JP6681545B2 - 水溶液中のガン細胞の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、水溶液が２以上のガン細胞を含有しているかどうかを判定する方法に関する。
非特許文献１は、テロメラーゼ活性測定方法を開示している。この方法では以下の手順（Ｉ）〜（ＩＶ）に従って生体試料に含有されるテロメラーゼの活性度が測定される。
（Ｉ） 生体試料を含有するテロメラーゼ反応溶液を調製し、テロメラーゼ反応溶液中でテロメラーゼ反応を行う。このようにして、テロメラーゼ反応産物が得られる。
（ＩＩ） テロメラーゼ反応産物が磁性ビーズ上に固定される。次いで、磁性ビーズは洗浄される。
（ＩＩＩ） このように固定されたテロメラーゼ反応産物をテンプレートとして用いて、テロメラーゼ反応産物に含まれるＤＮＡ配列がＰＣＲ法により増幅される。このようにして、ＰＣＲ産物が得られる。
（ＩＶ） ＰＣＲ産物がサイクリングプローブテクノロジー法で検出される。
特許文献１は、テロメラーゼ活性を検出するための方法および組成物を開示している。
Yaku H. et. al.,"A Highly Sensitive Telomerase Activity Assay that Eliminates False-Negative Results Caused by PCR Inhibitors", Molecules, 2013, Vol. 18, pp. 11751-11767
本発明の目的は、たとえ水溶液が２つしかガン細胞を含有していない場合であっても、当該水溶液がガン細胞を含有していると判定できる方法を提供することにある。
本発明は、水溶液中のガン細胞の検出方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） ＴＳプライマー、ｄＴＴＰ、ｄＴＰ、およびｄＧＴＰを前記水溶液に添加し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程、ここで、
前記ＴＳプライマーは、5’−AATCCGTCGAGCAGAGTT−3’（配列番号：０１）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであり、
前記水溶液中は、ガン細胞を２個以上含有しており、
（ｂ） 前記工程（ａ）において調製されたテロメラーゼ反応溶液を、テロメラーゼ反応が起こる条件に置き、テロメラーゼ反応産物を得る工程、
（ｃ） 工程（ｂ）において得られたテロメラーゼ反応産物を固相に結合する工程、
（ｄ） 工程（ｃ）において固相に結合されたテロメラーゼ反応産物の全量に、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、前記ＴＳプライマー、およびリバースプライマーを混合し、ＰＣＲ溶液を調製する工程、ここで、
前記リバースプライマーは、5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’（配列番号：０２）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであり、
前記ＰＣＲ溶液に含有されるＴＳプライマーは、０．１μＭ以上１μＭ以下の濃度を有し、かつ
前記ＰＣＲ溶液に含有されるリバースプライマーは、０．０２μＭ以上０．０６μＭ以下の濃度を有し、
（ｅ） 工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液をＰＣＲが起こる条件に置き、ＰＣＲ産物を得る工程、ここで、
前記ＴＳプライマーは、前記ＰＣＲにおいてフォワードプライマーとして作用し、
（ｆ） 工程（ｅ）で得られたＰＣＲ産物に、プローブＲＮＡおよびＲＮａｓｅＨ酵素を混合して、ＲＮａｓｅＨ反応溶液を調製する工程、ここで、
前記プローブＲＮＡは、5’−CCCUAACCC−3’（配列番号：０３）のＲＮＡ配列、蛍光基、および消光基からなり、
前記プローブＲＮＡの一端および他端は、それぞれ前記蛍光基および前記消光基により修飾されており、かつ
前記消光基は、前記蛍光基からの蛍光を吸収することができ、
（ｇ） 工程（ｆ）において調製されたＲＮａｓｅＨ反応溶液を、ＲＮａｓｅＨ反応が起こる条件に置く工程、および
（ｈ） 前記工程（ｇ）の後に、前記ＲＮａｓｅＨ反応溶液の蛍光強度を測定し、前記ガン細胞を検出する工程。
（ａ） ＴＳプライマー、ｄＴＴＰ、ｄＴＰ、およびｄＧＴＰを前記水溶液に添加し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程、ここで、
前記ＴＳプライマーは、5’−AATCCGTCGAGCAGAGTT−3’（配列番号：０１）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであり、
前記水溶液中は、ガン細胞を２個以上含有しており、
（ｂ） 前記工程（ａ）において調製されたテロメラーゼ反応溶液を、テロメラーゼ反応が起こる条件に置き、テロメラーゼ反応産物を得る工程、
（ｃ） 工程（ｂ）において得られたテロメラーゼ反応産物を固相に結合する工程、
（ｄ） 工程（ｃ）において固相に結合されたテロメラーゼ反応産物の全量に、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、前記ＴＳプライマー、およびリバースプライマーを混合し、ＰＣＲ溶液を調製する工程、ここで、
前記リバースプライマーは、5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’（配列番号：０２）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであり、
