CN105734137A - 一种检测人h3f3a基因突变的探针法及检测试剂盒 - Google Patents
一种检测人h3f3a基因突变的探针法及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测人类H3F3A基因突变的探针法及其试剂盒。该方法包括以下步骤：(1)在H3F3A K27M PCR反应混合液中加入人类基因组DNA，形成K27M反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中H3F3A K27M PCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的：H3F3A K27M上游引物、H3F3A K27M下游引物、H3F3A K27M探针、内参上游引物、内参下游引物和内参探针；(2)结果判断：根据PCR扩增的突变Ct值进行分析。该试剂盒包括：H3F3A K27M PCR反应混合液。该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的H3F3A基因突变检测体系。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其检测试剂盒。
背景技术
神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见也是最恶性的原发性中枢神经系统肿瘤，确诊后5年生存率不足10％，大多数高度恶性胶质瘤患者，生存期仅为1-2年(Louisetal.，2007；Dominiketal.，2012)，其主要原因是大多数胶质瘤确诊晚，使患者错失了治疗的最佳时机。
组蛋白突变与多种癌症相关，组蛋白翻译后修饰方式出现异常，以及组蛋白修饰位置出现异常都会导致肿瘤发生。其中组蛋白H3家族蛋白3A(H3F3A)编码组蛋白变体H3.3，其K27M突变(即27位赖氨酸突变为甲硫氨酸)在儿童与成人胶质瘤中极为常见(Schwartzentruberetal.，2012)。K27在所有组蛋白H3变体中都是一个重要残基，既可以被乙酰化修饰，也可以被甲基化修饰(Buczkowiczetal.，2014)。H3.3参与活性染色质状态的表观传递，并且与复制非依赖性的染色质重塑事件密切相关(Jhaetal.，2014)。在基因表达的转录后修饰过程中，H3K27M突变位点靠近调控H3.3活性的氨基酸残基(Hylandetal.，2011)，并且与不同的转录谱相关(Schwartzentruberetal.，2012)。K27M突变改变了H3.3组蛋白变体的转录后修饰的活性位点，导致DNA甲基化与基因表达的变化，从而驱动肿瘤发生(Davidetal.，2015)。
根据H3F3A(编码组蛋白H3.3)、IDH1突变情况可将胶质母细胞瘤分成6个亚型，各个亚型DNA甲基化形式不同，儿童、成人病理机制也不同(Dominiketal，2012)。例如弥漫性真性脑桥神经胶质瘤(diffuseintrinsicpontineglioma,DIPG)是一种好发于脑干部位、进展迅速的小儿肿瘤，是小儿脑部肿瘤的主要死因。研究表明DIPG有其自身的遗传学特征，如TP53突变与缺失、组蛋白变体H3K27M突变等(Hoffmanetal.，2016)。对临床病例的分析发现，H3.3K27M突变在DIPG中很常见，大约有80％的DIPG患儿都会携带H3.3K27M这种组蛋白突变，K27M-H3.3在DIPG病人中生存期较短，而无此突变的病人生存率延长(Dong-Anhetal.，2012)。
目前对于神经胶质瘤的诊断和筛查主要建立在形态学基础之上。但胶质瘤在形态学上的异质性，以及医生诊断过程中的主观性差异，诊断的不一致性可达30％-40％。并且，基于形态学的诊断不能准确反映疾病的本质特征。当取材为肿瘤(尤其是低级别胶质瘤)边缘，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。因此，现有的形态学诊断标准较大地制约了胶质瘤的临床治疗研究。往往有临床表现以及发现神经影像学和病理学异常时已经太晚，其五年生存率只有3％。近年来，分子分型方法为揭示胶质瘤发生和发展的细胞学和遗传学本质提供了可能，可极大地促进胶质瘤的靶向治疗研究。
本发明采用的荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用的一种技术，其实时定量，是适合临床大规模使用的方法。
本发明还结合了扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)ARMS于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。由于PCR过程中引物延伸是3’端开始的，所以3’末端的碱基对引物的延伸来说非常重要。根据这个原理，将突变与正常等位基因所不同的那个碱基安排在引物3’最末端，当反应进行时，如果引物3’末端碱基与模板DNA序列匹配则可以扩增，如果不匹配，则链延伸反应就会因3’,5’-磷酸二酯键形成障碍而受阻，从而达到区分检测等位基因的目的。
发明内容
为了实现对人类H3F3A基因突变的检测，从而为肿瘤病理分型、预后判断提供参考，本发明提供了一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法及其检测试剂盒，该探针法和试剂盒为临床上提供了一种速度快、灵敏度高、特异性强的H3F3A基因突变检测体系。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，包括以下步骤：
(1)在H3F3AK27MPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成H3F3AK27M反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述H3F3AK27MPCR反应混合液包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的H3F3AK27M上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的H3F3AK27M下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的H3F3AK27M探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
