METODOS Y COMPOSICIONES PARA DETECTAR ACTIVIDAD TELOMERASA REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD (ES) RELACIONADA(S) Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana Número de Serie 60/425,620, presentada el 12 de noviembre del 2002, la descripción de la cual es incorporada en la presente por referencia. CAMPO TECNICO La presente invención generalmente se relaciona a la tecnología de diagnóstico y pronóstico médico. En particular, la presente invención se relaciona a un método para la detección de actividad telomerasa. ANTECEDENTES La telomerasa es una enzima que sintetiza telómeros sobre extremos del cromosoma. Los telómeros . son- secuencias de DNA encontrados en los extremos de cromosomas eucarióticos que mantienen la fidelidad de la información genética durante la replicación. Bajo circunstancias normales, los telómeros llegan a ser más cortos y más cortos con cada ciclo de división celular. Un telómero suficientemente corto se cree que señaliza las células para detener la división. La telomerasa pertenece a una clase de enzimas conocidas como transcriptasas inversas que usan RNA como una plantilla para crear DNA. La telomerasa contiene tanto RNA y componentes de proteína. La porción de RNA de la enzima enlaza al DNA en el telómero mientras que el componente de proteina induce las subunidades de DNA en la región y las une al extremo del cromosoma. La telomerasa luego alarga la hebra rica en G de las terminales cromosómicas al adicionar repeticiones teloméricas. Este alargamiento ocurre mediante la transcripción inversa de una parte del componente RNA de telomerasa, que contiene una secuencia complementaria a la repetición del telómero. Después de la extensión catalizada con telomerasa de la hebra rica en G, la hebra de DNA complementaria del telómero presumiblemente se replica por medios más convencionales. En el caso de organismos eucarióticos las telomerasas están compuestas de una acumulación de secuencias de nucleótidos definidas repetidas (repeticiones) que, por ejemplo, contiene la secuencia TTAGGG en humanos. La actividad telomerasa no es detectable en tejidos normales excepto en las células de la. linea germinal. Las células de la linea germinal, cuyos extremos crornosómieos deben ser mantenidos a través de rondas repetidas de replicación de DNA, no disminuyen su longitud de telómero con el tiempo, presumiblemente debido a la actividad telomerasa. Las células madre de tejidos de renovación expresan muy bajos niveles de telomerasa y sus telómeros se acortan con múltiples divisiones celulares. La actividad telomerasa es ocasionalmente detectada en tejidos adyacentes a tumores que reflejan posiblemente la presencia de micrometastasis oculta. La telomerasa se cree que tiene una función en el proceso de la senectud de la célula. La represión de la actividad telomerasa en células somáticas es probable que sea importante en controlar el número de veces que ellas se dividen. En realidad, la longitud de los telómeros en fibroblastos primarios se correlaciona bien con el número de divisiones de estas células que pueden someterse antes de que envejezcan. La pérdida de DNA telomérico puede señalizar a la célula el fin de su potencial replicativo, como parte de un mecanismo global mediante el cual los organismos multicelulares limitan la proliferación de sus células. Debido a su función en el control de la replicación, la telomerasa también se ha implicado recientemente en la oncogénesis. La actividad telomerasa se ha detectado en la mayoría de células de tumor. Se ha sugerido que la telomerasa es responsable para el crecimiento no verificado de células de cáncer humanas. Distintas a las células normales, en las células de cáncer la telomerasa aparece para otorgar la inmortalidad de la célula al mantener la longitud del telómero de modo que la célula nunca recibe una señal para detener la división. La enzima telomerasa es un objetivo ideal para la quimioterapia debido a que esta enzima es activa en aproximadamente 90 por ciento de tumores humanos, pero inactiva en la mayoría de las células normales.
Las compañías farmacéuticas han clasificado miles de compuestos para encontrar agentes capaces de bloquear la telomerasa. Un método llamado como protocolo de amplificación de repetición telomérica (TRAP) se ha desarrollado para medir la actividad telomerasa. TRAP está basado en la detección In vitro de la actividad de la enzima. Brevemente un oligonucleótido sintético derivado de la secuencia de telómero se usa como un sustrato. Este sustrato es alargado por la telomerasa en una muestra de prueba y el producto de alargamiento luego es amplificado y cuantificado . La descripción detallada de los métodos TRAP se puede encontrar en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,891,639 de Harley y colaboradores, (después en la presente Harley) y la patente norteamericana No, 6,221,584 de Emrich y colaboradores, (después en la presente Emrich) . Recientemente, un número de grupos de investigación han reportado métodos de TRAP modificados usando la tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de tiempo real (Ver, por ejemplo, Hou y colaboradores, Clin. Chem. 47:519-524, 2001; Elmore y colaboradores, Diagn. Mol. Pathol., 11, 177-185, 2002; y Wege y colaboradores, Nucleic Acids Res., 31:E3-3, 2003). Específicamente, la tecnología de PCR en tiempo real se ha empleado para proporcionar una cuantificación más rápida y más sensible del producto de alargamiento de telomerasa. Los TRAPs actuales típicamente incluyen múltiples etapas de incubación y transferencia de muestra de un tubo a otro después de cada etapa de incubación. El proceso de transferencia es consumidor de tiempo y propenso a la contaminación y error de operación (por ejemplo, adición de muestras a un tubo o cavidad estropeada) . Los TRAPs actuales usualmente inician con un extracto de células o de tejido. Puesto que las telomerasas, que contienen tanto RWA y componentes de proteína, se someten a la digestión de proteasas y RNAsas en el extracto, inhibidores de proteasa y/o inhibidores de RNAsa frecuentemente se necesitan para impedir la degradación de las telomerasas. La adición de inhibidores de proteasa y/o inhibidores de KNAsa al extracto incrementa el costo del análisis. Así, existe una necesidad por un ensayo de telomerasa que sea más flexible y se puede realizar fácil y rápidamente a bajo costo. BREVE DESCRIPCION Se describe un método para determinar actividad telomerasa usando extensión de cebador seguida con cuantificación de PCR de tiempo real. El método proporciona una medición rápida, sensible y precisa para la actividad telomerasa en una muestra biológica. En una modalidad, el método incluye las etapas de : (1) adicionar la muestra biológica al tubo de reacción que contiene una primera mezcla de reacción que tiene un primer cebador