前記ＰＣＲ溶液に含有されるＴＳプライマーは、０．１μＭ以上１μＭ以下の濃度を有し、かつ
前記ＰＣＲ溶液に含有されるリバースプライマーは、０．０２μＭ以上０．０６μＭ以下の濃度を有し、
（ｅ） 工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液をＰＣＲが起こる条件に置き、ＰＣＲ産物を得る工程、ここで、
前記ＴＳプライマーは、前記ＰＣＲにおいてフォワードプライマーとして作用し、
（ｆ） 工程（ｅ）で得られたＰＣＲ産物に、プローブＲＮＡおよびＲＮａｓｅＨ酵素を混合して、ＲＮａｓｅＨ反応溶液を調製する工程、ここで、
前記プローブＲＮＡは、5’−CCCUAACCC−3’（配列番号：０３）のＲＮＡ配列、蛍光基、および消光基からなり、
前記プローブＲＮＡの一端および他端は、それぞれ前記蛍光基および前記消光基により修飾されており、かつ
前記消光基は、前記蛍光基からの蛍光を吸収することができ、
（ｇ） 工程（ｆ）において調製されたＲＮａｓｅＨ反応溶液を、ＲＮａｓｅＨ反応が起こる条件に置く工程、および
（ｈ） 前記工程（ｇ）の後に、前記ＲＮａｓｅＨ反応溶液の蛍光強度を測定し、前記ガン細胞を検出する工程。
本発明は、たとえ水溶液が２つしかガン細胞を含有していない場合であっても、当該水溶液がガン細胞を含有していると判定できる方法を提供する。
以下、本発明が詳細に説明される。
本発明は、非特許文献１において開示されたテロメラーゼ活性測定方法を改善することにより完成された。
本発明および非特許文献１の間の３つの相違点が、以下の項目（Ｉ）〜（ＩＩＩ）として以下に列挙される。
（Ｉ） 本発明では、工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液は、０．１μＭ以上１μＭ以下の濃度でＴＳプライマーを含有している一方で、非特許文献１では、ＰＣＲ溶液は、１０μＭの濃度でＴＳプライマーを含有している。
（ＩＩ） 本発明では、工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液は、5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’（配列番号：０２）のＤＮＡ配列により表されるリバースプライマー（以下、「ＡＣＸプライマー」という）を含有している一方で、非特許文献１では、ＰＣＲ溶液は、5’−GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’（配列番号：０４）のＤＮＡ配列により表されるリバースプライマー（以下、「ＣＸ−ｅｘｔプライマー」という）を含有している。
（ＩＩＩ） 本発明では、工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液は、０．０２μＭ以上０．０６μＭ以下の濃度でリバースプライマー（すなわち、ＡＣＸプライマー）を含有している一方で、非特許文献１では、ＰＣＲ溶液は、１μＭの濃度でリバースプライマー（すなわち、ＣＸ−ｅｘｔプライマー）を含有している。
後述される実施例において実証されているように、本発明では、たとえ水溶液が２つしかガン細胞を含有していない場合であっても、当該水溶液がガン細胞を含有していると正確に判定できる。一方、後述される比較例６において実証されているように、非特許文献１に開示された方法によれば、水溶液が２つしかガン細胞を含有していない場合、当該水溶液がガン細胞を含有していると判定できない。
ガン細胞の例は、ＨｅＬａ細胞である。以下、工程（ａ）〜工程（ｈ）が説明される。
（工程（ａ））
工程（ａ）においては、ＴＳプライマー、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＧＴＰを水溶液に添加する。このようにして、テロメラーゼ反応溶液が調製される。
工程（ａ）においては、ＴＳプライマー、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＧＴＰを水溶液に添加する。このようにして、テロメラーゼ反応溶液が調製される。
水溶液の例は、界面活性剤を含有する溶液を用いて細胞または生体組織を溶解することによって得られた細胞溶解液または組織溶解液である。
ＴＳプライマーは、テロメラーゼの基質となるＤＮＡである。ＴＳプライマーは、5’−AATCCGTCGAGCAGAGTT−3’（配列番号：０１）のＤＮＡ配列により表されるプライマーである。
用語「ｄＴＴＰ」、「ｄＡＴＰ」、および「ｄＧＴＰ」は、それぞれ、デオキシチミジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、およびデオキシグアノシン三リン酸を意味する。
水溶液に含有され得るＤＮａｓｅによってテロメラーゼ反応が阻害されることを抑制するために、テロメラーゼの基質とならないＤＮＡが水溶液に添加されることが望ましい。テロメラーゼの基質とならないＤＮＡの例は、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはＭ１３ファージベクターである。特許文献２を参照せよ。これに代えて、米国特許出願１４／７４３,９０１を参照せよ。この明細書の全体は本明細書に参考として援用される。
（工程（ｂ））
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる。工程（ｂ）においては、工程（ａ）において調製されたテロメラーゼ反応溶液が、テロメラーゼ反応が起こる条件に置かれる。このようにして、テロメラーゼ反応産物が得られる。具体的には、テロメラーゼ反応溶液は、摂氏２０度以上４０度以下の温度で、３０分以上１８０分以下の間、静置される。
