CN102220418A

CN102220418A - 双温快循环荧光定量pcr端粒酶活性的检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN102220418A
Application number: CN2011101013946A
Authority: CN
Inventors: 黄艳萍; 刘照胜; 汤华
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2011-10-19

Abstract

本发明涉及一种双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒。引物-锚定发夹引物(AHP)与复合式蝎形引物(DS)结合组成DS/AHP-TRAP体系，在双温快循环PCR条件下完成对永生化细胞蛋白提取液中端粒酶活性的检测。它是以含6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物R6为定量标准物，绘制检测端粒酶延伸产物定量曲线。通过比较永生化细胞样品及R6的两组定量标准曲线，得到检测端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图。假设1个TPG值为1个永生化细胞产生的端粒酶延伸产物，确定TPG值代表R6的量。本发明的试剂盒可在荧光定量PCR仪上，更简便、更快捷、大批量地完成端粒酶活性的实时检测。在恶性肿瘤早期诊断及抗癌药物筛选方面具有广阔的前景。

Description

双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒。该方法应用锚定发夹引物(Anchored hairpin structural primer，AHP)及复合式蝎形引物(Duplex scorpion primer，DS)，在荧光定量PCR仪上，采用双温快循环PCR扩增条件，进行端粒酶活性的检测。即为用DS/AHP-TRAP(锚定发夹引物及复合式蝎形引物-端粒重复序列扩增分析法)检测端粒酶活性的试剂盒。

背景技术

端粒酶(Telomerase)是广谱肿瘤标志物，它在近90％的癌症中都有高频率的表达，而良性、癌前病变以及癌周围的组织中，一般无表达。端粒酶活性的测定具有直接性、高敏感性和强特异性，可作为一个独立的恶性肿瘤早期诊断、治疗监测和预后判断的指标。而且作为分子诊断手段，端粒酶活性检测明显优于肿瘤临床病理分期、组织学分型或细胞分化程度等现有细胞学诊断技术。它尤其对筛查或诊断无症状的早期癌症，具有特殊的价值；对于那些形态学上良恶性难以鉴别的肿瘤，是判断肿瘤恶性程度有用的指标；作为肝细胞癌切除术后复发的独立预测指标，可预测肝癌术后转移复发。另一方面，端粒酶也是肿瘤治疗的最佳靶点之一，由于端粒酶在肿瘤细胞与正常体细胞之间的差别，端粒酶抑制剂可减少对机体的毒副作用。因此，抗端粒酶疗法已成为肿瘤治疗的一种新方法。围绕端粒酶抑制剂的研究也在如火如荼地进行着，而端粒酶活性测定则是评价药物的重要指标。总之，端粒酶活性的测定可用于癌症早期诊断、癌症预后、癌症的基因治疗和抗癌药物研发等各个领域。因此，采用现代分子生物学技术，研究开发端粒酶活性检测的新方法，为肿瘤防治提供技术上的保障，加速临床应用的进程，是十分必要的。

检测端粒酶活性的标准方法是端粒重复序列扩增分析法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP，Kim N.W.，Piatyszek M.A.，Prowse K.R.，Harley C.B.，West M.D.，Ho P.L.C.，Coviello G.M.，Wright W.E.，Weinrich S.L.，Shay J.W.，Science，1994，266，2011-2015)。该法主要分为三个步骤：1)延伸阶段，底物在端粒酶的作用下延伸，其3′-端加入若干TTAGGG的重复序列；2)PCR扩增阶段，端粒酶延伸产物扩增数百万倍以上；3)产物的检测阶段。TRAP法巧妙地将PCR技术应用于端粒酶活性检测中，极大地提高了检测的灵敏度，

