CN105331699A - 检测人tert基因启动子突变的探针法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测人TERT基因启动子突变的探针法及其试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)在TERT？C228T？PCR反应混合液中加入人类基因组DNA，形成C228T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，和/或在TERT？C250T？PCR反应混合液中加入人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行荧光定量PCR扩增；(2)结果判断：根据PCR扩增的突变Ct值进行分析。该试剂盒包括：TERT？C228T？PCR反应混合液和/或TERT？C250T？PCR反应混合液。该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的TERT基因启动子突变检测体系。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其试剂盒。
背景技术
端粒酶(telomerase)是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白复合体，属于反转录酶，与端粒的调控机理密切相关，起着维持细胞永生化和致癌的关键作用。端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)是端粒酶的重要催化部分，TERT基因位于人类第5号染色体，其中该基因的两个启动子突变位点，1,295,228C>T和1,295,250C>T(分别称为C228T和C250T)尤为常见，这两种突变已被证实能够增强TERT启动子转录活性。TERT启动子区突变不存在于正常的人类受试者及公共基因数据库，而表现为恶性肿瘤特异性体细胞的遗传改变，因此对于这两种突变的检测在监测人类肿瘤发生的过程中发挥重要作用。
TERT突变是原发性胶质母细胞瘤中出现频率较高(约为74.2％)的基因突变之一，在黑色素瘤、脂肪瘤、肝细胞癌、神经胶质瘤、膀胱癌等恶性肿瘤中都存在较高程度的TERT启动子突变，最新研究显示：只携带TERT突变的III-IV级胶质瘤患者，其病理诊断结果多为原发性胶母细胞瘤，且预后不良。因此，TERT突变为上述恶性肿瘤的发生和诊断提供了一个生物标记，能帮助肿瘤早期诊断、分子病理分型和预后判断。目前，尚无对于TERT基因特定点突变的检测方法。现有TERT基因的检测仅有通过原位杂交技术对TERT基因的表达进行分析的，该方法必须基于细胞形态学，且不包含对TERT基因特定区域的扩增，因此只有当TERT基因总表达量显著升高或降低时，才能用肉眼的方式观测到。而本发明采用的荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，该方法灵敏度高、可实时定量，是适合临床大规模使用的方法。
本发明还结合了扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)，ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。
发明内容
为了实现对人TERT基因启动子突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考，本发明提供了一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的TERT基因启动子突变检测体系。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，包括以下步骤：
(1)在TERTC228TPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C228T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，和/或在TERTC250TPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述TERTC228TPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
所述TERTC250TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.7所示序列的TERTC250T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
(2)结果判断：根据人类基因组DNA在C228T反应体系和/或C250T反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，所述样品可以是利用脑胶质瘤样本术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中：
C228T反应体系为：在16-20μlTERTC228TPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlTERTC228TPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述TERTC228TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC228T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM；
C250T反应体系为：在16-20μlTERTC250TPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlTERTC250TPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述TERTC250TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC250T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，15个循环；95℃15s，60℃45s，25个循环，在60℃45s阶段收集荧光。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中所述TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液中，PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中：所述结果判断步骤中Ct值进行分析为：
