-
3'）（配列番号１）が好ましく用いられる。
３’末端側合成開始配列とを有するヒト・テロメレース
伸長用オリゴＤＮＡプライマーとして、具体的にはｐＴ
Ｇ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG-
3'）（配列番号１）が好ましく用いられる。
【００２５】また、用いるヒト・テロメレース伸長用オ
リゴＤＮＡプライマーについては、例えばその５’末端
をビオチンやジゴキシゲニンなどで標識しておけば、の
ちにそれらに対する特異的レセプター（例えばビオチン
の場合はアビジン）を用いて細胞由来の挟雑物との分離
を容易にすることができることから好ましい。
リゴＤＮＡプライマーについては、例えばその５’末端
をビオチンやジゴキシゲニンなどで標識しておけば、の
ちにそれらに対する特異的レセプター（例えばビオチン
の場合はアビジン）を用いて細胞由来の挟雑物との分離
を容易にすることができることから好ましい。
【００２６】また、ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマーの結合様式をホスホロチオエート結合な
どにすることも好ましく、該結合のオリゴＤＮＡプライ
マーを用いれば、細胞内のＤＮＡ分解酵素に対し耐性に
なるため、細胞内テロメレース反応産物の回収率が増
加、検出が容易になる。
ＮＡプライマーの結合様式をホスホロチオエート結合な
どにすることも好ましく、該結合のオリゴＤＮＡプライ
マーを用いれば、細胞内のＤＮＡ分解酵素に対し耐性に
なるため、細胞内テロメレース反応産物の回収率が増
加、検出が容易になる。
【００２７】本発明の伸長用オリゴＤＮＡプライマー
は、通常の化学合成法により製造することができる。
は、通常の化学合成法により製造することができる。
【００２８】本発明において、生きた被検細胞へのヒト
・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの導入
は、リポフェクション法により行う。その為の試薬とし
ては、カチオン脂質キャリアが用いられ、具体的にはリ
ポフェクチン、リポフェクトアミン（以上ライフテック
オリエンタル社）、スーパーフェクト、エフェクテン
（以上キアゲン社）、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイア
グノティクス社）などが市販されているが、細胞に一本
鎖オリゴＤＮＡを導入できるリポフェクション用試薬な
らこの限りではない。
・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの導入
は、リポフェクション法により行う。その為の試薬とし
ては、カチオン脂質キャリアが用いられ、具体的にはリ
ポフェクチン、リポフェクトアミン（以上ライフテック
オリエンタル社）、スーパーフェクト、エフェクテン
（以上キアゲン社）、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイア
グノティクス社）などが市販されているが、細胞に一本
鎖オリゴＤＮＡを導入できるリポフェクション用試薬な
らこの限りではない。
【００２９】ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーの導入効率を高めたり、リポフェクションによ
る細胞へのダメージを抑えるために、あらかじめ細胞を
洗浄したり無血清培地に交換するなどの処理を行っても
良い。
ライマーの導入効率を高めたり、リポフェクションによ
る細胞へのダメージを抑えるために、あらかじめ細胞を
洗浄したり無血清培地に交換するなどの処理を行っても
良い。
【００３０】被検細胞への導入方法としては、例えば以
下の方法により行える。
下の方法により行える。
【００３１】上述のリポフェクション試薬とヒト・テロ
メレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの複合体を通常
の方法により作成し、これを被検ヒト細胞に加える。そ
のまま一定時間培養を継続し細胞内テロメレース反応を
行ってヒト・テロメレース反応産物を調製するが、用い
るリポフェクション試薬によっては、培地中のリポフェ
クション試薬とヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡ
プライマーの複合体の除去を行っても良い。
メレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの複合体を通常
の方法により作成し、これを被検ヒト細胞に加える。そ
のまま一定時間培養を継続し細胞内テロメレース反応を
行ってヒト・テロメレース反応産物を調製するが、用い
るリポフェクション試薬によっては、培地中のリポフェ
クション試薬とヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡ
プライマーの複合体の除去を行っても良い。
【００３２】これらの操作は全てリポフェクション試薬
の説明書に従うが、条件を至適化するため工程を適宜改
変しても良い。 （３）Ｂ工程（細胞内テロメレース反応産物の抽出とテ
ロメレース反応産物のストレッチＰＣＲによる増幅） Ｂ工程は、前記Ａ工程で得られたヒト・テロメレース反
応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロメレース反応
産物と、センス・プライマーとしての前記ヒト・テロメ
レース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、アンチセンス
・プライマーとしての、第１のタグ配列と相補性がなく
５’末端側にある第２のタグ配列及びヒト・テロメア配
列の相補配列CCCTAAの繰返し配列からなる３’末端側Ｄ
ＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮＡプライマー
とを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチＰＣＲ法によ
り増幅してＰＣＲ産物を得る工程である。
の説明書に従うが、条件を至適化するため工程を適宜改
変しても良い。 （３）Ｂ工程（細胞内テロメレース反応産物の抽出とテ
ロメレース反応産物のストレッチＰＣＲによる増幅） Ｂ工程は、前記Ａ工程で得られたヒト・テロメレース反