与常规的PCR扩增不同，TRAP方法检测的不是样本中核酸的量，而是端粒酶活性。因此在PCR扩增之前，端粒酶首先对底物进行延伸，产生端粒酶延伸产物，随后通过对端粒酶延伸产物的扩增，达到检测端粒酶活性的目的。TRAP法的模板分子——端粒酶延伸产物序列很特殊，由底物序列和多个不等的端粒重复序列组成。因此，在以底物序列为正向引物的TRAP法中，反向引物CX设计为有三个错配碱基的端粒重复序列的互补序列。然而由于端粒酶延伸产物含有多个端粒重复序列，因此，在PCR反应的每一轮循环时，它仍可结合在端粒重复序列的任意部位，甚至在同一时间同一条模板分子上都可能会有多于一个的CX引物开始延伸。这导致了TRAP法得到的PCR产物的个数与端粒酶延伸产物不完全一致。从而干扰检测结果。

改进PCR反向引物的新方法，如CX-ext、CXa引物、锚定引物ACX、发夹型引物以及双反向引物-TRAP法等，均极大地减少了副产物的生成。其中锚定引物在5′-末端加入了一段与端粒序列无关的锚定序列，使得PCR产物5′-末端被非端粒序列封闭，阻止端粒酶产物在此端的延伸。从而避免了假阳性结果的出现，因而得到广泛的应用。但是该方法在不进行热启动时，会有非特异性产物生成。除此之外，TRAP法尚有许多常规PCR的不足之处，如终点检测结果，因此，劳动强度大、定量不准确、重现性差；同时，在测定PCR扩增产物前须打开反应管，易造成污染。因此，难以满足临床应用的要求。

荧光定量PCR技术巧妙地将PCR扩增、荧光探针杂交和光学检测结合于一体，通过微机控制，对PCR每一轮循环进行实时监测，并自动报告分析结果。该技术操作简单、安全、自动化程度高。不需要PCR后处理，从而从根本上解决了产物污染而导致的假阳性问题。而且特异性、灵敏度和重现性显著提高。同时，由于在PCR扩增的指数期(原始模板以相对固定的指数形式增长)进行定量检测，从而真正在技术上实现了PCR从定性到定量的飞跃。

目前，Intergen公司已推出能量转移引物实时定量检测端粒酶活性的试剂盒(

XL)。但该法无法消除反向引物不确定退火带来的影响，因此，特异性和有效性受到质疑。且试剂盒价格昂贵，检测费用高。另外，有报道将DNA嵌插试剂SYBR Green和TRAP法结合，用于实时定量检测端粒酶活性。然而，非特异性以及所用试剂的昂贵也是阻碍其走向临床应用的最大绊脚石。

本申请人在TRAP法基础上设计了复合式蝎形引物，该引物由两条单标记的寡核苷酸链组成，其中一条为探针引物链(Probe-Primer，PP)，该链在引物序列与探针序列之间用PCR阻断剂(PCR-blocker)连接，以阻止PCR产物沿探针序列延伸；另一条为猝灭探针链(Quencher Probe，QP)，由标记有猝灭基团的探针互补序列组成，用于猝灭探针引物发出的荧光。复合式蝎形引物具有引物和探针的双重功能。它通过在检测步骤中形成稳定的茎环结构，导致探针引物链与猝灭探针链彻底分离，发出荧光从而实现端粒酶活性的定量分析(黄艳萍，孔德明，张晓滨，沈含熙，宓怀风，复合式蝎形引物实时定量检测端粒酶延伸产物，化学学报，2004，62，274-278)。

TRAP由于采用石蜡覆盖的热启动方法，要在PCR反应前进行繁琐的加热和冷却过程，且石蜡层两侧液体的混合在实际操作中也存在着一定的困难，往往达不到预定的效果。为此本申请人设计出了一类新的发夹型引物(Hairpin structural primer，HP)。该引物5′-末端具有与3′-端的碱基互补的序列，可在TRAP法开始阶段，处于发夹结构，无法行使引物延伸功能。因此实现了TRAP检测中PCR热启动的自动化，增加了检测的专一性(黄艳萍，孔德明，柴鼎赓，沈含熙，宓怀风，用凝胶电泳研究发夹型引物基因检测恶性肿瘤预警标志物端粒酶活性，现代仪器，2004，10：41-3)。