y trifosfatos de nucleósidos, una segunda mezcla de reacción que tiene un segundo cebador y una polimerasa de DNA y una capa de cera que separa la primera mezcla de reacción de la segunda mezcla de reacción; (2) incubar la muestra biológica con la primera mezcla de reacción bajo condiciones adecuadas para una telomerasa para producir un producto de extensión del primer cebador; (3) mezclar el producto de extensión con la segunda mezcla de reacción; (4) amplificar el producto de extensión usando PCR de tiempo real bajo condiciones que permiten la detección de actividad telomerasa de una sola célula 293T; y (5) cuantificar el producto de extensión amplificado usando una plantilla de control que es amplificada bajo las condiciones en la etapa (4) . El diseño de tubo individual de la modalidad simplifica el procedimiento experimental y reduce el error experimental. En otra modalidad, el método de detección incluye las etapas de: (1) introducir en una célula de ' muestra un primer cebador y trifosfatos de nucleósidos; (2) incubar la célula de muestra bajo condiciones adecuadas para una telomerasa para producir un producto de extensión del primer cebador dentro de la célula (extensión del cebador in situ) ; (3) amplificar el producto de extensión usando PCR de tiempo real; y (4) cuantificar el producto de extensión amplificado usando una plantilla de control que es amplificada bajo las condiciones en la etapa (3) . En esta modalidad, el producto de extensión se produce dentro de una célula de muestra intacta y se puede conservar bajo condiciones apropiadas durante un tiempo prolongado antes de la terminación de la etapa de cuantificación. También se describe un kit de reactivos para llevar a cabo el método y para diagnosticar enfermedades relacionadas con telomerasa . En una modalidad, el kit de reactivos incluye (1) tubos de reacción que contienen una primera mezcla de reacción que tiene un primer cebador y trifosfatos de nucleósidos, una segunda mezcla de reacción que tiene un segundo cebador y una polimerasa de DNA, y una capa de cera que separa la primera mezcla de reacción de la segunda mezcla de reacción; (2) tubos de control o cavidades que contienen una primera mezcla de reacción que tiene un primer cebador y trifosfatos de nucleósidos, una segunda mezcla de reacción que tiene un segundo cebador, una polimerasa de DNA y una plantilla de control, y una capa de cera que separa la primera mezcla de reacción de la segunda mezcla de reacción. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La descripción detallada se referirá a los siguientes dibujos, .en los cuales · números similares se refieren a elementos similares, y en los cuales: La Figura 1 es un dibujo esquemático que representa una modalidad del método para detectar actividad telomerasa. La Figura 2 es un dibujo esquemático que representa una etapa de extensión adicional en el método para detectar actividad telomerasa. La Figura 3 es un dibujo esquemático que representa otra modalidad del método para detectar actividad telomerasa. Las Figuras 4A y 4B son una gráfica del ciclo de fluorescencia/PCR y una gráfica del ciclo umbral/número de células, respectivamente, que demuestra la sensibilidad del método de detección. Las Figuras 5A y 5B son una gráfica del ciclo de fluorescencia/PCR y una gráfica del ciclo' de umbral/número de moléculas de plantilla, respectivamente, generadas por la PCR de tiempo real usando una plantilla de control. La Figura 6 es una gráfica que muestra la regresión lineal entre el número de células de la muestra y el ciclo umbral o entre el número de moléculas de la plantilla y el ciclo umbral. La Figura 7 es una gráfica de barras que muestra la actividad telomerasa en varias lineas de células y tejidos. La Figura 8 es una gráfica del ciclo de florescencia/PCR que muestra la detección de actividad telomerasa en células sometidas a la extensión de cebador In situ después del tratamiento con jeringa. La Figura 9 es una gráfica del ciclo de florescencia/PCR que muestra la detección de actividad telomerasa en células sometidas a la extensión de cebador in situ después de la precipitación con fosfato de calcio. DESCRIPCION DETALLADA La Figura 1 muestra un método 100 para detectar y cuantificar actividad telomerasa en una muestra biológica. Primero, la muestra biológica se adiciona a un tubo de reacción que contiene una primera mezcla de reacción que tiene un primer cebador y trifosfatos de nucleósidos y una segunda mezcla de reacción que tiene un segundo cebador y una polimerasa de DNA (etapa 102) . La primera mezcla de reacción se separa de la segunda mezcla de reacción mediante una capa de cera que se funde a altas temperaturas. La muestra biológica se mezcla con la primera mezcla de reacción, que ocupa la porción superior del tubo de reacción y se incuba bajo condiciones adecuadas para una telomerasa para producir un producto de extensión del primer cebador (etapa 104) . El producto de extensión luego se mezcla con la segunda mezcla de reacción al fundir la capa de cera (etapa 108) y se amplifica mediante la PCR de tiempo real (etapa 110) . El primer cebador no extendido en la primera mezcla de reacción y el segundo cebador en la segunda mezcla de reacción forman el par de cebadores para la amplificación de PCR. La actividad telomerasa en la muestra biológica luego se cuantifica al comparar la cantidad de producto de PCR en el tubo de reacción con la cantidad de producto de PCR en los tubos de control que tienen cantidades conocidas de una plantilla de control (etapa 112) . En esta modalidad, las condiciones experimentales para la primera extensión de cebador y la reacción de PCR se han optimizado para permitir la detección de actividad telomerasa de una sola célula 293T. La muestra biológica incluye tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, asi como tejidos, células y fluidos biológicos presentes dentro de un sujeto. La muestra biológica también incluye células primarias, células transformadas y cualquiera de otras células cultivadas. Puesto que el método de la presente invención detecta la actividad telomerasa una ribonucleoproteina sensible a RNAsa y no simplemente la presencia del RA o componentes de proteina de telomerasa, el método requiere muestras de células o de tejido enzimáticamente activas. En una modalidad, la muestra biológica es una muestra de tejido aislada por medios convencionales de un sujeto, por ejemplo, una biopsia. De preferencia, la muestra biológica es un extracto de células o de tejido, en particular un extracto de células o tejidos humanos. El extracto puede ser producido mediante la congelación/descongelación repetida de células, mediante la homogenización de células o tejidos, o mediante el lisado de células o tejidos en una solución reguladora de lisis que contiene un detergente no iónico y/o zwiteriónico .