(2)结果判断：根据人类基因组DNA在H3F3AK27M反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，所述样品可以是利用脑胶质瘤样本术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中H3F3AK27M反应体系为：在16-20μlH3F3AK27MPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为3-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlH3F3AK27MPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述H3F3AK27MPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述H3F3AK27M上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，15个循环；95℃15s，60℃45s，25个循环，在60℃45s阶段收集荧光。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中结果判断步骤中Ct值进行分析为：
当H3F3AK27M反应体系中的内参检测信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线6≤Ct≤10时，可以判断待测样本H3F3AK27M突变的阴性和阳性：当H3F3AK27M反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线Ct≤15时为K27M突变强阳性；当H3F3AK27M反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线15＜Ct≤20时为K27M突变弱阳性；当H3F3AK27M反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线Ct>20时为K27M突变阴性。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其中H3F3AK27MPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为H3F3AK27M突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有H3F3AK27M突变的阳性质粒溶解在没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与H3F3AK27M突变率10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的H3F3AK27MPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的弱阳性对照液，形成H3F3AK27M反应体系的阳性质控反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，在16-20μl，优选18μl的H3F3AK27MPCR反应混合液中加入1-4μl，优选2μl的空白对照液，形成H3F3AK27M反应体系的空白对照反应体系，并进行荧光定量PCR扩增。
一种检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，包括H3F3AK27MPCR反应混合液，其中所述H3F3AK27MPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的H3F3AK27M上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的H3F3AK27M下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的H3F3AK27M探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。
一种检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其中所述H3F3AK27MPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述H3F3AK27M上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
一种检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其中所述H3F3AK27M反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
一种检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液；其中所述弱阳性对照液为H3F3AK27M突变率10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有H3F3AK27M突变的阳性质粒溶解在没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所得水溶液与H3F3AK27M突变率为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。所述空白对照液是TE缓冲液。
本发明中所述H3F3AK27M上游引物序列为SEQIDNo.1：cagtagagggcgcactcA，其中cagtagagggcgcactcA中大写的第18位的A为腺嘌呤对应的LNA核苷酸(锁核酸)；所述H3F3AK27M下游引物序列为SEQIDNo.2：ggtctctgtaccatggctcgt；所述H3F3AK27M探针序列SEQIDNo.3：agcAgaCtgCccGc，其中agcAgaCtgCccGc中大写的第4、7、10、13位的A、C、C、G分别为腺嘌呤、胞嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤对应的LNA核苷酸(锁核酸)；H3F3AK27M探针序列探针序列5’端连接有荧光报告基团，优选为FAM，H3F3AK27M探针序列3’端连接有淬灭基团，优选为BHQ1；所述内参上游引物序列为SEQIDNo.4：taggcactgactctctc；所述内参下游引物序列为SEQIDNo.5：catcaggagtggacag；所述内参探针序列SEQIDNo.6：acccttggacccagaggttctttg，内参探针序列5’端连接有荧光报告基团，该荧光报告基团与H3F3AK27M探针序列所连接的不同，优选为ROX，内参探针序列3’端连接有淬灭基团，该淬灭基团与H3F3AK27M探针序列所连接的不同，优选为BHQ2。