然而由于TRAP法中PCR的扩增的模板序列为底物序列及多个不等长的端粒重复序列，因此PCR反应不可避免引入非特异性产物，干扰检测结果。因此本申请在已有工作的基础上对HP引物进行了再次的改进，以降低实时检测的背景荧光，增加了PCR反应的特异性。同时，本申请提供一种以绝对值来表示端粒酶活性的方法(Kim N.W.，Wu F.，Nucleic Acids Res.，1997，25，2595-2597)，从而进一步确保检测结果的准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法和试剂盒，以消除复杂的PCR反应后的检测过程，减少非特异性产物生成，提高检测的灵敏度、特异性和准确性，并可进行大批量样品的同时检测。

本发明提供的一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法包括如下步骤：

(1)永生化细胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸产物定量标准溶液的制备；

(2)在荧光定量PCR仪上，将锚式发夹型引物(AHP)与复合式蝎形引物(DS)结合，组成一个新的DS/AHP-TRAP体系，在双温快循环PCR扩增条件下，完成对细胞样品中端粒酶活性及标准溶液中端粒酶延伸产物的实时定量检测；

(3)根据实时扩增曲线，得到两组定量标准曲线，从检测端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图上，得到以人工合成端粒酶延伸产物的总量，即TPG值表示细胞中端粒酶活性的定量方法。

所述的锚定发夹型引物为：

5′-GCGCGGTTAGGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3′

其中，下划线部分为发夹的茎部，中间未划线部分为与靶序列互补的引物序列，5′-端的未划线部分为锚定序列(见附图1)。

发夹型结构在引物分子内部能形成独特的茎环状的二级结构，发夹型结构可实现PCR反应的自动热启动，增加了PCR反应的专一性，减少了非特异性产物的生成；锚定结构是在5′-末端加入了一段与延伸无关的锚定序列，使得PCR产物5′-末端被非端粒序列封闭，阻止端粒酶产物在此端的延伸。

选择的复合式蝎形引物为引物探针，包括探针引物(probe-primer，PP)和猝灭探针(quencher probe，QP)两部分，序列分别为：

PP：FAM-5′-[CCCTAA] ₃-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′(阻断剂为三个碳原子的碳链，带下划线的为探针序列)

QP：5′-[TTAGGG] ₃-3′-DABCYL

所述的双温快循环PCR扩增条件为：95℃0s，45℃3s，引物延伸在温度转换过程中进行，在30个循环数内完成对样品中端粒酶活性的实时定量检测。

所述的人工合成端粒酶延伸产物R6为含有6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物，即：

5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₆-3′

TPG(total product generated，总生成产物)值代表端粒酶活性反应产生的端粒酶延伸产物的总量。在细胞样品定量标准曲线及人工合成端粒酶延伸产物R6定量标准曲线的吻合图上，假设1个TPG相当于1个永生化细胞拷贝数，得到一个TPG为0.0058amol的寡核苷酸R6。

本发明提供的双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法的检测步骤如下：

1.样品的制备：1)永生化细胞蛋白提取液：1，10，10²，10³，10⁴/μL的永生化细胞样品；2)阴性对照样品；3)人工合成端粒酶延伸产物R6标准溶液：3300，330，33，3.3，0.33，0.033amol/μL的R6_(1-6)标准溶液。

2.DS/AHP-TRAP法反应前的准备：1)反应混合液：1×TRAP缓冲液，1.5mmol/LMgCl₂，各50μmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.21μmol/L的AHP，2U TaqDNA聚合酶，0.5μmol/L的PP链及1.0μmol/L的QP链，2μL样品溶液。反应液总体积为25μL；2)DS/AHP-TRAP法反应条件：采用30℃下30min进行端粒酶延伸反应，随后采用94℃0s，45℃3s的双温快循环的方式进行PCR扩增反应。