応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロメレース反応
産物と、センス・プライマーとしての前記ヒト・テロメ
レース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、アンチセンス
・プライマーとしての、第１のタグ配列と相補性がなく
５’末端側にある第２のタグ配列及びヒト・テロメア配
列の相補配列CCCTAAの繰返し配列からなる３’末端側Ｄ
ＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮＡプライマー
とを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチＰＣＲ法によ
り増幅してＰＣＲ産物を得る工程である。
【００３３】具体的には以下の通りである。
【００３４】上記（２）の後、細胞を可溶化して細胞内
テロメレース反応産物を抽出・回収する。その方法とし
ては細胞内テロメレース反応産物だけを選択的に抽出で
きるものが望ましいが、例えばＨｉｒｔの方法（Hirt
B., J. Mol. Biol., 26, 365,1967）なら、細胞内の比
較的低分子のＤＮＡだけを可溶性成分として抽出し、染
色体ＤＮＡのような高分子ＤＮＡは不溶物として除去す
ることができる。
テロメレース反応産物を抽出・回収する。その方法とし
ては細胞内テロメレース反応産物だけを選択的に抽出で
きるものが望ましいが、例えばＨｉｒｔの方法（Hirt
B., J. Mol. Biol., 26, 365,1967）なら、細胞内の比
較的低分子のＤＮＡだけを可溶性成分として抽出し、染
色体ＤＮＡのような高分子ＤＮＡは不溶物として除去す
ることができる。
【００３５】これを必要に応じてフェノール／クロロ
フォルム抽出及び／またはエタノール沈澱といった通常
の方法、一本鎖オリゴＤＮＡプライマーの相補配列を
利用した核酸ハイブリダイゼション、ビオチンやジゴ
キシゲニンで標識されたヒト・テロメレース伸長用プラ
イマーの場合は、それぞれアビジンや抗ジゴキシゲニン
抗体などの適当なレセプターを用いた特異的分離、抗
ＤＮＡ抗体を用いた分離、などによって細胞内テロメレ
ース反応産物を精製する。
フォルム抽出及び／またはエタノール沈澱といった通常
の方法、一本鎖オリゴＤＮＡプライマーの相補配列を
利用した核酸ハイブリダイゼション、ビオチンやジゴ
キシゲニンで標識されたヒト・テロメレース伸長用プラ
イマーの場合は、それぞれアビジンや抗ジゴキシゲニン
抗体などの適当なレセプターを用いた特異的分離、抗
ＤＮＡ抗体を用いた分離、などによって細胞内テロメレ
ース反応産物を精製する。
【００３６】また、テロメレース伸長反応を行う際、各
検体についてヒト・テロメレース伸長用ＤＮＡプライマ
ーを含まないで同様に操作した陰性対照群を設定するこ
とにより、染色体ＤＮＡの混入などによる疑陽性反応を
除外する判断を下すことが可能となるので、そのような
工程を含むことは本発明の望ましい態様である。
検体についてヒト・テロメレース伸長用ＤＮＡプライマ
ーを含まないで同様に操作した陰性対照群を設定するこ
とにより、染色体ＤＮＡの混入などによる疑陽性反応を
除外する判断を下すことが可能となるので、そのような
工程を含むことは本発明の望ましい態様である。
【００３７】その後、下記の方法によりＰＣＲ増幅を行
う。
う。
【００３８】上記（２）に示した工程において、被検ヒ
ト細胞内にヒト・テロメレースが存在すれば、ヒト・テ
ロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの３’末端か
らヒト・テロメア配列の繰返し配列が合成・伸長され
る。しかし、ヒト・テロメレースを発現していると言わ
れるヒト癌細胞においても、その酵素活性は見かけ上と
ても低いものなので、ＰＣＲ法を用いてテロメレース反
応産物を検出可能な量に増幅することが必要となる。
ト細胞内にヒト・テロメレースが存在すれば、ヒト・テ
ロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの３’末端か
らヒト・テロメア配列の繰返し配列が合成・伸長され
る。しかし、ヒト・テロメレースを発現していると言わ
れるヒト癌細胞においても、その酵素活性は見かけ上と
ても低いものなので、ＰＣＲ法を用いてテロメレース反
応産物を検出可能な量に増幅することが必要となる。
【００３９】ＰＣＲ法による増幅に用いられるセンス・
プライマーとしては、前記のヒト・テロメレース伸長用
オリゴＤＮＡプライマーを用いる。
プライマーとしては、前記のヒト・テロメレース伸長用
オリゴＤＮＡプライマーを用いる。
【００４０】そして、アンチセンス・プライマーとして
は、前記伸長用オリゴＤＮＡプライマーとはアニールせ
ず、ヒト・テロメレースにより産生したヒト・テロメア
配列TTAGGGの繰返し配列にはアニールするものが用いら
れる。具体的には、例えば、５’末端側にある第２のタ
グ配列、及びヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰
返し配列からなる３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセ
ンス・オリゴＤＮＡプライマーを用いる。
は、前記伸長用オリゴＤＮＡプライマーとはアニールせ
ず、ヒト・テロメレースにより産生したヒト・テロメア
配列TTAGGGの繰返し配列にはアニールするものが用いら
れる。具体的には、例えば、５’末端側にある第２のタ
グ配列、及びヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰
返し配列からなる３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセ
ンス・オリゴＤＮＡプライマーを用いる。
【００４１】CCCTAAの繰返し配列とは、CCCTAAを数回繰
返した配列であり、３’末端はCCCTAAの一部であっても
良い。特に３’末端がＴであると伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーにアニールしないために好ましい。
返した配列であり、３’末端はCCCTAAの一部であっても
良い。特に３’末端がＴであると伸長用オリゴＤＮＡプ
ライマーにアニールしないために好ましい。