当TERTC228TPCR反应体系中的内参信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线9≤Ct≤14时，可以判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C228T反应体系中的△Ct≤9时为C228T突变阳性；当C228T反应体系中△Ct>9时为C228T突变阴性，其中△Ct＝样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值；
当TERTC250TPCR反应体系中的内参信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线9≤Ct≤14时，可以判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C250T反应体系中的△Ct≤9时为C250T突变阳性；当C250T反应体系中△Ct>9时为C250T突变阴性。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有C228T和C250T双突变的阳性质粒溶解在没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的TERTC228TPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的弱阳性对照液，形成C228T反应体系的阳性质控反应体系，并进行荧光定量PCR扩增，和/或在16-20μl，优选18μl的TERTC250TPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的弱阳性对照液，形成C250T反应体系的阳性质控反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的TERTC228TPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的空白对照液，形成C228T反应体系的空白对照反应体系，并进行荧光定量PCR扩增，和/或在16-20μl，优选18μl的TERTC250TPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的空白对照液，形成C250T反应体系的空白反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在C228T反应体系和C250T反应体系的阳性质控反应体系中，内参扩增曲线应9≤Ct≤14，15≤阳性质控扩增曲线的Ct值≤18；在C228T反应体系和C250T反应体系的空白对照反应体系中，空白对照不出现“S”扩增曲线且Ct≥24。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，包括：TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液，其中：
所述TERTC228TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
所述TERTC250TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.7所示序列的TERTC250T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，所述TERTC228TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC228T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，所述TERTC250TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC250T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液种，PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，所述弱阳性对照液为TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA，来源可以是提取自病人离体肿瘤，或者是按照如下方法制备得到的弱阳性对照液：含有C228T和C250T双突变的阳性质粒溶解在没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl。所得水溶液与TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。
一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，所述空白对照液是TE缓冲液。
本发明中所述TERT228上游特异性引物序列为SEQIDNo.1：GGCTGGGAGGGCCCGGTA；所述TERT250上游特异性引物序列为SEQIDNo.7：GCTGGGCCGGGGACCCGTA；所述TERT通用引物序列为SEQIDNo.2：GGCTCCCAGTGGATTCG；所述TERT通用探针序列SEQIDNo.3：cacAgaCgcCcaGgacc，其中cacAgaCgcCcaGgacc中大写的第4、7、10和13位的碱基为相应碱基对应的LNA碱基。TERT通用探针5’端连接有荧光报告基团，优选为FAM，TERT通用探针3’端连接有淬灭接团，优选为BHQ1；所述内参上游引物序列为SEQIDNo.4：gataggcactgactctctctg；所述内参下游引物序列为SEQIDNo.5：agcatcaggagtggacagat；所述内参探针序列SEQIDNo.6：ctacccttggacccagaggttctttgag，内参探针5’端连接有荧光报告基团，该荧光报告基团与TERT通用探针所连接的不同，优选为ROX，内参探针3’端连接有淬灭接团，该淬灭接团与TERT通用探针所连接的不同，优选为BHQ2。
本发明中所述PCR预混液可通过商业化渠道购买得到，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，Mg2+，dNTPs和稳定剂。如：thermoUniversalMasterMixII，TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明中的Taqman探针法与Sanger法相比，检测速度快，同时其检测结果与Sanger法检测结果的阳性符合率和阴性符合率均为100％；