工程（ｂ）は、工程（ａ）の後に行われる。工程（ｂ）においては、工程（ａ）において調製されたテロメラーゼ反応溶液が、テロメラーゼ反応が起こる条件に置かれる。このようにして、テロメラーゼ反応産物が得られる。具体的には、テロメラーゼ反応溶液は、摂氏２０度以上４０度以下の温度で、３０分以上１８０分以下の間、静置される。
（工程（ｃ））
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われる。工程（ｂ）において得られたテロメラーゼ反応産物は、固相に結合される。結合後、固相は洗浄されることが望ましい。
工程（ｃ）は、工程（ｂ）の後に行われる。工程（ｂ）において得られたテロメラーゼ反応産物は、固相に結合される。結合後、固相は洗浄されることが望ましい。
固相の例は、基板または粒子である。粒子は磁性粒子であり得る。
テロメラーゼ反応産物を固相に結合する方法が、以下、簡単に説明される。詳細については、非特許文献１を参照せよ。
固相の表面が金から形成される場合、工程（ａ）で使用されるＴＳプライマーは、５’末端にチオール基を有する。テロメラーゼ反応産物は、チオール基に含まれる硫黄原子を介して金に結合される。
固相の表面がアビジン（ストレプトアビジンを含む）から形成される場合、工程（ａ）で使用されるＴＳプライマーは、５’末端にビオチン基を有する。テロメラーゼ反応産物は、アビジンおよびビオチンの間の親和力により固相に結合される。
（工程（ｄ））
工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に行われる。工程（ｃ）において固定されたテロメラーゼ反応産物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＳプライマー、およびリバースプライマーと混合され、ＰＣＲ溶液が調製される。
工程（ｄ）は、工程（ｃ）の後に行われる。工程（ｃ）において固定されたテロメラーゼ反応産物は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ＴＳプライマー、およびリバースプライマーと混合され、ＰＣＲ溶液が調製される。
ＤＮＡポリメラーゼの例は、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、Pfu ＤＮＡポリメラーゼ、またはTth ＤＮＡポリメラーゼである。用語「ｄＣＴＰ」は、デオキシシチジン三リン酸を意味する。
リバースプライマーは、5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’（配列番号：０２）のＤＮＡ配列により表されるＡＣＸプライマーである。万一、リバースプライマーが、非特許文献１に開示されているように、5’−GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’（配列番号：０４）のＤＮＡ配列により表されるＣＸ−ｎｅｔプライマーである場合、実際には水溶液は２つのガン細胞を含有しているにも拘わらず、当該水溶液はガン細胞を含有していないと誤って判定される。後述される比較例６を参照せよ。
ＰＣＲ溶液に含有されるＴＳプライマーは、０．１μＭ以上１μＭ以下の濃度を有する。言い換えれば、ＰＣＲ溶液は、０．１μＭ以上１μＭ以下の濃度でＴＳプライマーを含有する。万一、工程（ｄ）において、ＴＳプライマーの濃度が１μＭを超える場合には、実際には水溶液は２つのガン細胞を含有しているにも拘わらず、当該水溶液はガン細胞を含有していないと誤って判定される。後述される比較例５および比較例６を参照せよ。比較例５および比較例６の工程（ｄ）においては、ＴＳプライマーの濃度はそれぞれ２μＭおよび１０μＭである。
ＰＣＲ溶液に含有されるリバースプライマーは、０．０２μＭ以上０．０６μＭ以下の濃度を有する。言い換えれば、ＰＣＲ溶液は、０．０２μＭ以上０．０６μＭ以下の濃度でリバースプライマーを含有する。万一、工程（ｄ）において、リバースプライマーの濃度が０．０６μＭを超えると、実際には水溶液は２つのガン細胞を含有しているにも拘わらず、当該水溶液はガン細胞を含有していないと誤って判定される。後述される比較例１〜比較例３を参照せよ。比較例１、比較例２、および比較例３においては、工程（ｄ）において、リバースプライマーの濃度は、それぞれ、０．０８μＭ、０．１μＭ、および０．５μＭである。同様に、万一、工程（ｄ）において、リバースプライマーの濃度が０．０２μＭ未満である場合、実際には水溶液は２つのガン細胞を含有しているにも拘わらず、当該水溶液はガン細胞を含有していないと誤って判定される。後述される比較例４を参照せよ。比較例４の工程（ｄ）においては、リバースプライマーの濃度は０．０１μＭである。
（工程（ｅ））
工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に行われる。工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液が、ＰＣＲが生じる条件に置かれる。このようにして、ＰＣＲ産物が得られる。工程（ｄ）において混合されたＴＳプライマーは、フォワードプライマーとして作用する。
工程（ｅ）は、工程（ｄ）の後に行われる。工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液が、ＰＣＲが生じる条件に置かれる。このようにして、ＰＣＲ産物が得られる。工程（ｄ）において混合されたＴＳプライマーは、フォワードプライマーとして作用する。