【００４２】上記アンチセンス・オリゴＤＮＡプライマ
ーの５’末端にある「第２のタグ配列」とは、上記第１
のタグ配列と相補性がないものであれば特に制限はな
く、例えば、CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号２に示すう
ち塩基番号１〜１７）が挙げられる。
ーの５’末端にある「第２のタグ配列」とは、上記第１
のタグ配列と相補性がないものであれば特に制限はな
く、例えば、CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号２に示すう
ち塩基番号１〜１７）が挙げられる。
【００４３】アンチセンス・プライマーとして、５’末
端側に第２のタグ配列を有し、ヒト・テロメア配列の相
補配列CCCTAAを少なくとも３回繰り返した配列からなる
ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮＡプライマ
ーが好ましく、具体的にはｐＴＡＧγ（5'-CAGGAAACAGC
TATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番号２）が
より好ましく用いられる。
端側に第２のタグ配列を有し、ヒト・テロメア配列の相
補配列CCCTAAを少なくとも３回繰り返した配列からなる
ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮＡプライマ
ーが好ましく、具体的にはｐＴＡＧγ（5'-CAGGAAACAGC
TATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番号２）が
より好ましく用いられる。
【００４４】本発明におけるアンチセンス・オリゴＤＮ
Ａプライマーは、通常の化学合成法で製造することがで
きる。
Ａプライマーは、通常の化学合成法で製造することがで
きる。
【００４５】本発明におけるＰＣＲ法による増幅は、上
記ヒト・テロメレース産物、上記センス・プライマー及
びアンチセンス・プライマーを用いて通常の方法で行え
ば良い。 （４）Ｃ工程（ＰＣＲ産物の検出） Ｃ工程は、上記Ｂ工程で得られたＰＣＲ産物を測定する
工程である。
記ヒト・テロメレース産物、上記センス・プライマー及
びアンチセンス・プライマーを用いて通常の方法で行え
ば良い。 （４）Ｃ工程（ＰＣＲ産物の検出） Ｃ工程は、上記Ｂ工程で得られたＰＣＲ産物を測定する
工程である。
【００４６】本発明においてＰＣＲ増幅を行う際、後に
検出・測定するために、ＰＣＲ産物の長さや量をＰＣＲ
増幅時に基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸
（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ：以下ｄＮ
ＴＰと総称）のうちいくつかの放射性同位体を適当な割
合で加えてＰＣＲ産物を放射能（ＲＩ）標識することが
出来るが、ジゴキシゲニン、フルオレッセイン、ビオチ
ンといった低分子化合物で標識したｄＮＴＰ（例えばジ
ゴキシゲニン−ｄＵＴＰ）を用いてＰＣＲ産物を標識
（非ＲＩ標識）することが好ましい。また、用いられる
オリゴＤＮＡプライマーの５’末端を３２Ｐ−ＡＴＰ及
びポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化したも
の、または上記低分子化合物で化学修飾したものでＰＣ
Ｒ産物を標識してもよい。これらの標識法は通常の方法
により達成できる。
検出・測定するために、ＰＣＲ産物の長さや量をＰＣＲ
増幅時に基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸
（ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ：以下ｄＮ
ＴＰと総称）のうちいくつかの放射性同位体を適当な割
合で加えてＰＣＲ産物を放射能（ＲＩ）標識することが
出来るが、ジゴキシゲニン、フルオレッセイン、ビオチ
ンといった低分子化合物で標識したｄＮＴＰ（例えばジ
ゴキシゲニン−ｄＵＴＰ）を用いてＰＣＲ産物を標識
（非ＲＩ標識）することが好ましい。また、用いられる
オリゴＤＮＡプライマーの５’末端を３２Ｐ−ＡＴＰ及
びポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化したも
の、または上記低分子化合物で化学修飾したものでＰＣ
Ｒ産物を標識してもよい。これらの標識法は通常の方法
により達成できる。
【００４７】ＲＩ標識されたＰＣＲ産物については、必
要に応じて精製処理を施した後、尿素変性または非変性
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動した後オートラジオ
グラフィやイメージアナライザーにて長さ、量の解析を
行うことができる。
要に応じて精製処理を施した後、尿素変性または非変性
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動した後オートラジオ
グラフィやイメージアナライザーにて長さ、量の解析を
行うことができる。
【００４８】また、非ＲＩ標識のＰＣＲ産物については
電気泳動後、２本鎖ＤＮＡだけを特異的に検出できるサ
イバーグリーンＩ（モレキュラ・プローブス社）などの
蛍光試薬を用いて可視化・定量することが可能である。
また、例えばナイロン膜に転写したＰＣＲ産物を各々の
標識化合物に対するプローブ（例えば抗ジゴキシゲニン
抗体）を用いて可視化し同様に解析することが出来る。
同様に非ＲＩ標識ＰＣＲ産物をＥＬＩＳＡプレートなど
に固定化し、標識化合物に対する特異的抗体（例えば抗
ジゴキシゲニン抗体）を用いたＥＬＩＳＡ法により検出
・定量することも可能である。
電気泳動後、２本鎖ＤＮＡだけを特異的に検出できるサ
イバーグリーンＩ（モレキュラ・プローブス社）などの
蛍光試薬を用いて可視化・定量することが可能である。
また、例えばナイロン膜に転写したＰＣＲ産物を各々の
標識化合物に対するプローブ（例えば抗ジゴキシゲニン
抗体）を用いて可視化し同様に解析することが出来る。
同様に非ＲＩ標識ＰＣＲ産物をＥＬＩＳＡプレートなど
に固定化し、標識化合物に対する特異的抗体（例えば抗
ジゴキシゲニン抗体）を用いたＥＬＩＳＡ法により検出
・定量することも可能である。
【００４９】また、多検体評価時などに用いる簡便定量