Ejemplos de detergente no iónico incluye, pero no está limitado a, Tween 20, Tritón X-100, Tritón X-114, polidocanol (Thesit) ,. NP-40, n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecil-beta-maltósido, octanoil-N-metilglucamida (MEGA-8) , decanoil-N-metilglucamida (MEGA-10) e isotridecil-poli (etilenglicoléter) n . Ejemplos de los detergentes zwiteriónicos incluyen, pero no están limitados a CHAPS (3- [ (3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propano-sulfonato) , CHAPSO 3- [ (3-colamidopropil] dimetil-amonio] 2-hidroxi-l-propano-sulfonato) , N-docedil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propano-sulfonato y digitonina. La cantidad de detergente en la solución reguladora de lisis puede variar de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 2% en peso. En una modalidad, la solución reguladora de lisis contiene aproximadamente 0.5% de detergente en peso. Puesto que la telomerasa contiene tanto R A y componentes de proteína, proteasa y/o inhibidores de RNAsa, se pueden adicionar al extracto para impedir la destrucción de telomerasas en el extracto por otras proteasas celulares. Ejemplos de los inhibidores de proteasa incluyen, pero no están limitados a, amastaina, fluoruro de
4-amidinofenilmetanosulfonilo (AMPSF) , antipaina, aprotinina, bestatina, quimostatina, cistatina, 3, -dicloroisocumarina, ebelactona A y B, elastatinal, ácido etilendiamina tetra-acético (EDTA) , ácido etilenglicol tetra acético (EGTA) , leupeptina, pestatina A, fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) , fosforamidon, tócil lisil clorometilcetona (TLCK) , tosil fenilalanil clorometilcetona (TPCK) e inhibidores de tripsina. Ejemplos de inhibidores de R Asa incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de RNAsa de tipo pancreático, inhibidores de RNAsa de placenta humana y pirocarbonato de dietilo (DEPC) . El tubo de reacción puede ser un recipiente de cualquier forma o tamaño que se ajuste al requerimiento de una aplicación particular del método. Típicamente, el tubo de reacción es un tubo de PCR o una cavidad de PCR como es bien conocido por un experto en la técnica. El primer cebador en la primera mezcla de reacción es un oligodesoxiribonucleótido adecuado como un sustrato de telomerasa. El primer cebador sirve para dos funciones: sirve como un sustrato para la telomerasa para producir un producto de extensión, y también sirve como un cebador en la reacción de PCR subsecuente. En una modalidad, la longitud del primer cebador es de 10-60 nucleótidos. En otra modalidad, la longitud del primer cebador es de 12-30 nucleótidos. De , preferencia, el primer cebador, que sirve como el sustrato de telomerasa, no contiene una secuencia de repetición telomérica completa de la telomerasa particular que usará el primer cebador como un sustrato. Por ejemplo, la telomerasa humana adiciona repeticiones teloméricas de la secuencia 5'-TTAGGG~3' (SEQ ID N0:1). Por consiguiente, si uno está utilizando el presente método para analizar la actividad telomerasa humana, el sustrato de telomerasa debe ser un sustrato de telomerasa humana que carece de la secuencia de repetición completa 5' -TTAGGG-3' . La razón es que la telomerasa puede extender el sustrato de telomerasa solamente mediante la adición de repeticiones teloméricas . Por lo tanto, el segundo cebador, que está para formar un par de cebadores con el primer cebador en la reacción de PCR, necesariamente comprenderá una secuencia complementaria a una repetición telomérica. Si el primer cebador (es decir, el sustrato de telomerasa) empleado en la reacción de extensión de telomerasa comprende una repetición telomérica completa, entonces el segundo cebador empleado en la reacción de PCR podría hibridarse fácilmente al primer cebador no extendido y formar dímeros de cebador que potencialmente conducirían a resultados de PCR negativos . Los trifosfatos de nucleósidos en la mezcla de reacción incluyen, pero no están limitados a, trifosfato de desoxidenosina (dATP) , . trifosfato de desoxiguanosina (dGTP) , trifosfato de desoxiuridina (dUTP) , trifosfato de desoxitimidina (dTTP) y trifosfato de desoxicitidina (dCTP) . En una modalidad, la mezcla de reacción contiene dATP, dGTP, dCTP y uno de dUTP y DTTP, en relación molar igual. Los trifosfatos de nucleósidos son designados colectivamente como d TPs . Además del primer cebador y los trifosfatos de nucleósidos, la primera mezcla de reacción también puede contener un sistema regulador para mantener un pH óptimo para la reacción de extensión de cebador para la telomerasa. Ejemplos de los sistemas reguladores incluyen, pero no están limitados a, sistema regulador de fosfato, sistema regulador de citrato, sistema regulador de borato, Tris-(hidroximetil) aminometano, 3- [ (3-colamidopropil) dimetil-amonio] -1-propano sulfonato (CHAPS) , N-[2-hidroxietil]piperazina-N'' -2- [ácido etanosulfónico] (HEPES) y ácido 3- [N-morfolino] propanosulfónico (MOPS) . ' Las condiciones adecuadas para una telomerasa para producir un producto de extensión de primer cebador son bien conocidas en la técnica. Típicamente, la reacción de extensión de telómero se realiza aproximadamente 20-30°C durante aproximadamente 10-60 min, de preferencia aproximadamente 25°C o aproximadamente 30°C durante aproximadamente 15-30 min, y mucho más de preferencia de aproximadamente 25°C durante aproximadamente 20 min. El producto de extensión de la etapa 104 se puede someter al alargamiento independiente de plantilla adicional (etapa 106) . Este alargamiento de preferencia se obtiene por medio de una reacción enzimática, por ejemplo, mediante la unión de nucleótidos usando transferasa terminal o mediante la ligación de fragmentos de DNA cortos usando ligasa de DNA. En una modalidad un extremo poliA se adiciona al extremo 3' del producto de extensión mediante la transferasa terminal. En otra modalidad, un oligómero de DNA corto de 10-20 nucleótidos se liga al extremo 3' del producto de extensión. Estas modificaciones generan una secuencia única para el segundo cebador y de esta manera permite la inclusión de las secuencias de repetición telomérica completa en el primer cebador. Como se muestra en la Figura 2, un primer cebador que contiene una repetición telomérica humana TTAGGG se usa como un sustrato de telomerasa humana. Después de la extensión mediada por telomerasa, el producto de extensión tendrá una secuencia 3' de (TTAGGG) n TTAGGGTTAGGG-3' , donde n es un número entero que es igual a o es mayor que cero. Después del alargamiento independiente de plantilla adicional que adiciona un extremo poliA de por lo menos 10 nucleótidos del extremo 3' del producto de extensión, el producto de extensión alargado tendrá una secuencia 3' de (TTAGGG) nTTAGGGTTAGGGAAAAAAAAAAAn,-3' , donde n es un número entero que es igual a o es mayor que cero. El segundo cebador luego se puede diseñar para tener una secuencia complementaria a la unión de la secuencia de repetición telomérica y la secuencia poliA en el extremo 3' en el producto de extensión alargado . Como se muestra en la Figura 2, un segundo cebador complementario a la unión de las repeticiones teloméricas y los nucleótidos adicionales debe ser capaz de distinguir el primer cebador no extendido del producto extendido, mientras que el primer cebador no tenga una secuencia de repetición telomérica completa en su extremo 3' . En la ausencia de la etapa de alargamiento adicional 106, el segundo cebador en la segunda mezcla de reacción típicamente contiene múltiples ' secuencias de repetición teloméricas imperfectas y por lo menos una secuencia de repetición telomérica perfecta para minimizar la formación de productos de PCR no específicos tal como el dímero de cebador . La polimerasa de DNA en la segunda mezcla de reacción puede ser cualquier polimerasa de DNA adecuada para las condiciones de PCR estándares. Tales enzimas son bien conocidas para un experto en la técnica. En una modalidad, la segunda mezcla de reacción también contiene una sal de magnesio que proporciona el magnesio óptimo para la amplificación de PCR del producto de extensión. En otra modalidad, la segunda mezcla de reacción también contiene el primer cebador, o dNTP, o ambos. La capa de cera que separa la primera mezcla de reacción de la segunda mezcla de reacción debe tener una temperatura de fusión dentro del intervalo dentro de aproximadamente 50-90 °C, y de preferencia dentro del intervalo de aproximadamente 60-80°C. En. una modalidad, una cantidad pequeñísima de un tinte se puede adicionar a una de la primera mezcla de reacción y la segunda mezcla de reacción para monitorear la posible fuga a través de la capa de cera antes de la amplificación de PCR. En otra modalidad, la segunda mezcla de reacción se premezcla con la cera y se confina dentro de la capa de cera cuando la cera solidifica. Los contenidos de la segunda mezcla de reacción son liberados cuando la capa de cera es fundida a una temperatura más alta. El producto de extensión (con o sin alargamiento adicional) se cuantifica mediante la amplificación de PCR de tiempo real . Como es conocido para un experto en la técnica la amplificación de PCR típicamente se obtiene al adicionar una enzima termoestable y un par de cebadores a una mezcla de reacción que contiene una plantilla y que va a través de termociclos múltiples. En el método 100, el primer cebador no extendido en la primera mezcla de reacción sirve como el cebador de PCR 5' y el segundo cebador en la segunda mezcla de reacción sirve como el cebador de PCR 3' . El producto de PCR en una reacción de PCR de tiempo real se puede detectar usando la tecnología de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) . La acumulación de un producto de PCR específico se puede medir al comparar la porción lineal de cada amplificación a una curva estándar generada usando una plantilla conocida.