2、本发明在TERT通用探针序列中设计了LNA碱基，本发明中LNA碱基是对脱氧核糖核苷酸的戊糖进行了改变，其将糖限制为在A-DNA中见到的N-类型的构象，这种限制是通过1,2:5,6-二-O-异亚丙基-α-D-别呋喃糖中的2′-氧，4′-碳亚甲基键来实现，即它包含了2′-氧-4′碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和稳定性；含有LNA碱基的Taqman探针的灵敏度更高：本发明中的Taqman探针法检测C228T和C250T突变时均可以检测出浓度为2ng/μL、突变率为1％的突变样本；将C228T和C250T突变序列克隆到T载体上，转化大肠杆菌，随后将该突变质粒DNA连续10倍梯度稀释；分别用Taqman探针法和申请号为201510616584.X的专利申请中SYBR染料法检测，检测机型为BioradCfx96PCR仪，结果显示，SYBR染料法检出下限约为50～100拷贝，而Taqman探针法检测下限约为5～10拷贝；
3、SYBR染料为嵌入DNA双链染料，主要缺点是会同时检测特异性和非特异性PCR产物积累，PCR反应中的DNA双链模版、引物二聚体及非特异扩增产物都会影响结果，而本申请Taqman探针法需要与靶序列完全匹配时才能产生荧光信号，因此Taqman探针法中引物二聚体对结果的影响小，检测的特异性强；
4、由于Taqman探针可以标记不同波长的荧光基团，本发明实现了在同一反应体系中同时扩增及检测样品基因组DNA及内参序列，这样能排除在不同反应体系中加样时产生的误差；而申请号为201510616584.X的专利申请中SYBR染色法需要在不同反应体系中分别扩增样品基因组DNA与内参序列；
5、与采用SYBR染料法相比，实时荧光定量PCR采用Taqman探针法时，反应体系中起始模板量对结果判定的影响更小，当20μl反应体系中分别含有200ng、100ng、50ng、20ng、10ng、5ng的没发生C228T或C250T突变的野生型基因组DNA或突变型基因组DNA，分别用本申请Taqman探针法与申请号为201510616584.X的专利申请中SYBR染料法进行检测，检测机型为BioradCfx96PCR仪，结果显示，SYBR染料法在起始模板量100ng以下时能区分野生型基因组DNA和突变型基因组DNA，而当起始模板量增加到200ng时会将野生型样本误判为突变型样本；而Taqman探针法在所有上述起始模板量时均能准确区分野生型样本和突变型样本；
6、本申请还在试剂盒中引入了dUTP-UNG防污染体系，能有效的防止PCR产物的气溶胶污染。
附图说明
图1为TERTC228T突变比例54％和突变比例1％的样品的检测结果；
图2为TERTC250T突变比例75％和突变比例1％的样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
试剂盒的组成
本发明试剂盒是用于检测TERTC228T和TERTC250T基因启动子突变的试剂盒，包括：TERTC228TPCR反应混合液、TERTC250TPCR反应混合液，弱阳性对照液和空白对照液，其中：
(1)TERTC228TPCR反应混合液是在反应预混液TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)中加入如下浓度的各种物质：
| TERT C228T上游特异性引物 | 3μM |
| TERT通用引物 | 3μM |
| TERT通用探针 | 3μM |
| 内参上游引物 | 2μM |
| 内参下游引物 | 2μM |
| 内参探针 | 2μM |
| dUTP | 0.2μM |
| 尿嘧啶DNA糖基化酶 | 0.01U/μl |
(2)TERTC250TPCR反应混合液是在反应预混液TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)中加入如下浓度的各种物质：
| TERT C250T上游特异性引物 | 3μM |
| TERT通用引物 | 3μM |
| TERT通用探针 | 3μM |
| 内参上游引物 | 2μM |
| 内参下游引物 | 2μM |
| 内参探针 | 2uM |
| dUTP | 0.2μM |
| 尿嘧啶DNA糖基化酶 | 0.01U/μl |
所述TERT228上游特异性引物序列为：GGCTGGGAGGGCCCGGTA；
所述TERT250上游特异性引物序列为：GCTGGGCCGGGGACCCGTA；
所述TERT通用引物序列为：GGCTCCCAGTGGATTCG；
所述TERT通用探针序列：FAM-cacAgaCgcCcaGgacc-BHQ1，其中cacAgaCgcCcaGgacc中大写的碱基为相应碱基对应的LNA碱基；
所述内参上游引物序列为：gataggcactgactctctctg；
所述内参下游引物序列为：agcatcaggagtggacagat；
所述内参探针序列：ROX-ctacccttggacccagaggttctttgag-BHQ2；
(3)弱阳性对照液是按照如下方法制备的：含有C228T和C250T双突变的阳性质粒溶解在没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为10ng/μl；所得水溶液与TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。
(4)空白对照液为TE缓冲液。
检测方法
(1)临床患者离体肿瘤组织样本基因组DNA提取：利用实体瘤术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，参照所购买的Qiagen的商用基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取；
(2)稀释基因组DNA：将所提基因组DNA溶于Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)中，经NANODROP2000检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)调整基因组DNA浓度到10ng/μL作为PCR模板；
(3)加样进行PCR反应扩增：取2μL、10ng/μL的PCR模板加入18μlTERTC228TPCR反应混合液和/或取2μL、10ng/μL的PCR模板加入18μlTERTC250TPCR反应混合液中获得20μL的反应体系；每次检测均有阳性质控及空白对照，剩余DNA溶液分装后贮存于-20℃；
C228T反应体系及其阳性质控反应体系、空白对照反应体系如下表所列：
C250T反应体系及其阳性质控反应体系、空白对照反应体系如下表所列：
(4)实时荧光定量PCR仪器检测通道的选择：选择的荧光为FAM和ROX；
(5)PCR反应条件为：
(6)检测结果分析：
A.TERTC228TPCR反应体系