法としては、液相中でも２本鎖ＤＮＡだけを特異的に検
出・定量できる蛍光試薬、例えばピコグリーン（モレキ
ュラ・プローブス社）を用いれば良く、この場合はＰＣ
Ｒ産物の標識や精製は必要ない。 ＜２＞本発明の悪性新生物性疾患の判定方法 本発明のヒト・テロメレース活性測定方法により、被検
細胞、特にヒト細胞がガン細胞であるかどうかの判定、
つまり悪性新生物性疾患、細胞増殖性疾患か否かの判定
ができる。
法としては、液相中でも２本鎖ＤＮＡだけを特異的に検
出・定量できる蛍光試薬、例えばピコグリーン（モレキ
ュラ・プローブス社）を用いれば良く、この場合はＰＣ
Ｒ産物の標識や精製は必要ない。 ＜２＞本発明の悪性新生物性疾患の判定方法 本発明のヒト・テロメレース活性測定方法により、被検
細胞、特にヒト細胞がガン細胞であるかどうかの判定、
つまり悪性新生物性疾患、細胞増殖性疾患か否かの判定
ができる。
【００５０】また、本発明のヒト・テロメレース活性測
定方法により、被検者又はその組織の細胞がテロメレー
ス活性を示さない場合は、それは炎症であると予測され
る。 ＜３＞本発明のテロメレース阻害剤の製造方法 本発明は、下記工程を含む、テロメレース阻害剤の製造
方法である。（Ｄ）本発明のヒト・テロメレース活性測
定方法を用いて、テロメレース阻害活性を有する物質を
スクリーニングする工程、（Ｅ）前記（Ｄ）工程で得ら
れるテロメレース阻害活性を有する物質を用いてテロメ
レース阻害剤を製剤化する工程。
定方法により、被検者又はその組織の細胞がテロメレー
ス活性を示さない場合は、それは炎症であると予測され
る。 ＜３＞本発明のテロメレース阻害剤の製造方法 本発明は、下記工程を含む、テロメレース阻害剤の製造
方法である。（Ｄ）本発明のヒト・テロメレース活性測
定方法を用いて、テロメレース阻害活性を有する物質を
スクリーニングする工程、（Ｅ）前記（Ｄ）工程で得ら
れるテロメレース阻害活性を有する物質を用いてテロメ
レース阻害剤を製剤化する工程。
【００５１】「スクリーニングする工程」において、テ
ロメレース阻害活性を有する物質を含む分離源として、
微生物の培養液、菌体、植物エキス等を用いることがで
きる。
ロメレース阻害活性を有する物質を含む分離源として、
微生物の培養液、菌体、植物エキス等を用いることがで
きる。
【００５２】上記スクリーニング工程で得られるテロメ
レース阻害活性を有する物質を、テロメレース阻害活性
を指標として、該分離源から精製等して、通常の医薬の
製剤化の手法を用いてテロメレース阻害剤を製剤化すれ
ば良い。
レース阻害活性を有する物質を、テロメレース阻害活性
を指標として、該分離源から精製等して、通常の医薬の
製剤化の手法を用いてテロメレース阻害剤を製剤化すれ
ば良い。
【００５３】また、本発明のヒト・テロメレース活性測
定方法を用いた前記スクリーニングする工程において得
られたテロメレース阻害活性を有する物質の構造が同定
されれば、該物質を、化学合成法や購入する等の他の方
法で入手することも可能である。
定方法を用いた前記スクリーニングする工程において得
られたテロメレース阻害活性を有する物質の構造が同定
されれば、該物質を、化学合成法や購入する等の他の方
法で入手することも可能である。
【００５４】また、本発明は、テロメレース阻害活性を
有する物質を用いて、テロメレース阻害剤を製造する方
法において、本発明のヒト・テロメレース活性測定方法
を用いて、テロメレース阻害活性を測定し、テロメレー
ス阻害活性を確認する工程を含むテロメレース阻害剤の
製造方法である。確認する工程においては、テロメレー
ス阻害活性を有する物質が目的のテロメレース活性を有
するか否かの確認をするが、更に、医薬製剤として適当
なテロメレース活性に調整する工程を含むことは好まし
い。該方法により、テロメレース阻害剤の品質管理等を
行える。
有する物質を用いて、テロメレース阻害剤を製造する方
法において、本発明のヒト・テロメレース活性測定方法
を用いて、テロメレース阻害活性を測定し、テロメレー
ス阻害活性を確認する工程を含むテロメレース阻害剤の
製造方法である。確認する工程においては、テロメレー
ス阻害活性を有する物質が目的のテロメレース活性を有
するか否かの確認をするが、更に、医薬製剤として適当
なテロメレース活性に調整する工程を含むことは好まし
い。該方法により、テロメレース阻害剤の品質管理等を
行える。
【００５５】上述のように本発明のヒト・テロメレース
活性測定方法により、テロメレース阻害活性のある物質
（テロメレース阻害剤）を試験・評価することができる
ので、本発明のヒト・テロメレース活性測定方法をテロ
メレース阻害剤の製造工程に組み込むことにより、抗癌
剤として有用なテロメレース阻害剤を得ることができ
る。
活性測定方法により、テロメレース阻害活性のある物質
（テロメレース阻害剤）を試験・評価することができる
ので、本発明のヒト・テロメレース活性測定方法をテロ
メレース阻害剤の製造工程に組み込むことにより、抗癌
剤として有用なテロメレース阻害剤を得ることができ
る。
【００５６】なお、本発明のテロメレース阻害剤の製造
方法において、「テロメレース阻害活性を有する物質」
は、細胞内に投与された後に代謝されてテロメレース阻
害活性を発現するものでもよく、所謂プロドラックにつ
いても適用できる。
方法において、「テロメレース阻害活性を有する物質」
は、細胞内に投与された後に代謝されてテロメレース阻
害活性を発現するものでもよく、所謂プロドラックにつ
いても適用できる。
【００５７】また、本発明の生きた細胞内におけるヒト
・テロメレース活性測定方法を用いると、例えばある化
合物が示す癌細胞の増殖抑制のような薬理学的効果が、
細胞内テロメレースの阻害に基づくものかどうかを判定
することができる。
・テロメレース活性測定方法を用いると、例えばある化
合物が示す癌細胞の増殖抑制のような薬理学的効果が、
細胞内テロメレースの阻害に基づくものかどうかを判定
することができる。
【００５８】また、可逆的テロメレース阻害剤の場合は
細胞に投与しても、従来のストレッチＰＣＲやＴＲＡＰ
法では細胞からのテロメレース反応産物の抽出・テロメ
レース活性測定工程において希釈などにより阻害が解除
されてしまうと予想される。こうした可逆性阻害剤の細
胞内テロメレース阻害活性を評価するときは、生細胞内
のテロメレース活性の変化を測定するしかなく、本発明
はその測定に有用である。
細胞に投与しても、従来のストレッチＰＣＲやＴＲＡＰ