3.DS/AHP-TRAP法的测定：1)永生化细胞蛋白提取液实时扩增曲线的测定；2)DS/AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线的确定：将人工合成端粒酶延伸产物R6_(1-6)标准溶液及一系列细胞样品及按以上条件进行扩增，得到两组扩增曲线。

4.数据处理：1)永生化细胞蛋白提取液工作曲线：在细胞样品扩增曲线上设定荧光阈值，得到不同样品的Ct值。绘制细胞拷贝数10⁴～10的范围内的标准曲线；2)DS/AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线及TPG值的确定：同法绘制定量标准品R6的工作曲线，并与永生化细胞定量标准曲线作比较。从端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图上，得到以TPG值表示细胞中端粒酶的活性的定量方法。即根据假设1个TPG为1个拷贝数，确定TPG代表的定量标准物R6的量，从而可用TPG值表示细胞中端粒酶的活性。

本发明提供的一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的试剂盒包括：

本发明可适用于大多数的实时PCR扩增仪，包括Applied Biosystems，Eppendorf，Corbett，Bio-Rad，Roche，杭州博日(Line-GeneBioer)等品牌的PCR扩增仪。

本发明设计了一类新型的引物-锚定发夹引物(AHP)，这类引物在5′-末端加入了一段与引物功能无关的锚定序列，同时在锚定序列之后，是一段与3′-末端序列互补的碱基。在PCR反应的准备和起始升温阶段，锚定发夹引物分子内互补碱基相互杂交，形成茎环结构(见PCR反应的准备和起始升温阶段，锚定发夹引物分子内互补碱基相互杂交，形成茎环结构(见图1)。这个双链的形成使得引物的3′-端处于封闭状态，不能行使引物延伸的功能。因此形成引物二聚体的可能性大为降低；当反应加热到退火延伸温度时，发夹结构打开，引物延伸才开始。这时锚定式发夹型引物的5′-末端的锚定序列的存在，使得PCR产物5′-末端被非端粒序列封闭，阻止端粒酶产物在此端的延伸。因此，在锚定序列和发夹型结构的双重作用下，使PCR反应的专一性得到进一步的提高。

由于TRAP法中PCR反应的模板分子的序列最多在60-110bp。扩增短片段(约100bp)的目的基因，只需要双温循环，温度转换过程中可完成延伸。所以TRAP法很有希望采用双温快循环PCR扩增条件，同时由于复合式蝎形引物中的探针序列是以分子内杂交形式形成发夹结构而产生荧光，该发夹结构的形成可在不到1μs时间内完成，且具有较高的稳定性。因此本发明结合复合式蝎形引物，组成了一个新的DS/AHP体系。采用双温快循环扩增条件(即94℃0s，45℃3s)，建立了一个快速实时定量检测端粒酶活性的DS/AHP-TRAP法。同时，由于TRAP法中PCR反应的模板分子为端粒酶延伸产物，因此可通过人工合成的端粒酶延伸产物为标准品，来绘制检测端粒酶活性的工作曲线(Kim N.W.，Wu F.，Nucleic Acids Res.，1997，25，2595-2597)。故本发明提供一种以绝对值来表示端粒酶活性的方法。即以人工合成的端粒酶延伸产物为定量标准品，来模拟端粒酶延伸阶段应该得到的产物，进行端粒酶活性检测标准曲线的绘制。从而进一步确保检测结果的准确性。

附图说明

图1是本发明锚定发夹引物的空间结构图。

图2锚式发夹引物(1)和发夹引物(2)实时检测端粒酶活性的背景曲线。

图3DS/AHP-TRAP法实时检测HL60细胞中端粒酶活性的半对数扩增曲线。曲线1-4所含细胞数为：(1)10000(2)1000(3)100(4)10；曲线5为阴性对照。

图4DS/AHP-TRAP法检测端粒酶活性的永生化细胞定量标准曲线。

图5DS/AHP-TRAP法定量标准物R6的标准曲线及其与永生化细胞标准曲线的吻合图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细地阐述本发明。