具体的には、工程（ｅ）において実施されるＰＣＲでは、ＰＣＲサイクルが３０〜４０回繰り返される。１ＰＣＲサイクルは、二本鎖ＤＮＡを変成して一本鎖ＤＮＡを得る変性工程、プライマーを鋳型ＤＮＡ（すなわち、得られた一本鎖ＤＮＡ）に結合させるアニーリング工程、およびＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸長反応を生じさせるＤＮＡ伸長反応工程を含む。
工程（ｅ）で得られるＰＣＲ産物は、ＴＳプライマーから伸長されたＤＮＡ（以下、「第１ＤＮＡ」という）およびリバースプライマーから伸長されたＤＮＡ（以下、「第２ＤＮＡ」という）に大別される。上述のとおり、ＰＣＲ溶液に含有されるＴＳプライマーの濃度は、ＰＣＲ溶液に含有されるリバースプライマーの濃度よりも高い。従って、第１ＤＮＡの数は、第２ＤＮＡよりも多い。
（工程（ｆ））
工程（ｆ）は、工程（ｅ）の後に行われる。工程（ｅ）において得られたＰＣＲ産物は、プローブＲＮＡおよびＲＮａｓｅＨ酵素と混合され、ＲＮａｓｅＨ反応溶液を調製する。
工程（ｆ）は、工程（ｅ）の後に行われる。工程（ｅ）において得られたＰＣＲ産物は、プローブＲＮＡおよびＲＮａｓｅＨ酵素と混合され、ＲＮａｓｅＨ反応溶液を調製する。
プローブＲＮＡは、5’−CCCUAACCC−3’（配列番号：０３）のＲＮＡ配列、蛍光基、および消光基からなる。プローブＲＮＡは、第１ＤＮＡにハイブリダイズできる。プローブＲＮＡの一端および他端は、それぞれ蛍光基および消光基により修飾されている。プローブＲＮＡの５’末端が蛍光基により修飾されている場合には、プローブＲＮＡの３’末端が消光基により修飾されている。プローブＲＮＡの５’末端が消光基により修飾されている場合には、プローブＲＮＡの３’末端が蛍光基により修飾されている。
蛍光基の例は、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate、以下、「ＦＩＴＣ」という)である。消光基の例は、4-[4-(ジメチルアミノ)フェニルアゾ]安息香酸(4-[4-(dimethylamino)phenylazo]benzoic acid、以下、「Ｄａｂｃｙｌ」という)である。
ＲＮａｓｅＨ酵素は、ＤＮＡにハイブリダイズしたＲＮＡを切断するリボヌクレアーゼである。
（工程（ｇ））
工程（ｇ）は、工程（ｆ）の後に行われる。工程（ｆ）において調製されたＲＮａｓｅＨ反応溶液は、ＲＮａｓｅＨ反応が起こる条件に置かれる。具体的には、ＲＮａｓｅＨ反応溶液は、摂氏２０度〜摂氏４０度の温度で１０〜６０分の間、静置される。
工程（ｇ）は、工程（ｆ）の後に行われる。工程（ｆ）において調製されたＲＮａｓｅＨ反応溶液は、ＲＮａｓｅＨ反応が起こる条件に置かれる。具体的には、ＲＮａｓｅＨ反応溶液は、摂氏２０度〜摂氏４０度の温度で１０〜６０分の間、静置される。
（工程（ｈ））
工程（ｈ）は、工程（ｇ）の後に行われる。工程（ｈ）においては、ＲＮａｓｅＨ反応溶液からの蛍光の有無が観察される。
工程（ｈ）は、工程（ｇ）の後に行われる。工程（ｈ）においては、ＲＮａｓｅＨ反応溶液からの蛍光の有無が観察される。
工程（ａ）における水溶液が、ＨｅＬａ細胞のようなガン細胞を含有している場合、工程（ｂ）において多くのテロメラーゼ反応産物が得られる。そのため、工程（ｆ）において、多くの第１ＤＮＡ（すなわち、ＴＳプライマーから伸長されたＤＮＡ）が得られる。工程（ｇ）では、プローブＲＮＡが、工程（ｆ）で得られた第１ＤＮＡにハイブリダイズし、このハイブリダイズしたプローブＲＮＡはＲＮａｓｅＨ酵素によって切断される。プローブＲＮＡの切断によって、プローブＲＮＡの一端および他端に修飾された蛍光基および消光基の距離は広がるため、蛍光基からの蛍光強度は上昇する。
一方、工程（ａ）における水溶液が、ガン細胞を含有していない場合、工程（ｂ）においてテロメラーゼ反応産物が得られない。そのため、工程（ｆ）において、第１ＤＮＡが得られない。工程（ｇ）においては、ＲＮａｓｅＨ反応溶液は、第１ＤＮＡを含有しないため、プローブＲＮＡはＲＮａｓｅＨ酵素によって切断されない。このため、蛍光基および消光基の距離は変わらないままなので、蛍光強度は変化しない。
従って、ＲＮａｓｅＨ反応溶液からの蛍光がある場合には、水溶液はガン細胞を含有すると判定される。一方、ＲＮａｓｅＨ反応溶液からの蛍光がない（または極めて弱い）場合には、水溶液はガン細胞を含有しないと判定される。後述される実施例１〜実施例７において実証されるように、本発明においては、水溶液が２つしかガン細胞を含有していない場合であっても、当該水溶液がガン細胞を含有していると正確に判定できる。
（実施例）
以下、実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。
以下、実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。
（実施例１）
まず、テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄが調製された。表１は、テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄの組成の詳細を示す。
まず、テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄが調製された。表１は、テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄの組成の詳細を示す。