法では細胞からのテロメレース反応産物の抽出・テロメ
レース活性測定工程において希釈などにより阻害が解除
されてしまうと予想される。こうした可逆性阻害剤の細
胞内テロメレース阻害活性を評価するときは、生細胞内
のテロメレース活性の変化を測定するしかなく、本発明
はその測定に有用である。
【００５９】さらには試験管内でテロメレースの阻害活
性が確認されているにもかかわらず、生細胞内のテロメ
レースを阻害できないと本発明により判定される化合物
の場合、細胞内への取り込み、代謝、排出などの薬物動
態的問題があると予想される。本発明はそのような手が
かりを与えるのにも有用である。
性が確認されているにもかかわらず、生細胞内のテロメ
レースを阻害できないと本発明により判定される化合物
の場合、細胞内への取り込み、代謝、排出などの薬物動
態的問題があると予想される。本発明はそのような手が
かりを与えるのにも有用である。
【００６０】また、こうした阻害剤評価のみならず、増
殖刺激や細胞周期、細胞老化などの生命現象に伴う細胞
内テロメレース活性の変化を追跡する目的でも本発明は
有用である。
殖刺激や細胞周期、細胞老化などの生命現象に伴う細胞
内テロメレース活性の変化を追跡する目的でも本発明は
有用である。
【００６１】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例
によって限定されるものではない。 ＜テロメレース活性陽性および陰性ヒト細胞における細
胞内テロメレース活性の測定＞ （１）ヒト細胞の培養 従来のストレッチＰＣＲ法を用いてテロメレース活性陽
性と判定された、ヒト子宮頚癌由来Ｈｅｌａ Ｓ３細
胞、ヒト結腸癌由来ＰＡ−１細胞、ヒト乳癌由来ＳＫＢ
Ｒ−３細胞、ヒト大腸癌由来ＨＣＴ−１１６細胞、及び
テロメレース活性陰性と判定されたヒト繊維芽細胞由来
ＷＩ−３８、さらにＷＩ−３８の不死化細胞株であるＶ
Ａ−１３、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の７種をそ
れぞれ２万５千個／ウェルの濃度で９６ウェル培養プレ
ートに播き、それぞれ適切な培地で一晩培養した。
するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施例
によって限定されるものではない。 ＜テロメレース活性陽性および陰性ヒト細胞における細
胞内テロメレース活性の測定＞ （１）ヒト細胞の培養 従来のストレッチＰＣＲ法を用いてテロメレース活性陽
性と判定された、ヒト子宮頚癌由来Ｈｅｌａ Ｓ３細
胞、ヒト結腸癌由来ＰＡ−１細胞、ヒト乳癌由来ＳＫＢ
Ｒ−３細胞、ヒト大腸癌由来ＨＣＴ−１１６細胞、及び
テロメレース活性陰性と判定されたヒト繊維芽細胞由来
ＷＩ−３８、さらにＷＩ−３８の不死化細胞株であるＶ
Ａ−１３、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の７種をそ
れぞれ２万５千個／ウェルの濃度で９６ウェル培養プレ
ートに播き、それぞれ適切な培地で一晩培養した。
【００６２】ＨＵＶＥＣは東洋紡より、それ以外はAmer
ican Type Culture Collectionより購入した。それぞれ
のカタログ番号は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞（ＣＣＬ２．
２）、ＰＡ−１細胞（ＣＲＬ１５７２）、ＳＫＢＲ−３
細胞（ＨＴＢ３０）、ＨＣＴ−１１６細胞（ＣＣＬ２４
７）、ＷＩ−３８（ＣＣＬ７５）、ＶＡ−１３（ＣＣＬ
７５．１）である。
ican Type Culture Collectionより購入した。それぞれ
のカタログ番号は、Ｈｅｌａ Ｓ３細胞（ＣＣＬ２．
２）、ＰＡ−１細胞（ＣＲＬ１５７２）、ＳＫＢＲ−３
細胞（ＨＴＢ３０）、ＨＣＴ−１１６細胞（ＣＣＬ２４
７）、ＷＩ−３８（ＣＣＬ７５）、ＶＡ−１３（ＣＣＬ
７５．１）である。
【００６３】ＷＩ−３８、ＶＡ−１３、ＨＵＶＥＣの場
合は接着性を高めるためコラーゲンをコートした９６ウ
ェル培養プレート（岩城硝子）を用いた。 （２）リポフェクションによるヒト・テロメレース伸長
用オリゴＤＮＡプライマーのヒト細胞への導入と細胞内
テロメレース伸長反応 それぞれの細胞を血清不含ダルベッコ最少必須培地（Ｄ
ＭＥＭ）で洗浄した。その間、リポフェクチン（ライフ
テックオリエンタル社）の説明書に従い、リポフェクチ
ンとテロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマー：ｂ−
ＳｐＴＧ３（５’ビオチン標識された、ホスホロチオエ
ート結合型のｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTT
GGGGTTGGGGTTG-3'）（配列番号１））とリポフェクチン
との複合体を作成した。
合は接着性を高めるためコラーゲンをコートした９６ウ
ェル培養プレート（岩城硝子）を用いた。 （２）リポフェクションによるヒト・テロメレース伸長
用オリゴＤＮＡプライマーのヒト細胞への導入と細胞内
テロメレース伸長反応 それぞれの細胞を血清不含ダルベッコ最少必須培地（Ｄ
ＭＥＭ）で洗浄した。その間、リポフェクチン（ライフ
テックオリエンタル社）の説明書に従い、リポフェクチ
ンとテロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマー：ｂ−
ＳｐＴＧ３（５’ビオチン標識された、ホスホロチオエ
ート結合型のｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGGGGTT
GGGGTTGGGGTTG-3'）（配列番号１））とリポフェクチン
との複合体を作成した。
【００６４】この複合体溶液80μlを各ウェルに添加
し、37℃、5%ＣＯ2の条件下で5時間、細胞内への伸長反
応用プライマーの導入を行った。陰性対照として伸長用
オリゴＤＮＡプライマーを含まないで同様に操作を行っ
た細胞を設置した。
し、37℃、5%ＣＯ2の条件下で5時間、細胞内への伸長反
応用プライマーの導入を行った。陰性対照として伸長用
オリゴＤＮＡプライマーを含まないで同様に操作を行っ
た細胞を設置した。
【００６５】次いで複合体溶液を除去し、通常の培地に
交換して37℃、5%ＣＯ2の条件下で15時間、細胞内テロ
メレース反応を行った。 （３）細胞内テロメレース反応産物の抽出 細胞内テロメレース反応を行わせた細胞に、50μlの細