实施例1

锚定发夹引物对实时检测的背景荧光信号的影响

在该实施例中比较了锚定发夹引物及发夹引物对实时定量检测的背景荧光的不同影响。

实验中，以热处理灭活端粒酶的永生化细胞蛋白提取液(永生化细胞样品的处理方法见下面实施例)为阴性样品，分别以锚定发夹引物及发夹引物为下游引物进行荧光定量PCR检测。在循环数设为40的条件下，比较了其对实时定量检测的背景荧光的影响。反应试剂及条件如下：

反应试剂：阴性样品，0.1μg PP，0.5μg QP，0.05μgAHP，1×TRAP缓冲液，1.5mMMgCl₂，50μM dNTP，2U Taq酶，反应体积25μL。

反应条件30℃30min，95℃3分钟；94℃0s，45℃3s下，40个循环

结果表明：在相同条件下，锚定发夹引物AHP的背景荧光较发夹型引物升起的晚(见图2)。说明AHP中锚定序列的引入，增加了PCR反应的特异性，降低了实时检测的背景荧光。同时，在PCR扩增的前30个循环数内，AHP的背景荧光不会对定量产生干扰。所以DS/AHP-TRAP法PCR扩增的循环数选择30。

实施例2

DS/AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线及TPG值的确定

将本发明配制如下试剂盒：

洗液：Hepes-KOH(PH 7.5)10mmol/L，MgCl₂ 1.5mmol/L，KCl 10mmol/L，DTT 1mmol/L。

配制方法：

(1)称Hepes 23.83mg溶于10mL二次去离子水中，用浓KOH溶液调至PH＝7.5，配成10mmol/L Hepes-KOH(PH 7.5)溶液。

(2)将MgCl₂·6H₂O 1.52mg、KCl 3.72mg、DTT 0.772mg溶于5mL 10mmol/LHepes-KOH(PH 7.5)溶液中，于-20℃下贮存。

Hepes(Free acid)：High Pure Grade，上海生工生物工程有限公司，AMRESCO分装。

DTT：High Pure Grade，上海生工生物工程有限公司，AMRESCO分装。

细胞裂解液：Tris-HCl(PH 7.5)10mmol/L，EGTA 1mmol/L，MgCl₂ 1mmol/L，β-巯基乙醇5mmol/L，甘油10％，CHAPS 0.5％，PMSF 0.1mmol/L。

配制方法：

(1)配20mL 10mmol/L Tris-HCl(PH 7.5)溶液(称Tris 26.89mg溶于二次去离子水中，加HCl溶液调至PH＝7.5)；

(2)取9mL Tris-HCl(PH 7.5，10mmol/L)溶液加入EGTA 3.804mg，加热至50℃使溶解。然后再加入MgCl₂ 2.033mg、β-巯基乙醇3.48μL、CHAPS 50mg、甘油1mL，溶解后于-20℃下贮存。所配溶液为未加入PMSF的裂解液。

(3)配100mmol/L PMSF溶液：于1mL异丙醇中加入17.5mg PMSF，于-20℃下贮存。

(4)裂解液的配制：现用现配，取5mL未加入PMSF的裂解液加入5μL100mmol/LPMSF溶液。

10×TRAP缓冲溶液：200mmol/L Tris-HCl(pH＝8.3)，10mmol/L EGTA，630mmol/L KCl，0.05％Tween-20，1mg/mL BSA。

配制方法：

Tris碱2.4228g溶解并稀释至100mL，滴加HCl至PH 8.3，取Tris-HCl 10mL溶解EGTA0.03804g，KCl 0.46998g，Tween-20 5μL，BSA 0.01g。-20℃下保存。