本发明中所述PCR预混液可通过商业化渠道购买得到，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，Mg2+，dNTPs和稳定剂。如：thermoUniversalMasterMixII，KAPAPROBEFASTMasterMix(2×)，TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明中的Taqman探针法与Sanger法相比，检测速度快，灵敏度高；
2、本发明在H3F3AK27M探针序列中设计了LNA核苷酸，本发明中LNA核苷酸是对相应脱氧核糖核苷酸的戊糖进行了改变，其将糖限制为在A-DNA中见到的N-类型的构象，这种限制是通过1,2:5,6-二-O-异亚丙基-α-D-别呋喃糖中的2′-氧，4′-碳亚甲基键来实现，即它包含了2'-氧-4'碳亚甲基连接，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和稳定性；含有LNA核苷酸的Taqman探针的灵敏度更高：本发明中的Taqman探针法检测K27M突变时均可以检测出浓度为2ng/μL、突变率为1％的突变样本；将K27M突变序列克隆到T载体上，转化大肠杆菌，随后将该突变质粒DNA连续10倍梯度稀释后测得Taqman探针法检测下限约为5～10拷贝；
3、本申请还在试剂盒中引入了dUTP-UNG防污染体系，能有效的防止PCR产物的气溶胶污染。
附图说明
图1是本发明H3F3AK27M突变比例50％和突变比例1％的样品的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
试剂盒的组成
本发明试剂盒是用于检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，包括：H3F3AK27MPCR反应混合液、弱阳性对照液和空白对照液，其中：
(1)H3F3AK27MPCR反应混合液是在反应预混液TakaraPremixExTaq(ProbeqPCR)中加入如下浓度的各种物质：
| H3F3A K27M上游引物 | 3μM |
| H3F3A K27M下游引物 | 3μM |
| H3F3A K27M探针 | 3μM |
| 内参上游引物 | 2μM |
| 内参下游引物 | 2μM |
| 内参探针 | 2μM |
| dUTP | 0.2μM |
| 尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG) | 0.01U/μl |
所述H3F3AK27M上游引物序列为：cagtagagggcgcactcA(大写的A为腺嘌呤对应的LNA核酸。)
所述H3F3AK27M下游引物序列为：ggtctctgtaccatggctcgt
所述H3F3AK27M探针序列：FAM-agcAgaCtgCccGc-BHQ1(大写的A、C、C、G为腺嘌呤、胞嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤对应的LNA核苷酸。)
所述内参上游引物序列为：taggcactgactctctc
所述内参下游引物序列为：catcaggagtggacag
所述内参探针序列：ROX-acccttggacccagaggttctttg-BHQ2
(2)弱阳性对照液是浓度是按照如下方法制备的：含有K27M突变的阳性质粒溶解在没有K27M突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有K27M突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为10ng/μl；所得水溶液与K27M突变率为10％的人类基因组DNA按照本发明中的实时荧光定量PCRTaqman探针法、在相同的反应体系和扩增条件下进行PCR扩增，扩增曲线吻合。
(3)空白对照液为TE缓冲液。
检测方法：
(1)临床患者样本基因组DNA提取：利用人脑胶质瘤术后冰冻组织或者石蜡组织或者活检穿刺组织作为检测标本，参照所购买的Qiagen的商用基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取；
(2)稀释基因组DNA：将所提基因组DNA溶于Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)中，经NANODROP2000检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl缓冲液(10mmol/L，pH8.0)调整基因组DNA浓度到10ng/μL作为PCR模板；
(3)加样进行PCR反应扩增：取2μL、10ng/μL的PCR模板加入18μlH3F3AK27MPCR反应混合液中获得20μL的反应体系；每次检测均有阳性质控及空白对照，剩余DNA溶液分装后贮存于-20℃；
H3F3AK27M反应体系及其阳性质控反应体系、空白对照反应体系如下表所列：
(4)实时荧光定量PCR仪器检测通道的选择：选择的荧光为FAM和ROX；
(5)PCR反应条件为：
(6)检测结果分析：
本发明中Ct值是指反应体系中的荧光信号到达设定的基线值时所经历的循环数，扩增曲线基线值设定为相对荧光单位60，并在此设定条件下确定Ct值；ROX信号检测内参扩增情况，FAM信号检测PCR模板、阳性质控和空白对照的扩增情况；
当H3F3AK27M反应体系中的ROX信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线6≤Ct≤10时，可以判断待测样本H3F3AK27M突变的阴性和阳性：当H3F3AK27M反应体系中的FAM信号Ct≤15时为K27M突变强阳性；当H3F3AK27M反应体系中的FAM信号15＜Ct≤20时为K27M突变弱阳性；当H3F3AK27M反应体系中的FAM信号Ct>20时为K27M突变阴性。
H3F3AK27M反应体系中内参ROX信号的作用：当K27M反应体系中的内参扩增曲线的Ct＞10表示加入的基因组DNA模板有PCR抑制物或浓度不足，需要重新提取基因组DNA或增加DNA用量后重复实验；内参扩增曲线的Ct＜6，提示加入的样品DNA过量，建议稀释DNA后重新进行实验；