胞溶解液（20mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、0.5%の
ＳＤＳ、10mMのＥＤＴＡ、10mMのＮａＣｌ、0.5mg/mlの
プロナーゼＫ）を加え、37℃で20分インキュベートし
た。この内40μlを別の容器に移し、10μlの5MのＮａＣ
ｌを加え良く混和したのち、4℃で一晩放置した。
交換して37℃、5%ＣＯ2の条件下で15時間、細胞内テロ
メレース反応を行った。 （３）細胞内テロメレース反応産物の抽出 細胞内テロメレース反応を行わせた細胞に、50μlの細
胞溶解液（20mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、0.5%の
ＳＤＳ、10mMのＥＤＴＡ、10mMのＮａＣｌ、0.5mg/mlの
プロナーゼＫ）を加え、37℃で20分インキュベートし
た。この内40μlを別の容器に移し、10μlの5MのＮａＣ
ｌを加え良く混和したのち、4℃で一晩放置した。
【００６６】次いで10000×ｇ、4℃で30分遠心分離を行
い、染色体ＤＮＡなどを含む不溶性画分を除去した。得
られた可溶性画分を細胞内テロメレース反応産物溶液と
した。 （４）ストレッチＰＣＲによる細胞内テロメレース反応
産物の増幅とその定量 ストレプトアビジン（ライフテックオリエンタル社）を
共有結合させたポリカーボネート製９６ウェルＰＣＲプ
レート（コーニング社）に、細胞内テロメレース反応産
物溶液20μlを添加し、37℃で30分保温したのち蒸留水
で洗浄した。
い、染色体ＤＮＡなどを含む不溶性画分を除去した。得
られた可溶性画分を細胞内テロメレース反応産物溶液と
した。 （４）ストレッチＰＣＲによる細胞内テロメレース反応
産物の増幅とその定量 ストレプトアビジン（ライフテックオリエンタル社）を
共有結合させたポリカーボネート製９６ウェルＰＣＲプ
レート（コーニング社）に、細胞内テロメレース反応産
物溶液20μlを添加し、37℃で30分保温したのち蒸留水
で洗浄した。
【００６７】25μl／ウェルのＰＣＲ反応液［即ち20mM
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 8.3）、75mMのＫＣｌ、0.005%
のＷ−１（界面活性剤）、1.5mMのＭｇＣｌ2、1μMのｐ
ＴＧ３（センス・プライマー）、1μMのｐＴＡＧγ（ア
ンチセンス・プライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGACCCCTAA
CCCTAACCCTAACCCT-3'（配列番号２））、50μMのｄＡＴ
Ｐ、50μMのｄＧＴＰ、50μMのｄＣＴＰ、50μMのｄＴ
ＴＰ、1U／25μlのＴａｑ ＤＮＡポリメレースからなる
反応液］（以上、ライフテックオリエンタル社）を加
え、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造）を用いて
ＰＣＲを行った（93℃1分、69℃1分、72℃2分を30サイ
クル）。
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH 8.3）、75mMのＫＣｌ、0.005%
のＷ−１（界面活性剤）、1.5mMのＭｇＣｌ2、1μMのｐ
ＴＧ３（センス・プライマー）、1μMのｐＴＡＧγ（ア
ンチセンス・プライマー：5'-CAGGAAACAGCTATGACCCCTAA
CCCTAACCCTAACCCT-3'（配列番号２））、50μMのｄＡＴ
Ｐ、50μMのｄＧＴＰ、50μMのｄＣＴＰ、50μMのｄＴ
ＴＰ、1U／25μlのＴａｑ ＤＮＡポリメレースからなる
反応液］（以上、ライフテックオリエンタル社）を加
え、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造）を用いて
ＰＣＲを行った（93℃1分、69℃1分、72℃2分を30サイ
クル）。
【００６８】ＰＣＲ終了後、滅菌水を100μl加えて計12
5μlとした。このうち100μlを９６ウェル黒色プレート
（住友ベークライト）に移し、200倍希釈したピコグリ
ーン溶液（モレキュラ・プローブス社）を100μl加え5
分間放置した後、励起波長485nm、吸収波長538nmにおけ
る蛍光強度を蛍光プレートリーダー・フルオロスキャン
II（大日本製薬）にて測定した。
5μlとした。このうち100μlを９６ウェル黒色プレート
（住友ベークライト）に移し、200倍希釈したピコグリ
ーン溶液（モレキュラ・プローブス社）を100μl加え5
分間放置した後、励起波長485nm、吸収波長538nmにおけ
る蛍光強度を蛍光プレートリーダー・フルオロスキャン
II（大日本製薬）にて測定した。
【００６９】その結果、図１に示すようにテロメレース
活性陽性細胞と言われるＨｅｌａＳ３、ＰＡ−１、ＳＫ
ＢＲ−３、ＨＣＴ−１１６からは細胞内テロメレース反
応産物が検出され、テロメレース活性陰性細胞であるＷ
Ｉ−３８、ＶＡ−１３、ＨＵＶＥＣからは細胞内テロメ
レース反応産物は検出されなかった。
活性陽性細胞と言われるＨｅｌａＳ３、ＰＡ−１、ＳＫ
ＢＲ−３、ＨＣＴ−１１６からは細胞内テロメレース反
応産物が検出され、テロメレース活性陰性細胞であるＷ
Ｉ−３８、ＶＡ−１３、ＨＵＶＥＣからは細胞内テロメ
レース反応産物は検出されなかった。
【００７０】
【発明の効果】本発明により、生きた細胞内、特に生き
たヒト細胞内のテロメレース活性を検出・定量すること
ができる。特に本発明の方法では生きた細胞へのテロメ
レース伸長反応用プライマーの導入方法としてリポフェ
クション法を採用しているため、従来のin situ ＴＲＡ
Ｐ法やNaasaniらの方法（Naasani I. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 249, 391, 1998）と比較して
簡便・迅速であり多検体評価に好適であるという特徴が
ある。
たヒト細胞内のテロメレース活性を検出・定量すること
ができる。特に本発明の方法では生きた細胞へのテロメ
レース伸長反応用プライマーの導入方法としてリポフェ
クション法を採用しているため、従来のin situ ＴＲＡ
Ｐ法やNaasaniらの方法（Naasani I. et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 249, 391, 1998）と比較して