１０×Ｂｕｆｆｅｒは、２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、６３０ｍＭのＫＣｌ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０、および１０ｍＭのＥＤＴＡを含有していた。１０×Ｂｕｆｆｅｒに含有されるこれらの試薬は、和光純薬工業株式会社より入手された。
５０×ｄＮＴＰ ｍｉｘは、２．５ｍＭ ｄＡＴＰ、２．５ｍＭ ｄＴＴＰ、２．５ｍＭ ｄＣＴＰ、および２．５ｍＭ ｄＧＴＰを含有していた。５０×ｄＮＴＰ メルクミリポア社より入手された。
Ｂ−ＴＳプライマーは、ビオチンにより修飾された５’末端を有するＴＳプライマー（配列番号：０１）であった。Ｂ−ＴＳプライマーは、つくばオリゴサービス株式会社より入手された。
λＤＮＡは、タカラバイオ株式会社より入手された。
ＨｅＬａ細胞を含有する水溶液（メルクミリポア社より入手、含有されるＨｅＬａ細胞の数は１０万個であった）が、CHAPS lysisバッファー（メルクミリポア社より入手）を用いて希釈された。このようにして、溶液Ｂ、溶液Ｃ、および溶液Ｄのための３種類のＨｅＬａ細胞溶解液を得た。
テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄは、摂氏３７度の温度で３０分間静置された。次いで、テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄは、摂氏９５度の温度で１０分間加熱された。最後に、テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄは、摂氏４度まで冷却された。このようにして、テロメラーゼ反応産物が得られた。
次に、各テロメラーゼ反応溶液Ａ〜Ｄは、ストレプトアビジンによって被覆された磁性粒子を含有する磁性粒子溶液と混合された。磁性粒子溶液は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社より、商品名：Dynabeads M-280 Streptavidinとして入手された磁性粒子溶液は、20mg/mLの濃度および10μLの容量を有していた。このようにして、混合液Ａ〜Ｄが調製された。次いで、混合液Ａ〜Ｄは、摂氏２５度の温度で３０分間振盪された。このようにして、テロメラーゼ反応産物は磁性粒子の表面上に結合された。
混合液Ａ〜Ｄは、磁石上に静置された。次いで、上清のみが捨てられ、かつ磁性粒子を含有する沈殿物が回収された。沈殿物に含有される磁性粒子は、Tris-HCl（pH7.5、10mM）およびNaCl（1M）を含有する洗浄液によって洗浄された。磁性粒子は、純水によってさらに洗浄された。
次に、表２に示されるＰＣＲ溶液が調製された。磁性粒子がＰＣＲ溶液に添加され、ＰＣＲ溶液Ａ〜Ｄが調製された。
10×LA ＰＣＲ Buffer II (Mg2+ plus)および5 U/μL TaKaRa LA Taq HSは、タカラバイオ株式会社より入手された。
フォワードプライマーは、何も修飾されていないＴＳプライマー（配列番号：０１）であった。リバースプライマーは、5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’（配列番号：０２）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであった。いずれのプライマーも、つくばオリゴサービス株式会社より入手された。
各ＰＣＲ溶液Ａ〜Ｄに含有されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーの終濃度は、それぞれ１μMと０．０２μMであった。
ＰＣＲ溶液Ａ〜Ｄは、表３に示されるＰＣＲ条件下に置かれた。このようにして、磁性粒子の表面上に結合されたテロメラーゼ反応産物を鋳型として用いて、ＰＣＲが行われた。続いて、ＰＣＲ溶液Ａ〜Ｄは、摂氏４度に冷却された。ＰＣＲ溶液Ａ〜Ｄは、磁石上に静置された。次いで、磁石上に静置されたＰＣＲ溶液Ａ〜Ｄから、上清Ａ〜Ｄが回収された。
次に、表４に示されるＲＮａｓｅＨ反応溶液が調製された。各上清Ａ〜ＤにＲＮａｓｅＨ反応溶液が添加され、ＲＮａｓｅＨ反応溶液Ａ〜Ｄが調製された。
プローブＲＮＡは、5’−CCCUAACCC−3’（配列番号：03）のＲＮＡ配列により表されるプローブであった。プローブＲＮＡの５’末端および３’末端は、それぞれ蛍光基および消光基として作用するFITCおよびDabcylによって修飾されていた。プローブＲＮＡは、つくばオリゴサービス株式会社より入手された。10U/μL ＲＮａｓｅＨは、タカラバイオ株式会社より入手された。
ＲＮａｓｅＨ反応溶液Ａ〜Ｄは、摂氏３７度の温度で２０分間、静置された。このようにして、ＲＮａｓｅＨ反応が行われた。次いで、EDTA溶液（pH：8、500mM、10μL）がＲＮａｓｅＨ反応溶液Ａ〜Ｄに添加され、ＲＮａｓｅＨ反応を停止した。このようにして、反応溶液Ａ〜Ｄが得られた。
最後に、各反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度が、蛍光測定装置（テカンジャパン株式会社より入手、商品名：「インフィニットM1000プロ」）を用いて測定された。励起波長は４８２ナノメートルであった。蛍光波長は、５２０ナノメートルであった。測定温度は、摂氏２５度であった。以下、用語「蛍光強度」とは、反応溶液Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤに由来する蛍光強度値から反応溶液Ａに由来する蛍光強度値を引き算することによって算出される値を意味する。言うまでもないが、反応溶液Ａの蛍光強度は０に等しい。また、反応溶液Ａは、ＨｅＬａ細胞のようなガン細胞を全く含有しないことに留意せよ。