本发明中Ct值是指反应体系中的荧光信号到达设定的基线值时所经历的循环数，扩增曲线基线值设定为相对荧光单位500，并在此设定条件下确定Ct值；ROX信号检测内参扩增情况，FAM信号检测PCR模板、阳性质控和空白对照的扩增情况；
当TERTC228TPCR反应体系中的内参ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线9≤Ct≤14时，可以判断待测样本C228T突变的阴性和阳性：当C228T反应体系中的△Ct≤9时为C228T突变阳性；当C228T反应体系中△Ct>9时为C228T突变阴性，其中△Ct＝待测样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值；
TERTC228TPCR反应体系中内参ROX信号的作用：当TERTC228TPCR反应体系中的内参扩增曲线的Ct＞14表示加入的基因组DNA模板有PCR抑制物或浓度不足，需要重新提取基因组DNA或增加DNA用量后重复实验；内参扩增曲线的Ct＜9，提示加入的样品DNA过量，建议稀释DNA后重新进行实验；
空白对照反应体系的作用：空白对照反应体系中的FAM信号应不出现“S”扩增曲线且Ct≥24，若FAM信号的Ct＜24，则此实验结果视为无效，同时建议重复试验；
弱阳性反应体系的作用：弱阳性反应用于指示PCR反应体系是否有效及反应程序是否正确设置。弱阳性对照中，ROX扩增曲线应9≤Ct≤14，FAM扩增曲线应15≤Ct≤18。如果ROX和FAM扩增曲线不在此范围，则提示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。
灵敏度分析：取定量后浓度为10ng/μL的C228T1％突变样本基因组DNA进行稀释，使其浓度分别为10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL，按实施例1中的检测方法进行检测，每个TERTC228TPCR反应体系设置5个平行，结果表明，本发明灵敏度可以检测到2ng/μL的C228T1％突变样本。
B.TERTC250TPCR反应体系
扩增曲线基线值设定为相对荧光单位500，并在此设定条件下确定Ct值；ROX信号检测内参扩增情况，FAM信号检测PCR模板、阳性质控和空白对照的扩增情况；
当TERTC250TPCR反应体系中的内参ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线9≤Ct≤14时，可以判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C250T反应体系中的△Ct≤9时为C250T突变阳性；当C250T反应体系中△Ct>9时为C250T突变阴性，其中△Ct＝待测样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值；
TERTC250TPCR反应体系中内参ROX信号的作用：当TERTC250TPCR反应体系中的内参扩增曲线的Ct＞14表示加入的基因组DNA模板有PCR抑制物或浓度不足，需要重新提取基因组DNA或增加DNA用量后重复实验；内参扩增曲线的Ct＜9，提示加入的样品DNA过量，建议稀释DNA后重新进行实验；
空白对照反应体系的作用：空白对照反应体系中的FAM信号应不出现“S”扩增曲线且Ct≥24，若FAM信号的Ct＜24，则此实验结果视为无效，同时建议重复试验；
弱阳性反应体系的作用：弱阳性反应用于指示PCR反应体系是否有效及反应程序是否正确设置。弱阳性对照中，ROX扩增曲线应9≤Ct≤14，FAM扩增曲线应15≤Ct≤18。如果ROX和FAM扩增曲线不在此范围，则提示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。
灵敏度分析：取定量后浓度为10ng/μL的C250T1％突变样本基因组DNA进行稀释，使其浓度分别为10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL，按实施例1中的检测方法进行检测，每个TERTC250TPCR反应体系设置5个平行，结果表明，本发明灵敏度可以检测到2ng/μL的C250T1％突变样本。
实施例2荧光PCR方法对比Sanger的方法学验证
按照实施例1中的方法进行荧光PCR检测，并同时开展Sanger验证，验证数据与结果如下：随机选取95例脑胶质瘤患者冰冻组织样本平行开展qPCR与Sanger方法对比，得到qPCR与Sanger方法符合率的验证结果。从目前已获得的脑胶质瘤患者的临床样本研究结果显示，共获得93例有效检测数据，与Sanger检测方法学对比验证结果显示，qPCR检测与Sanger验证一致率为C228T100％，C250T100％。
用于对比的样本来源于脑胶质瘤样本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
验证分析结果为：
C228T位点统计数据
1.备注：PPA:阳性符合率；NPA:阴性符合率；OPA:总体符合率
2.从上表可知，在总共93例有效对比数据中，qPCR方法与Sanger方法相比，C228T阳性符合率、阴性符合率和总体符合率均为100％。
C250T位点统计数据
1.备注：PPA:阳性符合率；NPA:阴性符合率；OPA:总体符合率
2.从上表可知，在总共93例有效对比数据中，qPCR方法与Sanger方法相比，C250T阳性符合率、阴性符合率和总体符合率均为100％。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，包括：TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液，其中：
所述TERTC228TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
所述TERTC250TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.7所示序列的TERTC250T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。
2.根据权利要求1所述的检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述TERTC228TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC228T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