复合式蝎形引物(DS)由探针引物(probe-primer，PP)与猝灭探针(quencher probe，QP)组成，序列分别为：

PP：FAM-5′-[CCCTAA]₃-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；

QP：5′-[TTAGGG]₃-3′-DABCYL

锚定发夹引物引物(AHP)：5′-GCGCGGTTAGGGCTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3′

定量标准品R6序列为：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₆-3′

上述寡核苷酸及其探针可委托多家生物技术公司，如上海申友生物技术有限责任公司，上海生工生物技术工程有限公司等合成。干粉于-70℃保存。使用前用双蒸灭菌水稀释成溶液。溶液浓度通过测定260nm处吸光度OD₂₆₀计算。计算方法如下：用每种碱基的摩尔消光系数(dGTP：12.0mL/μmol，dCTP：7.1mL/μmol，dATP：15.2mL/μmol，dTTP：8.4mL/μmol)分别乘以各自的数目，再把4个乘积相加，便得到整段寡核苷酸链的摩尔消光系数(ε)。由公式OD＝ε×C便可求得C。-20℃下保存。

Taq酶：购自上海生工生物工程公司，浓度：5U/ul。附MgCl₂溶液(浓度为25mmol/L)。dNTPs(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)：购自上海生工生物工程公司，浓度：2.5mmol/L

检测步骤如下：

(一)样品的制备

1)永生化细胞蛋白提取液的制备

人血癌细胞HL60(购自天津血液病研究所)于100mol/l小牛血清的RPMI-1640(Invitrogen)培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养。细胞每隔48小时更换一次培养基，实验选用对数生长期的细胞。收集计数约2～3×10⁶个永生化细胞，3000rpm离心3min分离沉淀细胞，弃上清。沉淀用预冷的PBS悬浮，3000rpm离心3min，弃上清。将细胞重悬于预冷的洗液中，4℃，10000rpm离心1min收集沉淀。置1.5mL离心管中，加入200μL裂解液，冰浴裂解30min，期间用移液器反复抽吸3次，以保证充分裂解。然后，于4℃，14000rpm离心30min，吸取上清液，得到蛋白提取液。依次10倍稀释，分别得到细胞数为10，100，1000，10⁴/μL的细胞样品，并用液氮快速冷冻，置-80℃保存。

2)阴性对照样品的制备：

75℃，20min热处理1000/μL蛋白提取液的细胞样品，使其中的端粒酶失活。即得细胞样品检测时的阴性对照样品h1000。

3)人工合成端粒酶延伸产物R6标准溶液的制备

取2.5OD寡核苷酸R6加1540μL双蒸水，得到3.3μM R6储备液。再依次稀释，分别得到浓度为3300，330，33，3.3，0.33，0.033amol/μL的R6_(1-6)标准溶液，-20℃下保存。

(二)DS/AHP-TRAP法反应前的准备

1)反应混合液的制备：

将2μl上述处理的样品加入到试剂盒中进行TRAP检测，反应液总体积为25μl，成分为：

2)DS/AHP-TRAP法反应条件

在荧光定量PCR仪(ABI 7900型荧光定量PCR仪，美国ABI公司)上进行DS/AHP-TRAP法实时定量检测，端粒酶反应及PCR实时扩增检测条件为：

(三)DS/AHP-TRAP法的测定：

1)永生化细胞蛋白提取液实时扩增曲线的测定：

对细胞数为10，10²，10³，10⁴/μL的HL60细胞蛋白提取液样品，用DS/AHP-TRAP法检测不同细胞样品的实时扩增曲线，以h1000为阴性参照。

2)DS/AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线的确定：

实验中选用寡核苷酸R6(序列为含有6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物)为定量标准品，以浓度为3300，330，33，3.3，0.33，0.033amol/μL的R6_(1-6)标准溶液，用DS/AHP-TRAP试剂盒法对R6_(1-6)标准溶进行实时检测。同时，一系列稀释的HL60细胞的蛋白提取液在同一个实验中与R6同时被检测，考察定量标准物的工作曲线及其与永生化细胞样品工作曲线之间的关系。