En una modalidad, la reacción de PCR se lleva a cabo normalmente pero con la adición de un oligonucleótido de sonda fluorescentemente marcado que enlaza una secuencia entre los dos cebadores de PCR flanqueantes. El método depende de la actividad de 5' exonucleasa de la Taq polimerasa para segmentar un nucleótido fluorescentemente marcado del extremo .5' de la sonda. El oligonucleótido de sonda también tiene un suprimidor fluorescente en el extremo 3' que suprime la fluorescencia global, por lo tanto, cuando el nucleótido marcado 5' es removido el efecto de supresión es perdido debido a que la distancia entre los dos fluoróforos es demasiado grande para interferir entre sí. Cada ciclo produce incrementos adicionales en la fluorescencia que permite la reacción de PCR completa que se ha seguido en tiempo real. La cantidad de DNA de plantilla presente en la reacción se puede calcular al comparar la parte lineal de la amplificación exponencial con una curva estándar. Ejemplos de tal sistema de detección incluyen, pero no están limitados a, el sistema Taqman® (Applied Biosystems, Foster City, CA) . En otra modalidad, el producto de PCR se detecta al usar cebadores fluorogénicos de una sola marca, tal como los dejadores LUX® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y cebadores Amplifluor RP® (Chemicon, Temecula, CA) . Los cebadores producen una cantidad incrementada de emisión de fluorescencia cuando el cebador fluorogénico es incorporado en el producto de PCR de doble hebra. La cantidad del producto de PCR luego se determina basado en la fluorescencia producida durante la etapa de amplificación de cada ciclo de PCR en el tubo de reacción cerrado. En todavía otra modalidad, el producto de PCR se detecta usando un tinte - fluorescente que enlaza preferencialmente al DNA de doble hebra. El tinte, tal como SYBR® Green, luego puede cuantificar precisamente la cantidad de producto de doble hebra hecho en la presencia de cebadores de oligonucleótido de una sola hebra. La actividad telomerasa se cuantifica al comparar el incremento de fluorescencia en el tubo de reacción con respecto al incremento de fluorescencia en un tubo de control que contiene una cantidad conocida de una plantilla de control (etapa 110) . Típicamente, la PCR de tiempo real se realiza para generar una curva estándar usando un conjunto de tubos o cavidades de control que contienen diferentes diluciones de la plantilla de control. El producto de extensión en los tubos o cavidades de prueba luego se amplifican bajo condiciones de PCR idénticos y la actividad telomerasa en los tubos o cavidades de prueba se cuantifican basado en la curva estándar. La actividad telomerasa usualmente se expresa como la cantidad de repeticiones teloméricas sintetizadas dentro de un cierto período de tiempo. Una plantilla de control preferida para telomerasa humana es TSR9, que tiene la secuencia de 5' -AATCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA GGGTTAG-3' (SEQ ID NO.2). En otra modalidad, el extracto de células o tejido se adiciona a una mezcla de reacción maestra que contiene el primer cebador, el segundo cebador, dNTPs, una polimerasa de DNA y un tinte fluorescente que enlaza preferencialmente al DNA de doble hebra. La extensión mediada por telomerasa y la amplificación de PCR se realizan consecutivamente en el mismo tubo de reacción. La Figura 3 muestra otro método 300 para la detección de actividad telomerasa. En esta modalidad, la etapa de extensión del cebador se realiza dentro de una célula intacta. Específicamente, el primer cebador y los trifosfatos de nucleósidos se introducen en una célula de muestra intacta (etapa 302) ; la célula de muestra luego se incuba bajo condiciones adecuadas para la telomerasa dentro de la célula para producir un producto de extensión del primer cebador mientras que se mantiene la integridad de la estructura celular (etapa 304) . La etapa 304 también es referida como la "etapa de extensión de cebador in situ" debido a que el producto de extensión es generado dentro de la célula de muestra. El producto de extensión luego es amplificado y cuantificado usando la PCR de tiempo real y una plantilla de control (etapa 308) . En una modalidad, la célula de muestra se mezcla con la segunda mezcla de reacción y se somete a la amplificación de PCR. En otra modalidad, la célula de muestra es lisada en una solución reguladora de lisis y el lisado se usa en la reacción de PCR de tiempo real . Alternativamente, la célula de muestra puede ser almacenada después de la terminación de la extensión de cebador mediada por telomerasa (etapa 306) . En esta modalidad, puesto que el producto de extensión está todavía dentro de una célula de muestra intacta, el producto de extensión puede ser mejor conservado que el producto de extensión generado con un extracto de célula/tejido. El método 300 de esta manera permite a un operador realizar la etapa de extensión de cebador mediada por telomerasa inmediatamente después de recibir la muestra, y almacenar el producto intermediario, es decir, la célula de muestra después de la etapa de extensión del cebador 304, para la cuantificación en un tiempo posterior. Las células de muestra pueden ser cultivadas en suspensión o como una monocapa. El primer cebador y dNTPs puede ser introducido en células usando métodos bien conocidos para un experto en la técnica. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE Dextrano, transfección de lipofectina/lipofectamina, electroporación, microinyección, sonicación, corte mecánico, (por ejemplo forzar células a través de una aguja de jeringa), y otros medios químicos o físicos para romper la membrana celular o mejorar la permeabilidad de la membrana celular. En una modalidad, las células se suspenden y se hacen pasar a través de una aguja de calibre 25 al menos una vez, de preferencia 2-5 veces. Las células luego se siembran en tubos o cavidades de reacción en un medio de cultivo que contiene el primer cebador y dNTPs. El efecto de cortamiento del paso a través de la aguja daña la membrana celular y permite que el primer cebador entre a las células. Las células tratadas con jeringa luego se incuban con el primer cebador y dNTPs para permitir la generación del producto de extensión mediante la telomerasa en la célula. En otra modalidad, el primer cebador y dNTPs se introduce en las células usando la precipitación con fosfato de calcio. La precipitación con fosfato de calcio se forma en la presencia del primer cebador y dNTP, y se adiciona a las células. Las células luego se incuban a 37°C durante aproximadamente 10-120 min para permitir la generación del producto de extensión mediante la telomerasa en la célula. Los métodos de la presente invención se pueden usar . como ensayos de diagnóstico para determinar la progresión o severidad de una enfermedad relacionada con telomerasa tal como la enfermedad de Hodgkin. La cuantificación de la actividad telomerasa también es útil, por ejemplo, para determinar la severidad de la enfermedad relacionada con telomerasa después del tratamiento. Los métodos de detección descritos en la presente se pueden realizar por ejemplo, al utilizar kits de diagnóstico preempacados que contienen una composición de extensión que contiene un primer cebador y trifosfatos de nucleósidos, y una composición de detección que contiene un segundo cebador, trifosfatos de nucleósidos, un tinte de enlace de DNA de doble hebra y una polimerasa de DNA. La composición de extensión es capaz de producir un producto de extensión desde ' el primer cebador cuando se mezcla con una telomerasa; y la composición de detección es capaz de amplificar el producto de extensión en una reacción de PCR y generar un producto de amplificación marcado para- la cuantificación. Los kits de diagnóstico pueden ser convenientemente utilizados, por ejemplo, en instalaciones clínicas para diagnosticar sujetos que exhiben síntomas o historia clínica de una enfermedad relacionada con telomerasa tal como la enfermedad de Hodgkin. Cualquier tipo de célula o tejido en el cual la telomerasa es expresada se puede utilizar en los ensayos de pronóstico o diagnóstico descritos en la presente. En una modalidad, la actividad telomerasa en una muestra biológica se determina y una actividad telomerasa incrementada sobre un nivel normal predeterminado indica una enfermedad relacionada con telomerasa tal como la enfermedad de Hodgkin. El método de detección descrito en la presente también se puede utilizar como un ensayo del pronóstico para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar enfermedad relacionada con telomerasa, tal como la enfermedad de Hodgkin, que está asociada con la actividad telomerasa aberrante. Además, el ensayo de pronóstico descrito en la presente se puede usar para determinar si un sujeto puede ser administrado con un fármaco candidato para tratar o impedir una enfermedad asociada con la actividad telomerasa aberrante. Asi, la presente invención proporciona métodos para determinar si un sujeto puede ser tratado efectivamente con un agente para una enfermedad asociada con actividad telomerasa aberrante. Los ensayos de pronóstico se pueden idear para determinar si un sujeto que se somete al tratamiento para una enfermedad relacionada con telomerasa tiene una pobre perspectiva para la supervivencia a largo plazo o progresión de enfermedad. Al establecer los perfiles de actividad telomerasa de diferentes etapas de la enfermedad, desde el inicio de etapas posteriores, un patrón de actividad puede emerger para correlacionarse con un perfil de actividad particular para la probabilidad incrementada de una pobre prognosis. La prognosis luego se puede usar para idear un p ograma de tratamiento más agresivo y aumentar la probabilidad de supervivencia a largo plazo y bienestar. De manera, similar, el método de detección de la presente, invención se puede usar en ensayos de clasificación o clínicos de fármacos básicos para monitorear la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos, moléculas pequeñas, proteínas, nucleótidos) sobre la actividad telomerasa. Por ejemplo, la efectividad de un agente determinado por un ensayo de clasificación para disminuir la actividad telomerasa, se puede inspeccionar en experimentos clínicos de sujetos que exhiben actividad telomerasa incrementada. En tales experimentos clínicos, la actividad telomerasa se puede usar como una "interpretación" del fenotipo de un tejido particular. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para inspeccionar la .efectividad del tratamiento de un sujeto con un agente, que incluye las etapas de (i) obtener una muestra de pre-administración del sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de actividad telomerasa en la muestra de pre-administración; (iii) obtener una o más muestras de post-administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de actividad telomerasa en las muestras de post-administración; (v) comparar el nivel de actividad telomerasa en la muestra de pre-administración con el nivel de actividad telomerasa en la muestra o muestras de post-administración y (vi) alterar la administración del agente al sujeto por consiguiente. Por ejemplo, la administración disminuida del agente puede ser. deseable para incrementar la actividad telomerasa a niveles más altos que los detectados, es decir, para disminuir la efectividad del agente . De acuerdo con una modalidad de tal clase, la actividad telomerasa se puede utilizar como un indicador para la efectividad de un agente, aun en la ausencia de una respuesta fenotipica observable. Como es descrito en - la presente, el método de detección de telomerasa se puede usar para una variedad de aplicaciones, incluyendo pero no limitados