空白对照反应体系的作用：空白对照反应体系中的FAM信号应不出现“S”扩增曲线或Ct≥24，若FAM信号的Ct＜24，则此实验结果视为无效，同时建议重复试验；
弱阳性反应体系的作用：弱阳性反应用于指示PCR反应体系是否有效及反应程序是否正确设置。弱阳性对照反应体系中，ROX扩增曲线应6≤Ct≤10，FAM扩增曲线应15＜Ct≤20。如果ROX和FAM扩增曲线不在此范围，则提示实验出现问题，建议检查试剂是否在有效期或PCR反应程序是否正确设置。
灵敏度分析：取定量后浓度为10ng/μL的K27M1％突变样本基因组DNA进行稀释，使其浓度分别为10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL，按实施例1中的检测方法进行检测，每个K27M反应体系设置5个平行，结果表明，本发明灵敏度可以检测到2ng/μL的K27M1％突变样本，如图1所示。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，包括H3F3AK27MPCR反应混合液，其中所述H3F3AK27MPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的H3F3AK27M上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的H3F3AK27M下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的H3F3AK27M探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针。
2.根据权利要求1所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，所述H3F3AK27MPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述H3F3AK27M上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
3.根据权利要求1或2所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，所述H3F3AK27MPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
4.根据权利要求1-3之一所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括弱阳性对照液和/或空白对照液。
5.根据权利要求4所述的检测人类H3F3A基因突变的试剂盒，其特征在于，所述弱阳性对照液为H3F3AK27M突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有H3F3AK27M突变的阳性质粒溶解在没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，所述阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。
6.一种检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在H3F3AK27MPCR反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成H3F3AK27M反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述H3F3AK27MPCR反应混合液中包括溶解在PCR预混液中的以下组分：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的H3F3AK27M上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的H3F3AK27M下游引物、具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的H3F3AK27M探针、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的内参上游引物、具有如序列表中SEQIDNo.5所示序列的内参下游引物和具有如序列表中SEQIDNo.6所示序列的内参探针；
(2)结果判断：根据人类基因组DNA在K27M反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值进行分析。
7.根据权利要求6所述的检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，所述H3F3AK27M反应体系为：在16-20μlH3F3AK27MPCR反应混合液中加入1-4μl、浓度为2-10ng/μl的人类基因组DNA，优选在18μlH3F3AK27MPCR反应混合液中加入2μl、浓度为10ng/μl的人类基因组DNA；所述H3F3AK27MPCR反应混合液中各组分在PCR预混液中的浓度为：所述H3F3AK27M上游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M下游引物的浓度为2-4μM，优选3μM；所述H3F3AK27M探针的浓度为2-4μM，优选3μM；所述内参上游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参下游引物的浓度为1-3μM，优选2μM；所述内参探针的浓度为1-3μM，优选2μM。
8.根据权利要求6或7所述的检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，
PCR的扩增过程为：37℃3min；95℃3min；95℃15s，65℃45s，15个循环；95℃15s，60℃45s，25个循环，在60℃45s阶段收集荧光；
所述结果判断步骤中Ct值进行分析为：
当H3F3AK27M反应体系中的内参检测信号呈现“S”曲线、内参扩增曲线6≤Ct≤10时，可以判断待测样本H3F3AK27M突变的阴性和阳性：当H3F3AK27M反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线Ct≤15时为K27M突变强阳性；当H3F3AK27M反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线15＜Ct≤20时为K27M突变弱阳性；当H3F3AK27M反应体系中的待测样品作为PCR模板扩增时扩增曲线Ct>20时为K27M突变阴性。