(四)实验结果及其处理

处理原则：荧光定量PCR当荧光到达阈值(Threshold，在PCR的指数增长期设定的某个荧光强度)时，模板分子的阈循环值Ct与模板浓度成反比关系。实验中，根据每个样品的扩增曲线得到相应的Ct值，通过Ct值与初始浓度的对数值作图，就可以获得准确的工作曲线，来确定未知样品的起始拷贝数或起始浓度。(李金明编著，实时荧光PCR技术，人民军医出版社)。

1)永生化细胞蛋白提取液工作曲线：

永生化细胞蛋白提取液细胞样品的实时扩增曲线见图3。在此图上设立荧光阈值，得到各个细胞样品的Ct值，以Ct值～细胞数作半对数曲线，得到DS/AHP-TRAP法检测端粒酶活性的永生化细胞定量标准曲线。定量范围跨越4个数量级(从10⁴到10个细胞数间)，线性相关系数的平方值(R²)为0.9986(图4)。

2)DS/AHP-TRAP试剂盒定量工作曲线及TPG值的确定：

同上法得到DS/AHP-TRAP法检测定量标准物R6的工作曲线。线性范围跨越6个数量级(从3300到0.0033amol之间)，线性相关系数的平方值(R²)为0.995。

将R6工作曲线与永生化细胞定量标准曲线作比较。可发现当0.0058amol(atto mole)R6相当于1个永生化细胞时，两条标准曲线能很好地吻合在一起(图5)。因此，在假设一个TPG(total product generated，总生成产物)值代表0.0058amol的寡核苷酸R6时，一个TPG相当于一个永生化细胞产生的端粒酶延伸产物。因此，端粒酶活性检测可使用定量标准物R6的工作曲线，且端粒酶活性的水平可以用TPG值来表示。

用DS/AHP-TRAP法进行端粒酶活性的实时检测具有以下优势：

1.采用在PCR反应的指数增长期进行实时检测的方式，较TRAP法采用凝胶电泳或TRAP-ELISA等“终点”检测方式，结果更准确，可获得精确的定量结果。同时避免了放射性和凝胶电泳，大大地简化了检测步骤，减少了技术失误。而且整个TRAP反应在封闭管中进行，减少了交叉污染。尤其是锚定发夹引物的引入，提高了TRAP法的专一性，确保了结果的准确性。

2.运用双温快循环PCR扩增能将扩增时间缩短一半，与最初TRAP法需10个小时的检测时间相比，DS/AHP-TRAP法大大地节省了端粒酶活性检测的时间。

3.DS/AHP-TRAP法提供了一种绝对定量的方法。该法以化学合成的寡核苷酸代表端粒酶延伸产物，作为定量标准物绘制标准曲线。因此，端粒酶活性就可以用TPG值来表示，一个TPG值相当于一个永生化细胞。该法有许多优点，如所得数据在不同实验室之间，或不同操作者之间都可以很容易地进行比较等。因此，DS/AHP-TRAP法的建立，有望为临床诊断带来一个更简便、更快捷的端粒酶活性检测方法。

Claims

1.一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)永生化细胞蛋白提取液及人工合成端粒酶延伸产物定量标准溶液的制备；

2)在荧光定量PCR仪上，将新型锚式发夹型引物与复合式蝎形引物结合，组成一个新的端粒重复序列扩增分析法体系，在双温快循环PCR扩增条件下，完成对细胞样品中端粒酶活性及标准溶液中端粒酶延伸产物的实时定量检测；

3)根据实时扩增曲线，得到两组定量标准曲线，即检测端粒酶活性定量曲线和端粒酶延伸产物定量曲线，在这两组定量标准曲线吻合图上，得到以人工合成端粒酶延伸产物的总量，即TPG值表示细胞中端粒酶活性的定量方法。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的锚定发夹型引物为：