a, evaluación de la efectividad de inhibidores de telomerasa, medición de la relación entre la actividad telomerasa y las condiciones del cultivo de células, determinación de la relación entre la actividad telomerasa y enve ecimiento, o entre la actividad telomerasa y tumorigénesis, diagnóstico de la enfermedad relacionada con telomerasa e inspección del tratamiento para tales enfermedades . E emplos Ejemplo 1, Determinación de la relación de cebador La linea de células 293T (riñon embrional humano primario transformado por el adenovirus humano cortado tipo 5 (Ad 5) DNA y el antigeno T SV 40, obtenido de la Colección Americana de Cultivos Tipo) se cultivó en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37 °C en una incubadora modificada con C02 al 5%. Las células se recolectaron a 70-8·5% de confluencia, se contaron ' y se Usaron usando una solución reguladora de lisis que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, MgCl2 1 mM, EGTA 1 irtM, Benzaiuidina 0.1 mM, b-mercaptoetanol 5 mM, CHAPS 0.5% p/v y Glicerol 10% p/v (solución reguladora de lisis CHAPS) sobre hielo durante 30 min. La concentración de proteína se determinó usando el it de Ensayo de Proteína BC (Pierce, Rockford, IL) . El extracto de célula se almacenó a -70°C. Los cebadores de oligonucleótidos se pidieron de Interar DNA Technologies, Inc. "(Coraville, 1(A). El primer cebador (FP) tiene la secuencia de 5' -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3' (SEQ ID NO: 3) y es designado TS, el segundo cebador (SP) tiene la secuencia de 5' -GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3' (SEQ ID NO: 4) y es designado ACX. Para probar el efecto de la relación de cebador del primer cebador contra el segundo cebador, se usaron diferentes relaciones (FP:SP = 1:1, 1:08, 1:0.5 y 1:0.2). Brevemente, 1 µ? de extracto de células de diferentes diluciones se mezcló con 1 µ? de la mezcla de cebador (0.5 µg TS/ACX en diferente relación), 11.5 µ? de agua y 12.5 µ? de solución reguladora de premezcla de PCR que contiene 0.25 unidad de Polimerasa de DNA, 2.5 mM de dATP, dUTP, dCTP, y dGTP y SYBR Green (dilución 1:2000 de la solución de extracto SYBR Green 1 (S-7563) adquirido de Molecular Probes Inc., Eugene, OR) se incubó primero a 25°C durante 20 min y luego a 95°C durante 10 min, y se amplificó mediante la PCR de tiempo real cuantitativa (95°C 30 sec, 60°C 30 seg, 72°C 30 seg durante 40 ciclos) . El resultado indicó que la relación 1/1 (p/p) dio el mejor resultado (Tabla 1) . Tabla 1. Efecto de la relación de cebadores sobre la reacción de PCR de tiempo real cuantitativa
Extracto de Ciclos umbrales (CT) Célula ^g) Diluciones Relación FP/SP 1/1 1/0.8 1/0.5 1/0.2
A 0. 40 20.7 25.4 28.2 27.5
B 0. , 08 22.5 27.0 26.9 27.9
C 0. ,016 25.1 27.8 28.4 30.1
D 0. .0032 27.4- 30.0 32.3 32.7
E 0. .00064 29.6 32.0 31.2 35.4
F 0. .00013 32.4 33.8 35.6 35.4
Blanco — 33.0 33.5 34.3 — Ejemplo 2, Determinación de la sensibilidad del ensayo Para probar la sensibilidad del método de ensayo de actividad telomerasa, el ensayo se realizó usando diferentes cantidades (o números de células) del extracto de células 293T bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 1 y una relación de FP/SP de 1/1. Como se muestra en la Tabla 2 y la Figura 4, el método es capaz de detectar la actividad telomerasa de una sola célula 293T Tabla 2. Detección de actividad telomerasa en células 293T
Extracto de células Ciclos umbrales (CT) (Por reacción) Diluciones µg Célula Números
A 2.800 8500 18.0 B 0.82 2500 19.7 c 0.16 500 21.1 D 0.032 100 23.1 E 0.0064 20 25.4 F 0.0032 10 26.6 G 0.0016 5 27.5 H 0.00033 1 28.8 Blanco 33.0 Ejemplo 3, Generación de curvas estándares Para cuantificar los resultados de la reacción de PCR de tiempo real, una molécula de plantilla de control se usó para generar una curva estándar bajo condiciones descritas en el Ejemplo 2 para correlacionar la actividad telomerasa con los números de molécula de plantilla por reacción a través de los ciclos umbrales. Como se muestra en la Tabla 3 y la Figura 5, la curva estándar se generó usando la lectura del umbral (CT) de la PCR de tiempo real bajo las condiciones de reacción estándares y una plantilla de control TSR9. La Figura 6 muestra la regresión lineal entre el número de células 293T y el ciclo umbral y la regresión lineal entre el número de molécula TSR9 de la plantilla de control y el ciclo umbral. Tabla 3. Generación de la curva estándar usando la plantilla de control TSR9
Diluciones Concentración de TS 9 Ciclos umbrales (CT)
(µ?t/µ?) moléculas/reacción SI 0.5 300000 18.3 S2 0.1 60000 20.8 S3 0.02 12000 22.6 S4 0.004 2400 25.2 S5 0.0008 480 27.3 S6 0.00016 96 29.8 S7 0.000032 20 32.0 S8 0.0000064 4 32.5 Blanco - - 33.0 Ejemplo 4. Especificidad del método de ensayo de telomerasa Para probar la especificidad del método de ensayo de telomerasa, el ensayo se realizó usando varias lineas de células de tumor incluyendo MCF7 (adenocarcinoma de efusión pleural de pecho), ZR-75-1 (carcinoma ductal de ascitis de pecho) y células Hela (adenocarcinoma de cerviz) , varios tejidos de murino (recolectados de ratones C57BL/6 adulto) incluyendo el cerebro, riñon, hígado, corazón, testículos y sangre, así como extracto inactivado con calor (95°C durante 10 min) extracto de células 293T. Como se muestra en la Tabla 4 y Figura 7, la actividad telomerasa se detecta en células proliferantes, líneas de células de cáncer (293T, Hela, MCF7 y ZR-75-1), pero no es detectado en el extracto de células 293T inactivadas con calor y el control de blanco. Los resultados también indicaron que hubo baja actividad telomerasa en tejidos de murino adultos normales, indicando que las células proliferantes (por ejemplo, células madre) en tejidos normales son detectables . Tabla 4. Actividad telomerasa en varias líneas de células y tejidos de murino