9.根据权利要求6-8之一所述的检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，所述H3F3AK27MPCR反应混合液的PCR预混液中还溶解有dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶；所述dUTP在PCR预混液中的浓度为0.05-0.8μM，优选0.2μM，所述尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR预混液中的浓度为0.005-0.02U/μl，优选0.01U/μl。
10.根据权利要求6-9之一所述的检测人类H3F3A基因突变的实时荧光定量PCRTaqman探针法，其特征在于，还使用了弱阳性对照液和/或空白对照液，所述弱阳性对照液为H3F3AK27M突变率为10％的人类基因组DNA，或者是按照如下方法制备的弱阳性对照液：含有H3F3AK27M突变的阳性质粒溶解在没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA水溶液中，使得阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA的拷贝数为1:9，阳性质粒与没有H3F3AK27M突变的人类基因组DNA在弱阳性对照液中的核酸总浓度为2-10ng/μl，优选为10ng/μl；所述空白对照液是TE缓冲液。
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|---|---|
| CN (1) | CN105734137A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108949975A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-12-07 | 北京大学 | 用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物、探针、设备及方法 |
| CN117844925A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-04-09 | 深圳海普洛斯医学检验实验室 | 一种检测h3f3a基因突变的引物探针和试剂盒及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805208A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-07-29 | 山东维真生物科技有限公司 | 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 |
| CN105039514A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-11-11 | 武汉友芝友医疗科技有限公司 | 人类braf基因v600e突变检测试剂盒 |
| CN105238871A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-13 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 一种检测人idh1基因突变的探针法及其试剂盒 |
| CN105331699A (zh) * | 2015-11-05 | 2016-02-17 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人tert基因启动子突变的探针法及其试剂盒 |
-
2016
- 2016-03-25 CN CN201610178701.3A patent/CN105734137A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104805208A (zh) * | 2015-04-30 | 2015-07-29 | 山东维真生物科技有限公司 | 用于检测人类kras基因7种热点突变的引物探针组合物、试剂盒及检测方法 |
| CN105039514A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-11-11 | 武汉友芝友医疗科技有限公司 | 人类braf基因v600e突变检测试剂盒 |
| CN105331699A (zh) * | 2015-11-05 | 2016-02-17 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人tert基因启动子突变的探针法及其试剂盒 |
| CN105238871A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-01-13 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 一种检测人idh1基因突变的探针法及其试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LATORRA D ET AL.: "Design considerations and effects of LNA in PCR primers", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 * |
| RAY ZHANG等: "Detecting the H3F3A mutant allele found in high-grade pediatric glioma by real-time PCR", 《J. NEUROONCOL》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108949975A (zh) * | 2018-07-03 | 2018-12-07 | 北京大学 | 用于检测人h3f3a基因g34w位点突变的引物、探针、设备及方法 |
| CN117844925A (zh) * | 2023-12-28 | 2024-04-09 | 深圳海普洛斯医学检验实验室 | 一种检测h3f3a基因突变的引物探针和试剂盒及其应用 |
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