5′-GCGC GGTTAGGG CTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3′

其中，下划线部分为发夹的茎部，中间未划线部分为与靶序列互补的引物序列，5′-端的未划线部分为锚定序列；

复合式蝎形引物为引物探针，包括探针引物和猝灭探针两部分，序列分别为：

PP：FAM-5′-[CCCTAA] ₃-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′；阻断剂为三个碳原子的碳链，带下划线的为探针序列

QP：5′[TTAGGG] ₃-3′-DABCYL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的双温快循环PCR扩增条件为：94℃0s，45℃3s，样品中端粒酶活性的实时定量检测可在30个循环数内完成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的人工合成端粒酶延伸产物为含有6个端粒重复序列的端粒酶延伸产物R6，即：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₆-3′。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的用TPG值表示细胞中端粒酶的活性，是根据假设1个TPG为1个永生化细胞产生的端粒酶延伸产物，确定TPG代表的定量标准物R6的量，即一个TPG为0.0058amol的R6时，一个TPG相当于一个永生化细胞。

6.一种双温快循环荧光定量PCR快速检测端粒酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)样品的制备：a)永生化细胞蛋白提取液：10，10²，10³，10⁴/μL的永生化细胞样品；b)阴性对照样品；c)人工合成端粒酶延伸产物R6标准溶液：3300，330，33，3.3，0.33，0.033amol/μL的R6_(1-6)标准溶液；

2)反应液的制备：1×TRAP缓冲液，1.5mmol/L MgCl₂，各50μmol/L的dATP，dTTP，dCTP，dGTP，0.21μmol/L的AHP，2U Taq DNA聚合酶，0.5μmol/L的PP链及1.0μmol/L的QP链，2μL样品溶液，反应液总体积为25μL；反应条件：采用30℃下30min进行端粒酶延伸反应，随后采用94℃0s，45℃3s的双温快循环的方式进行PCR扩增反应；

3)测定：a)永生化细胞蛋白提取液实时扩增曲线的测定；b)试剂盒定量工作曲线的确定：将人工合成端粒酶延伸产物R6_(1-6)标准溶液及一系列细胞样品及按以上条件进行扩增，得到两组扩增曲线；

4)数据处理：a)永生化细胞蛋白提取液工作曲线：在细胞样品扩增曲线上设定荧光阈值，得到不同样品的Ct值；绘制细胞拷贝数10⁴～10的范围内的标准曲线；b)试剂盒定量工作曲线及TPG值的确定：同法绘制定量标准品R6的工作曲线，并与永生化细胞定量标准曲线作比较。从端粒酶活性定量曲线及端粒酶延伸产物定量曲线的吻合图上，得到以TPG值表示细胞中端粒酶的活性的定量方法。

7.一种权利要求1所述的双温快循环荧光定量PCR检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于它包括：

洗液：Hepes-KOH 10mmol/L pH 7.5，MgCl₂ 1.5mmol/L，KCl 10mmol/L，DTT 1mmol/L；

细胞裂解液：Tris-HCl 10mmol/L pH 7.5，EGTA 1mmol/L，MgCl₂ 1mmol/L，β-巯基乙醇5mmol/L，甘油10％，CHAPS 0.5％，PMSF 0.1mmol/L；

10×TRAP缓冲液：Tris-HCl 200mmol/L pH＝8.3，10mmol/L EGTA，630mmol/L KCl，0.05％Tween-20，1mg/mL BSA；

复合式蝎形引物PP：FAM-5′-[CCCTAA] ₃-阻断剂-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′

PP+QP：阻断剂为三个碳原子的碳链，带下划线的为探针序列，

QP：5′[TTAGGG] ₃-3′-DABCYL；

定量标准物R6：5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTAG[GGTTAG]₆-3′；

AHP：5′-GCGC GGTTAGGG CTTACCCTTACCCTTA CCCTAACC-3′；

附：25mmol/L MgCl₂，2.5mmol/L dNTP含dATP，dTTP，dCTP，dGTP各2.5mmol/L，5U/ul Taq DNA聚合酶。