簡便・迅速であり多検体評価に好適であるという特徴が
ある。
【００７１】更に全行程を９６穴プレートを用いて操作
することによって、処理量を飛躍的に増大させることが
でき、本発明の方法は、悪性新生物性疾患等の判定に利
用できる。
することによって、処理量を飛躍的に増大させることが
でき、本発明の方法は、悪性新生物性疾患等の判定に利
用できる。
【００７２】また、本発明によりテロメレース阻害剤の
大量スクリーニングおよび品質の評価などに応用可能で
ある。
大量スクリーニングおよび品質の評価などに応用可能で
ある。
【００７３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals, Inc.(三菱東京製薬株式会社) <120> テロメレース活性測定方法 <130> YK00024 <160> 2 <210> 1 <211> 38 <212> nucleic acid <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense primer <400> 1 gtaaaacgac ggccagtttg gggttggggt tggggttg 38 <210> 2 <211> 39 <212> nucleic acid <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense primer <400> 2 caggaaacag ctatgacccc taaccctaac cctaacct 39
【図１】 テロメレース抽出液においてはテロメレース
活性陽性または陰性と判定された各種ヒト細胞の細胞内
テロメレース活性を測定した結果である。ＰＣＲ増幅用
のアンチセンス・プライマー／センス・プライマーを加
えない場合をプライマー（−）、加えた場合をプライマ
ー（＋）と示した。
活性陽性または陰性と判定された各種ヒト細胞の細胞内
テロメレース活性を測定した結果である。ＰＣＲ増幅用
のアンチセンス・プライマー／センス・プライマーを加
えない場合をプライマー（−）、加えた場合をプライマ
ー（＋）と示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 CA01 GA13 HA11 4B063 QA05 QQ02 QQ34 QQ95 QR08 QR32 QR42 QR59 QR62 QS02 QS25 QS32 QS34 QX02 4C084 AA27 NA14 ZB262 ZC202
Claims (16)
- 【請求項１】 以下の工程を含む、生きた細胞内のヒト
・テロメレース活性測定方法： （Ａ）５’末端側にある第１のタグ配列、及びヒト・テ
ロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる３’末端側
合成開始配列とを含むヒト・テロメレース伸長用オリゴ
ＤＮＡプライマーを、カチオン脂質キャリアにより生き
た細胞に導入し、細胞内テロメレースによりヒト・テロ
メア配列TTAGGGの繰り返し配列からなるＤＮＡ配列を前
記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーの
３’末端に伸長させてヒト・テロメレース反応産物を調
製する工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られたヒト・テ
ロメレース反応産物を細胞内から抽出し、該ヒト・テロ
メレース反応産物と、センス・プライマーとしての前記
ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマーと、
アンチセンス・プライマーとしての、第１のタグ配列と
相補性がなく５’末端側にある第２のタグ配列及びヒト
・テロメア配列の相補配列CCCTAAの繰返し配列からなる
３’末端側ＤＮＡ配列を含むアンチセンス・オリゴＤＮ
Ａプライマーとを用いて、ＰＣＲを利用したストレッチ
ＰＣＲ法により増幅してＰＣＲ産物を得る工程、（Ｃ）
前記（Ｂ）工程で得られたＰＣＲ産物を測定する工程。 - 【請求項２】 前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返
し配列からなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰
り返し配列からなる請求項１に記載のヒト・テロメレー
ス活性測定方法。 - 【請求項３】 前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返
し配列からなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGを少
なくとも３回繰り返した配列からなる請求項１又は２に
記載のヒト・テロメレース活性測定方法。 - 【請求項４】 前記アンチセンス・オリゴＤＮＡプライ
マーは、ヒト・テロメア配列の相補配列CCCTAAを少なく
とも３回繰り返した配列からなるＤＮＡ配列を含むオリ
ゴＤＮＡプライマーである請求項１〜３のいずれか一項
に記載のヒト・テロメレース活性測定方法。 - 【請求項５】 前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマーがｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTTGG
GGTTGGGGTTGGGGTTG-3'）（配列番号１）であり、アンチ
センス・オリゴＤＮＡプライマーがｐＴＡＧγ（5'-CAG
GAAACAGCTATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列番
号２）である請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒト
・テロメレース活性測定方法。 - 【請求項６】 前記生きた細胞は、生きたヒト細胞であ
ることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載
のヒト・テロメレース活性測定方法。 - 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒ
ト・テロメレース活性測定方法を用いた悪性新生物性疾
患、細胞増殖性疾患または炎症の判定方法。 - 【請求項８】 ５’末端側にある第１のタグ配列、及び
ヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返し配列からなる
３’末端側合成開始配列とを含む、ヒト・テロメア配列
TTAGGGの繰り返し配列からなるＤＮＡ配列を３’末端に
伸長させるためのヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮ
Ａプライマー。 - 【請求項９】 前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴＤ
ＮＡプライマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰返
し配列からなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGの繰
り返し配列からなる請求項８に記載のヒト・テロメレー
ス伸長用オリゴＤＮＡプライマー。 - 【請求項１０】 前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴ
ＤＮＡプライマーのヒト・テロメア配列TTAGGG以外の繰
返し配列からなる３’末端側合成開始配列は、TTGGGGを
少なくとも３回繰り返した配列からなる請求項８に記載
のヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマー。 - 【請求項１１】 請求項８〜１０のいずれか一項に記載
のヒト・テロメレース伸長用オリゴＤＮＡプライマー
と、前記第１のタグ配列と相補性がなく５’末端側にあ
る第２のタグ配列及びヒト・テロメア配列の相補配列CC
CTAAの繰返し配列からなる３’末端側ＤＮＡ配列を含む
アンチセンス・オリゴＤＮＡプライマーとのプライマー
セット。 - 【請求項１２】 前記ヒト・テロメレース伸長用オリゴ
ＤＮＡプライマーがｐＴＧ３（5'-GTAAAACGACGGCCAGTTT
GGGGTTGGGGTTGGGGTTG-3'）（配列番号１）であり、アン
チセンス・オリゴＤＮＡプライマーがｐＴＡＧγ（5'-C
AGGAAACAGCTATGACCCCTAACCCTAACCCTAACCCT-3'）（配列
番号２）である請求項１１に記載のプライマーセット。 - 【請求項１３】 下記工程を含む、テロメレース阻害剤
の製造方法。（Ｄ）請求項１〜６のいずれか一項に記載
のヒト・テロメレース活性測定方法を用いて、テロメレ
ース阻害活性を有する物質をスクリーニングする工程、
（Ｅ）前記（Ｄ）工程で得られるテロメレース阻害活性
を有する物質を用いてテロメレース阻害剤を製剤化する
工程。 - 【請求項１４】 テロメレース阻害活性を有する物質が
細胞内に投与された後に活性を発現するものであること
を特徴とする請求項１３に記載のテロメレース阻害剤の
製造方法。 - 【請求項１５】 テロメレース阻害活性を有する物質を
用いて、テロメレース阻害剤を製造する方法において、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト・テロメレー
ス活性測定方法を用いて、テロメレース阻害活性を測定
し、テロメレース阻害活性を確認する工程を含むテロメ
レース阻害剤の製造方法。 - 【請求項１６】 テロメレース阻害活性を有する物質が
細胞内に投与された後に活性を発現するものであること
を特徴とする請求項１５に記載のテロメレース阻害剤の
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000363301A JP2002165595A (ja) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | テロメレース活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000363301A JP2002165595A (ja) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | テロメレース活性測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002165595A true JP2002165595A (ja) | 2002-06-11 |
Family
ID=18834429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000363301A Pending JP2002165595A (ja) | 2000-11-29 | 2000-11-29 | テロメレース活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002165595A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006001174A1 (ja) * | 2004-06-24 | 2006-01-05 | Riken | 生体組織切片を用いるテロメラーゼ活性の測定方法 |
| JP2014197008A (ja) * | 2005-04-01 | 2014-10-16 | メドベット サイエンス ピーティーワイ． リミティッド | 診断法および治療法ならびにそれに有用な薬剤 |
-
2000
- 2000-11-29 JP JP2000363301A patent/JP2002165595A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006001174A1 (ja) * | 2004-06-24 | 2006-01-05 | Riken | 生体組織切片を用いるテロメラーゼ活性の測定方法 |
| JP2006006169A (ja) * | 2004-06-24 | 2006-01-12 | Institute Of Physical & Chemical Research | 生体組織切片を用いるテロメラーゼ活性の測定方法 |
| JP2014197008A (ja) * | 2005-04-01 | 2014-10-16 | メドベット サイエンス ピーティーワイ． リミティッド | 診断法および治療法ならびにそれに有用な薬剤 |
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