Muestra Extracto de Célula (Por reacción) Ciclos Umbrales (CT) Medio ± SD
Control — 34.3±0.2
Cerebro 0.01 29.6±0.2
Riñon 0.01 29.6±0.2
Hígado 0.01 29.4±0.2
Corazón 0.01 28.6±0.2
Testículos 0.01 28.2±0.2 Sangre 0.01 31,.3±0,.1
MCF7 0.01 23, .3±0. .5
ZR75 0.01 24. .2±0. .4
Hela 0.01 24. .6±0. ,4
293T 0.01 24, ,3±0, ,5
293T (inactivado con calor) 0.01 34, ,7±0. ,2
Ejemplo 5, Estabilidad de la mezcla de reacción Para probar la estabilidad de los reactivos usados en el ensayo de telomerasa, se preparó una mezcla de reacción que contiene un primer cebador TS, Polimerasa DNA, d TPs y SYBR Green. Alícuotas de la mezcla de reacción se conservaron a temperatura ambiente durante 0, 24, 48 o 72 h y se probaron en un ensayo de telomerasa. Como se muestra en la Tabla 5, la mezcla de reacción se considera que es estable a temperatura ambiente por hasta al menos 72 horas. Tabla 5. Estabilidad de la mezcla de reacción a temperatura ambiente Extracto de Ciclos umbrales (CT) Célula (\ig) Diluciones Exposición a RT 0 24 48 72 (hrs) A 2 .0 18.0 16.7 18.2 16. ,4
B 0 .40 21.6. 22.4 21.9 20. .9
C 0 .08 22.3 21.8 21.9 21. ,4
D 0 .016 24.3 24.2 23.9 24. .2 F 0.,0032 26.1 25.7 25..6 25,,2
G 0. .00064 27.9 27.7 28, .2 27, .6
H 0. .00013 28.3 28.4 28. .6 31. .5
Blanco 34.3 32.1 33. .9 32.9 Ejemplo 6, Extensión de cebador en células intactas Células 293T se cultivaron en medio de crecimiento (medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a 37°C en una incubadora humidificada con C02 al 5%) . Las células se tripsinizaron, se lavaron con el medio de crecimiento, se suspendieron en el medio de crecimiento a una densidad de 1 x 106 cells/ml, y se sometieron a uno de los siguientes tratamientos. Tratamiento A: La suspensión de células se transfirió a un tubo de centrífuga estéril, se centrifugó a 800 rpm durante 5 min en una centrifuga Beckman GS-6R, se re-suspendió en solución salina regulada con fosfato (PBS) . Las células re-suspendidas se retiraron en una jeringa de 1 mi estéril a través de una aguja de calibre 25 y luego se expulsaron mediante presión permanente sobre el émbolo. El procedimiento de jeringa se repitió cinco veces. Las células se transfirieron en tubos de centrífuga estériles a 1 x 104 células/tubo y un medio de transferencia (dNTP 2.5 mM y albúmina de suero bovino al 0.1% (BSA) ) se adicionó, ya sea con o sin cebador TS. Las células se cultivaron a 37 °C durante 60 min. Los tubos se centrifugaron a 4°C durante 20 min y se recolectaron las suspensiones. Las pelotillas se Usaron usando solución reguladora Chaps a 4°C durante 30 min. Los Usados se centrifugaron a 14,000 rpm durante 20 min a 4°C. Los sobrenadantes se recolectaron, se calentaron a 95°C durante 10 min. y se almacenaron a -70 °C antes del uso. Alternativamente, las células se pueden asentar en placas de 96 cavidades a una densidad de 1 x 104 células/cavidad después del procedimiento de jeringa y se cultivaron durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con C02 al 5%. Al siguiente dia, las células pueden ser lavadas con PBS y una cantidad deseada de solución reguladora de transferencia (PBS con cebador TS, 0.5 µg/ca idad, dNTP 2.5 mM y BSA al 0.1%, o PBS con dNTP, 2.5 mM y BSA al 0.1%, o PBS solamente) se adiciona a cada cavidad. Después de la incubación a 37 °C durante 30 min, 60 min, y durante la noche, las células se recolectan y se lisan con la solución reguladora CHAPS a 4°C durante 30 min. Los lisados se centrifugan a 14,000 rpm. Los sobrenadantes se recolectan, se calientan a 95°C durante 10 min, y se almacenan a -70°C antes del uso. Tratamiento B: La suspensión de células se sembró directamente en una placa de 96 cavidades, se cultivó durante la noche y se transfectó con una cantidad deseada de cebador TS y dNTP usando la precipitación de fosfato de calcio.
Brevemente, las células 293T se cultivan en el medio de crecimiento (DMEM con FBS al 10%) durante la noche. 'El medio de crecimiento se reemplazó con medio de crecimiento fresco 3 horas antes de la transfección. La precipitación de fosfato de calcio (usando el kit de fosfato de Calcio de GIBCO) se formó en la presencia de cebador TS y dNTP (HBS 100 µ?, fosfato 2 µ?, ¾0 26 µ?, DNA portador 10 µ?, primer cebador 20 µ?, dNTP 0.25 mM, 12 µ? de calcio) y se adicionó a las células. Las células de incubaron a 37 °C durante 10, 30 y 60 min, y se Usaron con la solución reguladora de lisis CHAPS a 4°C durante 30 min. Los Usados se calentaron a 100°C durante 10 min y se centrifugaron a 14, 000 rpm durante 20 min. Los sobrenadantes se recolectaron y se almacenaron a -70°C. Un microlitro de lisado del tratamiento A o B se mezcló con 11.5 µ? de agua y 12.5 µ? de premezcla que contiene dNTPs (2.5 mM para cada trifosfato de micleósido) , 0.25 unidades de polimerasa de DNA, 0.25 µg de cebador ACX y se sometieron a la PCR de tiempo real cuantitativas) 95 °C durante 10 min, 95°C 30 seg, 60°C 30 seg, 72°C 30 seg durante '35-40 ciclos) . Los resultados mostrados en la Figura 8 indican que la actividad telomerasa es détectable en células 293T después de una hora de incubación con el cebador TS y dNTP como es descrito en el tratamiento A. Los resultados mostrados en la Figura 9 indican que la actividad telomerasa es détectable en las células 293T después de una incubación de 30 minutos con precipitado de fosfato de calcio que contiene el cebador TS y dNTP, como es descrito en el tratamiento B. No se detectó actividad teloitierasa sin el cebador TS, sugiriendo que los productos detectados son específicos de teloitierasa. Aunque modalidades preferidas y sus ventajas se han descrito en detalle, varios cambios, sustituciones y alteraciones se pueden hacer en la presente sin apartarse del alcance de las composiciones y métodos como es definido por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes y todos estos se proponen que están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.