以下の表５は、実施例１における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表５から明らかなように、実施例１では、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（実施例２）
実施例２では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０４μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
実施例２では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０４μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表６は、実施例２における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表６から明らかなように、実施例２でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（実施例３）
実施例３では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０６μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
実施例３では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０６μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表７は、実施例３における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表７から明らかなように、実施例３でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（実施例４）
実施例４では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．５μＭおよび０．０２μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
実施例４では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．５μＭおよび０．０２μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表８は、実施例４における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表８から明らかなように、実施例４でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（実施例５）
実施例５では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．５μＭおよび０．０６μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
実施例５では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．５μＭおよび０．０６μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表９は、実施例５における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表９から明らかなように、実施例５でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（実施例６）
実施例６では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．１μＭおよび０．０２μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
実施例６では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．１μＭおよび０．０２μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１０は、実施例６における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１０から明らかなように、実施例６でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（実施例７）
実施例７では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．１μＭおよび０．０６μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
実施例７では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ０．１μＭおよび０．０６μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１１は、実施例７における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１１から明らかなように、実施例７でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合であっても、反応溶液がＨｅＬａ細胞を含有していると判定できるほど蛍光強度は高い。
（比較例１）
比較例１では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０８μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
比較例１では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０８μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１２は、比較例１における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１２から明らかなように、比較例１では、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
（比較例２）
比較例２では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．１μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
比較例２では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．１μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１３は、比較例２における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１３から明らかなように、比較例２でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
（比較例３）
比較例３では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．５μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
比較例３では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．５μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１４は、比較例３における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１４から明らかなように、比較例３でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
（比較例４）
比較例４では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０１μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
比較例４では、工程（ｄ）におけるリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度が０．０１μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１５は、比較例４における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１５から明らかなように、比較例４では、反応溶液に含有されるＨｅＬａ細胞の数が２０個以下である場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂおよび反応溶液Ｃ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
（比較例５）
比較例５では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ２μＭおよび０．０２μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
比較例５では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ２μＭおよび０．０２μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１６は、比較例５における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１６から明らかなように、比較例５でも、反応溶液が２つしかＨｅＬａ細胞を含有していない場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
（比較例６）
比較例６では、以下の項目（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を除き、実施例１と同様の実験が行われた。
（Ｉ） 工程（ｄ）におけるＴＳプライマーの終濃度は、１０μＭであった。
（ＩＩ） 工程（ｄ）におけるリバースプライマーは、ＣＸ−ｅｘｔプライマー（配列番号：０４）であった。
（ＩＩＩ） リバースプライマー（すなわち、ＣＸ−ｅｘｔプライマー）の終濃度は、１μＭであった。
比較例６では、以下の項目（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を除き、実施例１と同様の実験が行われた。
（Ｉ） 工程（ｄ）におけるＴＳプライマーの終濃度は、１０μＭであった。