3.根据权利要求1或2所述的检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，所述TERTC250TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC250T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
4.根据权利要求1-3之一所述的检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液中，PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
5.根据权利要求1-4之一所述的检测人TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液；所述弱阳性对照液为TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有C228T和C250T双突变的阳性质粒溶解在没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。
6.一种检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在TERTC228TPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C228T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，和/或在TERTC250TPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成C250T反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述TERTC228TPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的TERTC228T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
所述TERTC250TPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.7所示序列的TERTC250T上游特异性引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的TERT通用引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的TERT通用探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
(2)结果判断：根据人类基因组DNA在C228T反应体系和/或C250T反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，
所述C228T反应体系为：在16-20μlTERTC228TPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlTERTC228TPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述TERTC228TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC228T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM；
所述C250T反应体系为：在16-20μlTERTC250TPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlTERTC250TPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述TERTC250TPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述TERTC250T上游特异性引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述TERT通用探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
8.根据权利要求6或7所述的检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，
PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，15个循环；95℃15s，60℃45s，25个循环，在60℃45s阶段收集荧光；
所述结果判断步骤中Ct值进行分析为：
当TERTC228TPCR反应体系中的内参信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线9≤Ct≤14时，可以判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C228T反应体系中的△Ct≤9时为C228T突变阳性；当C228T反应体系中△Ct>9时为C228T突变阴性，其中△Ct＝样品扩增曲线的Ct值-内参扩增曲线的Ct值；
当TERTC250TPCR反应体系中的内参信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线9≤Ct≤14时，可以判断待测样本C250T突变的阴性和阳性：当C250T反应体系中的△Ct≤9时为C250T突变阳性；当C250T反应体系中△Ct>9时为C250T突变阴性。
9.根据权利要求6-8之一所述的检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，所述TERTC228TPCR反应混合液和/或TERTC250TPCR反应混合液中，PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
10.根据权利要求6-9之一所述的检测人TERT基因启动子突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为TERTC228T突变率和TERTC250T突变率均为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有C228T和C250T双突变的阳性质粒溶解在没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有C228T或C250T突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。
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