（ＩＩ） 工程（ｄ）におけるリバースプライマーは、ＣＸ−ｅｘｔプライマー（配列番号：０４）であった。
（ＩＩＩ） リバースプライマー（すなわち、ＣＸ−ｅｘｔプライマー）の終濃度は、１μＭであった。
以下の表１７は、比較例６における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１７から明らかなように、比較例６では、反応溶液に含有されるＨｅＬａ細胞の数が２０個以下である場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂおよび反応溶液Ｃ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
（比較例７）
比較例７では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ１０μＭおよび１μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
比較例７では、工程（ｄ）におけるＴＳプライマー（配列番号：０１）およびリバースプライマー（配列番号：０２）の終濃度がそれぞれ１０μＭおよび１μＭであったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
以下の表１８は、比較例７における反応溶液Ａ〜Ｄの蛍光強度を示す。
表１８から明らかなように、比較例７でも、反応溶液に含有されるＨｅＬａ細胞の数が２０個以下である場合、当該反応溶液（すなわち、反応溶液Ｂおよび反応溶液Ｃ）はＨｅＬａ細胞を含有していないと誤って判定されるほど蛍光強度は低い。
本発明は、たとえ水溶液が２つしかガン細胞を含有していない場合であっても、当該水溶液がガン細胞を含有していると判定できる方法を提供する。
Claims (5)
- 水溶液中のガン細胞の検出方法であって、以下の工程を具備する：
（ａ） ＴＳプライマー、ｄＴＴＰ、ｄＴＰ、およびｄＧＴＰを前記水溶液に添加し、テロメラーゼ反応溶液を調製する工程、ここで、
前記ＴＳプライマーは、5’−AATCCGTCGAGCAGAGTT−3’（配列番号：０１）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであり、
前記水溶液中は、ガン細胞を２個以上含有しており、
（ｂ） 前記工程（ａ）において調製されたテロメラーゼ反応溶液を、テロメラーゼ反応が起こる条件に置き、テロメラーゼ反応産物を得る工程、
（ｃ） 工程（ｂ）において得られたテロメラーゼ反応産物を固相に結合する工程、
（ｄ） 工程（ｃ）において固相に結合されたテロメラーゼ反応産物の全量に、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、前記ＴＳプライマー、およびリバースプライマーを混合し、ＰＣＲ溶液を調製する工程、ここで、
前記リバースプライマーは、5’−GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC−3’（配列番号：０２）のＤＮＡ配列により表されるプライマーであり、
前記ＰＣＲ溶液に含有されるＴＳプライマーは、０．１μＭ以上１μＭ以下の濃度を有し、かつ
前記ＰＣＲ溶液に含有されるリバースプライマーは、０．０２μＭ以上０．０６μＭ以下の濃度を有し、
（ｅ） 工程（ｄ）において調製されたＰＣＲ溶液をＰＣＲが起こる条件に置き、ＰＣＲ産物を得る工程、ここで、
前記ＴＳプライマーは、前記ＰＣＲにおいてフォワードプライマーとして作用し、
（ｆ） 工程（ｅ）で得られたＰＣＲ産物に、プローブＲＮＡおよびＲＮａｓｅＨ酵素を混合して、ＲＮａｓｅＨ反応溶液を調製する工程、ここで、
前記プローブＲＮＡは、5’−CCCUAACCC−3’（配列番号：０３）のＲＮＡ配列、蛍光基、および消光基からなり、
前記プローブＲＮＡの一端および他端は、それぞれ前記蛍光基および前記消光基により修飾されており、かつ
前記消光基は、前記蛍光基からの蛍光を吸収することができ、
（ｇ） 工程（ｆ）において調製されたＲＮａｓｅＨ反応溶液を、ＲＮａｓｅＨ反応が起こる条件に置く工程、および
（ｈ） 前記工程（ｇ）の後に、前記ＲＮａｓｅＨ反応溶液の蛍光強度を測定し、前記ガン細胞を検出する工程。 - 請求項１に記載の方法であって、
前記水溶液が、細胞溶解液および組織溶解液からなる群から選択される少なくとも１つを含有する。
- 請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ａ）において、λＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、およびＭ１３ファージベクターからなる群から選択される少なくとも１つのＤＮＡがさらに水溶液に添加される。
- 請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ａ）において添加されるＴＳプライマーの５’末端がビオチンによって修飾されており、かつ
前記固相が、ストレプトアビジンで被覆された磁性粒子から形成されている。
- 請求項１に記載の方法であって、
前記蛍光基が、フルオレセインイソチオシアネート(fluorescein isothiocyanate)から形成されており、かつ
前記消光基が、4-[4-(ジメチルアミノ)フェニルアゾ]安息香酸(4-[4-(dimethylamino)phenylazo]benzoic acid) から形成されている。
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